Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 2, 1
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Summary

Цель Протокола заключается в представлении оптимизированная процедура для создания в vitro гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) модели на основе первичных свиного мозга эндотелиальных клеток (pBECs). Модель показывает высокую воспроизводимость, высокая герметичность и подходит для исследования транспорта и внутриклеточных оборота лекарственных препаратов.

Abstract

Целью настоящего Протокола представляет оптимизированная процедура для очистки и выращивание pBECs и установить в vitro гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) модели, основанные на pBECs в моно культура (MC), MC с кондиционером экзоцитоз среднего (ACM), и Бесконтактный культуры (НКК) совместно с астроциты свинины или крыса происхождения. pBECs были изолированы и культивировали из фрагментов капилляров от мозга коре домашних свиней 5-6 месяцев. Эти фрагменты были очищены путем тщательного удаления мозговых оболочек, изоляции и гомогенизации серого вещества, фильтрации, ферментативного пищеварения и центрифугирования. Для дальнейшей ликвидации загрязняющих клетки, капиллярные фрагменты были культивируемых с puromycin содержащих среднего. Когда 60-95% притока, pBECs, растущих из капилляра фрагменты были пассированной на проницаемой мембраны фильтра вставляет и созданы в модели. Для повышения герметичности барьер и BBB характерные фенотип pBECs, клетки рассматриваются следующие факторы дифференциации: мембраны permeant 8-CPT-лагерь (здесь сокращенный), гидрокортизон и ингибитор фосфодиэстеразы, RO-20-1724 (RO). Процедура была проведена в течение 9-11 дней, а при создании модели НКК, астроциты были культивированный 2-8 недель заранее. Соблюдение описанных процедур в протоколе позволило создание эндотелиального слоя с весьма ограниченным параклеточный проницаемости, с НКК модели показаны средние трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР) 1249 ± 80 см Ω 2и параклеточный проницаемости (Papp) для Люцифера желтый 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 см сек-1 (означает ± SEM, n = 55). Дальнейшая оценка этой pBEC фенотип показал хорошее выражение туго белков соединительной Клаудин 5, ZO-1, occludin и adherens перекрестка белка p120 катенина. Представленная модель может использоваться для ряда исследований BBB в здоровье и болезни, и, с строгими параклеточный проницаемости, эта модель подходит для исследования транспорта и внутриклеточных людьми.

Introduction

Сотовая структура и функции гематоэнцефалического барьера

В интерфейсе кровообращения и центральной нервной системы (ЦНС) BBB выступает в качестве ключевых нормативных сайт для управления homoeostatic ЦНС микроокружения, который необходим для правильного функционирования и защиты нервной системы. На сайте BBB является эндотелиальных клеток, выстилающих просвета кровеносного сосуда. В капилляров мозга эндотелиальные клетки образуют комплекс межклеточных плотные соединения и сильно поляризованных выражение структуры конкретной приток и измеряем перевозчиков обеспечить весьма конкретные молекулярные транспорта между кровью и мозг 1. Структурные компоненты жесткие соединения комплексов белки из семьи occludin и Клаудин, zonula occludens (ЗО) белки, cingulin и связанные молекулы адгезии соединительной (джемы). Клаудин 5 особенно важна в параклеточный соединительной ограничения. Индукция и поддержание этой характерной BBB эндотелиальной фенотип включают динамические взаимодействия с окружающих клеток, включая pericytes, астроциты, нейроны и подвал мембраны, которые вместе с мозга эндотелиальных клеток формы нервно-сосудистого блок (NVU)2,3. Механизмы, участвующие в этих взаимодействиях пока еще не полностью изучены, но включают в себя обмен химических сигналов между клетками, которые позволяет модуляции BBB проницаемости в краткосрочной перспективе и вызывает долгосрочные BBB особенности4. Астроциты особенно известны вносить фенотип эндотелиальных клеток мозга и являются источником регулирования факторов, таких как глиальных нейротрофического фактором (внутриклеточный лагерь)5, основные фибробластический фактор роста6, Гидрокортизон7и преобразование фактор роста β (TGF-β)8. Однако, эффект TGF-β, был обсуждается9.

В естественных условиях в Vitro BBB

В vivo исследований по-прежнему предоставляют ценную информацию по биологии BBB. Однако модели культуры клеток может предоставить дополнительные идеи и представляют собой полезные инструменты для понимания детальные молекулярной и функциональные аспекты BBB в здоровье и болезни. Хотя сложных взаимодействий между типами клеток и составляющих BBB трудно полностью достичь в моделях в пробирке , там был, начиная с первой очистки эндотелиальных клеток мозга и применение их в моно культур 10 , 11 , 12, экстенсивное развитие очистительных процедур и условий роста BBB ячейки модели культуры, что приводит к большей сходство барьер в естественных условиях . Часто используемые в vitro BBB модели основаны на первичной клетки грызуна, свинину и говядину происхождения и на увековечен клеточных линий. Каждая модель имеет свои преимущества и недостатки. Для сравнения и модель выбора проверки маркеров, такие как выражение BBB ферментов, транспортеры, рецепторы, и структурных белков используются для создания обзоры текущей установленной модели1.

Цель протокола

Одной важной особенностью BBB барьер герметичности и высокой ТЕЕР, но большое количество доступных моделей также не отражают уровни в естественных условиях . Включение развития и оптимизации вклада от нескольких лабораторий, Цель настоящего Протокола заключается в представлении метод для создания высокой ТЕЕР в vitro BBB модель на основе первичных pBECs в MC с или без ACM, или в НКК с начальной Астроциты крыса или свиного происхождения. Применяемые процедуры и создание модели включают в себя усилия по ликвидации загрязняющих клеток и для улучшения дифференциации pBECs в BBB фенотип. Эта работа привела в создании надежных, высококачественных ТЕЕР моделей с низким параклеточный проницаемости и хорошее функциональное выражение ключевых туго соединительной белков, перевозчиков и рецепторы. Однако как астроциты являются фактором, способствующим фенотип эндотелиальных клеток мозга, три различных условий культуры представляют собой три разных фенотипов эндотелиальных клеток мозга. НКК модель специально полезно для исследования некоторых специализированных механизмов, участвующих в лекарственных препаратах, транспортных исследований и внутриклеточных людьми, а также для исследования взаимодействия клеток где максимальное выражение BBB функций является выгодно.

Происхождение и история протокола

Модель pBEC, описанные здесь в основном основана на свинину модель, разработанная в лаборатории «Eisai» (Лондон) д-р Луизы Морган и его коллеги, whichis, на основе успешных ранее мозга эндотелиальных клеток модель13. Оригинальный метод подготовка клетки была двухступенчатой фильтрации с помощью нейлоновых сетки поймать микрососудов, последовал subculturing шаг для улучшения чистоты. В более ранних разработки метода оптимального BBB фенотипа и барьер герметичность были достигнуты роста в дополнение среде, включая ACM. В лаборатории проф. н. Rothwell в Манчестер Великобритания14,15р. Скиннер были сделаны дальнейшие изменения в метод. Этот метод был принят в лаборатории Эбботт, KCL Лондон, где Патабендиге сделали это значительно проще подготовить, избегая использования астроциты или ACM и устраняя вредные клетки, такие как pericytes с puromycin. Документы первой подтвердил, что модель MC сохранились несколько важных особенностей в vivo BBB, включая эффективные плотные соединения, мембранных транспортных систем и рецептор опосредованный Трансцитоз16,17 , 18 , 19 , 20. позднее S. Юсуф снова протестировано экзоцитоз Сопредседатель культуры и она значительно улучшилась ТЕЕР, так что это предпочтительный вариант, в настоящее время используется в лабораторию Эббот21. Модели был успешно передан M. Nielsen лаборатории в Орхусе, где дальнейшие изменения были введены (этот протокол), включая упрощение серый вопрос извлечения, используя только один сетки фильтрации шаг и шаг покрытие один фильтр сочетание коллагена и фибронектина. Прикладная процедура изоляции свинину астроциты (этот протокол) был основан на протоколах, разработанных лабораторией т. Moos в Ольборг, описываемого Thomsen et al22. ТЕЕР и другие свойства модель, созданная в Лондоне и Орхус похожи, который придает уверенность в том, что модель легко передается между лабораториями и хорошо реагирует на тщательное наблюдение и рационализации метода действия. Действительно S. Юсуф теперь создана модель MC в тропические страны (Малайзия)23, предполагающей дополнительную корректировку для местных условий и ткани источников.

Преимущества над альтернативными методами и в настоящее время созданы модели

По сравнению с эндотелиальных клеток мозга крупного рогатого скота и грызунов происхождения, pBECs обеспечивают преимущество более низкий уровень потерь в vivo фенотипа BBB после изоляции24. Кроме того pBECs способны образовывать относительно жесткая эндотелиальной барьеров, даже когда выросла в16 MC (800 Ω см2) по сравнению с часто сообщаемых уровней для монослои клеточных линий, таких как bEND.5 и bEND.3 (50 Ω см2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω см2)28,29,30и cerebEND (500 Ω см2)29,,3132и первичного мозга эндотелиальные клетки мыши (100-300 Ω см2)SS = «внешней» > 33,34,,3536 и крыса (100-300 Ω см2)37,38. Однако ТЕЕР показал зависимость на процедурах очистки и культуры. В большинстве случаев добавлением ACM или совместного культуры с астроциты показывает дифференциации воздействия на эндотелиальных клеток и увеличение в герметичности эндотелиального слоя1. Тем не менее, с усилиями по оптимизации условий культивирования, только говядину на основе модели показали значения ТЕЕР сопоставимы с свинину на основе моделей (в среднем 800 Ω см2 в MC, до 2500 Ω см2 экзоцитоз Сопредседатель культуры)13 ,39,40,,4142,,4344,45. Как модели, основанные на первичного мозга эндотелиальных клеток показали большие вариации, как между, так и в лаборатории14,45,46,47,48, воспроизводимости может быть проблемой. В модели pBEC, сообщили здесь участвующих лабораторий достигли очень похожие ТЕЕР и параклеточный проницаемости значения с низкой изменчивости, как в, так и между лабораториями. Следовательно должно быть возможно для других лабораторий учредить надежную модель с низкой изменчивости, с помощью метода, представленные здесь. Помимо формирования жесткой эндотелиального слоя, модели с pBECs ранее были подтверждены выражением туго Джанкшен белков, функциональные BBB перевозчиков, рецепторы и ферментов и продемонстрирована пригодность для ряда исследований15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Кроме того, неопубликованные транскриптом данные о сотрудничестве культур pBECs показывает ожидаемое профиль BBB перевозчиков и рецепторов (неопубликованные результаты, Нильсен и др.).

BBB свинину ориентированная модель имеет еще одно преимущество как генома, анатомии, физиологии, и прогрессирования заболевания свиней отражают биологии человека в большей степени, чем другие установленные модели60, которые являются благоприятные возможности для Фармацевтическая промышленность. Как свиные мозги общим побочным продуктом мясной промышленности, они представляют собой легко доступного источника мозга эндотелиальных клеток, свести к минимуму количество животных для экспериментов и обеспечение высокой очистки доходность от одной свиного мозга. Хотя очистки и культивирования клеток первичного несколько трудоемкий и требует знаний для стандартизации в создании модели, первичные элементы генерировать самые надежные модели BBB. Увековечен клеточных линий не могут заменить, как важные свойства, такие как барьер герметичность, транспортер выражение профили и микроокружения регулирование не отражают экспериментальной выводы в vivo61, 62. в vitro модели обеспечивают преимущество клеток изображений с высоким разрешением, возможность визуализации внутриклеточных процессов, позволяя близость подход к пробы или наблюдаемых ячейки, используя цели с увеличение и лучше оптическое качество63. Это не дело для использования двух Фотон микроскопии в живых животных. Кроме того в пробирке модели обеспечивают возможность transfect клетки, позволяя визуализации тегами белков и расследования их незаконной торговли.

Применение модели

Функция BBB не является фиксированной и может быть динамически модулированный в физиологии и патологии. Во многих неврологических заболеваний, в том числе нейродегенеративных воспалительные и инфекционные заболевания, нарушения и повышение проницаемости BBB наблюдается64,65,66,67 . Для того, чтобы уменьшить и предотвратить прогрессирование заболевания и последующего ущерба, определение и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе модуляции BBB являются большое значение. В этом контексте надежные в vitro модели пользуются большим спросом в фармацевтической промышленности и Кроме того играют важную роль в прогнозировании BBB проницаемость наркотиков в ЦНС. Любая модель в пробирке , выступающей в качестве экрана проницаемости должен отображаться ограничительные параклеточный путь, физиологически реалистичные клеток архитектуры и функциональных выражение транспортер механизмы68. Продемонстрировал в предыдущих исследованиях16,17,57и параклеточный проницаемости и выражение AJ и TJ белков здесь, представленная модель отвечает всем этим критериям и подходит для диапазона BBB исследования в обеих нормальной физиологии и патологии. Преимущества метода представленных очищения и культивирования включают в себя сочетание простоты и воспроизводимость и возможность включать Астроцитарная влияние с результирующей надежные и высокой ТЕЕР в vitro BBB моделью. Для этого назначения, астроциты свинины и крыса происхождения было показано для увеличения BBB фенотипа pBECs в аналогичный способ22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

свиные мозги были получены как побочные продукты Датский пищевой промышленности. Датский бойнях находятся под строгим надзором и наблюдением датского министерства охраны окружающей среды и продовольствия.

крыс, используется для изоляции астроциты были воспитанные и группа размещается в Фонд местных животных при температуре 22 ° С - 23 ° C и на 12/12 h темно/свет цикла под инспекции ветеринар и датский правила для лабораторных животных. Крысы были умерщвлены прежде, чем они были принесены в соответствии с международных руководящих принципов этического использования животных (Европейская директива Совета сообществ 24 ноября 1986 года; 86/609/EEC) и Дании руководящие принципы. В естественных условиях экспериментов на животных или человека материала были использованы в этих экспериментах.

Примечание: ниже приводится pBEC основной протокол, описывая очистки (Шаг 1), культивирование (Шаг 2) и (Шаг 3) ТЕЕР измерений. Для установки НКК с астроциты, представлены альтернативные protcol (Шаг 4), описывая очищения и выращивание крыса и свинину астроциты.

1. Очищение капилляров свиного мозга

  1. собирать мозги 8-10 от 5-6-месячного домашних свиней (например от близлежащих скотобойня) и транспортировать их на льду в лабораторию. Мы рекомендуем начинать следующую процедуру очищения в течение 2-3 h прекращения животного.
  2. Место мозги, в стерильных потока скамьи и аккуратно мыть их с PBS 1 Л на стакан на ДВС.
  3. Тщательно удалить мозговых оболочек из одного мозг на время, используя пинцет штраф наконечник и передачи свободных мозговых оболочек мозги в другой стакан емкостью 1 Л с PBS на льду. Продление времени может осложнить удаления. Приблизительное время для каждой мозг должен быть 10-15 мин
  4. С помощью скальпеля, соскрести серого вещества из одного мозга одновременно и передачи изолированных материала Петри (8,8 cm 2), содержащий 20 мл DMEM питательной смеси F-12 (DMEM/F-12) размещены на льду. Изолируйте как много серого вещества как можно без снятия материала белого вещества. Для первоначального фрагментации, запустить материал серого вещества через 50 мл шприц без иглы. Продолжить для все мозги и объединить собранные серого вещества материала. Продление времени может осложнить удаления. Приблизительное время для каждой мозг должен быть 10-15 мин
  5. Передачи изолированных серого вещества материала точильщика трубки гомогенизатор ручных тканей в соотношении 50/50 с DMEM/F-12 средствами массовой информации. Однородный материал, сделав 8 вверх и вниз штрихами с свободно пестиком, следуют 8 вверх и вниз штрихами с жесткой пестиком. Продолжать пока все изолированные гомогенизированные материал, затем передать бутылка 500 мл огневки и разбавляют DMEM/F-12 до приблизительно 450 мл общего объема.
  6. Фильтр огневки, используя синий Кап бутылка 500 мл с держатель фильтра и 140 мкм фильтр сетка и изолировать капилляров, запустив в ткани через фильтр. Использование одного фильтра на 50 мл огневки и потом мыть каждый фильтр с DMEM/F-12.
  7. Место капиллярно содержащих фильтры в чашках Петри с раствором Пищеварение трипсина/ЭДТА (2,5% трипсина, 0,1 Нм ЭДТА в PBS), коллагеназа CLS2 (2000 ед/мл) и DNase 1 (3400 ед/мл) в среде DMEM/F-12. Используйте 1 чашку Петри (8,8 см 2, 20 мл раствора) за 3 сетки фильтр.
  8. Место Петри при 37 ° C для 1 h на орбитальный шейкер на 180 об/мин или перемешайте их нежно каждые 10 мин. После 1 h, смыть капилляры от фильтров с отстранением от Петри с помощью пипетки 1мл.
  9. Разделить подвеска из 3 блюд на 2 50 мл трубки и остановить пищеварение путем добавления каждого 50 мл тюбик 10 мл DMEM/F-12.
  10. Центрифуг клеточных суспензий на 250 x g, 4 ° C на 5 мин аспирационная supernatants и вновь приостановить каждой гранулы в 10 мл DMEM/F-12. Добавьте еще 20 мл DMEM/F12 к каждой трубе. Повторите этот шаг центрифуги дважды.
  11. Пусть трубы остыть на льду на 5 мин и передачи решения 2 новых 50 мл трубки.
  12. Центрифуга клеточных суспензий на 250 x g, 4 ° C на 5 минут и вновь приостановить каждой гранулы в 8-10 мл (примерно 1 мл/мозг используется) замораживания раствора, состоящий из 10% ДМСО в FBS.
  13. Суспензию клеток передавать криопробирки, используя 1 мл на cryovial. В среднем очищение приводит к 1 флакон за мозг используется, в среднем предоставление эндотелиальных клеток для вставки 12-16. Место флаконов в коробке замораживания при температуре-80 ° C для по крайней мере 4 ч до ночлега. Затем, хранить криопробирки в cryotank с жидким азотом.
    Предупреждение: Жидкий азот имеет экстремально низких температурах. Пожалуйста, носите надлежащей защиты.

2. Культивирование первичных pBECs (8-10 дней)

  1. Первоначальной культуры (3-5 дней)
    1 день
    1. для оптимизации условий для вложения pBECs, выполняют покрытие колбы T75, добавив раствором с финал концентрации коллаген IV (150 мкг/мл) и фибронектина (50 мкг/мл) в ddH 2 O к колбе, убедившись, что решение охватывает всю поверхность. Для каждого T75 настой используйте 10 мл. Инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
      Примечание: Покрытие может быть выполнена непосредственно перед использованием или до за неделю до и хранятся с PBS на 4 ° C. Покрытие не должна высыхать, или она больше не будет сформировать подходящий привязанность и роста поверхность.
      2. Средний
    2. подготовить 16 мл pBEC роста, состоящий из DMEM/F-12 дополнена 10% плазмы производные сыворотки (PDS), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гепарина (15 ед/мл). Дополнение в среду с puromycin (4 мкг/мл) для выбора эндотелиальных клеток. Имейте в виду, что лечение puromycin может использоваться только для максимум 5 дней.
    3. Алиготе подготовленный носитель в 6 мл и 10 мл тома в два 15 мл пробирок.
    4. Флакон с капилляров из жидкого азота (шаг 1.13) и разморозить капилляров путем использования ванну воды 37 ° C или путем добавления 750 мкл подготовленный среды от 6-мл Алиготе. Если оттаивания, добавив среднего, тщательно Пипетка вверх и вниз, оттепель и приостановлении гомогенизировать. Когда таял, передачи суспензию клеток средний 6-мл аликвота.
    5. Чтобы удалить замораживания среды, спина капилляров вниз на 250 x g, 4 ° C на 7 минут
    6. Тщательно удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в 1-2 мл 10-мл Алиготе. Когда вновь приостановлено, передачи решение в 10-мл средний аликвота.
    7. Передавать покрытием колбы T75 капиллярного подвеска и аккуратно наклоните Фляга для обеспечения равного распределения по поверхности. Место T75 настой при 37 ° C, 5% CO 2.
      День 2
    8. После ночи инкубации, подготовить 10 мл pBEC роста среднего дополнена puromycin (4 мкг/мл) для одного T75 колбу и среднего изменения. Имейте в виду, что все средних решения, примененные к ячейкам должен быть подогретым до 37 ° C перед использованием.
      Примечание: в качестве альтернативы, среднего изменения может быть осуществляется 4-6 ч после покрытия когда капилляров должны прикреплены к поверхности. Инкубируйте клетки до достижения 60-95% слияния, обычно 3-5 дней от таяния. Сделать не Аллоw клеток для достижения 100% слияния, чтобы избежать контакта ингибирование, который может остановить дальнейшее клетки роста.
      День 4-6
    9. Когда достигается желаемый confluency, проход эндотелиальные клетки проницаемой мембраны вставки (см. раздел 2.2). Если желаемый confluency достигается не на 4 день, производится изменение среды. На самой последней на 6 день клетки следует пассированной на проницаемой мембраны вставок. Если не требуется confluency достигается за счет 6 день, клетки не подходит для экспериментального использования.
      Примечание: подготовка астроциты для НСС: при настройке совместного культуры модель, 2 - 8 недели старый астроциты в культуре (см. раздел 4) должно быть подготовлено для модели совместного культуры выполнения среднего изменения на день раньше пассированый эндотелиальных клеток для вставки. Для каждого экзоцитоз, готовят 1500 мкл экзоцитоз роста средних состоящий из DMEM низкий глюкозы с 10% FBS, пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и затем выполнить среднего изменения.
  2. Роста pBECs на проницаемой мембраны вставляет (5 дней)
    4-6 день
    1. подготовить проницаемой мембраны вставляет (12-ну пластины со вставками 1.12 см 2 площади поверхности, 0,4 мкм поры) для заполнение pBEC покрытием с коллагеном IV (500 мкг/мл) и фибронектина (100 мкг/мл) в ddH 2 O. Использование около 300 мкл для каждой вставки и убедитесь, что решение охватывает всю поверхность растет. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 для минимум 2 ч.
    2. Подготовить 30 мл pBEC среднего роста (для СМИ композиции, см. раздел 2.1.2) без puromycin.
    3. Аспирационная средних от pBEC культуры в колбу T75 и аккуратно мыть два раза с 5 мл стерильной PBS при комнатной температуре.
    4. Trypsinize клетки, добавив 2 мл раствора (2,5% трипсина, 0,1 Нм ЭДТА в PBS) трипсина-ЭДТА в T75 и место настой при 37 ° C, 5% CO 2 для 5-7 мин.
    5. Для отсоединения эндотелиальных клеток головного мозга, аккуратно нажмите сторону T75 колбу с рукой, в конечном итоге оставив сохранившихся и сильнее крепления pericytes на поверхности колбы. Визуально Исследуйте отряд под микроскопом. Когда наблюдается 80% отряда, остановить trypsinization, добавив 5 мл среды.
    6. Клетки решение передать 15 мл с помощью пипетки 10 мл и спин вниз эндотелиальных клеток мозга центрифугированием на 250 x g, 4 ° C на 7 минут.
    7. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в среде 1 мл. При приостановке, добавьте еще 2 мл среды, довести объем до 3 мл
    8. подсчитать количество ячеек вручную с использованием клеток подсчета камеру или камеру автоматическая система подсчета. Приготовляют раствор 2.2 x 10 5 клеток/мл среды, в результате окончательного заполнения плотности 1.1 x 10 5 клеток/вставить ячейки.
    9. Удалить раствор для нанесения покрытия из вставок проницаемой мембраны и передачи 500 мкл суспензии клеток для каждой вставки. На одном из вставок, добавить только среднего и использовать этот вставить как ' фильтр только ' управления для измерений ТЕЕР.
    10. Установить эндотелиальных клеток в MC, MC с ACM, либо в НКК с астроциты следующим образом:
      1. для MC: добавить 1500 мкл pBEC роста среднего/ACM в колодец 12-ну пластины под проницаемой мембраны вставок. Место вставки проницаемой мембраны при 37 ° C, 5% CO 2 и инкубировать в течение 2 дней и.
      2. Для НСС: передачи вкладыши для скважин с астроциты обновляется с экзоцитоз роста среднего за день до. Место вставки проницаемой мембраны при 37 ° C, 5% CO 2 и инкубировать в течение 2 дней и.
        Примечание: Имейте в виду использования различных типов носителей в нижней скважины из трех моделей,.
        День 6-8
    11. На 2 день, изменить СМИ на проницаемой мембраны вставок с pBECs. Подготовка 500 мкл pBEC роста среднего за вставки и тщательно выполнять изменения к минимуму нарушения слоя клеток. Инкубируйте клетки в течение двух дней. Имейте в виду, что средства массовой информации изменения выполняется на вставки только, а не на дно скважины.
  3. Стимуляции дифференцировки факторов (1-2 дня)
    8-10 день
    1. для каждого из различных моделей, стимуляции СМИ должен быть подготовлен следующим:
      1. для MC: для каждого Вставить и хорошо, подготовить 500 мкл среднего роста pBEC, содержащих лагерь (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон).
        MC: Подготовить дополнительно 1500 мкл среднего роста pBEC, содержащих лагерь (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон).
        MC с ACM: оттепель 1500 мкл ACM и дополнить его с лагерь (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон).
      2. Для НСС: для каждой вставки, подготовить 500 мкл среднего роста pBEC, содержащих лагерь (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон). Для каждого экзоцитоз хорошо, подготовить 1500 мкл DMEM/F-12 дополнена пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), гепарином (15 ед/мл), лагеря (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон).
    2. Для каждого из различных моделей, выполняют обмен СМИ следующим:
      1. для MC: тщательно аспирационная среднего из колодцев и вставки и добавить дифференциации среднего в обоих отделениях, используя 500 мкл для каждой вставки и 1500 мкл для каждой скважины. Учтите, что беспорядки на обе стороны пластины может повлиять на и нарушить слоя клеток.
      2. Для НСС: тщательно аспирационная среднего из скважин и добавьте 750 мкл дифференциации среднего за хорошо. Тщательно аспирационная среднего из вставок и добавьте 500 мкл дифференциации среднего за вставки. Затем добавить оставшиеся 750 мкл дифференциации среднего для каждой хорошо экзоцитоз.
    3. Для всех моделей: место клетки при 37 ° C, 5% CO 2 и инкубировать дифференциации среднего до следующего дня и.
      Примечание: Учтите, что для НКК с астроциты, астроциты являются от этой точки хранится в среде, свободной от сыворотки.

3. ТЕЕР измерения

  1. в день после того, как стимулирование клеток с дифференциации среднего, ТЕЕР измерений подготовиться камерная система измерения сопротивления тканей, промыв палата два раза с ddH 2 O, один раз с 70% EtOH за 5 мин и 2 раза с ddH 2 O.
  2. Добавить 4 мл DMEM/F-12 в зале измерения сопротивления тканей, подключить его к системе и калибровки для приблизительно 30 мин согласно следующие параметры: R = 0, тест R = 1000, режим = р.
  3. Выполнения измерений ТЕЕР размещая тщательно вставок в зале измерения сопротивления ткани. Для каждой вставки, выполнять измерения в трех экземплярах и вычислить среднее Ω cm 2.
    Примечание: Для модели совместного культуры, ТЕЕР значения ожидается достичь > 500 Ω см 2. Если соответствующий уровень ТЕЕР не достигнуто в первый день измерения ТЕЕР, добавить новые факторы дифференциации (лагерь (250 мкм), гидрокортизон (550 Нм) и RO (17,5 микрон)) и измерить ТЕЕР снова на следующий день. Когда соответствующие уровни будут достигнуты, модель должна быть готова для запланированного эксперимента. Имейте в виду, что клетки должна лежать по крайней мере 3 часа перед выполнением эксперимент, чтобы восстановиться после ТЕЕР измерения. После стимуляции, ТЕЕР значения в целом остаются приемлемыми для 24-48 ч после стимуляции.
    Примечание: Метод альтернативного и быстрее с помощью жесткой STX - 100C электрод пара также записывает высокой ТЕЕР в этой модели 81. Гибкий STX2 элеctrode пара дает менее надежным чтений.

4. ПОДГОТОВКИ из АСТРОЦИТОВ БЕСКОНТАКТНЫЙ Сопредседатель культуры: Альтернативный метод

  1. Очистки астроциты
    1. для каждого крыса мозг используется, слой 2 фляги T75, добавив 10 мл поли L-лизин (5 мкг/мл) в ddH 2 O для каждого T75 колбу. Инкубировать фляги при 37 ° C на 30 мин
    2. Изоляции астроцитов может быть выполнена следующим образом:
      1. крыса астроциты:
        1. обезглавить 2 1 - 2 день старых крыс, утвержденным методом.
        2. Вырезать кожу с черепом, начиная от шеи к носу и сократить кости с Сагиттальный разрез.
        3. Открыть черепа с Изогнутый пинцет, вынимают мозг и поместить его в 15 мл (трубка 1) с 11 мл DMEM низкий глюкозы с FBS и гентамицина сульфата 10% (125 мкг/мл).
        4. Тщательно удалить мозговых оболочек, используя пинцет штраф наконечник и приостановить мозга материал с помощью пипетки 1 мл.
      2. Свинину астроциты:
        1. 1, получить мозг от 5-6-месячного домашней свиньи.
        2. Осторожно снимите мозговых оболочек мозга, используя пинцет штраф наконечник или руки.
        3. Собирать 4 g серый вопрос от мозга и место штук в 1-2 мл DMEM низкий глюкозы с FBS и гентамицина сульфата 10% (125 мкг/мл) в чашку Петри. Если большие куски, фарш с скальпели или щипцами.
        4. Приостановить изолированных материал с помощью пипетки 1 мл, переместить его в 15 мл (1 флакон) и заполнить с DMEM низкий глюкозы с FBS и гентамицина сульфата 10% (125 мкг/мл) в суммарный объем 11 мл.
        5. Продолжать гомогенизации изолированных материал с длинной иглой, придает шприц 10 мл и приостановить вверх и вниз по 3 раза. Подождите, пока большие куски поселились в нижней части трубки, а затем собирать 7 мл средний от верхней части трубки (трубки 1).
        6. Фильтр суспензию клеток 7-мл через фильтр нейлон 40 мкм в новой 50 мл трубки (флакон 2).
          7. Средние
        7. Добавить 7 мл трубки 1 с мозгом. Продолжать гомогенизации и фильтрации от 4.1.2.2.5-6 шаги до тех пор, пока объем суспензии отфильтрованных клеток в трубе 2 составляет приблизительно 35 мл.
    3. Удалить раствор для нанесения покрытия из фляги T75 [шаг 4.1.1]. Быстрая стирка с 5 мл PBS после инкубации с поли L-лизин может использоваться для обеспечения, что клетки не страдают от каких-либо токсических эффектов покрытие решения.
    4. Делят и семян изолированных экзоцитоз раствор поровну между T75 колбы. Инкубировать фляги при 37 ° C, 5% CO 2 на 3-5 дней.
  2. Культивирование астроциты и подготовке НКК с эндотелиальных клеток (3 недели)
    1. Первоначальной культуры
      1. после 3-5 дней инкубации, выполняют среднего изменения тщательно аспирационных среднего и добавляя 10 мл DMEM низкий глюкозы с FBS и гентамицина сульфата 10% (125 мкг/мл).
        Примечание: После первого среднего изменения, средний должны меняться каждые 5 дней. В течение первых 2 недель встряхните флакон и вымыть клетки тщательно с PBS при изменении среды. Это помогает в удалении загрязняющих микроглии.
      2. После 3 недели культивирования trypsinize клетки, добавив 2 мл раствора трипсина-ЭДТА в нижней части каждого T75 колбу и инкубировать их при 37 ° C, 5% CO 2 для 5-7 мин.
      3. Остановить trypsinization, добавив 5 мл среды, передачи ячеек решение 15 мл и центрифуги астроциты в 250 x g, 4 ° C на 7 минут
      4. Тщательно удалить супернатант и вновь приостановить клетки в замораживания раствор, состоящий из 10% ДМСО в FBS.
      5. Подсчитать количество ячеек и подготовить решение клетки 4.0 x 10 6 клеток/мл. Заблокировать ячейки в криопробирки, добавив 1 мл в флаконе.
    2. Рост проницаемой мембраны вставить системы нижней скважины (2-12 недель)
      1. подготовить 12-ну пластины для роста астроциты, добавив 1 мл (5 мкг/мл) поли L-лизин ddH 2 O для каждой скважины. Поместите пластины при 37 ° C на 2 ч.
      2. Для каждого 12-ну плита, готовить 25 мл экзоцитоз роста средних (DMEM низкий глюкозы с 10% FBS и пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл)).
      3. Принесите Фиал астроциты из жидкого азота и размораживать клетки путем добавления 750 мкл DMEM среднего низкий глюкозы. Тщательно Пипетка вверх и вниз, оттепель и гомогенизации подвеска. Когда таял, передать 15 мл суспензии клеток и добавить средний суммарный объем 7 мл.
        Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкая температура, так что носить личной защиты такие перчатки.
      4. Чтобы удалить замораживания среды, спина капилляров вниз на 250 x g, 4 ° C на 7 минут
      5. Тщательно удалить супернатант и вновь приостановить клетки в средне.
      6. Снять покрытие из скважин 12 хорошо пластин и передачи суспензию клеток для скважин с помощью 1 мл за хорошо. Инкубировать клетки при 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Обновления среды каждый третий день и культура клетки для минимум 2 недели перед использованием клетки для совместного культуры с эндотелиальных клеток. Клетки могут быть использованы для совместного культуры на срок до 12 недель после оттаивания, оптимальный возраст, 2-8 недель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Создание моделей в Vitro BBB

В методе представлены, оптимизированный выращивание pBECs и создание системы Вставка проницаемой мембраны с MC или без ACM или НКК с астроциты (рис. 1) была проведена в течение 9-11 дней (рис. 2). Для выбора эндотелиальных клеток, первоначальный культуры очищенного капиллярного фрагментов была объединена с puromycin лечения для максимум 5 дней, которые ликвидировали большинство загрязняющих клеток и способствовали росту веретеновидной формы эндотелиальных клеток от Капиллярный фрагменты (Рисунок 3А-C). В день 4-6 pBECs увеличилось на confluency 60-95%, рост как non перекроя, контакт тормозится, продольно унифицированных ячеек. Когда клетки достигли желаемого confluency, pBECs были покрытием на IV коллагена и фибронектина покрытием проницаемой мембраны вставка фильтра мембраны (1.12 см2 площади поверхности, 0,4 мкм поры) при плотности 1.1 x 105 клеток/Вставка, в которой они обычно формируется вырожденная монослои после 4 дней (день 8-10 пост изоляции). При совместном культивировании pBECs, астроциты крыса или свиного происхождения были позолоченными на поли L-лизин покрытием дна скважины для минимум 2 недели до начала НКК (рис. 3D). При установлении НКК, опыт показал, что астроциты, культивированный для 2-8 недель обеспечивают лучшую поддержку для содействия BBB фенотип в pBECs; в течение этого времени астроциты сформирована вырожденная культур клеток, расположенных в структуре Сота как (Рисунок 3E-F). День 4 в модели системы Вставка проницаемой мембраны (день 8-10 пост изоляции), клетки были стимулируется с лагерь, гидрокортизон и RO для повышения герметичности барьер и BBB характерный шаблону туго соединительной белков, транспортеры, и рецепторы.

Характеристика pBEC фенотип и параклеточный проницаемости

Визуальные клеток инспекции в сочетании с измерением ТЕЕР регулярно являются наиболее надежные способы для оценки confluency и герметичности слоя эндотелиальных клеток, растущих на проницаемой мембраны вставок до экспериментов. Рисунок 4 показывает результаты от двух серий экспериментов для оценки малые молекулы препарата проницаемость через BBB, параметры управления ТЕЕР (отражающий ионной проницаемости), в сочетании с очевидной проницаемость21 (Papp, cm s-1) либо radiolabeled сахарозы или краситель трассирующими Люцифер желтый (LY), отражающие параклеточный проницаемости наркотиков типичных малых молекул (~ 200-600 да). Соединение интерес с Papp , больше, чем Papp сахарозы или LY (в зависимости от молекулярной массы наркотиков) может предложить transcellular проницаемости и/или транспорта через клетки. Рисунок 4 показывает, что в проницаемой мембраны пластины с pBECs культивировали выше крыса астроциты, хорошей партии pBEC (например здесь задать LY) будет генерировать TEERs в диапазоне 500-2000 Ω см2, с несколько выше или ниже. Некоторые пакеты, особенно во время ранних стадиях обучения протокол, могут иметь меньше TEERs вокруг 100-900 Ω см2 (например здесь задать сахарозы). ТЕЕР измерения позволяет выбрать фильтры, например, с началом ТЕЕР > 500 Ω см2, и над диапазон ТЕЕР показано, Papp относительно независимыми от ТЕЕР, свидетельствует о достаточно плотный барьер слоя для этих экспериментов. Протокол для измерения проницаемости зависит от типа экстракцию/конструкции. Для описания процедуры для измерения проницаемости малых молекул в НКК протокол описан в Юсуф, SR, et. Аль-21. Вычисление выражения белков туго перекрестка в pBECs в НКК с крыса астроциты показал локализации Клаудин 5, occludin и ZO-1 вдоль узлы ячеек, как показано иммунофлюоресценции (Рисунок 5A-C). Кроме того adherens Джанкшен белка p120 катенина показал четко распределение вдоль ячеек соединения (рис. 5 d).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление прикладных моделей в пробирке BBB. Схематическое представление проницаемой мембраны в MC (A), MC с ACM (B)и НКК с астроциты (C)вставить системы модели pBECs. В MC pBEC рост средний или ACM были применены в нижней скважины, тогда как в НКК, вставки с pBECs были помещены в скважинах с 2-8-недельных астроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема основных шагов во время выращивания pBEC и создание представленных моделей. Обзор и сроки для метода это схематическое представление резюмируются основные шаги в процедуре культивирования pBECs и создание представленных моделей, т.е. MC с или без ACM и НКК с астроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель время курс начальной культур pBECs и крыса астроциты. Фаза контраст изображения микроскопии культур pBECs (A-C) и астроциты (D-F) рассматривать более 5 дней. Очищенный капиллярного фрагментов в первый день первоначальной культуры, показали присутствие капилляров и загрязняющих клетки (A, день 1), который после среднего изменения на 2 день и один дополнительный день роста, показан выбор для pBECs, Начиная от капиллярной фрагменты их роста (Б, день 3). Вырожденная монослои pBECs обычно были достигнуты на день 4-6, в котором время pBECs показал веретеновидной формы морфологии и продольно были выровняны (C). Крыса астроциты, посеяна в нижней скважины обычно распространяются вырожденная слои в течение 5 дней (D-F)и были использованы для НСС моделей после 2 недель роста. Линейки для всех изображений: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: жесткие соединения целостность pBECs. Очевидной проницаемость (appP) pBECs параклеточный маркеров сахарозы (МВт 342,5 14C-маркировкой, 14,8-25,9 ГБК/ммоль) и желтой Люцифер (МВт 521.57, 10 мкг мл-1), заговор против ТЕЕР. pBECs были выращены на 1.12 см2 проницаемой мембраны вставка фильтров выше крыса астроциты в базе хорошо и маркеры добавлены в апикальной камеру. После 1 часа при 37 & #730; C, внешний вид маркера в зале базальной был измеренных и апикального в базальной Papp (x 10-6 см сек-1) рассчитывается. ТЕЕР измерялась > 3 ч до Papp, с помощью STX100C EVOM электроды, исправления для фильтра Вставка пустой проницаемой мембраны с сопротивление 150 Ω. средняя ТЕЕР для Люцифера желтый набора данных: 1249 ± 80 Ω см2 (означает ± SEM, n = 55). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: иммуноцитохимическое характеристика pBECs. Для pBECs, выращенных на 1.12 см2 проницаемой мембраны вставка фильтра вставляет выше крыса астроциты в базовый хорошо, микроскопия помощью иммунофлуоресцентного анализа жесткие соединения компонентов (A) Клаудин 5 (B) Occludin (C) ZO-1 и adherens перекрестка протеина (D) p120 катенина показали четкой локализации на перекрестках ячеек и показал вырожденная мозга эндотелиальных клеток слои с веретеновидной формы, non перекроя клеток. Линейки для всех фотографий: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Очистка и распространение pBEC

Во время процедуры очистки критические шаги включают быстрое и эффективное удаление мозговых оболочек и разделение белых и серых вопроса, который имеет важное значение для очистки урожайность и чистоты и для надлежащего создания модели. Для представленных в vitro BBB модели с помощью pBECs мы улучшили и упрощена процедура очищения, основанные на механической гомогенизации изолированных серого вещества, размер селективная фильтрация для изоляции микрососудов, пищеварение с коллагеназы , DNase и трипсина, с первоначальной культуры microvessel фрагментов. В целом одна из основных задач во время очищения и культивирования клеток первичного является ликвидация загрязнения клеток. Опыт с очисткой эндотелиальных клеток первичного мозга показал, что тщательное удаление мозговых оболочек и белого вещества результаты в улучшение чистоты и доходность капилляров, а также увеличить рост эндотелиальных клеток и выражение BBB характеристики. По этой причине тщательное удаление мозговых оболочек (включая внутри борозд) в протоколе представленных был разработан для обеспечения удаления лептоменингеальных клеток (которые имеют фибробластоподобных свойства), а также артерий и артериол гладких мышечных клеток, которые растут более быстро, чем эндотелиальных клеток в культуре. Аналогичным образом минимизация белого вещества материала привели к чище культур эндотелиальных клеток, с меньше загрязняясь клеток, растущих из изолированных капиллярного фрагментов. Однако это упрощенный быстрый метод применяется для изоляции снижает урожайность отдельных капилляров и оптимизации серого вещества изоляции может значительно улучшить доходность каждого мозга. Градиент плотности, который включен в протокол альтернативного очистки69, могут быть использованы для изоляции бесплатно эндотелиальных клеток и улучшения чистоты эндотелиальных клеток, но это отнимает много времени и может также снизить доходность. Оба этих метода очистки широко используется и характеризуется и обладают следующими общими характеристиками генерации высоких ТЕЕР pBEC модели в MC и экзоцитоз Сопредседатель культуры (обычно 500-1500 Ω см2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

Чтобы установить монослои с высоким параклеточный ограничительности, опыт показал, что pericytes должны быть ликвидированы с эндотелиальной культур16. Pericytes свиного мозга обычно растут под pBEC слои и не вызывают отверстия в эндотелиального слоя, как заметил культур крыса мозга эндотелиальных клеток72,73. Pericytes в pBEC, у культур, однако, как правило, влияет на морфологию эндотелиальных клеток, которые появляются более широкие и с неправильной клеток бордеров16. Потому что эндотелиальных клеток мозга Экспресс более высокие уровни измеряем транспортеров (например Р-гликопротеина), чем другие типы клеток в микрососудов, количество загрязняющих клеток может быть уменьшена puromycin лечения74. Кроме того использование плазмы производные сыворотки (PDS) вместо плода или новорожденного теленка производные сыворотки способствует рост эндотелиальных клеток, как PDS имеет более низкой концентрации факторов роста например, тромбоцитарный фактор роста и сосудистого эндотелия роста фактор, который повышают проницаемость BBB и стимулирует ангиогенез14,75,,7677. Представляя первоначальный культуры изолированных капиллярного фрагментов и сочетая это с puromycin лечение (4 мкг/мл) и использование PDS, нам удалось значительно уменьшить количество загрязняющих клеток, оставшихся после очищения, так что после этого мы могли бы создание жесткой эндотелиальной монослои на проницаемой мембраны вставок. С тем чтобы обеспечить лучшее вложение эндотелиальных клеток на культуру блюда и проницаемой мембраны Вставка поверхностей, было отмечено, что покрытие смесь коллаген типа IV (от человеческой плаценты) и фибронектин значительно увеличивает распространение урожайность и комбинированного смесь был поэтому выступает над традиционным методом, используя только коллаген типа I78.

Дифференциация клеток и создание модели в Vitro высокие ТЕЕР BBB

PBECs в MC обычно сохраняют многие BBB ключевых функций после изоляции, так что культуры совместно с астроциты не является существенным для стимулирования функциональной плотные соединения и достижения высокой ТЕЕР значения16,-57. Усилия по оптимизации условий для дифференцировки клеток эндотелия в BBB фенотип включают в себя использование сыворотки содержащих среднего дополнена 8-CPT-лагерь, гидрокортизон7 (повышение внутриклеточной лагеря уровня13) и RO 20-1724 (поддержание внутриклеточного уровня лагеря), который в соответствии с предыдущие выводы74,79 вместе успешно улучшена герметичность барьер и увеличение ТЕЕР и может также помогли восстановить более в естественных условиях как выражение гена профиль80. Однако, использование гидрокортизон для ужесточения эндотелиального слоя может изменять ответ эндотелиальных клеток определенные стимулы и для целей с использованием модели для исследования реакций к химио - и цитокины во время воспаления, Использование Гидрокортизон может необходимо избегать.

Сравнительных исследований с MC MC с ACM и экзоцитоз совместно культур в обеих участвующих лабораторий и других местах, было показано, что Астроцитарная вклад способен улучшения эндотелиальной функции BBB и повышения герметичности барьер 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. для достижения таких высоких выражение BBB фенотип в pBECs, мы созданы НКК с астроциты и обнаружил, что оба свинину и крыса первичной астроциты являются полезными, а также наблюдается в других лабораториях22. Во время создания экзоцитоз СЧД опыт показал, что чистоты и возраст экзоцитоз культур влияют результате эндотелиальный барьер герметичности, wITH оптимальный возраст астроциты, будучи 2-8 недель, который коррелирует с наблюдаемых изменений в морфологии экзоцитоз со временем. За день до создания НКК среднего изменения для астроциты предназначен для удаления вредных метаболитов и достаточно времени для астроциты выпустить стимуляции и сигнализации факторы, влияющие на развитие барьер. Когда совместного культивирования эндотелиальных клеток и астроциты в системе Вставка проницаемой мембраны, важно обратить особое внимание на обработку барьера модель. Во время среднего изменения аспирации и добавлением среды и движения вставки должно быть сделано тщательно для того, чтобы свести к минимуму нарушение эндотелиальный барьер.

Воспроизводимость и надежность

Большой проблемой при использовании Главные ячейки для создания модели в пробирке является достижение высокой воспроизводимости между культурами. Такая стандартизация может покрываться выбор метода, использование инструментов высокого качества и реагентов и опыт microdissection. Высокая воспроизводимость с низкой вариации партии партии для метода представленных таким образом сильно зависит от строгого соблюдения описанных процедур.

Для достижения хорошей воспроизводимости между партиями и флаконов во время ТЕЕР измерения, палата измерения сопротивления ткани или эпителиальных вольтметры с жесткой миниатюрные электродов, вместо гибкой палочек электроды могут быть использованы, сокращение изменчивость ТЕЕР наблюдаемых значений. Помимо достижения высоких значений ТЕЕР (рис. 4), достоверность представленной модели подтверждена соответствующей небольшой примеси низкопроницаемых (рис. 4) и характеристика иммуноцитохимическое pBECs (Рисунок 5 ).

Ограничения модели и прикладной метод

В последние десятилетия возросло использование трансгенных и миниатюрные свиньи, но количество данных в естественных условиях по-прежнему ограничен по сравнению с данными, доступны для грызунов моделей и поэтому может создавать проблему для сравнения данных свинину в пробирке в естественных условиях результаты. Однако как биология свиньи отражает биологии человека более тесно, чем многие установленных лабораторных животных, и трансгенных свиней модели для изучения неврологических заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера были установлены84, наличие Ожидается, что в естественных условиях данных станет менее проблематичным с течением времени.

Ограничение текущей модели системы Вставка проницаемой мембраны BBB является неспособность имитировать кровотока в микрососудов. В естественных условиях, касательное напряжение было показано влияет на многие аспекты физиологии эндотелиальных клеток, таких как отдел, дифференциация, миграции и апоптоз85,86, а также влияние таких как важные характеристики BBB выражение соединительной белков и индукции и поляризации транспортеры61,85,87. Ввести такие условия, недавно разработанный microfluidic систем может считаться88,,8990.

Полезным методом для устранения эффекта слоя unstirred воды (водный слой границы) в vitro проницаемости данных является наследование предсказал «внутренние проницаемость» в естественных условиях, используя подход на основе программного обеспечения21. Это программное обеспечение также может использоваться для подробного проницаемости данных анализа21.

Будущих заявок и направления для метода

Как было показано, что компоненты нервно-сосудистого подразделения играют важную роль в склонение и поддержания функций BBB, а не текущей модели в vitro еще не удалось полностью имитировать условия в естественных условиях , важных составляющих и взаимодействия по-прежнему могут быть пропущены. Текущие усилия по разработке представленной модели включают в себя создание тройной культура модели с астроциты и pericytes и эксперименты, сочетание клетки различных видов. До сих пор не было отмечено, что включение pericytes значительно увеличить уровень ТЕЕР барьера. Однако наблюдается сингенных свинину модели сопоставимы с тройной культур с использованием свиного мозга эндотелиальных клеток, крыса астроциты и крыса pericytes отношении барьер герметичности и выражение отличительной характеристики белков головного мозга Эндотелий22. Для того, чтобы разработать модель на основе клеток человека, будущее развитие в vitro BBB модели для обнаружения наркотиков и доставки может полагаться на человеческих плюрипотентных стволовых клеток и взрослых стволовых и прогениторных клеток21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы доклада никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Elisabeth Елены Бруун, Сара Кристин Кристенсен и Нильс м. Кристиансен для оказания технической помощи, и номер R155-2013-14113 гранта фонда компании «Лундбек».

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Медицина выпуск 127 гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) центральной нервной системы (ЦНС) нервно-сосудистого блок (NVU) свиного мозга эндотелиальных клеток (pBECs) трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР) моно культура (MC) Бесконтактный Сопредседатель культуры (NCC) главной ячейки изоляция внутриклеточный людьми лекарственных препаратов нейродегенеративных заболеваний
Улучшен метод для создания <em>в Vitro</em> гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,… More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter