Summary
프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.
Introduction
세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의
순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 짧은 기간에 BBB 침투성의 변조를 허용 하 고 장기 BBB 기능4유도 세포 사이의 화학 신호 교환 포함. 이다 특히 뇌 내 피 세포 표현 형을 위해 알려져 있으며 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (영향을 미치는 세포내 캠프)5,6기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 등 규제 요인의 원천 날린7, 그리고 변형 성장 인자 (TGF-β) β8. 그러나 TGF-β의 효과, 토론된9되었습니다.
생체 내에서 생체 외에서 BBB에서
Vivo에서 학문 계속 BBB 생물학에 유용한 정보를 제공 합니다. 그러나, 셀 문화 모델 추가적인 통찰력을 제공 하 고 건강 및 질병에 BBB의 상세한 분자와 기능적인 측면을 이해 하는 데 유용한 도구를 구성할 수 있습니다. 세포 유형 및 BBB의 성분 사이 복잡 한 상호 작용 생체 외에서 모델에 완벽 하 게 달성 하기 어려운 있지만, 거기는 이후, 뇌 내 피 세포의 첫 번째 정화 및 모노 문화에서 이러한 응용 프로그램 10 , 11 , 12, BBB의 성장 조건과 정화 절차의 광범위 한 개발 문화 모델, vivo에서 방 벽을 더 닮 았의 결과 세포. 일반적으로 사용 되 체 외에 BBB 모델은 기초를, 돼지, 설치류 및 소 출신의 1 차 셀에 불멸 하 게 세포에. 각 모델은 서로 다른 장점과 단점이 있다. 비교 및 모델 선택에 대 한 유효성 검사 마커 BBB 효소, 운송업 자, 수용 체, 그리고 구조 단백질의 표현 등은 현재 설립된 모델1의 개요를 만드는 데 사용 됩니다.
프로토콜의 목표
BBB의 중요 한 기능 중 하나는 배리어 견고 하 고 높은 TEER 아직 사용 가능한 모델의 많은 수를 반영 하지 않습니다 잘 비보에 수준. 이 프로토콜의 목표 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER 기본과 기본 pBECs MC 또는 ACM, 없이 또는 NCC에 기반을 구축 하는 방법을 제시 하는 여러 실험실에서 개발 및 최적화 기여를 통합, 쥐 또는 돼지 근원의 이다입니다. 적용된 절차와 모델의 설립 포함 오염 세포를 제거 하 고 BBB 표현 형으로 pBECs의 차별화를 개선 하기 위해 노력 합니다. 이 작품은 낮은 paracellular 침투성 및 주요 꽉 접합, 전송기, 단백질과 수용 체의 기능 표현의 좋은 안정적이 고 높은 TEER 모델의 설립에 결과 있다. 그러나,는 이다 뇌 내 피 세포 표현 형을 기여 하는 요소는, 문화의 세 가지 다른 조건 뇌 내 피 세포의 3 개의 다른 고기를 나타냅니다. NCC 모델은 최대한 표현의 BBB 특징은 약물 발견, 전송 및 세포내 매매에 관련 된 특정 전문된 메커니즘의 연구 뿐만 아니라 세포 세포 상호 작용의 조사를 위해 특히 유용 유리.
기원과 프로토콜의 역사
여기에 설명 된 pBEC 모델은 기반 사이 실험실 (런던)에서 개발 된 돼지 모델 닥터 루이스 모건과 동료, whichis는 성공적인 이전 소 뇌 내 피 세포 모델13을 기반으로 합니다. 셀 준비의 원래 방법이 이었다 나일론을 사용 하 여 2 단계 여과 순도 개선 하기 위해 subculturing 단계 뒤 microvessels를 잡으려고 메시. 메서드의 이전 개발에 최적의 BBB 표현 형 및 압박감 ACM을 포함 하 여 보충된 매체에 성장에 의해 달성 했다. 메서드에 추가 수정 R. 스키 너에 의해 맨체스터 영국14,15명. 로스웰 교수 실험실에서 만들어졌다. 메서드는 Abbott 실험실, KCL 런던, Patabendige 크게 이다 또는 ACM의 사용을 피 함으로써 그리고 puromycin와 pericytes와 같은 오염 셀을 제거 하 여 준비를 간단 하 게 했다 그것은 의해 채택 되었다. 첫 번째 서류 MC 모델은 vivo에서 BBB, 효과적인 단단한 접속점, 수용 체-중재 transcytosis16,17 , 막 교통 시스템 등의 여러 가지 중요 한 기능을 유지 확인 , 18 , 19 , 20. 미 Yusof 나중 다시 사이토 공동 문화를 시험 하 고 그것은 크게 향상 된 TEER, 그래서 이것이 기본 variant 애 보트 연구소21에서 현재 사용 발견. 모델 지금은 성공적으로 되었습니다 M. 닐슨 전송 오르후스, 추가 수정 되었습니다 연구소 소개 (이 프로토콜), 단순화 그레이 포함 하 여 중요 한 메쉬 여과 단계와 단일 필터 코팅 단계를 사용 하 여 추출 콜라겐과 fibronectin 결합. 돼지 이다 (이 프로토콜)의 절연을 위한 적용된 절차는 센 외22에 의해 설명 된 알 보 그에서 토니 무스 연구소에 의해 개발 된 프로토콜에 근거 했다. 아후 스에서 생성 된 모델의 다른 속성과 TEER 비슷합니다는 자신감 개념 모델과 실험실 사이 전송 쉽게 잘 주의 관찰 및 합리화 방법 단계에 응답을 하 신 다. 실제로, S. Yusof 이제는 열 대 국가 (말레이시아)23, 현지 조건 및 조직 소스에 대 한 추가 조정 관련 MC 모델을 설립 했다.
이점을 다른 방법 및 현재 설립 모델
소와 설치류의 뇌 내 피 세포에 비해, pBECs는 vivo에서 BBB 형 절연24다음의 손실의 낮은 속도의 이점을 제공 합니다. 또한, pBECs bEND.5 및 bEND.3 (50 Ω c m2) 같은 셀 라인의 monolayers에 대 한 일반적으로 보고 된 수준에 비해 MC (800 Ω cm2)16 에서 재배 하는 경우에 상대적으로 꽉 내 피 방 벽을 형성 할 수 있다 25 , 26 , 27, ㄷ (300-800 Ω c m2)28,,2930및 cerebEND (500 Ω c m2)29,,3132, 그리고 기본 뇌 마우스 (100-300 Ω c m2)의 내 피 세포ss = "외부 참조" > 33,,3435,36 및 쥐 (100-300 Ω c m2)37,38. 그러나,는 TEER 정화 및 문화 절차에 의존성을 보이고 있다. 대부분의 경우, ACM의 추가 또는 이다 공동 문화 내 피 레이어1의 견고에 증가 내 피 세포에 차별화 효과 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 자란 조건 최적화에 노력, 소 기반 모델 나타났습니다 TEER 값 돼지 기반 모델 (평균 800 Ω cm2 MC, 사이토 공동 문화에 2500 Ω c m2 )에 비해13 ,39,40,41,,4243,44,45. 모델 기본 소 뇌를 기반으로 내 피 세포 사이 및 실험실14,45,,4647,48, 내 큰 변화가 나타났습니다. 재현성에 문제가 있을 수 있습니다. 여기 보고 pBEC 모델에서 기여 실험실 낮은 가변성, 실험실 사이 매우 비슷한 TEER 그리고 paracellular 침투성 값 달성 했다. 따라서, 그것은 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 낮은 변화 강력한 모델 확립에 다른 실험실에 대 한 가능 해야 합니다. 단단한 내 피 층을 형성, 뿐만 아니라 pBECs 모델 이전 검증 된 꽉 접합, 기능적인 BBB 전송기, 수용 체와 효소, 단백질과 연구15 의 범위에 대 한 시연된 적합성의 식에 의해 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. 또한, pBECs의 공동 문화에 게시 되지 않은 transcriptome 데이터 BBB 전송기와 수용 체 (미 발표 결과, 닐슨 그 외 여러분)의 예상된 프로필을 보여줍니다.
BBB 돼지-기반 모델에는 게놈, 해부학, 생리학, 더 이점이 있다 그리고 돼지의 질병 진행 반영 인간의 생물학60을 유리한는 기능에 대 한 다른 기존된 모델 보다 더 높은 학위에는 제약 산업입니다. 돼지 머리 고기 업계의 일반적인 부산물 이기 때문에, 그들은 두뇌의 쉽게 접근할 수 있는 소스는 실험에 필요한 한 돼지의 뇌에서 높은 정화 수확량을 제공 하는 동물의 수를 최소화 하는 내 피 세포 구성. 정화 및 1 차 셀의 다소 시간이 소요 되 고 표준화 모델 설정에 대 한 전문 지식이 필요로, 1 차 셀 가장 신뢰할 수 있는 BBB 모델을 생성 합니다. 불멸 하 게 셀 라인 수 없습니다 대신, 중요 한 속성으로 같은 수 장벽 압박감, 전송 식 프로필, 및 microenvironment 규칙 vivo에서실험 결과61, 를 반영 하지 않습니다. 62. 생체 외에서 모델 라이브 셀 높은 해상도 이미징, 목표를 사용 하 여 샘플링 또는 관찰 된 셀에 대 한 근접 접근 함으로써 세포내 프로세스의 시각화를 가능 하 게의 이점을 제공 높은 확대와 더 나은 광학 품질63. 이건 살아있는 동물에서 2 광자 현미경의 사용에 대 한 경우입니다. 또한, 생체 외에서 모델 transfect 세포, 태그 단백질의 시각화와 그들의 매매의 조사 하는 기능을 제공 합니다.
모델의 응용 프로그램
BBB의 기능 고정 되지 않습니다 하 고 동적으로 생리학과 병 리에 변조 될 수 있습니다. 신경를 포함 하 여 많은 신경 질환, 염증 성 및 전염 성 질병, 장애 및 BBB의 증가 된 침투성은 관찰64,,6566,67 . 감소 하 고 질병의 진행 및 후속 피해 방지, 식별 및 BBB의 변조를 기본 분자 메커니즘의 중요 한 중요성의 있습니다. 이러한 맥락에서 신뢰할 수 있는 생체 외에서 모델 높은 수요 제약 산업에에서 있는 고 BBB 침투성 CNS 약물의 예측에 중요 한 역할 게다가. 어떤 체 외 모델 침투성 화면으로 제한적인 paracellular 통로, 순수 현실 셀 건축과 기능 표현의 전송 메커니즘68표시 되어야 합니다. 이전 연구16,17,의57, 그리고 paracellular 침투성 및 여기 TJ 고에 단백질의 표정에 의해 입증, 제시 모델 이러한 모든 조건을 충족 하며 적합 BBB의 범위 두 정상 생리에서 및 병리학에서 연구입니다. 제시 정화 및 재배 방법의 강점 단순의 조합을 포함 하 고 재현성 및 astrocytic를 포함 하는 기능 결과 강력 하 고 신뢰할 수 있는 높은 TEER 생체 외에서 BBB 모델 영향. 이 대 한 목적, 돼지의 이다 고 쥐 원점 비슷한 방식으로22에 pBECs의 BBB 표현 형을 증가 시키기 위해 표시 되었습니다.
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Protocol
돼지 두뇌 덴마크 식품 산업의 부산물으로 가져온. 덴마크어 Slaughterhouses 엄격한 감독 및 환경과 식품의 덴마크 내각에 의해 관찰 된다.
이다의 절연에 사용 되는 쥐 사육 되었고 덴마크어에 따라 수 의사의 검사에서 12/12 h 다크/라이트 사이클에 22 ° C-23 ° C의 주변 온도에서 로컬 동물 시설에 그룹 보관 실험실 동물에 대 한 규정입니다. 그들은 (1986 년 11 월 24 일의 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC); 동물의 윤리적 사용에 대 한 국제 지침 및 덴마크어 지침 희생 했다 전에 쥐 안락사 되었다. 아니 vivo에서 실험 동물 또는 인간 자료가이 실험에 사용 되었다.
참고: 다음은 정화 (단계 1), (2 단계) 재배 (3 단계) TEER 측정을 설명 하는 pBEC 주요 프로토콜. 이다와 NCC의 설치에 대 한 정화의 재배 쥐와 돼지 이다를 설명 하는 대체 protcol (4 단계) 제공 됩니다.
1. 돼지 뇌의 모세 혈관의 정화
- 국내 돼지에 게 (예: 근처 도살에서) 5-6-개월에서 8-10 두뇌를 수집 하 고 실험실에 얼음에 그들을 전송. 동물의 종료의 2-3 h에서 다음 정화 절차를 시작 하는 것이 좋습니다.
- 살 균 흐름 도구에 머리를 놓고 부드럽게 얼음에 비 커에 1 L PBS와 함께 그들을 씻어합니다
- 신중 하 게 파인 팁 집게를 사용 하 여 한 번에 하나의 두뇌에서 meninges를 제거 하 고 얼음에 PBS를 가진 또 다른 1 리터 비 커에 meninges 무료 두뇌를 전송. 시간 확장 제거 복잡 해질 수 있습니다. 각 두뇌에 사용 되는 대략적인 시간 10-15 분 해야 합니다.
- 메스를 사용 하 여 한 번에 하나의 두뇌에서 회색 물질을 긁어와 접시 (8.8 cm 2) 20 mL DMEM 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 얼음에 포함 된 격리 된 자료 전송. 백색 질 물자를 철수 하지 않고 가능한 많은 회색 물질로 격리 합니다. 초기 조각화에 대 한 회색 물질 소재 바늘 없는 50 mL 주사기를 통해 실행 합니다. 모든 두뇌에 대 한 계속 하 고 수집 된 회색 물질 자료 수영장. 시간 확장 제거 복잡 해질 수 있습니다. 각 두뇌에 사용 되는 대략적인 시간 10-15 분 해야 합니다.
- 는 DMEM/F-12 미디어와 50: 50의 비율로 소형 조직 균질 화기의 분쇄기 튜브 절연된 회색 물질 자료 전송. 8 선 위아래로 꽉 유 봉과 뒤 느슨한 유 봉과 선 위아래로 8 함으로써 자료를 균질. 재료 무 균까지 모두 격리 계속 하, 500 mL 병에는 homogenate 전송 DMEM/F-12 약 450 mL 전체 볼륨을 희석.
- 필터 홀더를 가진 500 mL 블루 모자 병 및 140 µ m 필터 메쉬를 사용 하 여 homogenate를 필터 및 필터를 통해 조직을 실행 하 여 모세 혈관을 분리. Homogenate의 50 mL 당 하나의 필터를 사용 하 고 이후에 DMEM/F-12 각 필터를 세척.
- 장소 모 세관 포함 된 트립 신/EDTA (2.5 %trypsin, PBS에서 0.1 nM EDTA)의 소화 솔루션 접시 콜라 CLS2 필터 (2000 U/mL)와 DMEM/F-12에서 DNase (3400 U/mL) 1. 1 페 트리 접시 (8.8 cm 2, 20 mL 해결책)를 사용 하 여 3 필터 메쉬 당.
- 180 rpm에서 궤도 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 접시 또는 부드럽게 모든 10 분 저 어. 1 시간 후 1 mL 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 서 스 펜 션 필터에서 모 세관 씻어.
- 2 50 mL 튜브 3 요리에서 현 탁 액을 분할 하 고 각 50 mL 튜브에 10 mL DMEM/F-12를 추가 하 여 소화를 중지.
- 원심 분리기는 세포 정지 250 x g, 4 ° C에서 5 분에 대 한 발음은 supernatants 고 다시 DMEM/F-12의 10 mL에 각 펠 릿을 중단. 각 튜브를 DMEM/F12의 추가 20 mL를 추가 합니다. 이 원심 분리기 단계를 반복 하 여 두 번.
- 튜브 5 분 동안 얼음에 진정 및 전송 솔루션 2 새로운 50 mL 튜브.
- 셀-정지 250 x g, 4 ° C에서 5 분간 원심 하 고 다시 냉동 솔루션 FBS에 10 %DMSO 구성의 8-10 ml (약 1 mL/두뇌 사용) 각 펠 릿을 일시 중지.
- 세포 현 탁 액 cryovials, cryovial 당 1 mL를 사용 하 여 전송. 평균적으로, 한 정화 두뇌 사용, 평균 12-16 삽입에 대 한 내 피 세포를 제공 당 1 유리병에 결과. 적어도 4 하룻밤까지 h-80 ° C에서 냉동 상자에 튜브를 놓습니다. 나중에, 액체 질소와 cryotank에는 cryovials를 저장.
주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도. 적절 한 보호를 착용 하십시오.
2. 기본 pBECs (8-10 일)의 재배
- 초기 문화 (3-5 일)
1 일- pBECs의 첨부 파일에 대 한 조건을 최적화 하
- 마지막으로 솔루션을 추가 하 여 T75 플라스 크의 코팅을 수행 콜라겐 IV의 농도 (150 µ g/mL) 및 fibronectin ddH 2 O 확인 솔루션 전체 표면을 커버 하 고 플라스 크를 (50 µ g/mL). 10 mL를 사용 하 여 각 T75 플라스 크에 대 한. 2 h. 위해 37 ° C에서 품 어
참고: 코팅 수 있습니다 사용의 바로 전에 또는 1 주일 전에 수행 되며 4 ° c.에 PBS를 가진 저장 코팅 건조 하지 해야 합니다, 또는 그것은 더 이상 적합 한 부착 및 성장 표면 형성 합니다. - PBEC 성장의 준비 16 mL 매체 DMEM/F-12의 구성 된 보충 10% 플라스마 파생 된 혈 청 (PDS), 페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 헤 파 린 (15 U/mL). 내 피 세포에 대 한 선택에 puromycin (4 µ g/mL)와 매체를 보충. Puromycin 치료만 5 일의 최대 사용 될 수 있다는 점에 유의.
- 약 6 mL와 10 mL 두 15 mL 튜브에 볼륨으로 준비 된 매체 수.
- 액체 질소 (단계 1.13)에서 모세 혈관으로 유리병을 지참 하 고 37 ° C 물 목욕의 사용 하거나 6 mL 약 수에서 준비 된 매체의 750 µ L을 추가 하 여 모세를 녹여. 매체를 추가 하 여 해 동 하는 경우 신중 하 게 녹여 현 탁 액을 균질 하도 여기저기 플라스틱. 동 때 세포 현 탁 액 aliquot 6 mL 매체에 전송.
- 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 아래로 모세 혈관 회전 고정 매체를 제거 하려면
- 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 다시 10 mL 약 수의 1-2 mL에 펠 릿을 중단. 때 다시 일시 중단, 전송 솔루션 aliquot 10 mL 매체.
- 코팅된 T75 플라스 크를 모 세관 현 탁 액을 전송 하 고 부드럽게 표면에 동등 하 게 분배 되도록 플라스 크를 기울기. 37 ° c, 5% CO 2 T75 플라스 크를 놓습니다.
제 2 일 - 하룻밤 부 화 후 10 mL pBEC 성장 매체 puromycin (4 µ g/mL) 한 T75 플라스 크에 대 한 보충을 준비 하 고 수행 하는 중간 변경. 셀에 적용 된 모든 중간 솔루션은 사용 하기 전에 37 ° C에 미리 데워 진 수 한다.
참고: 또는, 중간 변경 될 수 있습니다 수행된 4-6 h 후 도금 모 세관 표면에 첨부 해야 하는 경우. 60-95% 합류 이루어집니다, 녹고에서 일반적으로 3-5 일 때까지 세포를 품 어. 여 보세요 하지 마십시오정지 수 접촉 금지를 피하기 위해 100% 합류에 도달 w 셀 추가 셀 성장.
제 4-6 일 - 원하는 confluency를 달성 하는 때 통로 내 피 세포 투과성 막 삽입 (섹션 2.2 참조). 원하는 confluency 4 일에 달성 하지, 매체의 변경 수행 됩니다. 6 일에 최신에 세포 투과성 막 삽입에 passaged 한다. 필요한 confluency 주 6에 의해 달성 되지 않은, 경우 세포 실험 사용에 적합 하지 않습니다.
참고: 준비의 NCC 위한 이다: 공동 문화 모델, 2-설정 하는 경우 8 주 된 이다 문화 (섹션 4 참조)에 삽입 하는 내 피 세포를 뿌리고 전날에 중간 변화를 수행 하 여 공동 문화 모델에 대 한 준비 되어야 한다. 각 사이토는, 사이토 성장 매체의 1500 µ L를 준비 DMEM 구성 된 낮은 포도 당 보충 10 %FBS, 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL)와 중간 변경 수행.
- 마지막으로 솔루션을 추가 하 여 T75 플라스 크의 코팅을 수행 콜라겐 IV의 농도 (150 µ g/mL) 및 fibronectin ddH 2 O 확인 솔루션 전체 표면을 커버 하 고 플라스 크를 (50 µ g/mL). 10 mL를 사용 하 여 각 T75 플라스 크에 대 한. 2 h. 위해 37 ° C에서 품 어
- 투과성 막 삽입 (5 일)에 pBECs의 성장
하루 4-6- 준비 투과성 막 삽입 (1.12 c m 2 면적, 0.4 µ m 숨 구멍의 삽입과 12-잘 접시)에 대 한 pBEC의 콜라겐 IV와 코팅에 의해 시드 (500 µ g/mL) 및 fibronectin (100 µ g/mL) ddH 2 각각 O. 사용 약 300 µ L에에서 넣고 솔루션 전체 성장 표면을 덮어 다는 것을 확인. 37 ° C, 5% CO 2 2 헤의 최소에서 품 어
- PBEC 성장 매체의 30 mL를 준비 (미디어 구성 섹션을 참조 2.1.2) puromycin 없이.
- T75 플라스 크에서 pBEC 문화에서 중간 및 실 온에서 5 mL 살 균 PBS를 가진 두 번 부드럽게 세척 발음.
- 트립 신-EDTA 솔루션 (2.5 %trypsin, PBS에서 0.1 nM EDTA) T75을 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5-7 분에 플라스 크를 배치
- 뇌 내 피 세포를 분리 하려면 부드럽게 손끝, 플라스 크의 표면에 생존 하 고 더 강한 연결 pericytes을 떠나 결국 T75 플라스 크의 측면을 누릅니다. 시각적으로 분리 현미경으로 조사 한다. 80% 분리 관찰 하는 때 매체의 5 mL을 추가 하 여 trypsinization 중지.
- 셀 솔루션 15 mL 튜브를 사용 하 여 10 mL 피 펫 및 스핀 뇌 내 피 세포 250 x g, 7 분간 4 ° C에서 원심 분리 하 여 전송.
- 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 1 mL 중에 펠 릿을 resuspend. 일시 중단 하는 경우 추가 3 ml 전체 볼륨을가지고 매체의 더 2 mL
- 챔버 또는 자동 셀 카운팅 시스템 계산 셀을 사용 하 여 셀의 수를 수동으로 계산 하는 방법. 10 5 셀/mL 매체, 10 5 셀/삽입 x 1.1의 최종 시드 밀도 결과 x 2.2의 셀 솔루션 준비.
- 투과성 막 삽입에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 각 삽입을 세포 현 탁 액의 500 µ L를 전송. 삽입 중 하나에, 유일한 매체를 추가 하 고로이 삽입을 사용 하는 '만 필터 ' TEER 측정 제어.
- 내 피 세포 MC, ACM, 함께 MC 또는 NCC와 설정 이다 다음과 같은 방식으로:
- 대 MC: 추가 1500 µ L pBEC 성장 매체/acm 투과성 막 삽입 아래 12-잘 접시의 당. 37 ° C, 5% CO 2에 침투성 막 삽입을 놓고 2 일 동안 품 어.
- 대 한 NCC: 사이토 성장 매체와 함께 새롭게 이다와 웰 스 전송 삽입 하루 전에. 37 ° C, 5% CO 2에 침투성 막 삽입을 놓고 2 일 동안 품 어.
참고: 세 가지 모델의 하단 우물에서 다른 미디어 종류의 사용의 유의.
하루 6-8
- 하루에 2, pBECs로 침투성 막 삽입에서 미디어 변경. 삽입, 당 pBEC 성장 매체의 500 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 수행 셀 계층의 장애를 최소화 하기 위해 변경. 2 일에 대 한 셀을 품 어. 미디어 변경 삽입, 그리고 하단 우물에 수행 됩니다 것을 유의.
- 차별화 요소 (1-2 일)와 자극
하루 8-10- 각각 다른 모델에 대 한 자극 미디어 다음으로 준비 되어야 한다:
- 위한 MC: 각 삽입 하 고, 포함 된 캠프 (250 µ M), 날린 pBEC 성장 매체의 500 µ L를 준비 (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
MC: 준비 캠프 (250 µ M), 날린 포함 pBEC 성장 매체의 또한 1500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
ACM와 MC: ACM의 1500 µ L를 해 동 하 고 캠프 (250 µ M), 날린 보충 (550 nM)와 RO (17.5 µ M). - 대 한 NCC: 각 삽입에 대 한 준비 포함 된 캠프 (250 µ M), 날린 pBEC 성장 매체의 500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M). 각 사이토 잘에 대 한 준비 DMEM/F-12의 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL), 헤 파 린 (15 U/mL), 캠프 보충 (250 µ M), 날린 1500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
- 위한 MC: 각 삽입 하 고, 포함 된 캠프 (250 µ M), 날린 pBEC 성장 매체의 500 µ L를 준비 (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
- 각각 다른 모델에 대 한 다음과 같은 미디어 교환 수행:
- 대 MC: 신중 하 게 우물과 삽입에서 매체를 발음 하 고 각 삽입 500 µ L를 사용 하 여 두 구획을 차별화 매체 추가 및 각 잘 1500 µ L입니다. 삽입의 어느 한쪽에 중단에 영향을 미칠 수 있으며 셀 레이어를 방해 수.
- 대 한 NCC: 신중 하 게 우물에서 매체를 발음 하 고 잘 당 750 µ L 차별화 매체를 추가. 조심 스럽게 삽입에서 매체를 발음 하 고 삽입 당 500 µ L 차별화 매체를 추가 합니다. 잘 각 사이토를 나머지 750 µ L 차별화 매체 추가.
- 모든 모델에 대 한: 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 배치 하 고 다음 날까지 차별화 매체와 품 어.
참고: 알고 있어야 그 이다와 NCC에 대 한 이다 혈 청 자유로운 매체에 보관 하는이 시점에서.
- 각각 다른 모델에 대 한 자극 미디어 다음으로 준비 되어야 한다:
3. TEER 측정
- 당일 차별화 매체와 자극 세포 챔버 rinsing 하 여 TEER 측정을 위한 조직 저항 측정 챔버 시스템을 준비 후 두 번 ddH 2 O, 한 번 70% EtOH 5 분 그리고 2 번 더 ddH 2 o.
- 조직 저항 측정 챔버에 DMEM/F-12의 4 mL를 추가 하 고, 시스템에 연결 하 고 다음 설정에 따라 약 30 분에 대 한 보정: R = 0, 테스트 R = 1000, 모드 = R.
- 신중 하 게 조직 저항 측정 챔버에 삽입을 배치 하 여 TEER 측정을 수행 합니다. 각 삽입에 대 한 3 중에서 측정을 수행 하 고 계산 하는 평균 Ω c m 2.
참고: 공동 문화 모델 TEER 값은 도달할 것으로 예상 > 500 Ω c m 2. 적절 한 TEER 수준 측정 TEER의 첫날에 도달 하지, 새로운 차별화 요소를 추가 (캠프 (250 µ M), 하이드로 코 티 손 (550 nM)와 RO (17.5 µ M)) 다음 날에 다시 TEER 측정. 적절 한 수준을 달성 하는 때에 모델 계획 된 실험에 대 한 준비 되어야 합니다. 셀 TEER 측정 후 복구 하는 실험을 수행 하기 전에 적어도 3 h 동안 휴식 한다 다는 것을 유의 하십시오. 자극, 후 TEER 값 일반적 남아 24-48 h 적합 자극 후.
참고: 또한 엄밀한 STX-100 C 전극 쌍을 사용 하 여 대체 하 고 빠른 방법이 모델 81에서 높은 TEER를 기록 합니다. 유연한 STX2 요소ctrode 쌍 제공 덜 신뢰할 수 있는 판독.
4. 비-접촉 공동 문화에 대 한 준비의 이다: 다른 방법
- 정화의 이다
- 각 쥐 두뇌 사용, 각 ddH 2 O에서에서 폴 리-L-리 신 (5 µ g/mL)의 10 mL를 추가 하 여 2 T75 플라스 크 코트 T75 플라스 크입니다. 30 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어
- 이다의 격리는 다음과 같이 수행할 수 있습니다:
- 이다 쥐:
- Decapitate 2 1-2 일 된 쥐를 승인 된 방법을 사용 하 여.
- 코 쪽으로 목에서 시작 하는 두개골에서 피부를 잘라내어 화살 절 개를 가진 뼈를 잘라.
- 두개골 곡선된 겸 자와, 뇌를 꺼내 열고 DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL)와 보완의 11 mL 15 mL 튜브 (튜브 1)에 배치.
- 신중 하 게 meninges 파인 팁 집게를 사용 하 여 제거 하 고 뇌 자료 1 mL 피 펫을 사용 하 여 중단.
- 돼지 이다:
- 5 6 개월 국내 돼지에서 얻을 1 뇌.
- 파인 팁 겸 자 또는 손을 사용 하 여 뇌에서 meninges를 조심 스럽게 제거.
- 수집 4 g 회색의 뇌에서 중요 하 고 1-2 mL DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL) 페 트리 접시에 보충에 조각을 놓으십시오. 조각 큰 경우 scalpels와 집게 말하다.
- DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL) 11 mL의 총 볼륨을 보충와 함께 15 mL 관 (1 관) 및 채우기 이동 중단 1 mL 피 펫을 사용 하 여 절연된 소재.
- 계속 10 mL 주사기에 부착 된 긴 바늘으로 절연된 재료를 조직 하 고 3 번 아래로 중단. 큰 조각, 튜브의 하단에 정착 될 때까지 기다린 후 관 (1 관)의 상단에서 7 mL 매체 수집.
- 새 50 mL 튜브 (튜브 2)로 7 mL 세포 현 탁 액 40 µ m 나일론 필터를 통해 필터링.
- 추가 7 mL 튜브 1 두뇌와 매체. 균질 및 단계 4.1.2.2.5-6에서 여과 관 2에서에서 필터링 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨은 약 35 mL 때까지 계속.
- 이다 쥐:
- T75 플라스 크 [4.1.1 단계]에서 코팅 솔루션을 제거. 5 mL PBS 폴 리-L-리 신을 가진 외피 세포는 코팅 솔루션의 모든 독성 효과 의해 감염 되지 않도록 하는 데 사용할 수 있습니다 후로 빠른 세척.
- 분할 하 고 씨앗 T75 플라스 크 사이 고립 된 사이토 솔루션. 37 ° C, 5% CO 2 3-5 일 동안에 플라스 크를 품 어.
- 경작 이다 및 내 피 세포 (3 주)와 함께 준비 NCC
- 초기 문화
- 외피의 3-5 일 후 신중 하 게 매체를 발음 하 고 10 mL을 추가 하 여 중간 변경 수행 DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL)와 보완의.
참고: 첫 번째 중간 변경 후 중간 바뀌어야 한다 매 5 일. 처음 2 주 동안은 플라스 크를 흔들어 하 고 매체를 변경할 때 셀 PBS 철저 하 게 세척. 이 오염 microglia의 제거에 에이즈. - 재배의 3 주 후 각 T75 플라스 크의 하단에 트립 신-EDTA 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5-7 분 대에 그들을 품 어
- 중간의 5 mL을 추가 하 여 trypsinization 15 mL 튜브에 셀 솔루션을 전송 멈추고 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 이다 원심
- 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 다시 10% DMSO FBS에 구성 된 솔루션에 셀 중단.
- 셀의 수를 계산 하 고 10 6 셀/mL x 4.0의 셀 솔루션을 준비 합니다. Cryovials 유리병 당 1 mL을 추가 셀 고정.
- 외피의 3-5 일 후 신중 하 게 매체를 발음 하 고 10 mL을 추가 하 여 중간 변경 수행 DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL)와 보완의.
- 투과성 막 삽입 시스템 하단 웰 스 (2-12 주)에서 성장
- ddH 2 O 각 잘 폴 리-L-리 신 (5 µ g/mL)의 1 mL를 추가 하 여 12-잘 접시 이다의 성장을 위한 준비. 2 h. 위해 37 ° C에서 접시를 놓고
- 각 12-잘 접시 준비의 사이토 성장 매체 (DMEM 낮은 포도 당 보충 10 %FBS 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL)) 25 mL.
- 액체 질소에서 이다의 유리병을 지참 하 고 750 µ L DMEM 낮은 포도 당 매체를 추가 하 여 셀을 녹여. 신중 하 게 녹여 균질 정지를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 해 동, 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 매체 7 mL의 총 볼륨 추가.
주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 그래서 착용 장갑 등 개인 보호. - 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 아래로 모세 혈관 회전 고정 매체를 제거 하려면
- 신중 하는 상쾌한 발음 하 고 다시 셀 중간에 중단.
- 12 잘 접시의 우물에서 코팅을 제거 하 고 잘 당 1 mL 사용 하 우물에 세포 현 탁 액을 전송. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
- 3 매일 매체를 새로 고침 하 고 최소 2 주 전에 내 피 세포와 공동 문화에 대 한 셀을 사용 하 여 셀 문화. 녹고, 최적의 나이 되 고 2-8 주 후 최대 12 주 동안 공동 문화에 대 한 셀을 사용할 수 있습니다.
- 초기 문화
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Representative Results
모델 체 외에 BBB의 설립
제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다. PBECs IV collagen과 fibronectin에 도금 했다 셀 원하는 confluency를 도달 했다 때에 침투성 막 삽입 필터 막 (1.12 c m2 면적, 0.4 µ m 모) 105 셀/삽입, x 1.1의 조밀도에 코팅는 그들은 일반적으로 4 일 (하루 8-10 게시물 격리) 후 confluent monolayers를 형성. 공동 경작 pBECs 때 쥐 또는 돼지 근원의 이다 최소 NCC (그림 3D)를 시작 하기 전에 2 주에 대 한 폴 리-L-리 신 코팅된 하단 우물에 도금 했다. 2-8 주에 대 한 교양 이다 pBECs;에 BBB 표현 형을 홍보 하기 위한 최상의 지원을 제공 경험으로 나타났습니다 NCC를 설정할 때 이 시간 내에 이다 세포는 벌집 같은 구조 (그림 3E-F)에 배열 confluent 문화 형성. 하루에 4 투과성 막 삽입 시스템 모델 (하루 8-10 게시물 격리), 셀 캠프, 날린와 장벽 압박감 및 BBB 특성 식 패턴 꽉 접합 단백질, 전송기의 증가 자극 했다 고 수용 체입니다.
PBEC 표현 형의 특성화 및 Paracellular 침투성
시각 세포 검사 TEER 측정 함께 정기적으로 confluency 및 투과성 막 삽입 실험 이전에 내 피 세포 층의 압박감을 평가 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법 있습니다. 그림 4 는 2 개의 시리즈에서 명백한 침투성21 (P애플 리 케이 션, 결합 (이온 침투성 반영) TEER의 제어 매개 변수는 BBB 통해 작은 분자 약물 침투성을 평가 하기 위해 실험의 결과 cm s-1) 방사선된 자당 또는 반영 하는 전형적인 작은 약물 분자의 paracellular 침투성 염료 추적 프로그램 루시퍼 노란색 (만 민)의 (~ 200-600 다). P애플 리 케이 션 (약물의 분자량)에 따라 자당 또는 LY P애플 리 케이 션 보다 더 큰 관심의 화합물은 셀에 걸쳐 transcellular 침투성 또는 수송 제안 수 있습니다. 그림 4 쇼를 투과 막 쥐 이다, pBEC의 좋은 배치 위에 경작 하는 pBECs와 삽입 (예: 여기는 LY 설정) 범위 500-2000 Ω cm2, 높은 또는 낮은 몇 TEERs 생성 됩니다. 일부 일괄 처리 프로토콜을 학습의 초기 단계 동안 특히 있을 수 있습니다 주위 낮은 TEERs 100-900 Ω cm2 (예: 여기는 자당 설정). TEER 측정 필터, 예를 들어 시작 TEER 선택할 수 > 500 Ω c m2는 범위의 TEER 표시, 이상 P애플 리 케이 션 은 상대적으로 독립적인 TEER, 이러한 실험에 대 한 충분히 꽉 배리어 층의 지표의. 투과율을 측정 하기 위한 프로토콜 용액/구조물의 종류에 따라 달라 집니다. NCC에 작은 분자의 침투성을 측정 하기 위한 절차의 설명에 대 한 프로토콜 Yusof, SR, 외에에서 설명 되어 있습니다. 알21. 표현의 쥐 이다와 NCC에 pBECs에 꽉 접합 단백질의 평가 면역 형광 검사 (그림 5A-C)에서 같이 셀 접합 함께 claudin 5 occludin, 1, 및 ZO의 지역화를 보여주었다. 또한, 외화 접합 단백질 p120 catenin-셀 연결 (그림 5D)에 따라 잘 정의 된 분포를 보여주었다.
그림 1: 적용 된 생체 외에서 BBB 모델의 도식 표현. 침투성 막의 도식 대표 MC (A), ACM (B)와 MC와 NCC 이다 (C)와 pBECs의 시스템 모델을 삽입 합니다. MC, pBEC 성장 매체 또는 ACM 했다 적용 아래 우물에는 NCC에 pBECs와 삽입 2 8 주 된 이다와 웰 스에 배치 하는 반면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 흐름 차트 pBEC 재배 및 제시 모델의 설립 시 주요 단계. 개요 및 방법에 대 한 타임 라인에 대 한이 도식 프레 젠 테이 션 pBECs의 자란 절차 및 제시 모델 즉 MC 또는 ACM, 그리고 NCC 없이 이다와 설립의 주요 단계를 요약합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: pBECs와 쥐 이다의 초기 문화의 대표적인 시간 과정. 단계 대조 현미경 검사 법 심상 (A-C) , 이다 pBECs의 문화 (D-F) 전망 5 일 이상. 모세 혈관과 오염 세포의 존재를 보여준 초기 문화의 첫 날에 모 세관 조각 정화 (A, 2 일과 성장, 보여주었다 pBECs에 대 한 선택의 추가 하루에 1)후 중간 변경 일 모 세관 조각에서 그들의 성장을 시작 (B, 주 3). PBECs의 confluent monolayers 일반적으로 하루 4-6, 어떤 시간에 pBECs 스핀 들 모양의 형태학 그리고 경도 정렬 했다 달성 했다 (C). 하단에 시드 쥐 이다 일반적으로 5 일 (D-F), 이내 confluent 레이어에 확산 우물 그리고 성장의 2 주 후 NCC 모델에 사용 되었다. 모든 사진에 대 한 눈금 막대: 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: pBECs의 꽉 접합 무결성. Paracellular 표식 자당에 pBECs의 명백한 침투성 (Papp) (MW 342.5 14C 표시 14.8 25.9 GBq/mmol) TEER에 대 한 루시퍼 노란색 (MW 521.57, 10 µ g mL-1), 플롯. pBECs 잘 마커 꼭대기 챔버에 추가의 베이스에 쥐 이다 위에 1.12 cm2 투과 막 삽입 필터에 성장 했다. 37 & # 730에서 1 시간 후; C, 기저 챔버에서 표시기의 모양을 측정 하 고 꼭대기-기저 P애플 리 케이 션 (x 10-6 cm 초-1) 계산 했다. TEER 측정 되었다 > 3 h P애플 리 케이 션을 사용 하 여 STX100C EVOM 전극, 저항 150 Ω. 빈 투과성 막 삽입 필터에 대 한 루시퍼 노란색 데이터 집합에 대 한 평균 TEER 수정 전에 1249 ± 80 Ω cm2 (± sem의 의미 n = 55). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: pBECs의 Immunocytochemical 특성. 1.12 cm2 투과 막 삽입에 성장 하는 pBECs에 대 한 필터 삽입 쥐 이다 위에 기본 음, 꽉 연결 구성 요소 (A) Claudin의 면역 형광 현미경 분석에에서 조-1, 5 (B) Occludin (C) 그리고 외화 접합 단백질 (D) p120 catenin 셀 접속점에 잘 정의 된 지역화를 보여주었다 스핀 들-모양, 겹치지 셀 confluent 뇌 내 피 세포 층을 공개 합니다. 모든 사진에 대 한 눈금 막대: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
정화와 pBEC의 확산
정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운 근육 세포의 뿐만 아니라 환자의 세포 (fibroblast와 같은 속성을가지고)의 제거를 보장 하기 위해 설계 되었다 주의 성장 더 빠르게 내 피 세포 문화에 보다. 마찬가지로, 백색 질 재료의 최소화 순수한 내 피 세포 배양, 더 적은 오염 세포 격리 된 모 세관 조각에서 성장 하는 결과. 그러나,이 단순화 및 격리에 대 한 적용 하는 빠른 방법은 격리 된 모세 혈관의 수익률을 회색 물질 격리의 최적화 각 뇌의 수익률을 크게 향상 시킬 수 있습니다. 밀도 그라데이션 대체 정화 프로토콜69에 포함 되어 있는 무료 내 피 세포를 분리 하 고 내 피 세포의 순도 향상 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 시간이 소요 마찬가지로 수익률을 낮출 수 있습니다. 이 정화 방법의 둘 다 광범위 하 게 사용 되었고, MC와 사이토 공동 문화 (일반적으로 500-1500 Ω c m2)7,16, 높은 TEER pBEC 모델 생성의 특성을 공유 하 고 21,22,,4957,70,71.
높은 paracellular 제한으로 monolayers를 설치 하기 위하여 경험 pericytes 내 피 문화16에서 제거 되어야 합니다 나타났습니다. 일반적으로 돼지의 뇌 pericytes pBEC 레이어 아래 성장 하 고 쥐 뇌 내 피 세포72,73의 문화에 대 한 관찰로 내 피 층에 구멍을 발생 하지 않습니다. 그러나 PBEC 문화 할,에서 Pericytes 그리고 불규칙 한 셀 경계선16나타나는 광범위 한 내 피 세포의 형태에 영향을 미칠 경향이 있다. 뇌 내 피 세포는 microvessels에서 다른 세포 유형 보다 높은 수준의 경과 전송기 (예: P-당단백질)의 표현, 때문에 puromycin 치료74에 의해 오염 셀의 수를 줄일 수 있습니다. 또한 사용 하 여 플라스마 파생 된 혈 청 (PDS)의 태아 또는 신생아 송아지 파생 된 혈 청 호의 내 피 세포의 성장 보다는 PDS는 혈소판 파생 된 성장 인자와 혈관 내 피 성장 성장 요인의 낮은 농도 요소 BBB 침투성을 증가 하 고 자극 하는 신생14,,7576,77에 표시 됩니다. 고립 된 모 세관 파편의 초기 문화를 소개 하 고 puromycin 치료 (4 µ g/mL)와 PDS의 사용이 결합, 우리 이후 우리가 할 수 있도록 정화, 후 남은 오염 셀의 수를 크게 감소에 성공 침투성 막 삽입에 꽉 내 피 monolayers를 설정 합니다. 문화 요리 및 투과성 막 삽입 표면에 내 피 세포의 최고의 부착을 지키기 위하여 관찰 되었다 (에서 인간 태 반) 콜라겐 유형 IV 및 fibronectin 코팅 혼합물 크게 확산 증가 수율, 그리고 결합 된 혼합물은 교원 질 유형 I78만 사용 하는 전통적인 방법에 따라서 선호 됩니다.
셀과 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER의 설립의 차별화
MC에 pBECs 일반적으로 이다 공동 문화 기능 꽉 접합을 유도 하 고 높은 TEER 값16,57달성에 대 한 중요 하지 않습니다 있도록 격리, 다음과 같은 많은 BBB 주요 기능을 유지 합니다. BBB 표현 형으로 내 피 세포의 분화 조건을 최적화 하는 노력 등이 포함 하는 혈 청의 사용 매체 8-CPT-캠프, 날린7 (세포내 캠프 레벨13증가)와 보완 및 RO 20-1724 (세포내 캠프 수준 유지), 하 이전 결과74,79 함께 따라 성공적으로 장벽 압박감을 향상 TEER, 증가 하 고 또한 더 복원 하는 데 도움이 될 수 있습니다 vivo에서 유전자 발현 같은80프로 파일. 그러나, 내 피 층의 강화를 위한 날린을 사용 하 여 특정 자극 하 고 염증 하는 동안 응답을 항 암 치료 및 cytokines의 조사에 대 한 모델을 사용 하 여 목적 내 피 세포의 응답을 수정할 수 있습니다는 날린의 사용은 피해 야 할 수 있습니다.
엠씨와 함께 비교 연구, ACM와 사이토 엠씨 공동 모두 참여 실험실에와 다른 문화, astrocytic 기여는 내 피 BBB 기능을 개선 하 고 장벽 압박감을 증가 표시 되었습니다. 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. pBECs 표현 형 BBB의 이러한 높은 표현을 달성 하기 위해 우리는 이다와 NCC를 설립 하 고 발견 둘 다 돼지 쥐 기본 이다 유리, 또한으로 다른 실험실22에서 관찰 했다. 사이토 NCCs의 설립 동안 경험이 나타났습니다 순도 사이토 문화 시대의 영향 결과 내 피 장벽 압박감, with는 이다 2-8 주 되는 시간이 지남에 사이토 형태에서 관찰 된 변화를 상관의 최적의 나이. NCC를 수립 하기 전에 하루에는 이다에 대 한 중간 변화는 유해한 대사 산물을 제거 하 고 자극 및 배리어 개발에 영향을 미치는 신호 요소를 이다에 대 한 충분 한 시간을 허용 하는 위한 것입니다. 공동 투과성 막 삽입 시스템에는 내 피 세포와 이다 경작 때 그것은 장벽 모델의 처리에 특별 한 관심을 지불 하는 것이 중요. 중간 변경 동안 모두 포부와 매체의 추가 및 삽입의 움직임 수행 되어야 합니다 신중 하 게 내 피 방 벽의 중단을 최소화.
재현성 및 신뢰성
생체 외에서 모델을 수립에 대 한 1 차 셀을 사용 하는 경우 큰 도전 문화 사이 높은 재현성을 달성 하기 위해입니다. 이러한 표준화 방법, 높은 품질 도구 및 시 약, 기정에서 경험의 사용의 선택에 의해 충족 수 있습니다. 제시 방법에 대 한 낮은 일괄 배치 변이로 높은 재현성은 따라서 매우 엄격한 준수 설명된 절차에 의존 합니다.
감소 유연한 젓가락 전극 사용 될 수 있습니다 TEER 측정, 조직 저항 측정 챔버 또는 엄밀한 미니어처 전극 가진 상피 전압계 동안 일괄 처리 및 튜브 사이 좋은 재현성을 달성 하는 관찰 TEER 값의 다양성 높은 TEER 값 (그림 4)을 달성, 뿐만 아니라 해당 낮은 작은 용 질 침투성 (그림 4)와 pBECs (그림 5의 immunocytochemical 특성에 의해 제시 모델의 신뢰성은 확인 ).
적용된 방법 및 모델의 한계
유전자 변형 및 소형 돼지의 사용은 마지막 십 년간 동안 증가 하지만 시내 vivo 데이터의 양을 제한 설치류 모델에 사용할 수 있는 데이터에 비해 이며 따라서 체 외에 돼지 데이터 비교에 대 한 도전 포즈 수 있습니다. 와 결과 vivo에서 . 그러나, 돼지의 생물학 인간 생물학 많은 설립된 실험실 동물 보다 더 밀접 하 게 반영 하 고 유전자 변형 돼지 모델84의 가용성을 설립 알 츠 하이 머 병 되었습니다 지금 같은 신경 질환을 공부 vivo에서 데이터는 적은 시간 문제가 될 전망 이다.
BBB의 현재 투과성 막 삽입 시스템 모델의 한계는 microvessels에 혈액의 흐름을 모방 하는 무 능력 이다. Vivo에서, 전단 응력은 보였다 부문, 차별화, 마이그레이션 등 apoptosis85,86, 내 피 세포 생리학의 많은 측면에 영향을 하 고와 같은 중요 한 BBB 특성에 영향을 접합 단백질 및 유도 및 전송기61,,8587의 분극의 식입니다. 같은 조건 소개, 새로 개발된 된 미세 시스템88,,8990여겨질 수 있다.
예측된 '본질적인 침투성'는 비보에, 소프트웨어 기반의 접근21을 사용 하 여 파생 체 외에 침투성 데이터에서 unstirred 물 층 (수성 경계 층)의 효과 대 한 하는 유용한 방법이입니다. 이 소프트웨어는 또한 자세한 침투성 데이터 분석21에 대 한 사용할 수 있습니다.
미래의 응용 프로그램 및 방법에 대 한 방향
혈관 단위의 구성 요소 유도 및 BBB 기능 유지에 중요 한 역할을 보여왔다 고 아니 현재 생체 외에서 모델 아직 완전히 vivo에서 조건, 중요 한 성분 모방 할 수 있다 고 상호 작용은 아직 없을 수 있습니다. 제시 모델 개발에 노력을 현재 이다 pericytes, 및 다른 종의 세포 결합 실험 트리플 문화 모델을 설정 포함 됩니다. Pericytes의 지금까지 하지 않은 장벽의 TEER 수준을 크게 증가 관찰 되었습니다. 그러나, syngeneic 돼지 모델 관찰 되었습니다 트리플 문화 돼지 뇌 내 피 세포, 쥐 이다 쥐 pericytes 장벽 압박감 및 두뇌의 각 인 단백질 특성의 표현을 사용 하 여 비교 해야 피22. 모델을 개발 하기 위하여 기반 인간 세포, 생체 외에서 의 미래 개발에 BBB 모델 약물 발견 및 배달 인간 pluripotent 줄기 세포 및 성체 줄기의 유도에 의존 수 있습니다 또는 조상 세포21에 대 한.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 보고.
Acknowledgments
저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
| DMEM/F-12 | Lonza | BE12-719F | |
| DMEM/Low Glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Invitrogen | 15140 | |
| Plasma derived serum (PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
| Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| 8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
| RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EtOH | VWR | 20,824,296 | Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Collagenase CLS2 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| ddH2O | Made with Elga System | ||
| T75 flasks | Thermo Scientific | 156499 | |
| Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) | Costar | CLS3401 | 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane |
| 15 ml centrifuge tubes | Cellstar | 188271 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Cellstar | 227261 | |
| Petri dishes | Thermo Scientific | 150350 | |
| Cryo vials | Thermo Scientific | 377224 | |
| 500 ml bottle | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
| Scalpels | Swann-Morten | REF0211 | Type 24 |
| Tissue homogenizer | Sigma | D9188 | |
| 140 μm filters | MERCK | NY4H04700 | |
| 40 μm filters | Corning | 431750 | |
| EndOhm chamber system | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm chamber for 12mm Culture Cups |
| EVOM2 electrode system | World Precision Instruments | 300523+STX100C | TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair |
| Long needle | Sigma | Attach to a syringe | |
| Fine-tip curved forceps | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
| Broad tip forceps | VWR | 82027-390 | |
| Filter holder | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
| 50 ml syringe | Braun | 4617509F | |
| 10 ml syringe | Terumo | SSt20ESI | |
| Anti-Occludin antibody | Abcam | ab31721 | 1:100 |
| Anti-p120 Catenin antibody | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
| Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
| Anti-Claudin 5 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
| Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
| Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 | Thermo Scientific | A21202 | 1:500 |
| Sucrose | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µl/ml final working conc |
| Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 µg/ml final working conc |
References
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