Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 2, 1
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Summary

وهدف البروتوكول تقديم إجراء محسنة لإنشاء في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) نموذجا يستند إلى خلايا المخ الخنزيري الابتدائي غشائي (ببيكس). نموذج يظهر إمكانية تكرار نتائج عالية، ضيق عالية، وهي مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا في اكتشاف الأدوية.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول ويعرض إجراء أمثل لتنقية وزراعة ببيكس و في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) وضع نماذج تستند إلى ببيكس في مونو-الثقافة (MC)، مولودية مع مكيفة astrocyte المتوسطة (ACM)، و عدم الاتصال ثقافة المشارك (NCC) مع أستروسيتيس من الخنزير أو الفئران المنشأ. ببيكس كانت معزولة ومثقف من شظايا من الشعيرات الدموية من كورتيسيس الدماغ من الخنازير المحلية 5-6 أشهر من العمر. تم تنقية هذه الأجزاء بعناية بإزالة السحايا والعزلة وتجانس المادة الرمادية، والترشيح، والهضم الأنزيمي، والطرد المركزي. لمواصلة القضاء على الخلايا تلويث، كان مثقف الشظايا الشعرية مع المحتوية على بوروميسين المتوسطة. عند روافد 60-95%، كانت باساجيد ببيكس المتزايد من الشظايا الشعرية لإدراج تصفية نفاذية الأغشية والمنشأة في النماذج. زيادة حاجز ضيق والنمط الظاهري مميزة BBB من ببيكس، تعامل الخلايا مع عوامل التمايز التالي: غشاء بيرمينت 8-CPT-المخيم (مخيم المختصر هنا) والهيدروكورتيزون المانع فوسفوديستريس، رو-20-1724 (RO). الإجراء الذي أجرى خلال فترة من 9-11 يوما، وعند إنشاء نموذج لجنة التنسيق الوطنية، أستروسيتيس كانت مثقف 2-8 أسابيع مقدما. التقيد بالإجراءات الموصوفة في البروتوكول قد سمح بإنشاء طبقات بطانية ذات النفاذية باراسيلولار مقيدة للغاية، ومع لجنة التنسيق الوطنية نموذج عرض ترانسيندوثيليال متوسط مقاومة كهربائية (طير) 1249 ± 80 سم Ω 2، وباراسيلولار نفاذية (فالتطبيق) "إبليس الأصفر" من 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 سم-1 ثانية (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 55). أظهرت مزيد من التقييم لهذا النمط الظاهري المجلس التعبير الجيد عن كلودين البروتينات هالة ضيق 5، زوي-1، كاتينين p120 البروتين مفرق أوككلودين وأدهيرينس. ويمكن استخدام نموذج عرض لمجموعة من دراسات BBB في الصحة والمرض، ومع نفاذية باراسيلولار الشديدة التقييد، وهذا النموذج مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا.

Introduction

البنية الخلوية ووظيفة حاجز الدم في الدماغ

في واجهة جهاز الدورة الدموية والمركزي العصبي (CNS)، أعمال BBB كموقع تنظيمية رئيسية للسيطرة على هومووستاتيك المكروية الجهاز العصبي المركزي، هو أمر ضروري لوظيفة مناسبة وحماية للجهاز العصبي. هو موقع BBB خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية. في الشعيرات الدموية في الدماغ، تشكيل خلايا بطانية تقاطعات ضيق بين الخلايا المعقدة وأنماط التعبير بقوة الاستقطاب من الناقلين تدفق و efflux خاصة ضمان النقل جزيئية محددة للغاية بين الدم و الدماغ 1. العناصر الهيكلية للمجمعات مفرق ضيق تشمل البروتينات من الأسرة أوككلودين وكلاودين، أوككلودينس زونولا (زوي) البروتينات، سينجولين، وترتبط جزيئات الالتصاق هالة (المربيات). 5 كلودين مهم بشكل خاص في تقييد هالة باراسيلولار. التعريفي، والحفاظ على هذا النمط الظاهري غشائي BBB مميزة تنطوي على التفاعلات الديناميكية مع الخلايا المحيطة بها، بما في ذلك بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية والأغشية الطابق السفلي، الذي جنبا إلى جنب مع الدماغ غشائي الخلايا النموذج نيوروفاسكولار وحدة (NVU)2،3. الآليات التي تشارك في هذه التفاعلات لا بعد فهم فهما كاملا، ولكن تشمل تبادل الإشارات الكيميائية بين الخلايا، والذي يسمح بتحوير نفاذية BBB في الأجل القصير والحث على ميزات BBB طويل الأجل4. Astrocytes خاصة معروفة للمساهمة في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ وهي مصدر للعوامل التنظيمية مثل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة عامل (يؤثر في مخيم داخل الخلايا)5، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية6، الهيدروكورتيزون7، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)8. بيد أن تأثير TGF-β، كانت موضع نقاش9.

من في فيفو إلى في المختبر BBB

في فيفو دراسات عن الاستمرار في تقديم معلومات قيمة عن البيولوجيا BBB. ومع ذلك، نماذج الثقافة خلية يمكن تقدم أفكاراً إضافية وتشكل أدوات مفيدة لفهم الجوانب الجزيئية ووظيفية مفصلة من BBB في الصحة والمرض. على الرغم من صعوبة تحقيق كامل في نماذج في المختبر التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا والمكونة من BBB، كان هناك، منذ أول تنقية خلايا الدماغ بطانية وتطبيق هذه في مونو-الثقافات 10 , 11 , 12، وتنمية واسعة النطاق لتنقية إجراءات وشروط النمو من BBB الخلية نماذج الثقافة، أدى إلى تشابه أكبر للحاجز في فيفو . الخلايا الأولية من أصل القوارض والخنزير والأبقار، وفي خطوط الخلايا مخلدة تستند النماذج BBB استخداماً في المختبر . يحتوي كل نموذج مختلف المزايا والعيوب. لاختيار نموذج والمقارنة، تستخدم علامات التحقق من الصحة مثل التعبير عن الإنزيمات BBB والناقلين والمستقبلات والبروتينات الهيكلية لإنشاء لمحات عامة عن النماذج المتبعة حاليا1.

وهدف البروتوكول

هو إحدى السمات الهامة ل BBB حاجز ضيق وطير عالية، ومع ذلك عدد كبير من النماذج المتاحة لا تعكس جيدا على مستويات في فيفو . إدراج مساهمات التنمية والتحسين من عدة مختبرات، والهدف من هذا البروتوكول تقديم أسلوب لإنشاء نموذج طير عالية في المختبر BBB استناداً إلى ببيكس الأولية في MC مع أو بدون أية سي أم، أو في لجنة التنسيق الوطنية مع الابتدائية أستروسيتيس الفئران أو أصل الخنزير. وتشمل الجهود الرامية إلى القضاء على خلايا تلويث وتحسين تمايز ببيكس في النمط الظاهري BBB الإجراءات التطبيقية وإنشاء نموذج. وقد نتج عن هذا العمل في إنشاء نماذج طير موثوقة وعالية مع باراسيلولار منخفضة النفاذية وحسن التعبير الوظيفية الرئيسية البروتينات هالة ضيقة والناقلين، ومستقبلات. بيد كما astrocytes عاملاً مساهما في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ، تمثل ثلاثة شروط مختلفة للثقافة تعمل مختلف ثلاث خلايا غشائي الدماغ. نموذج NCC مفيدة على وجه الخصوص لإجراء دراسات لبعض الآليات المتخصصة التي تشارك في اكتشاف المخدرات، ودراسات النقل والاتجار بها داخل الخلايا، وكذلك للتحقيق من التفاعلات خلية خلية حيث التعبير القصوى من الميزات BBB فائدة.

أصل وتاريخ البروتوكول

نموذج المجلس الموصوفة هنا يستند أساسا إلى نموذج الخنزيري الذي وضع في "مختبرات وايساي" (لندن) الدكتور لويز مورغان والزملاء، استناداً إلى نجاح سابق الدماغ بقرى خلية بطانية نموذجي13whichis. طريقة إعداد الخلية الأصلي كان ترشيح مرحلتين استخدام النايلون تنسجم للقبض على ميكروفيسيلس، تليها خطوة سوبكولتورينج لتحسين نقاء. في تطوير الأسلوب سابق، قد تحققت الأمثل BBB النمط الظاهري وحاجز ضيق بالنمو في المتوسط المستكملة، بما في ذلك مواد تحتوي على الأسبستوس. وأدلى المزيد من التعديلات على الأسلوب سكينر R. في مختبر البروفيسور أ. فنادق في مانشستر المملكة المتحدة14،15. الأسلوب الذي اعتمدته مختبر أبوت، لندن بوكل، حيث جعلت باتابينديجي من أبسط بكثير للتحضير بتجنب استخدام astrocytes أو مواد تحتوي على الأسبستوس، والقضاء على خلايا تلويث مثل بيريسيتيس مع بوروميسين. وأكدت الورقات الأولى الحفاظ على نموذج MC العديد من الميزات الهامة في فيفو بي بي بي، بما في ذلك تقاطعات ضيق فعالة ونظم النقل الغشاء بوساطة مستقبلات ترانسسيتوسيس16،17 , 18 , 19 , 20-يوسف س. "في وقت لاحق" مرة أخرى اختبار ثقافة المشارك astrocyte ووجد أنها تحسن كبير طير، حيث أن هذا هو البديل المفضل المستخدمة حاليا في مختبر أبوت21. النموذج الآن تم بنجاح نقل إلى نيلسن م. عرض مختبر في آرهوس، حيث تم إجراء المزيد من التعديلات (هذا البروتوكول)، بما في ذلك تبسيط غراي يهم استخراج واستخدام شبكة واحدة فقط خطوة الترشيح، وخطوة طلاء تصفية واحد الجمع بين الكولاجين وفيبرونيكتين. تستند الإجراءات التطبيقية لعزل الخنزير أستروسيتيس (هذا البروتوكول) البروتوكولات الذي وضعه مختبر Moos ت. في البورغ، وصف Thomsen et al22. في طير وخصائص أخرى للنموذج التي تم إنشاؤها في لندن وارهوس مماثلة، مما يعطي الثقة للفكرة القائلة بأن هذا النموذج سهولة نقلها بين مختبرات ويستجيب جيدا لرصد دقيق وترشيد أسلوب الخطوات. في الواقع، أنشأ يوسف س. الآن نموذج MC في البلاد المدارية (ماليزيا)23، التي تنطوي على مزيد من التكيف للظروف المحلية ومصادر الأنسجة.

مزايا أكثر الأساليب البديلة وحاليا إنشاء النماذج

بالمقارنة مع خلايا الدماغ بطانية المنشأ البقري والقوارض، ببيكس توفر ميزة وجود معدل أقل من الخسارة في فيفو BBB النمط الظاهري بعد عزل24. وعلاوة على ذلك، ببيكس قادرون على تشكيل الحواجز غشائي ضيق نسبيا، حتى عندما تزرع في MC (800 Ω سم2)16 مقارنة بالمستويات المبلغ عنها شيوعاً مونولاييرس خطوط الخلايا مثل bEND.5 و bEND.3 (سم Ω 502) 25 , 26 , 27وسند (300-800 Ω سم2)28،،من2930، و31،29،سيريبيند (سم Ω 5002)32والدماغ الأولية خلايا بطانية للماوس (100-300 سم Ω2)[س] = "xref" > 33،34،،من3536 والفئران (100-300 سم Ω2)37،38. بيد أظهرت طير التبعية على إجراءات تنقية والثقافة. في معظم الحالات، يظهر إضافة مواد تحتوي على الأسبستوس أو الثقافة المشتركة مع astrocytes آثار التفريق في خلايا بطانية وزيادة في ضيق من طبقات غشائي1. ومع ذلك، مع الجهود المبذولة لتحسين ظروف تثقيف، فقط النماذج المستندة إلى الأبقار أظهرت القيم طير قابلة للمقارنة للنماذج المستندة إلى الخنزير (متوسطات 800 Ω سم2 في MC، تصل إلى 2500 Ω سم2 في ثقافة المشارك أستروسيتي)13 39، ،،من4042،41،43،،من4445. كنماذج تستند إلى الدماغ البقري الأولية أظهرت خلايا بطانية تفاوتاً كبيرا، بين وداخل المختبرات14،45،46،،من4748، يمكن أن تكون إمكانية تكرار نتائج قضية. في نموذج المجلس ذكرت هنا، حققت المختبرات المساهمة طير مشابهة جداً وقيم النفاذية باراسيلولار مع تقلب منخفض، على حد سواء في وبين المختبرات. ومن ثم، سيكون من الممكن لمختبرات أخرى إلى إقامة نموذج قوي مع تقلب منخفضة باستخدام الطريقة المعروضة هنا. بالإضافة إلى تكوين طبقات غشائي ضيق، سبق صحة النماذج مع ببيكس بالتعبير عن البروتينات مفرق ضيق ووظيفية BBB الناقلين والمستقبلات والأنزيمات وأظهرت مدى ملاءمتها لمجموعة من الدراسات15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59-وعلاوة على ذلك، تظهر البيانات الترنسكربيتوم غير منشورة في ثقافات ببيكس المشارك الشخصية المتوقعة من الناقلين BBB والمستقبلات (لم تنشر النتائج، نيلسن et al.).

نموذج BBB المستندة إلى الخنزير يتمتع بميزة إضافية الجينوم، والتشريح، وعلم وظائف الأعضاء، وتعكس تطور المرض من الخنازير البيولوجيا البشرية بدرجة أعلى من نماذج أخرى ثابتة ويضم60، التي مواتية صناعة المستحضرات الصيدلانية. كما العقول الخنزير منتج ثانوي مشترك لصناعة اللحوم، أنها تشكل مصدر يمكن الوصول بسهولة للدماغ خلايا بطانية، تقليل عدد الحيوانات اللازمة للتجارب، وتوفير تنقية عالية غلة من المخ الخنزيري واحد. على الرغم من أن زراعة الخلايا الأولية وتنقية تستغرق وقتاً طويلاً إلى حد ما وتتطلب خبرة للتوحيد القياسي في إعداد النموذج، تولد الخلايا الابتدائية نماذج BBB الأكثر موثوقية. خطوط خلية مخلدة لا يمكن أن يكون بديلاً، كخصائص هامة مثل ضيق الحاجز وملامح التعبير الناقل، والتنظيم المكروية لا تعكس النتائج التجريبية في فيفو61، 62-تقديم نماذج في المختبر وميزة خلية يعيش التصوير بدقة أعلى، مما يجعل من الممكن تصور للعمليات داخل الخلايا بالسماح لاتباع نهج مقربة إلى الخلايا عينات أو الملاحظة، باستخدام الأهداف مع تضخم أعلى وأفضل نوعية البصرية63. هذه ليست الحال بالنسبة لاستخدام اثنين-فوتون مجهرية في الحيوانات الحية. وعلاوة على ذلك، توفر نماذج في المختبر القدرة على ترانسفيكت الخلايا، مما يسمح لتصور بروتينات المعلمة والتحقيق في الاتجار بها.

تطبيقات نموذج

وظيفة BBB ليست ثابتة ويمكن أن يكون بشكل حيوي والتضمين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. في الكثير من الأمراض العصبية، بما في ذلك الأعصاب، والالتهابات والأمراض المعدية، واضطراب وزيادة نفاذية BBB يلاحظ64،،من6566،67 . من أجل تقليل ومنع تطور المرض والأضرار اللاحقة، يتم تحديد وتوصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء تحوير BBB أهمية كبرى. وفي هذا السياق، يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج هي في ارتفاع الطلب في صناعة المستحضرات الصيدلانية، وتلعب أدواراً هامة في التنبؤ نفاذية BBB من المخدرات على الجهاز العصبي المركزي وعلاوة على ذلك. يجب عرض نموذج في المختبر أي يخدم كشاشة نفاذية طريقا باراسيلولار تقييدية، والعمارة خلية فسيولوجيا واقعية والتعبير الوظيفي ل آليات نقل68. أثبتت في الدراسات السابقة16،،من1757، وباراسيلولار النفاذية والتعبير عن بروتينات تي جي وجعفر هنا، نموذج عرض يفي بجميع معايير هذه وهي مناسبة لمجموعة من بي بي بي دراسات في كلا الفسيولوجيا العادية وفي علم الأمراض. نقاط قوة طريقة تنقية وزراعة المقدمة تشمل مزيجاً من البساطة وإمكانية تكرار نتائج والقدرة على تضمين أستروسيتيك التأثير الناتج قوية وموثوق بها عالية طير في المختبر BBB نموذجا. لهذا الغرض، أستروسيتيس من الخنزير والفئران أظهرت المنشأ زيادة النمط الظاهري BBB من ببيكس طريقة مماثلة22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على العقول الخنزير كمشتقات صناعة الأغذية الدانمركية. المجازر الدانمركية تحت إشراف صارم ومراقبة وزارة البيئة الدانمركية والأغذية-

ولدت الفئران المستخدمة لعزل astrocytes ويضم الفريق في مرفق الحيوانات المحلية في درجة حرارة المحيطة من 22 درجة مئوية-23 درجة مئوية وعلى دورة ضوء الظلام/ح 12/12 تحت التفتيش البيطري وحسب الدانمركية اللوائح لمختبر الحيوانات. وقد euthanized الفئران قبل أنهم قد ضحى بها وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية على استخدام الأخلاقية للحيوانات (توجيه مجلس الجماعات الأوروبية من 24 نوفمبر 1986؛ 86/609/EEC) والمبادئ التوجيهية الدانمركية. لا يوجد في فيفو تجارب على الحيوانات أو المواد البشرية واستخدمت في هذه التجارب-

ملاحظة: التالي بروتوكول المجلس الرئيسي تصف تنقية (الخطوة 1) والزراعة (الخطوة 2) والقياسات (الخطوة 3) طير. للإعداد للبلدان المتبرعة الصافية مع أستروسيتيس، يرد بروتكول بديل (الخطوة 4) تصف تنقية وزراعة الفئران والخنزير أستروسيتيس.

1-"تنقية الشعيرات المخ الخنزيري"

  1. جمع العقول 8-10 من 5-6-شهرا المحلية الخنازير (مثلاً من المسالخ قريبة) ونقل لهم على الجليد للمختبر. نحن نوصي ببدء الإجراء تنقية التالية ضمن ح 2-3 الإنهاء للحيوان.
  2. ضع العقل المدبر في مقاعد البدلاء تدفق عقيمة وغسلها برفق مع برنامج تلفزيوني 1 لتر في كوب على مدت
  3. بعناية إزالة السحايا من الدماغ واحدة في وقت باستخدام الملقط نصيحة غرامة ونقل أدمغة السحايا خالية أخرى ل 1 كوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد. تمديد الوقت الذي يمكن أن يعقد الإزالة. ينبغي أن يكون الوقت التقريبي الذي يستخدم للدماغ كل 10-15 دقيقة
  4. استخدام مشرط، كشط قبالة المادة الرمادية من الدماغ واحدة في وقت واحد، ونقل المواد المعزولة إلى أطباق بتري (8.8 سم 2) الذي يحتوي على 20 مل "مزيج المغذيات دميم" F-12 (دميم/و-12) على الجليد. عزل كالمادة الرمادية كثير ممكن دون سحب المواد المسألة الأبيض. من خلال حقنه 50 مل دون إبرة لتجزئة الأولية، تشغيل المواد المادة الرمادية. مواصلة لجميع العقول وتجميع المواد التي جمعت المادة الرمادية. تمديد الوقت الذي يمكن أن يعقد الإزالة. ينبغي أن يكون الوقت التقريبي الذي يستخدم للدماغ كل 10-15 دقيقة
  5. نقل مواد متفرقة المادة الرمادية إلى أنبوب مطحنة من الخالطون الأنسجة باليد نسبة 50/50 مع وسائط الإعلام دميم/و-12. مجانسة المواد بجعل 8 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية مع مدقة فضفاضة، تليها 8 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية مع مدقة ضيق. يستمر جميع معزولة قد تم تجانس المواد، ثم نقل هوموجيناتي باستخدام زجاجة 500 مل وتمييع مع دميم/و-12 إلى حوالي 450 مل الحجم الإجمالي-
  6. تصفية هوموجيناتي استخدام زجاجة كاب أزرق 500 مل مع الفلتر و 140 عامل التصفية-ميكرون، وعزل الشعيرات الدموية عن طريق تشغيل الأنسجة من خلال عامل تصفية. استخدام عامل تصفية واحد كل 50 مل هوموجيناتي وتغسل كل مرشح مع دميم/و-12 بعد ذلك.
  7. المكان الشعرية التي تحتوي على مرشحات في أطباق بتري مع حل هضم التربسين/يدتا (2.5% التربسين، 0.1 nM يدتا في برنامج تلفزيوني)، كولاجيناز CLS2 (2,000 U/mL) والدناز 1 (3,400 U/mL) في دميم/و-12. استخدام طبق بتري 1 (8.8 سم 2، حل 20 مل) كل 3 تصفية تنسجم.
  8. وضع أطباق بيتري في 37 درجة مئوية ح 1 على شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة أو إثارة لهم بلطف كل 10 دقيقة. بعد ح 1، يغسل الشعيرات الدموية من عوامل التصفية مع تعليق من طبق بيتري استخدام ماصة 1 مل.
  9. تقسيم التعليق من الأطباق 3 إلى 2 50 مل الأنابيب وتتوقف عملية الهضم بإضافة 10 مل دميم/و-12 لكل أنبوب 50 مل.
  10. الطرد المركزي أن الخلية الإيقاف في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نضح في supernatants وإعادة تعليق كل بيليه في 10 مل من دميم/و-12. إضافة 20 مل مزيد من DMEM/F12 لكل أنبوبة. كرر هذه الخطوة للطرد المركزي مرتين.
  11. السماح الأنابيب يبرد على الجليد لمدة 5 دقائق ونقل الحلول لأنابيب 50 مل جديدة 2-
  12. الطرد المركزي أن الخلية الإيقاف في 250 x ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإعادة تعليق كل بيليه في 8-10 مل (حوالي 1 مل/الدماغ المستخدمة) لتجميد حل يتكون من 10% [دمس] في FBS-
  13. نقل تعليق الخلية إلى كريوفيالس، باستخدام 1 مل كل كريوفيال. وفي المتوسط، على تنقية النتائج في 1 القنينة الواحدة الدماغ المستخدمة، في المتوسط توفير خلايا بطانية لإدراج 12-16. ضع القنينات في مربع تجميد في-80 درجة مئوية على الأقل 4 ح حتى بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تخزين كريوفيالس في كريوتانك مع النيتروجين السائل-
    تنبيه: نيتروجين سائل بدرجات حرارة منخفضة للغاية. يرجى ارتداء حماية ملائمة.

2. زراعة ببيكس الأولية (8-10 أيام)

  1. الثقافة الأولية (3-5 أيام)
    1 يوم
    1. لتحسين شروط مرفق ببيكس، إجراء طلاء قارورة T75 بإضافة إلى حل مع النهائي تركيزات الكولاجين الرابع (150 ميكروغرام/مل) وفيبرونيكتين (50 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س إلى قارورة، التأكد من أن الحل الذي يغطي السطح كله. استخدام 10 مل لكل قارورة T75. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 2
      ملاحظة: الطلاء يمكن القيام بها فقط قبل استخدام أو تصل إلى أسبوع قبل وتخزينها مع برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. لا يجب أن تجف الطلاء، أو لم تعد تشكل سطحاً مرفق ونمو مناسب.
      2. وتستكمل المتوسطة
    2. إعداد 16 مل من النمو المجلس تتألف من دميم/و-12 مع 10% مصل المستمدة من البلازما (PDS) البنسلين (100 U/mL)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) والهيبارين (15 U/mL). الملحق المتوسطة مع بوروميسين (4 ميكروغرام/مل) لتحديد للخلايا البطانية. انتبه إلى أن العلاج بوروميسين يمكن استخدامها فقط لمدة أقصاها 5 أيام-
    3. قاسمة المتوسطة مستعدة إلى وحدات تخزين 6 مل و 10 مل في أنبوبين 15 مل.
    4. جلب قنينة مع الشعيرات الدموية من النتروجين السائل (الخطوة 1، 13)، وذوبان الجليد الشعيرات الدموية باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية أو بإضافة 750 ميليلتر من المتوسط استعداد من قاسمة 6 مل. إذا كان ذوبان الجليد بإضافة المتوسطة، بعناية "الماصة؛" صعودا ونزولاً ذوبان الجليد وتجانسه بتعليق. عندما مذاب، نقل تعليق خلية في المتوسط 6 مل الكوة.
    5. لإزالة التجميد المتوسطة، تدور الشعيرات الدموية إلى أسفل في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
    6. نضح المادة طافية بعناية وإعادة تعليق بيليه في 1-2 مل قاسمة 10 مل. عند إعادة تعليق، نقل الحل إلى متوسط 10 مل الكوة.
    7. نقل تعليق الشعرية إلى قارورة T75 المغلفة والميل بلطف قارورة لضمان التوزيع المتساوي على السطح. ضع قارورة T75 عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
      يوم 2
    8. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، يعد المجلس 10 مل النمو المتوسطة وتستكمل مع بوروميسين (4 ميكروغرام/مل) لأحد T75 قارورة وإجراء تغيير متوسطة. أن تدرك أن جميع الحلول المتوسطة المطبقة على الخلايا يجب أن يكون المعالجون مسبقاً إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، تغيير متوسطة يمكن أن يؤديها 4-6 ح بعد الطلاء عند الشعيرات الدموية ينبغي أن تعلق على السطح. احتضان الخلايا حتى يتحقق التقاء 60-95%، عادة ما تكون من 3-5 أيام من ذوبان الجليد. عدم الوw الخلايا للتوصل إلى التقاء 100% لتجنب إعاقة الاتصال التي يمكن أن توقف الخلية زيادة النمو.
      يوم 4-6
    9. عندما يتم تحقيق كونفلوينسي المطلوب، مرور خلايا بطانية لإدراج نفاذية الأغشية (انظر القسم 2-2). إذا كونفلوينسي المرجوة لم تتحقق في يوم 4، يتم إجراء تغيير في المتوسط. في موعد أقصاه يوم 6، ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا إلى إدراج نفاذية الأغشية. وإذا لم يتحقق كونفلوينسي المطلوبة قبل يوم 6، الخلايا غير مناسبة للاستخدام التجريبي.
      ملاحظة: إعداد أستروسيتيس للبلدان المتبرعة الصافية: عند إعداد نموذج ثقافة المشارك، 2-ينبغي إعداد astrocytes الأسبوع عمره 8 في الثقافة (انظر الجزء 4) لنموذج الثقافة المشارك عن طريق إجراء تغيير متوسطة في اليوم قبل باساجينج خلايا بطانية لإدراج. لكل أستروسيتي الاستعداد جيدا، ميليلتر 1500 من متوسط النمو astrocyte تتألف من دميم انخفاض الجلوكوز تستكمل مع 10% FBS والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، ثم قم بإجراء التغيير المتوسطة-
  2. نمو ببيكس على "نفاذية الغشاء إدراج" (5 أيام)
    يوم 4-6
    1. إدراج تحضير نفاذية الأغشية (لوحة 12-جيدا مع إدراج 1.12 سم 2 مساحة السطح، 0.4 ميكرومتر المسام) ل البذر للمجلس بطلاء مع الكولاجين الرابع (500 ميكروغرام/مل) وفيبرونيكتين (100 ميكروغرام/مل) في ddH 2 ميليلتر O. استخدام ما يقرب من 300 لكل إدراج، والتأكد من أن الحل الذي يغطي كامل سطح المتنامية. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2 للحد أدنى من 2 حاء
    2. إعداد 30 مل من المجلس النمو المتوسطة (لتشكيل وسائل الإعلام، الرجوع إلى الفقرة 2.1.2) دون بوروميسين-
    3. نضح أغسل بلطف مرتين مع 5 مل PBS العقيمة في درجة حرارة الغرفة والمتوسطة من الثقافة المجلس في قارورة T75.
    4. تريبسينيزي الخلايا بإضافة 2 مل من محلول يدتا التربسين (2.5% التربسين، 0.1 nM يدتا في برنامج تلفزيوني) إلى T75، ومكان قارورة على 37 درجة مئوية، 5% CO 2 ل 5-7 دقيقة
    5. لفصل خلايا غشائي الدماغ، واضغط برفق على الجانب من قارورة T75 مع أطراف الأصابع، في نهاية المطاف ترك بيريسيتيس الباقين على قيد الحياة وأقوى إرفاق على سطح قارورة. التحقيق بصريا مفرزة تحت مجهر. عندما يلاحظ مفرزة 80%، وقف تريبسينيزيشن بإضافة 5 مل متوسطة.
    6. نقل الحل خلية إلى أنبوب 15 مل باستخدام الماصة 10 مل وتدور أسفل الخلايا غشائي الدماغ بالطرد المركزي في 250 x ز، 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    7. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في المتوسط 1 مل. عندما علقت، إضافة مل 2 مزيد من المتوسطة تحقيق الحجم الإجمالي إلى 3 مل
    8. حساب عدد الخلايا يدوياً باستخدام خلية العد الدائرة أو خلية تلقائي عد النظام. تعد حلاً خلية 2.2 x 5 10 خلايا/مل المتوسطة، نتج عنه كثافة بذر نهائية 1.1 × 10 5 خلايا/إدراج.
      9. إزالة الحل الطلاء من إدراج نفاذية الأغشية
    9. ونقل 500 ميليلتر من تعليق خلية لكل إدراج. على واحد من إدراج، إضافة المتوسطة فقط واستخدم هذا الإدراج ' تصفية فقط ' التحكم للقياسات طير.
    10. إنشاء خلايا بطانية مولودية, مولودية مع ACM، أو في لجنة التنسيق الوطنية مع أستروسيتيس بالطريقة التالية:
      1. "لمولودية": ميليلتر 1500 إضافة المجلس النمو المتوسطة/الأسبستوس كل من لوحة 12-البئر تحت إدراج نفاذية الأغشية جيدا. مكان إدراج نفاذية الأغشية في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضانها لأيام 2-
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": إدراج نقل إلى الآبار مع astrocytes منتعشة مع متوسط النمو astrocyte في اليوم السابق. مكان إدراج نفاذية الأغشية في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضانها لأيام 2-
        ملاحظة: احذر من استخدام أنواع وسائل الإعلام المختلفة في الآبار السفلي من النماذج الثلاثة-
        يوم 6-8
    11. في اليوم 2، تغيير وسائط الإعلام بشأن إدراج نفاذية الأغشية مع ببيكس. إعداد 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة الواحدة وإدراج، وإجراء التغيير إلى تقليل تعطل طبقة الخلية بعناية. احتضان الخلايا لمدة يومين. انتبه إلى أن يتم إجراء تغيير وسائل الإعلام على إدراج فقط، وليس على الآبار أسفل.
  3. التحفيز مع "عوامل التمايز" (1-2 أيام)
    يوم 8-10
    1. لكل من نماذج مختلفة، وينبغي إعداد تحفيز وسائل الإعلام كما يلي:
      1. ل MC: لكل إدراج والاستعداد جيدا، 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
        MC: إعداد بالإضافة إلى ذلك 1500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
        مولودية مع ACM: ذوبان الجليد ميليلتر 1500 الأسبستوس واستكمالها بمعسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": لكل إدراج، إعداد 500 ميليلتر من المجلس النمو المتوسطة المحتوية على معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر). لكل أستروسيتي جيدا، وإعداد 1500 ميليلتر من دميم/و-12 وتستكمل مع البنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، الهيبارين (يو 15/mL)، معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر).
    2. لكل من نماذج مختلفة، إجراء تبادل وسائل الإعلام كما يلي:
      1. "لمولودية": بعناية نضح المتوسطة من الآبار وإدراج وإضافة متوسطة التمايز إلى كل الأجزاء الأخرى، استخدام 500 ميليلتر لكل إدراج و 1500 ميليلتر لكل بئر. أن تدرك أن تعطل على جانبي للإدراج يمكن أن تؤثر على وتعطيل طبقة الخلية.
      2. "للبلدان المتبرعة الصافية": بعناية نضح المتوسطة من الآبار وإضافة 750 متوسطة التمايز ميليلتر كل بئر. نضح المتوسطة من إدراج وإضافة 500 ميليلتر التمايز المتوسطة كل إدراج بعناية. ثم أضف متوسطة التمايز ميليلتر 750 المتبقية لكل أستروسيتي جيدا.
    3. لجميع الموديلات: وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 واحتضان مع متوسطة التمايز حتى اليوم التالي-
      ملاحظة: يمكن تدرك أن للمركز مع أستروسيتيس، أستروسيتيس من هذه النقطة في المتوسط خالية من المصل.

3. قياسات طير

  1. في اليوم بعد تحفيز الخلايا بالتمايز المتوسطة، إعداد نظام الدائرة قياس مقاومة الأنسجة للقياسات طير قبل الشطف الدائرة مرتين مع ddH 2 س، مرة واحدة مع 70% EtOH لمدة 5 دقائق و 2 مرات أكثر مع ddH 2 أولمبيك
  2. إضافة 4 مل من دميم/و-12 إلى دائرة قياس مقاومة الأنسجة وتوصيله إلى النظام ومعايرة لما يقرب من 30 دقيقة حسب الإعدادات التالية: R = 0، اختبار R = 1000، وضع = ر.
  3. إجراء القياسات طير بعناية وضع تدرج في قاعة قياس مقاومة الأنسجة. لكل إدراج، إجراء قياسات في ثلاث نسخ، وحساب متوسط Ω سم 2.
    ملاحظة: من المتوقع لنموذج الثقافة المشارك، قيم طير للوصول إلى > Ω 500 سم 2. إذا لم يتم التوصل إلى المستوى المناسب طير اليوم الأول لقياس طير، إضافة عوامل التمايز جديدة (معسكر (250 ميكرومتر)، الهيدروكورتيزون (550 نانومتر) وريال عماني (17.5 ميكرومتر)) وقياس طير مرة أخرى في اليوم التالي. عندما يتم تحقيق مستويات مناسبة، ينبغي أن يكون النموذج جاهز للتجربة المزمعة. كن على علم أن الخلايا يجب أن تقع على الأقل 3 ح قبل إجراء التجربة لاسترداد بعد قياسات طير. بعد التحفيز، وقيم طير عموما تظل مقبولة ح 24-48 بعد التحفيز.
    ملاحظة: أسلوب بديل وأسرع باستخدام زوج القطب STX-100 ج جامدة أيضا سجلات طير عالية في هذا النموذج 81. إيلي STX2 مرنةزوج كترودي يعطي قراءات أقل موثوقية.

4. ASTROCYTES التحضير لثقافة عدم الاتصال المشارك: أسلوب بديل

  1. تنقية أستروسيتيس
    1. لكل الفئران الدماغ المستخدمة، معطف قوارير T75 2 بإضافة 10 مل من بولي-L-يسين (5 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س إلى كل قارورة T75. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30
    2. عزلة astrocytes يمكن أن يؤديها كما يلي:
      1. فأر أستروسيتيس:
        1. ديكابيتاتي 2 1-2 يوم من العمر الفئران باستخدام أسلوب معتمدة.
        2. قطع الجلد خارج الجمجمة بدءاً من الرقبة نحو الآنف، وقطع العظام مع شق السهمي.
        3. فتح الجمجمة مع منحنى ملقط وتأخذ بها الدماغ ووضعه في أنبوب 15 مل (أنبوب 1) مع 11 مل من دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS ومع الجنتامايسين كبريتات (125 ميكروغرام/مل).
        4. بعناية إزالة السحايا استخدام الملقط غرامة-نصيحة وتعليق مواد الدماغ باستخدام ماصة 1 مل.
      2. أستروسيتيس الخنزيري:
        1. 1 الحصول على الدماغ من خنزير المحلي البالغ من العمر 5-6 أشهر-
        2. بعناية إزالة السحايا من الدماغ باستخدام الملقط نصيحة غرامة و/أو الأيدي-
        3. ز 4 جمع رمادية المسألة من الدماغ ومكان القطع في 1-2 مل دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% كبريتات FBS ومع الجنتامايسين (125 ميكروغرام/مل) في طبق بتري. إذا كانت القطع كبيرة، فرم مع المشارط أو الملقط.
        4. تعليق المواد المعزولة باستخدام ماصة 1 مل، نقله إلى أنبوب 15 مل (أنبوب 1) والتعبئة مع الجلوكوز منخفضة دميم وتستكمل مع 10% كبريتات FBS ومع الجنتامايسين (125 ميكروغرام/مل) لوحدة تخزين إجمالي 11 مل.
          5. مواصلة المجانسة المواد المعزولة بإبرة طويلة تعلق على حقنه 10 مل
        5. وتعليق صعودا وهبوطاً 3 مرات. انتظر حتى استقروا القطع الكبيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، ثم جمع متوسطة 7 مل من الجزء العلوي من الأنبوب (أنبوب 1)-
        6. تصفية تعليق خلية 7 مل من خلال عامل تصفية نايلون 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل جديدة (أنبوب 2)-
          7. متوسطة
        7. مل 7 إضافة أنبوب 1 مع الدماغ. مواصلة تحقيق التجانس والترشيح من الخطوات 4.1.2.2.5-6 حتى حجم تعليق الخلية التي تم تصفيتها في أنبوب 2 ما يقرب من 35 مل.
    3. إزالة الحل الطلاء من قوارير T75 [خطوة 4.1.1]. غسيل سريع مع 5 مل برنامج تلفزيوني بعد الحضانة مع بولي-L-يسين يمكن استخدامها للتأكد من أن الخلايا هي لا يتضرر أي آثار سمية للحل الطلاء.
      4. تقسيم
    4. والبذور الحل astrocyte معزولة التساوي بين قوارير T75. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية، 5% CO 2 لمدة 3-5 أيام-
  2. أستروسيتيس استزراع وإعداد NCC مع "خلايا بطانية" (3 أسابيع)
    1. الثقافة الأولية
      1. بعد 3-5 أيام للحضانة، إجراء تغيير متوسطة بعناية يسفط المتوسطة وإضافة 10 مل دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS ومع الجنتامايسين كبريتات (125 ميكروغرام/مل).
        ملاحظة: بعد التغيير المتوسطة الأولى المتوسطة يجب تغيير كل 5 أيام. خلال الأسبوعين الأولين، اهتز قوارير وغسل الخلايا تماما مع برنامج تلفزيوني عند تغيير المتوسطة. وهذا يساعد في إزالة تلويث microglia.
      2. بعد 3 أسابيع زراعة، تريبسينيزي الخلايا بإضافة 2 مل من محلول التربسين أدتا إلى الجزء السفلي من كل قارورة T75، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2 ل 5-7 دقيقة
      3. وقف تريبسينيزيشن بإضافة 5 مل متوسطة ونقل حل خلية أنبوب 15 مل والطرد المركزي astrocytes في 250 x g، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
      4. بعناية إزالة المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في تجميد حل يتكون من 10% [دمس] في FBS-
        5. حساب عدد الخلايا
      5. وإعداد حل خلية 4.0 × 10 6 خلايا/مل. تجميد الخلايا في إضافة 1 مل كل قنينة كريوفيالس.
    2. النمو في "نفاذية الغشاء إدراج نظام أسفل الآبار" (2-12 أسبوعا)
      1. إعداد لوحات 12-جيدا لنمو أستروسيتيس بإضافة 1 مل من بولي-L-يسين (5 ميكروغرام/مل) في ddH 2 س لكل بئر. وضع اللوحات في 37 درجة مئوية حاء 2
      2. لكل لوح 12-جيدا، وإعداد 25 مل من أستروسيتي النمو المتوسطة (دميم الجلوكوز منخفضة وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل))-
      3. جلب قنينة أستروسيتيس من النتروجين السائل وإذابة الخلايا بإضافة 750 ميليلتر دميم الجلوكوز منخفضة متوسطة. بدقة "الماصة؛" صعودا ونزولاً ذوبان الجليد وتجانسه بتعليق. عندما مذاب، نقل الخلية-التعليق على أنبوب 15 مل وإضافة المتوسطة إلى إجمالي حجم مل 7-
        تنبيه: نيتروجين سائل درجة حرارة منخفضة للغاية، وحتى ملابس الحماية الشخصية مثل القفازات.
      4. لإزالة التجميد المتوسطة، تدور الشعيرات الدموية إلى أسفل في 250 x ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 7
      5. نضح المادة طافية بعناية وتعليق إعادة الخلايا في المتوسط-
        6. إزالة الطلاء من آبار لوحات جيدا 12
      6. ونقل تعليق خلية إلى الآبار استخدام 1 مل لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
      7. تحديث في المتوسط كل يوم ثالث والثقافة الخلايا للحد أدنى من 2 أسابيع قبل استخدام الخلايا لثقافة التعاون مع خلايا بطانية. يمكن أن تستخدم الخلايا لثقافة المشارك لمدة تصل إلى 12 أسبوعا بعد ذوبان الجليد، مع سن الأمثل حاليا 2-8 أسابيع-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء BBB نماذج في المختبر

في أسلوب عرضها، والأمثل، أجريت زراعة ببيكس وإنشاء نظام إدراج نفاذية الأغشية مع MC أو دون ACM أو NCC مع أستروسيتيس (الشكل 1) لفترة من 9-11 يوما (الشكل 2). لاختيار خلايا بطانية، اقترن ثقافة أولية من الشظايا الشعرية المنقي بالعلاج بوروميسين لمدة أقصاها 5 أيام، والقضاء على معظم الخلايا تلويث وتشجيع نمو الخلايا البطانية على شكل المغزل من الشظايا الشعرية (الشكل 3 ألف-ج). في يوم 4-6، قد تكاثرت ببيكس إلى كونفلوينسي من 60-95%، تنمو غير متداخلة، الخلايا طوليا الانحياز، تحول دون الاتصال. عندما وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي المرجوة، كانت مطلي ببيكس الكولاجين الرابع وفيبرونيكتين نفاذية الأغشية إدراج عامل تصفية الأغشية (1.12 سم2 المساحة السطحية، 0.4 ميكرومتر المسام) في كثافة 1.1 × 105 خلايا/إدراج، المغلفة في التي كانت شكلت مونولاييرس المتلاقية عادة بعد 4 أيام (يوم 8-10 وظيفة العزل). عندما يشترك استزراع ببيكس، كانت مطلي astrocytes الفئران أو أصل الخنزير في الآبار بولي-L-يسين المغلفة الأسفل للحد أدنى من 2 أسابيع قبل بدء لجنة التنسيق الوطنية (3D الشكل). عند إنشاء لجنة التنسيق الوطنية، وقد أظهرت التجربة أن astrocytes مثقف 2-8 أسابيع لتقديم أفضل دعم للنهوض النمط الظاهري BBB في ببيكس؛ خلال هذا الوقت، شكلت astrocytes الثقافات المتلاقية مع الخلايا المرتبة في بنية تشبه قرص العسل (الرقم 3E-F). في يوم 4 في طراز نظام إدراج نفاذية الأغشية (يوم 8-10 وظيفة العزل)، حفز الخلايا مع المخيم، الهيدروكورتيزون وريال عماني لزيادة حاجز ضيق ونمط التعبير مميزة BBB البروتينات هالة ضيقة، ومتعهدي النقل، و مستقبلات.

وصف المجلس النمط الظاهري والنفاذيه باراسيلولار

فحص الخلية البصرية جنبا إلى جنب مع قياس طير يتم بصورة روتينية بالطرق الأكثر موثوقية لتقييم كونفلوينسي وضيق طبقة الخلايا البطانية المتزايد على إدراج نفاذية الأغشية قبل التجارب. ويبين الشكل 4 النتائج من سلسلتين من التجارب لتقييم نفاذية المخدرات جزيء صغير من خلال BBB، المعلمات السيطرة من طير (تعكس نفاذية الأيونية) جنبا إلى جنب مع نفاذية الظاهر21 (فالتطبيق، ق سم-1) أما السكروز راديولابيليد أو الأصفر إبليس الراسم صبغ (LY)، مما يعكس النفاذية باراسيلولار من جزيئات المخدرات صغيرة نموذجية (~ 200-600 دا). مركب اهتمام مع فالتطبيق أكبر مما يمكن أن توحي فالتطبيق السكروز أو LY (اعتماداً على الوزن الجزيئي للدواء) النفاذية ترانسسيلولار و/أو النقل عبر الخلايا. يبين الشكل 4 أن يدرج مع ببيكس مثقف أعلاه astrocytes الفئران، دفعات جيدة من المجلس في نفاذية الأغشية (مثلاً هنا تعيين لي) سينشئ تيرس في نطاق 500-2000 Ω سم2، مع عدد قليل من أعلى أو أدنى. بعض دفعات، خاصة خلال المراحل الأولى من التعلم في البروتوكول، قد يكون تيرس أقل بحوالي 100-900 Ω سم2 (مثلاً هنا تعيين السكروز). قياس طير يسمح اختيار مرشحات، على سبيل المثال مع بدء طير > Ω 500 سم2، وعلى مدى نطاق طير سيظهر، فالتطبيق مستقلة نسبيا عن طير، يدل على طبقة الجدار ضيقة بما فيه الكفاية لهذه التجارب. البروتوكول المتعلق بقياس النفاذية يعتمد على نوع المذاب/التركيب. للحصول على وصف لإجراء قياس نفاذية الجزيئات الصغيرة في لجنة التنسيق الوطنية، يرد بروتوكول في يوسف, ريال, et. ال21. تقييم تعبير البروتينات مفرق ضيق في ببيكس في لجنة التنسيق الوطنية مع astrocytes الفئران أظهرت التعريب كلاودين 5، أوككلودين، وزوى--1 على طول الوصلات خلية خلية، كما يتضح من الفلورة (الشكل 5 ألف-ج). أيضا، أظهرت كاتينين p120 البروتين مفرق أدهيرينس توزيع محددة تحديداً جيدا على طول الوصلات خلية خلية (الشكل 5).

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي لنماذج BBB في المختبر التطبيقي. التمثيل التخطيطي من نفاذية الأغشية إدراج نماذج نظام ببيكس في MC (A)ومولودية مع ACM (ب)NCC مع أستروسيتيس (ج). في المؤتمر الوزاري، طبقت المجلس النمو المتوسطة أو مواد تحتوي على الأسبستوس في الآبار السفلي، بينما في لجنة التنسيق الوطنية، وإدراج مع ببيكس وضعت في الآبار مع أستروسيتيس 2-8 أسبوع من العمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الرسم البياني من الخطوات الرئيسية أثناء زراعة المجلس وإنشاء النماذج المقدمة- لنظره عامة والجدول الزمني للأسلوب، يلخص هذا العرض التخطيطي الخطوات الرئيسية في عملية تثقيف ببيكس وإنشاء النماذج المعروضة، أي MC مع أو بدون مواد تحتوي على الأسبستوس، ولجنة التنسيق الوطنية مع أستروسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: دورة الوقت الممثل الثقافات الأولية من astrocytes ببيكس والفئران. المرحلة التباين مشاهدة الصور مجهرية من ثقافات ببيكس (أ-ج) وأستروسيتيس (د-و) على مدى 5 أيام. تنقية الشظايا الشعرية اليوم الأول للثقافة الأولية أظهرت وجود الشعيرات الدموية وتلويث الخلايا (A، يوم 1)، التي تغير المتوسط بعد يوم 2 ويوم إضافي للنمو، وأظهر اختيار ببيكس، بدء نموها من الشظايا الشعرية (ب، يوم 3). مونولاييرس متكدسة من ببيكس وتحققت عادة في يوم 4-6، في الوقت الذي يظهر على شكل شوكي مورفولوجيا ببيكس وتتمشى طوليا (ج)- Astrocytes الجرذان المصنفة في أسفل الآبار انتشرت عادة لطبقات متكدسة في غضون 5 أيام (د-و)، واستخدمت نماذج NCC بعد 2 أسابيع نمو. شريط مقياس لجميع الصور: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: حرمة مفرق ضيق ببيكس. نفاذية (فالتطبيق) الظاهر ببيكس لعلامات باراسيلولار السكروز (342.5 ميغاواط 14ج-المسمى، 14.8-25.9 جبق/ملمول) ورسم "إبليس الأصفر" (521.57 ميغاواط، 10 ميكروغرام مل-1)، مقابل طير. وقد نمت ببيكس على 1.12 سم2 نفاذية الأغشية إدراج عوامل التصفية أعلاه astrocytes الفئران في قاعدة البئر وعلامات تضاف إلى قاعة قمي. وبعد ساعة واحدة في 37 & #730; ج، وكان ظهور علامة في الدائرة بصل المقاسة وقمي إلى القاعدية فالتطبيق (× 10-6 سم ثانية-1) تحسب. وتم قياس طير > ح 3 قبل تصحيح فالتطبيق، استخدام أقطاب افوم STX100C، لتصفية إدراج فارغة نفاذية الأغشية مع المقاومة 150 Ω. طير متوسط لمجموعة البيانات "الأصفر إبليس" كان 1249 ± 80 Ω سم2 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 55). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: وصف Immunocytochemical ببيكس- ببيكس نمت على 1.12 سم2 نفاذية الأغشية إدراج إدراج عامل تصفية أعلاه astrocytes الفئران في قاعدة البئر، التحليل المجهري الفلورة مكونات مفرق ضيق كلاودين (أ) 5 (ب) أوككلودين (ج) زوي-1، ومفرق أدهيرينس البروتين (د) p120 كاتينين أظهر التعريب واضحة المعالم في تقاطعات خلية خلية وكشف طبقات الخلايا غشائي الدماغ المتلاقية مع الخلايا على شكل عمود الدوران، وغير متداخلة. شريط مقياس لجميع الصور: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تنقية وانتشار للمجلس

أثناء إجراء تنقية، تشمل الخطوات الحاسمة الإزالة السريعة والفعالة للسحايا والفصل بين المسألة الأبيض والرمادي، ومهمة لتنقية الغلة والنقاء وإنشاء النموذج الصحيح. لعرضها في المختبر BBB الطراز باستخدام ببيكس، تحسين وتبسيط إجراء تنقية استناداً إلى تجانس الميكانيكية للمادة الرمادية معزولة، حجم انتقائية التصفية لعزل ميكروفيسيلس، الهضم مع كولاجيناز ، الدناز والتربسين، مع ثقافة الشظايا ميكروفيسيل أولى. بشكل عام، واحداً من التحديات الرئيسية التي تواجه أثناء تنقية وزراعة الخلايا الأولية هو القضاء على الخلايا تلويث. وقد دلت التجربة مع تنقية خلايا غشائي الدماغ الأولية أن إزالة شاملة للسحايا ونتائج المسألة الأبيض في تحسين العائد من الشعيرات الدموية والنقاء، فضلا عن زيادة نمو الخلايا البطانية والتعبير عن بي بي بي الخصائص. ولهذا السبب، حذراً من إزالة السحايا (بما في ذلك داخل سولسي) في عرض بروتوكول يهدف إلى ضمان إزالة الخلايا ليبتومينينجيل (التي تنتجها الخلايا الليفية مثل خصائص)، وكذلك خلايا العضلات الملساء في الشرايين وأرتيريولار، التي تنمو سرعة أكبر من خلايا بطانية في الثقافة. وبالمثل، أدى تدنية المواد المسألة الأبيض أنقى غشائي خلية الثقافات، مع خلايا تلويث أقل المتزايدة من الشظايا الشعرية معزولة. ومع ذلك، تبسيط هذا وسريعة الطريقة المطبقة لعزل يقلل العائد من الشعيرات الدموية المعزولة، والأمثل لعزل المادة الرمادية يمكن تحسين العائد من كل الدماغ بصورة كبيرة. تدرج كثافة، التي يتم تضمينها في بروتوكول تنقية بديلة69، يمكن استخدامها لعزل خلايا بطانية الحرة وتحسين نقاء غشائي خلية، ولكن مضيعة للوقت، ويمكن كذلك انخفاض العائد. كل من هذه الأساليب تنقية المستخدمة على نطاق واسع وتتميز، وتشترك في السمات لتوليد نماذج المجلس طير عالية في مولودية و astrocyte ثقافة المشارك (عادة 500-1500 Ω سم2)7،16، 21،22،،من4957،،من7071.

من أجل إقامة مونولاييرس مع التقييد باراسيلولار عالية، أظهرت التجربة أنه يجب القضاء على بيريسيتيس من الثقافات غشائي16. بيريسيتيس المخ الخنزيري عموما تنمو أسفل طبقات المجلس ولا تسبب ثقوب في طبقات بطانية، كما لاحظ للثقافات من الفئران الدماغ خلايا بطانية72،73. بيريسيتيس في المجلس الثقافات، ومع ذلك، تميل للتأثير على مورفولوجيا الخلايا البطانية، الذي يبدو أوسع ومع الخلية غير النظامية الحدود16. نظراً لأن خلايا المخ بطانية التعبير عن مستويات أعلى من الناقلين efflux (مثل فبروتين سكري) من أنواع الخلايا الأخرى في ميكروفيسيلس، يمكن تخفيض عدد الخلايا تلويث ب العلاج بوروميسين74. بالإضافة إلى ذلك، استخدم المصل المستمدة من البلازما (PDS) بدلاً من العجل الجنين أو الوليد المستمدة تفضل المصل نمو الخلايا البطانية، كما PDS لديها تركيز أقل من عوامل النمو مثل عوامل النمو المشتقة من الصفيحات ونمو الأوعية الدموية غشائي عامل، مما يبين زيادة نفاذية BBB وتحفيز الأوعية14،75،،من7677. بإدخال ثقافة أولية من الشظايا الشعرية معزولة، والجمع بين هذه المعاملة بوروميسين (4 ميكروغرام/مل) واستخدام PDS، نجحنا في تخفيض عدد تلويث الخلايا المتبقية بعد التنقية، إلى حد كبير حيث أنه بعد ذلك بأننا يمكن أن إنشاء مونولاييرس بطانية مشددة على إدراج نفاذية الأغشية. من أجل ضمان المرفق أفضل من خلايا بطانية على أطباق الثقافة واسطح إدراج نفاذية الأغشية، وقد لوحظ أن خليط طلاء من نوع الكولاجين الرابع (من المشيمة البشرية) وفيبرونيكتين يزيد كثيرا من انتشار ولذلك كان يفضل الغلال، وخليط مجتمعة على الطريقة التقليدية باستخدام فقط الكولاجين النوع الأول78.

التفريق بين الخلايا وإنشاء طير عالية في المختبر نموذج BBB

عموما الاحتفاظ ببيكس في MC بي بي بي العديد من الميزات الرئيسية بعد عزلة، حتى أن ثقافة التعاون مع أستروسيتيس ليست ضرورية لحفز تقاطعات ضيق الوظيفية وتحقيق قيم طير عالية16،57. وتشمل الجهود الرامية إلى تحسين الظروف للتفريق بين الخلايا البطانية في النمط الظاهري BBB استخدام المحتوية على مصل المتوسطة وتستكمل مع 8-CPT-مخيم الهيدروكورتيزون7 (زيادة مستوى المخيمات داخل الخلايا13) و ريال عماني 20-1724 (الحفاظ على مستوى المخيم داخل الخلايا)، التي وفقا للسابقة نتائج74،79 معا بنجاح تحسين ضيق الحاجز وزادت طير، وقد ساعدت أيضا على استعادة أكثر في فيفو مثل التعبير الجيني الشخصية80. ومع ذلك، استخدام الهيدروكورتيزون لتشديد الطبقة غشائي قد تعديل استجابة خلايا بطانية لبعض المثيرات، وأغراض استخدام النموذج لتحقيق ردود على الكيماوي والسيتوكينات أثناء التهاب، قد تحتاج إلى استخدام الهيدروكورتيزون تجنبها.

من دراسات مقارنة مع المؤتمر الوزاري، اشتركت الثقافات MC مع ACM وأستروسيتي في كل المختبرات المشاركة، وفي أماكن أخرى، فقد ثبت أن مساهمة أستروسيتيك قادر على تحسين الميزات BBB غشائي وزيادة ضيق الحاجز 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83-من أجل تحقيق مثل هذا التعبير عالية من النمط الظاهري BBB في ببيكس، نحن المنشأة من لجنة التنسيق الوطنية مع astrocytes ووجد أن كلا الخنزير والفئران astrocytes الأولية كانت مفيدة، كما لوحظ في مختبرات أخرى22. أثناء إنشاء astrocyte البلدان المتبرعة الصافية، وقد أظهرت التجربة أن نقاء والعمر من الثقافات astrocyte التأثير ضيق حاجز غشائي الناجمة عن ذلك، ثايث سن astrocytes يجري 2-8 أسابيع، الذي يرتبط مع تغيير الملاحظة في مورفولوجيا astrocyte مع مرور الوقت الأمثل. في اليوم قبل إنشاء لجنة التنسيق الوطنية، يهدف تغيير متوسطة أستروسيتيس إزالة نواتج الأيض الضارة، والسماح بوقت كاف أستروسيتيس للإفراج عن التحفيز، ومما يشير إلى العوامل التي تؤثر على وضع حاجز. عندما يشترك استزراع خلايا بطانية وأستروسيتيس في نظام إدراج نفاذية الأغشية، من المهم أن تولي اهتماما خاصا للتعامل مع نموذج الحاجز. أثناء تغيير المتوسطة، تطلع وإضافة على المديين المتوسط والحركات من إدراج يجب أن يتم بعناية بغية تقليل تعطل حاجز غشائي.

إمكانية تكرار نتائج والموثوقية

تحد كبير عند استخدام الخلايا الأولية لإنشاء نماذج في المختبر لتحقيق إمكانية تكرار نتائج عالية بين الثقافات. قد يتحقق هذا التوحيد باختيار الأسلوب، استخدام أدوات عالية الجودة والمواد الكاشفة، وخبرة في ميكروديسيكشن. ولذلك إمكانية تكرار نتائج عالية مع انخفاض التباين دفعة لدفعة لطريقة عرض يعتمد اعتماداً كبيرا على الالتزام الصارم بالإجراءات الموصوفة.

لتحقيق إمكانية تكرار نتائج جيدة بين دفعات وقنينات خلال طير القياسات أو غرفة قياس مقاومة الأنسجة الظهارية الفولتميترات مع أقطاب مصغرة جامدة، بدلاً من أن يمكن استخدام أقطاب chopstick مرنة، خفض التغير الملحوظ طير القيم. بالإضافة إلى تحقيق قيم طير عالية (الشكل 4)، هو تأكيد موثوقية النموذج المقدم يقابلها انخفاض صغيرة ذائبة نفاذية (الشكل 4)، ووصف immunocytochemical ببيكس (الرقم 5 ).

القيود المفروضة على تطبيق الأسلوب والطراز

وقد زاد استخدام الخنازير المعدلة وراثيا ومصغر خلال العقود الماضية، ولكن كمية البيانات في فيفو لا تزال محدودة مقارنة بالبيانات المتاحة لنماذج القوارض، وقد يشكل ذلك تحديا لمقارنة البيانات الخنزير في المختبر في فيفو النتائج. ومع ذلك، بيولوجيا الخنزير يعكس البيولوجيا البشرية أوثق من العديد من الحيوانات المختبرية الراسخة، ونماذج الخنازير المعدلة وراثيا لدراسة الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر وقد تم الآن إنشاء84، توافر ومن المتوقع في فيفو البيانات لتصبح أقل صعوبة مع مرور الوقت.

حد من إدراج نفاذية الأغشية الحالي نظام نماذج BBB هو عدم القدرة على تقليد تدفق الدم في ميكروفيسيلس. في فيفو، ثبت إجهاد القص تؤثر على جوانب عديدة من فيزيولوجيا الخلية البطانية مثل شعبة، والتمايز، والهجرة والمبرمج85،86، والتأثير الهام BBB الخصائص مثل التعبير عن هالة من البروتينات، وتحريض واستقطاب متعهدي النقل61،،من8587. أن الأخذ بمثل هذه الظروف، يمكن اعتبار النظم المطورة حديثا موائع جزيئية88،،من8990.

طريقة مفيدة لتصحيح لتأثير طبقة المياه أونستيريد (طبقة الحدود المائية) من البيانات في المختبر النفاذية استخلاص توقع 'نفاذية جوهري' في فيفو، استخدام نهج البرامج على أساس21. يمكن أيضا استخدام هذا البرنامج ل تحليل بيانات مفصلة نفاذية21.

التطبيقات المستقبلية والتوجهات للأسلوب

مكونات وحدة neurovascular قد ثبت أن تلعب أدواراً هامة في حفز والحفاظ على ميزات بي بي بي، ولا يوجد حاليا في المختبر النموذجي لم قادرة على تقليد تماما الظروف في فيفو ، مكونات هامة و التفاعلات قد تكون لا تزال مفقودة. وتشمل الجهود الحالية في تطوير نموذج عرض إنشاء نماذج الثقافة ثلاثية مع كل من أستروسيتيس وبيريسيتيس، وتجارب دمج خلايا أنواع المختلفة. وقد لوحظ حتى الآن قد لا إدراج بيريسيتيس زيادة كبيرة في مستويات طير من الحاجز. ومع ذلك، لوحظت نماذج الخنزير سينجينيك تكون قابلة للمقارنة إلى ثلاثة إضعاف الثقافات باستخدام خلايا المخ الخنزيري بطانية و astrocytes الجرذان والفئران بيريسيتيس فيما يتعلق بحاجز ضيق والتعبير السمة المميزة التي تميز البروتينات الدماغ 22من البطانة. من أجل وضع نموذج استناداً إلى الخلايا البشرية، والتطورات المستقبلية في المختبر نماذج BBB لاكتشاف المخدرات والتسليم قد تعتمد على اشتقاق الخلايا الجذعية pluripotent البشرية والجذعيه الكبار و/أو خلايا السلف21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

واضعي التقرير لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يعترف بروون هيلانة إليزابيث وسارة كريستين كريستنسن نيلز كريستيانسن م. للحصول على المساعدة التقنية، ومنح مؤسسة Lundbeck رقم R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

الطب، العدد 127، حاجز الدم في الدماغ (BBB)، الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ووحدة نيوروفاسكولار (NVU)، وخلايا المخ الخنزيري غشائي (ببيكس)، ترانسيندوثيليال المقاومة الكهربائية (طير)، مونو-الثقافة (MC)، عدم الاتصال ثقافة المشارك (NCC)، الخلية الابتدائية العزلة، الاتجار داخل الخلايا، واكتشاف الأدوية، وأمراض الأعصاب
تحسين أسلوب لإنشاء <em>في المختبر</em> حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,… More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter