Summary
Dieses Manuskript beschreibt einen murinen calvarial Osteolyse Modell durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel, die ideale Tiermodell für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen in aseptischen Lockerung darstellt.
Abstract
Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse ist eine der Hauptursachen für aseptische Lockerung Endoprothetik scheitern, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist unklar. Durch lange Follow-ups nötig für die Erkennung und sporadisch auftreten ist es schwierig um zu beurteilen, die Pathogenese Ofparticle-induzierte Osteolyse in klinischen Fällen. Daher sind optimale Tiermodelle für weitere Studien erforderlich. Das Mausmodell calvarial Osteolyse gegründet durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein wirksam und gültig Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell wurden CoCrMo Partikel zuerst von Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Nach zwei Wochen die Mäuse wurden geopfert und Calvaria Exemplare wurden geerntet; qualitative und quantitative Auswertungen wurden von Hämatoxylin und Eosin Färbung und Mikro-Computertomographie durchgeführt. Die Stärken dieses Modells gehören Verfahren Einfachheit, quantitative Bewertung des Knochenverlustes, Schnelligkeit der Osteolyse Entwicklung, mögliche Verwendung transgenen oder Ko-Modelle und einen relativ niedrigen Kosten. Jedoch kann dieses Modell verwendet werden, um die mechanische Kraft und chronische Effekte von Partikeln in aseptischen Lockerung zu beurteilen. Murine calvarial Osteolyse Modell generiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen, z. B.Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.
Introduction
Aseptische Lockerung ist die häufigste Ursache von total hip Arthroplasty (THA) und Knie-Endoprothetik (TKA) Ausfall, erfordert die Überarbeitung Chirurgie1. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unklar2. Eine lange Follow-up ist erforderlich, um die Partikel-induzierte Osteolyse, erkennen deren selten vorkommt; Daher ist es schwierig, um seine Pathogenese in klinischen Fällen zu erkunden. Daher benötigen weitere Studien mit Schwerpunkt auf komplexen Mechanismen der zellulären und Gewebe, dass beide in Vivo -Experimente in der Partikel-induzierte Osteolyse Modelle und in-vitro- Assays in Zellen, die im Zusammenhang mit Homöostase3Knochen tragen. Eine gültige Tiermodell ist wichtig enthüllt hat, die Auswirkungen von Abriebpartikeln auf Knochenschwund, Nachweis für weitere zelluläre Assays.
Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist eine effektive und gültige Methode zur Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell verursachen CoCrMo Partikel calvarial Osteolyse von inflammatorischen Zytokinen in Makrophagen induzieren, Aktivierung von Osteoklasten, Hemmung der Osteoblasten Verbreitung und Förderung der Osteoblasten Apoptose.
Es dauert nur zwei Wochen, dieses Modell zu etablieren. Osteolyse visualisiert und durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung quantifiziert werden kann und Mikro Tomographie (Mikro-CT)2berechnet. Darüber hinaus hat dieses Modell eine relativ niedrigen Kosten und transgenen und Knockout Maus Modelle können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen in verschiedene Dosen3Bildschirm.
Das Verfahren zu etablieren und Werten dieses Modell ist einfach. Zunächst wurden CoCrMo Partikel durch Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom gewonnen und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Die Mäuse wurden geopfert, nach zwei Wochen, und Calvaria Proben wurden geerntet; qualitative und quantitative Analysen wurden von H & E Färbung Andmicro-CT durchgeführt.
Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen CoCrMo Partikel und verschiedene Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Universität Nanjing genehmigt.
1. CoCrMo Partikel Vorbereitung
- Erhalten Sie CoCrMo Partikel mithilfe einer vorgefertigten Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom4. CoCrMo-Legierung in das Instrument unter 10-3 Pa Vakuum, 0,04 MPa Argon und Wasserstoff 3:2 (V/V) und 650 A Katode aktuelle zu platzieren.
- Messen Sie den Durchmesser der CoCrMo Partikel.
- Fügen Sie 1 mg CoCrMo Partikel in 1,5 mL wasserfreiem Ethanol.
- Aufschwemmen Sie CoCrMo Partikel in wasserfreiem Ethanol durch Ultraschall bei 28 kHz und 600 W für 5 min schütteln.
- Die entstandene Suspension auf den objektiven Tisch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) einen Tropfen (ca. 20 µL) gelten. TEM Fotoserie bei 200 kV Beschleunigungsspannung und 0,24 nm Auflösung zu erfassen.
- Verwenden Sie die mitgelieferte Software, um die mittlere Durchmesser und Partikel Größenverteilung in TEM Mikrographen berechnen.
- Dekontaminieren Endotoxine
- Autoklaven 50 g der Partikel für 15 min bei 121 ° C und 15 Psi.
- Endotoxine durch einen quantitativen Assay Limulus Amebocyte Lysate (LAL) zu erkennen (< 0,25 % EU/mL wurde als Endotoxin Abwesenheit anzugeben)5.
- Die Partikel in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL Stammlösung6aufzuwirbeln.
2. Konstruktion des Modells Calvarial Osteolyse
- 6 Wochen alten C57BL/J6 Mäuse (sechs Mäuse pro Gruppe) Withpentobarbital (50 mg/kg) zu betäuben. Verwenden Sie den Kneiftest um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verhindert Austrocknen der Augen mit normalen Kochsalzlösung.
- Mäuse in Bauchlage zu platzieren. Entfernen Sie das Fell auf den Schädel mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie die Haut mit medizinischen Wattebällchen, die 75 % Ethanol enthält.
- Identifizieren Sie für Punkt Lokalisierung zwei Punkte, einschließlich der Halbsummen zwischen den beiden Augen und Ohren, beziehungsweise. Dann bestimmen Sie die Linie zwischen den beiden oben genannten Punkte, und einzuschneiden Sie die Haut entlang der oben genannten Linie mit einer Schere (Abbildung 1A).
- Entfernen Sie die Craniale Periost aus der Calvaria mit einem Skalpell (Abbildung 1 b)6.
- Naht Haut an beiden Enden mit einfachen unterbrochenen Naht.
- Machen Sie eine Naht Linie durch die Mitte des Schnittes ohne verknoten. Halten Sie die beiden Enden der Linie Naht.
- Einbetten von 50 µL CoCrMo Partikel Suspension (50 mg/mL, mit PBS-Puffer) in der Mitte der Calvarias (Abbildung 1)2.
- Verknoten Sie die letzte Masche in einfachen unterbrochenen Naht (Abbildung 1).
- Pflegen Sie Mäuse für weitere 2 Wochen.
3. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von Mikro-CT-Scan
- Die Mäuse mit Kohlendioxid zu opfern. Die Mäuse in der Horizontalebene zu enthaupten. Entfernen Sie das Hirngewebe im Inneren und die Haut und Fell außerhalb. Ernten Sie die Calvarias für weitere Experimente.
- Das weiche Gewebe auf die Calvaria klären Sie vorsichtig mit einer Pinzette. Fix die geräumte Calvarias in 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 h Tauchen Calvarias in PBS 24 h vor dem Mikro-CT-Scan.
- Analysieren der Mäuse Calvarias durch hochauflösende Mikro-CT bei einer isometrischen Auflösung von 18 µm und Röntgen-Energieeinstellungen 45 kV und 550 mA.
- Durchzuführen Sie dreidimensionale Rekonstruktion von Mikro-CT-Daten mit der Software.
- Qualitative und Quantitative Analyse.
- Wählen Sie zunächst den quadratischen Bereich rund um die Mittellinie Naht als die Region von Interesse.
- Zweitens, Messung der Knochendichte (BMD), Knochen Volumen/Gesamt Volumen (BV/TV), trabekuläre Anzahl (Tb.N), trabekuläre Dicke (Tb.Th), trabekuläre Trennung/Abstand (Tb.Sp) und Prozentsatz der gesamten Porosität mit der mitgelieferten Software für Mikro-CT.
- Drittens vergleichen Sie die drei Gruppen für verschiedene Messungen durch einfache ANOVA. Post-hoc-Analyse der Varianz beantragen Sie die Bonferroni-Methode2.
4. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von H & E Färbung
- Entkalken Calvaria Proben in 15 % Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA)-PBS bei 4 ° C. Wechseln Sie die Entkalkung Lösung 3 Wochen lang jeden Tag.
- Betten Sie die Entkalkung Proben in Paraffin für eine 2 x 1 cm x 1 cm-Würfel, und schneiden Sie sie in 2 µm Abschnitte im Bereich der Partikelabscheidung.
- Fleck in den Abschnitten mit Hämatoxylin und Eosin wie oben beschrieben7.
- Aufnahmen des gesamten Pathomorphism durch Lichtmikroskopie zu erfassen.
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Representative Results
Die hauseigene erzeugten nanoskaligen CoCrMo Partikel wurden rund 50 nm (Standardfehler von 3,56) im Durchmesser, wie durch TEM (Abbildung 2) quantifiziert. Nach Exposition der Maus Calvarias CoCrMo Teilchen, die Tiere (n = 6 pro Gruppe) wurden für weitere zwei Wochen beibehalten. Innerhalb der zwei Wochen der calvarial Schnitt war vollständig geheilt, und die Naht kann fallen. Keine lokale Infektion oder Pseudarthrose Mai Knochen Verlust Bewertung beeinflussen. Nach Maus Opfer wurden Calvaria Proben geerntet. Dann war das weiche Gewebe sanft geklärt und Mikro-CT wurde verwendet, um den Verlust an Knochenmasse zu quantifizieren. Dreidimensionale Rekonstruktion Bilder und repräsentative koronale Fotos am Querschnitt verzeichneten erheblichen Knochenverlust Mäuse behandelten mit CoCrMo Teilchen (Abbildung 3). Mineralische Knochendichte (BMD), Knochen Volumen/Gesamt Volumen (BV/TV), trabekuläre Anzahl (Tb.N) und trabekuläre Dicke (Tb.Th) waren deutlich reduziert, während insgesamt Porosität und trabekuläre Trennung/Abstand (Tb.Sp) in die CoCrMo erheblich erhöht wurden Gruppe im Vergleich mit der Kontrolle und Sham Betrieb Gruppen (Abbildung 4). Student t-Test wurde zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Gruppen und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Darüber hinaus bestätigt die H & E Färbung von Calvaria Abschnitte Knochenverlust bei Mäusen mit CoCrMo Partikel (Abbildung 5) behandelt.
Abbildung 1 : Schaltplan des Partikel-induzierte Osteolyse (PIO) Mausmodells. Die linke Seite zeigt die Position des Mauszeigers in der Modellierung. Zeigen Sie (A) Lokalisierung. Die Halbsummen zwischen den beiden Augen und Ohren, beziehungsweise bestimmen, und Einschneiden der Haut entlang der Linie zwischen ihnen. Setzen Sie (B) und entfernen Sie die Craniale Periost aus der Calvaria. (C) einbetten CoCrMo Partikel Aufhängung in der Mitte der Calvaria. (D) Naht Haut in einfachen unterbrochenen Naht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Transmission Electron Microscopy Scannen von CoCrMo Partikel. (A) repräsentative Transmission Electron Microscopy Bilder CoCrMo Partikel. (B) Partikelgrößenverteilung CoCrMo Teilchen wurde mit der Software quantifiziert. Jeder Balken repräsentiert Frequenz normiert auf die Gesamtzahl der Partikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Mikro-CT-Analyse mit 3-dimensionalen Rekonstruktion von Proben aus Kontroll-Mäusen und diejenigen mit PBS (Schein-Betrieb) und CoCrMo Partikel behandelt. Die weiße horizontale Linie zeigt die Position des Bildes Querschnitt. Der weiße Pfeil zeigt Knochenverlust im Gruppenrahmen CoCrMo-Implantation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Quantitative Analyse von Mikro-CT-Aufnahmen nach dreidimensionale Rekonstruktion. Quantifizierung der Bone Mineral Density (BMD) (A), Volumen/Gesamt Knochenvolumen (BV/TV) (B), Anteil der gesamten Porosität (C), trabekuläre Anzahl (Tb.N) (D), trabekuläre Dicke (Tb.Th) (E), und trabekuläre Trennung/Abstand (Tb.Sp) (F), Mean±standard Fehler. Student t-Test wurde zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Gruppen mit p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. **, P < 0,01; , P < 0,001. n = 6 Mäuse pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Repräsentative Bilder der H & E Färbung von Calvaria Proben (10 ×) von Kontrollmäusen und diejenigen mit PBS (Schein-Betrieb) und CoCrMo Teilchen behandelt. Roter Pfeil zeigt Osteolyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es gibt zwei Hauptmethoden für Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse bei Mäusen: die Luft-Beutel und das Modell calvarial Osteolyse. In der Luft-Beutel-Modell wird zuerst ein subkutan erzeugte Luft-Beutel hergestellt, gefolgt von Abnutzung Partikel Einführung und Implantation in die Knochen Gewebe8. Die Beutel Wand imitiert das Periost in aseptische Lockerung. Implantation von Knochen ist jedoch nonvascular ohne biologische Aktivität, wodurch es schwierig zu beurteilen, direkte Wechselwirkungen zwischen Teilchen und Knochengewebe. Das calvarial Osteolyse Modell hat mehrere Vorteile gegenüber der Luft-Beutel-Pendant. Erstens sind Abriebpartikeln direkt ausgesetzt die Calvaria, die es ermöglichen, Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln zu beurteilen und Knochen Homöostase, einschließlich Knochenabbau und Osteoblasten, Osteoklasten und Makrophagen Aktivitäten9,10 . Zweitens sind quantitative Messungen des Knochenverlustes erhältlich, so dass die Beurteilung der verschiedenen Lösungsansätze genetische und biologische Arbeitsstoffe in Knochen Verlust Prävention11. Drittens ist es möglich, das Verhältnis von Abriebpartikeln und Knochenverlust in verschiedene genetische Hintergründe, einschließlich der transgenen und gen Knockout Mäuse12,13zu bewerten. Viertens kann es verwendet werden, eine große Anzahl von Verbindungen in verschiedenen Dosierungen auf den Bildschirm. Allerdings die Erfolgsquote des Modells Traditionalcalvarial Osteolyse ist relativ gering, und mit Knochen Histomorphometrie Osteolyse messen die Ergebnisse weniger objektive1macht.
Zur Verbesserung der Erfolgsquote des Modells und Ergebnisse objektiver zu machen, wurden einige Änderungen vorgenommen. Zunächst wurden nanoskalige Partikel verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen der Calvaria verbessern und Verschleißpartikel. In der Tat, die Interaktionen zwischen nanoskaligen Partikeln und die Calvaria ist erhöht im Vergleich zu kommerziell Legierung Partikel mit einem mittleren Durchmesser von 1,5 µm14,15. Zweitens wurde ein 1,0 cm-2 -Gebiet auf die Calvaria abgegrenzt, um ausreichende Belichtung der Calvaria zu erreichen. Drittens, Mikro-CT und dreidimensionale Rekonstruktion wurden verwendet, um Verlust der Knochenmasse zu quantifizieren.
Es gibt mehrere Einschränkungen des gegenwärtigen Modells. Erste, Mikro-CT-Geräte für Mäuse ist nicht zugänglich für Forscher und Techniker sind für Scannen und dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich. Zweitens die CoCrMo-Nanopartikel verwendet des gegenwärtigen Modells sind nicht im Handel erhältlich, und ihre Produktion stützt sich auf die Unterstützung von Materialwissenschaft Techniker. Drittens wird dieses Modell repräsentiert nicht chronische Effekte von Partikeln auf die Knochenmasse und fehlt nicht-biologischen Faktoren im Zusammenhang mit Osteolyse, wie oszillierende Flüssigkeitsdruck oder mechanische Kräfte. Die Wirksamkeit des Modells konnte mit Hilfe von nanoskaligen Partikeln und genug Exposition der Calvaria deutlich gesteigert werden. Knochenverlust kann quantifiziert werden, und objektivere Daten mit Mikro-CT.
Ein murinen calvarial Osteolyse Modell gegründet durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen CoCrMo Partikel und verschiedene Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptischen Lockerung zu beurteilen. Darüber hinaus kann eine Reihe von Medikamenten über deren Auswirkungen auf die aseptische Lockerung mit Hilfe dieses Modells getestet werden.
Es gibt viele wichtige Schritte dieses Verfahrens. Die erste ist die Anwendung der CoCrMo Nanopartikel mit einem mittleren Durchmesser von 50 nm. Zweitens wurde die ausreichende Belichtung der Calvaria erreicht. Eine 1,0 cm-2 -Gebiet auf die Calvaria genügte in diesem Modell, und der Knochenhaut auf die Calvaria sollte sorgfältig und vollständig zerlegt werden. Eine klare Dissektion der Knochenhaut intensiviert die Wechselwirkungen zwischen den Teilchen und Calvaria. Drittens ist eine quantitative Messung des Knochenverlustes von Mikro-CT möglich. Quantitative Messungen des Knochenverlustes aus drei dimensionale Rekonstruktion, wie BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp und Prozentsatz der gesamten Porosität, erleichtert die Knochen Verlust Unterschiede in verschiedenen Behandlungen unterscheiden und solide nachweisen im Vergleich zu den traditionellen Knochen Histomorphometrie Osteolyse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (81572111), der klinischen Wissenschaft und Technologie Projekt Stiftung der Provinz Jiangsu (BL2012002), der wissenschaftlichen Forschung Projekt Nanjing (201402007), die Naturwissenschaft unterstützt. Gründung der Provinz Jiangsu (BK20161385), und die besondere Gründung der Chinese Medical Doctor Association (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
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