Summary
本稿では、摩耗粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための理想的な動物モデルを構成する CoCrMo 粒子への暴露によってマウス頭蓋骨融解モデルについて説明します。
Abstract
摩耗粒子誘起融解は無菌ゆるみ、膝関節障害の主な原因が、基になるメカニズムは不明のまま。長いフォロー アップ必要な検出と散発的な発生のためのための臨床例で病原性 ofparticle 誘起融解を評価することは難しい。したがって、最適な動物モデルはさらなる研究の必要があります。CoCrMo 粒子への暴露によって確立された頭蓋骨の融解のマウスモデルは粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための効果的かつ有効なツールです。このモデルで CoCrMo 粒子は最初高真空 3 電極直流電流によって得られ、リン酸緩衝生理食塩水 50 Mg/ml の濃度で再停止されます。政教分離によって頭蓋骨膜シャープ郭清後、結果の懸濁液を 50 μ l 添加されたマウス頭蓋骨の中央に適用されます。2 週間後、マウスが犠牲になったし、頭蓋骨標本が収穫されました。ヘマトキシリンとエオシン染色とマイクロ コンピューター断層撮影による定性的および定量的な評価を行った。このモデルの長所は、手順のシンプルさ、骨の損失の定量的評価、融解開発、遺伝子の潜在的な使用またはノックアウト モデル、および比較的安価の速さ。ただし、このモデルは機械的な力と無菌ゆるみにおける粒子の慢性的な影響を評価するために使用することはできません。CoCrMo 粒子への暴露によって生成されたマウス頭蓋骨融解モデルは、摩耗粒子と様々 な細胞、例えばマクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞や破骨細胞、無菌を緩める間の相互作用を評価するための理想的なツールです。
Introduction
最も一般的な原因は、無菌を緩める (THA) 人工股関節、人工膝関節全置換術 (TKA) 障害の修正手術1必要があります。ただし、基になるメカニズムは、不明2残ります。長期フォロー アップが必要検出粒子誘起融解、その発生はまれです。したがって、臨床症例でその病因を探ることは難しい。したがって、細胞およびティッシュの複雑なメカニズムに焦点を当ててさらなる研究が必要で両方生体内で実験摩耗粒子誘起融解モデルおよび生体外の試金骨の恒常性3に関係する細胞です。有効な動物モデルは、さらに細胞試金のための証拠を提供する骨の損失に及ぼす摩耗粒子を明らかに重要です。
CoCrMo 粒子への暴露によって作成したマウス頭蓋骨融解モデルは粒子と無菌を緩める様々 な細胞間の相互作用を評価するための効果的かつ有効な方法です。このモデルでは、CoCrMo 粒子は、マクロファージの炎症性サイトカインを誘導し破骨細胞を活性化、骨芽細胞の増殖を阻害する、骨芽細胞のアポトーシスを促進して頭蓋骨の融解を引き起こします。
このモデルを確立する 2 週間たった。融解の可視化し、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色による定量化マイクロ計算された断層レントゲン写真撮影 (マイクロ CT)2することができます。さらに、このモデルは、比較的低コスト、トランスジェニック、ノックアウト マウス モデルは様々 な用量3化合物の数が多いを画面に使用できます。
確立し、このモデルを評価する手順は簡単です。まず、CoCrMo 粒子に高真空 3 電極直流電流によって得られ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 50 mg/mL の濃度で再停止されます。政教分離によって頭蓋骨膜シャープ郭清後、結果の懸濁液を 50 μ l 添加されたマウス頭蓋骨の中央に適用されます。2 週間後、マウスが犠牲になったし、頭蓋骨のサンプルを採取しました。H & E 染色及び CT による定性・定量分析を行った
CoCrMo 粒子への暴露によって作成したマウス頭蓋骨融解モデルは CoCrMo 粒子、マクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、無菌を緩めるなどの様々 な細胞間の相互作用を評価するための理想的なツールです。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 南京大学によって承認されています。
1. CoCrMo 粒子の作製
- 作製した高真空 3 電極直流4CoCrMo 粒子を取得します。現在 10-3 Pa の真空、0.04 MPa アルゴン、水素 3:2 (v/v)、下で楽器の CoCrMo 合金と 650 A 陰極を配置します。
- CoCrMo 粒子の直径を測定します。
- 1.5 mL の無水エタノールに CoCrMo 粒子の 1 mg を追加します。
- 28 kHz、600 W 5 分の超音波振動による CoCrMo 粒子を無水エタノールで再懸濁します。
- 透過電子顕微鏡 (TEM) の目的のテーブルに生成される懸濁液の一滴 (約 20 μ L) を適用します。一連の 200 kV 加速電圧と 0.24 nm 分解能の TEM 写真をキャプチャします。
- 付属のソフトウェアを使用して、TEM 顕微鏡写真の平均直径と粒度分布を計算します。
- エンドトキシンを消毒します。
- オートクレーブで 121 ° C、15 psi 15 分の粒子の 50 g。
- カブトガニ含まライセート (ラル) 定量によるエンドトキシンの検出 (< EU/mL はエンドトキシンの不在を示すと考えられた 0.25%)5。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 原液6として 50 mg/mL の濃度で粒子を再懸濁します。
2. 頭蓋骨融解モデルの構築
- 6 週古い C57BL/J6 マウス (グループごと 6 マウス) withpentobarbital (50 mg/kg) を麻酔します。ピンチのテストを使用すると、麻酔のレベルを評価します。通常生理食塩水で目の乾燥を防ぐ。
- 傾向がある位置にマウスを配置します。髭剃りと頭蓋に毛皮を削除し、75% のエタノールを含む医療脱脂綿を使用して皮膚を消毒します。
- ポイントのローカリゼーションの 2 つの目と耳の間の中点をそれぞれ含む 2 つの点を識別します。上記の点を 2 つのラインを決定し、ハサミ (図 1 a) 上記のラインに沿って皮膚を切開します。
- メス (図 1 b)6と頭蓋骨から頭蓋骨膜を削除します。
- 簡単な縫合と両端に皮膚を縫合します。
- 切開部を縫合線を作る結びなし。縫合線の両端を保持します。
- Calvarias (図 1)2の途中で CoCrMo 粒子懸濁液 (PBS で 50 mg/mL) の 50 μ L を埋め込みます。
- 簡単な縫合 (図 1) 内で最後のステッチを結び目。
- 別の 2 週間のマウスを維持します。
3. マイクロ Ct で頭蓋骨融解モデルの評価
- 二酸化炭素とマウスを犠牲に。水平面内マウスの首をはねます。内部では、脳組織と皮膚を削除し、毛皮の外。さらに実験の calvarias を収穫します。
- 軽くピンセットで、頭蓋骨にすべての軟部組織をオフにします。マイクロ CT スキャンの前に PBS の 24 h で calvarias 24 時間浸 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドでクリアの calvarias を修正します。
- 18 μ m の等尺性解像度と 45 の x 線エネルギー設定で高分解能マイクロ CT を用いたマウス calvarias を分析 kV と 550 mA。
- ソフトウェアとマイクロ CT データの三次元再構成を行います。
- 定性・定量分析。
- まず、関心領域として正中縫合糸の周りの正方形の領域を選択します。
- 第二に、骨のミネラル密度 (BMD) の測定、骨量/総ボリューム (BV/TV)、骨梁数 (Tb.N)、骨梁の厚さ (Tb.Th)、海綿分離/間隔 (Tb.Sp)、マイクロ CT の提供されたソフトウェアと総気孔率の割合
- 第三に、一方向の分散分析による様々 な測定の 3 つのグループを比較します。事後分析の分散、ボンフェローニの方法2が適用されます。
4. H & E 染色による頭蓋骨融解モデルの評価
- 15% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の頭蓋冠由来サンプルをめし-4 ° C で PBS脱灰液に 3 週間毎日を変更します。
- 2 cm × 1 cm × 1 cm キューブのパラフィンで脱灰試料を埋め込み、粒子沈着の領域で 2 μ m のセクションにそれらをスライスします。
- ヘマトキシリンでセクションを汚し、エオシン前述した7。
- 光学顕微鏡検査によって全体的な pathomorphism の顕微鏡写真をキャプチャします。
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Representative Results
社内生産ナノスケール CoCrMo 粒子が約 50 nm (3.56 の標準誤差) 直径、量 TEM (図 2)。マウス calvarias の CoCrMo 粒子、動物への暴露後 (n = グループあたり 6) 別の 2 週間を維持されました。2 週間以内頭蓋骨切開は、完全に癒されましたし、の縫合が落ちることがあります。任意の局所感染や偽関節 5 月骨損失の評価に影響を与えます。マウス犠牲後頭蓋冠由来サンプルが収穫されました。すべての軟部組織が優しく晴れたし、マイクロ CT は、骨の損失を定量化に使用されました。三次元再構成画像と断面で代表的なコロナの写真の両方で、重要な骨の損失 CoCrMo 粒子 (図 3) を投与したマウスで観察されました。骨のミネラル密度 (BMD)、骨のボリューム/総ボリューム (BV/TV)、骨梁数 (Tb.N)、骨梁の厚さ (Tb.Th) は有意に小さく全孔隙率と骨分離/間隔 (Tb.Sp) が有意に、CoCrMo で増加中群制御と偽の操作グループ (図 4)。スチューデント t 検定はグループと p の違いを評価するために使用された < 0.05 は、統計的に有意と考えられていた。さらに、H & E 染色頭蓋骨セクションの CoCrMo 粒子 (図 5) を投与したマウスの骨量の減少を確認しました。
図 1: 粒子誘起融解 (PIO) マウス モデルのスケマティック。左側は、モデリングでマウスの位置を示しています。(A)は、ローカリゼーションをポイントします。それぞれ、2 つの目と耳との間の中間点を決定し、それらの間の線に沿って皮膚を切開します。(B)を公開し、頭蓋骨から頭蓋骨膜を削除します。(C)埋め込む CoCrMo 粒子懸濁、頭蓋骨の真ん中に。(D)は、単純な縫合で皮膚を縫合します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: CoCrMo 粒子の透過電子顕微鏡スキャンします。(A) CoCrMo 粒子の代表的な透過電子顕微鏡像。(B)ソフトウェアの CoCrMo 粒子の粒径分布の定量化を行った。各バーは、パーティクルの総数に正規化周波数を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: PBS (間歇) と CoCrMo 粒子コントロール マウスおよびそれらからのサンプルの 3次元マイクロ CT 解析が扱われます。白い水平の線は、断面画像の位置を示します。白い矢印は、CoCrMo 注入群の骨の損失を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 三次元再構成後のマイクロ CT 画像の定量解析します。骨ミネラル密度 (BMD) (A)、骨量/総ボリューム (BV/テレビ) (B)、総気孔率(C), 骨梁数 (Tb.N) (D), 骨梁の厚さ (Tb.Th) (E)の割合の定量化と骨梁分離/間隔 (Tb.Sp) (F) 、mean±standard エラーが発生します。スチューデント t 検定 p のグループ間の違いを評価するために使用された < 0.05 を有意と見なされます。* *、P < 0.01;、P < 0.001。n = グループあたり 6 マウス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: コントロール マウスから頭蓋骨のサンプル (10 ×) の H & E 染色の代表的な画像処理 PBS (間歇) CoCrMo 粒子と。赤い矢印は、融解を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
摩耗粒子誘起融解マウスの 2 つの主な方法がある: 空気袋モデルと頭蓋骨融解モデル。空気袋モデルで生成された皮下の空気袋は最初設立、骨組織8に摩耗粒子導入と注入が続いてポーチ壁は、無菌を緩める骨膜を模倣します。ただし、骨移植は粒子と骨組織との直接の相互作用を評価するために難しくありませんの生物学的活性を持つ非血管性。頭蓋骨融解モデルには、空気袋相手にいくつかの利点があります。まず、摩耗粉は、直接摩耗粒子間の相互作用を行い、骨の恒常性は、骨吸収と骨芽細胞、破骨細胞とマクロファージの活動9,10 を含むこと、頭蓋骨にさらされています。.第二に、骨の損失の定量的測定が骨損失予防11のさまざまな潜在的な遺伝子解析と生物学的製剤の評価することが可能。第三に、摩耗粒子と様々 な形質転換などの遺伝的背景や遺伝子ノックアウト マウス12,13における骨量減少との関係を評価することが可能です。第四に、それは多数の様々 な用量で化合物をスクリーニングするために使用できます。Traditionalcalvarial 融解モデルの成功率が低いし、融解を測定する骨強度を使用する客観的1以下の結果になります。
モデルの成功率を改善しより客観的に結果を描画、いくつかの変更がなされました。最初に、ナノ粒子は、頭蓋骨との間の相互作用を高め、摩耗粒子に使用されました。確かに、ナノスケール粒子と、頭蓋骨との間の相互作用は、市販合金粒子、1.5 μ m14,15の平均直径と比較して強化されています。第二に、頭蓋骨骨上 1.0 cm2の領域は、頭蓋骨の十分な露出を達成するために区切られました。第三に、マイクロ CT と 3次元の再建は、骨の損失を定量化に使用されました。
現在のモデルのいくつかの制限があります。マウスの最初、マイクロ CT 装置は、研究者に広く利用可能ではない、スキャンや 3次元の復興に必要な技術者。第二に、現在のモデルで使用される CoCrMo ナノ粒子、市販は、彼らの生産は材料科学技術者からのサポートに依存しています。第三に、このモデルは、慢性骨量に及ぼす粒子を表さない、振動流体圧または機械力などの融解に関連する非生物要因に欠けています。モデルの有効性が大幅に増加をナノ粒子の助けと、頭蓋骨の十分な露出。骨の損失を定量化することができるとより客観的なデータを用いてマイクロ CT
CoCrMo 粒子への暴露によって確立されたマウス頭蓋骨融解モデルは CoCrMo 粒子、マクロファージ、線維芽細胞、骨芽細胞、無菌を緩める破骨細胞など別の細胞間の相互作用を評価するために理想的なツールです。さらに、このモデルを使用して無菌ゆるみ効果の薬のシリーズをテストできます。
この手順の多くの重要なステップがあります。最初は 50 の平均直径の CoCrMo ナノ粒子の応用 nm。第二に、頭蓋骨骨の十分な露出を実現しました。頭蓋骨骨上 1.0 cm2の領域このモデルで十分、慎重にそして完全に、頭蓋骨の骨膜を解剖する必要があります。骨膜の明確な郭清は、粒子と頭蓋骨との間の相互作用を強めます。第三に、マイクロ CT による骨損失の定量的な測定が可能です。三次元再構築、骨密度、BV/テレビ、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、全孔隙率の割合などから骨の損失の定量的測定は様々 な治療法で骨の損失の違いを区別しやすくし、の固体証拠を提供伝統的な骨強度と比較して融解。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、中国の国家自然科学基金 (81572111)、臨床科学技術プロジェクト財団の江蘇省 (BL2012002)、南京の科学研究プロジェクト (201402007)、自然科学に支えられました。江蘇省 (BK20161385) の基礎と中国医師協会 (2015COS0810) の特別な基礎。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
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