Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 2, 1
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Summary

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Abstract

Het doel van dit protocol presenteert een geoptimaliseerde procedure voor de zuivering en de teelt van pBECs en om vast te stellen in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) modellen, gebaseerd op de pBECs in mono-cultuur (MC), MC met Astrocyt-geconditioneerd medium (ACM), en contactloze co cultuur (NCC) met astrocyten van varkens- of rat oorsprong. pBECs waren geïsoleerd en gekweekt uit fragmenten van haarvaten van de cortices van de hersenen van binnenlandse varkens 5-6 maanden oud. Deze fragmenten werden gezuiverd door zorgvuldige verwijdering van de hersenvliezen, isolatie en homogenisering van de grijze stof, filtratie, enzymatische spijsvertering en centrifugeren. Om te verder elimineren contaminerende cellen, de capillaire fragmenten werden gekweekt met puromycin-bevattende medium. 60-95% heuvels, pBECs groeien uit de capillaire fragmenten waren gepasseerd te permeabel membraanfilter wordt ingevoegd als vastgesteld in de modellen. Ter verbetering van de barrière krapte en BBB karakteristiek fenotype van pBECs, de cellen werden behandeld met de volgende factoren van de differentiatie: permeant 8-CPT-kamp van de membraan (hier afgekort kamp), hydrocortison, en een fosfodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). De ingreep was uitgevoerd over een periode van 9-11 dagen, en bij de vaststelling van de NCC-model, de astrocyten 2-8 weken van tevoren werden gekweekt. Naleving van de beschreven procedures in het protocol heeft toegestaan de oprichting van endothelial lagen met zeer beperkt paracellular permeabiliteit, met de NCC model tonen een gemiddelde signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER) van 1249 ± 80 Ω cm 2, en paracellular permeabiliteit (Papp) voor gele Lucifer van 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm sec-1 (bedoel ± SEM, n = 55). Verdere evaluatie van deze pBEC fenotype toonde goede uitdrukking van de strakke regulates eiwitten claudin 5, ZO-1, occludin en adherens junction eiwit p120 catenine. Het model gepresenteerd kan worden gebruikt voor een aantal studies van de BBB in gezondheid en ziekte en met de zeer restrictieve paracellular permeabiliteit, dit model is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire mensenhandel.

Introduction

Cellulaire structuur en functie van de bloed - hersen barrière

Op het grensvlak van de bloedsomloop en het centrale zenuwstelsel (CNS) fungeert de BBB als een belangrijke regelgevende site voor homoeostatic controle op de communicatie van de CNS, die is van essentieel belang voor de werking en bescherming van het zenuwstelsel. De site van de BBB is de endotheliale cellen voering van het bloedvat lumen. In de haarvaten van de hersenen, endotheliale cellen vormen complexe intercellulaire strakke kruispunten en sterk gepolariseerde expressiepatronen van bepaalde toestroom en efflux vervoerders zorgen voor zeer specifieke moleculaire vervoer tussen het bloed en de hersenen 1. De structurele onderdelen van de strakke junction complexen bevatten eiwitten uit de occludin en claudin familie, de zonula occludens (ZO) eiwitten, de cingulin, en bijbehorende regulates celadhesie-moleculen (Jam). Claudin 5 is vooral belangrijk in de paracellular regulates beperking. Inductie en onderhoud van deze karakteristieke BBB endothelial fenotype dynamische interacties met de omringende cellen, met inbegrip van de membranen van de kelder, die samen met de hersenen endotheliale cellen van vorm, pericytes, astrocyten en neuronen betrekken de neurovasculaire eenheid (NVU)2,3. De mechanismen die betrokken zijn bij deze interacties worden nog niet volledig begrepen, maar omvatten uitwisseling van chemische signalen tussen cellen, waardoor modulatie van de permeabiliteit van de BBB op korte termijn en lange termijn BBB functies4induceert. Astrocyten vooral bij te dragen tot de hersenen endothelial cel fenotype zijn bekend en zijn een bron van regelgevende factoren zoals gliale-afgeleide neurotrophic factor (die intracellulaire cAMP)5, fundamentele fibroblast groeifactor6, Hydrocortison7en transformerende groeifactor β (TGF-β)8. Het effect van TGF-β, echter al besproken9.

Van In Vivo In Vitro BBB

In vivo studies blijven waardevolle informatie te verstrekken over BBB biologie. Cel cultuur modellen kunnen echter aanvullende inzichten en vormen nuttige hulpmiddelen voor het begrijpen van de gedetailleerde moleculaire en functionele aspecten van de BBB in zowel de volksgezondheid als de ziekte. Hoewel de complexe interacties tussen de celtypes en bestanddelen van de BBB moeilijk om volledig in in vitro modellen, is er, sinds de eerste reiniging van endotheliale cellen van de hersenen en de toepassing hiervan in mono-culturen 10 , 11 , 12, uitgebreide ontwikkeling van de zuiveringsprocedures en groei omstandigheden van de BBB mobiele cultuur modellen, wat resulteert in meer gelijkenis met de barrière in vivo . De meest gebruikte in vitro BBB modellen zijn gebaseerd op primaire cellen van knaagdieren, varkens en runderen oorsprong, en vereeuwigd cellijnen. Elk model heeft verschillende voor- en nadelen. Voor vergelijkings- en model keuze, worden validatie markeringen zoals expressie van BBB enzymen, vervoerders, receptoren en structurele proteïnen gebruikt voor het maken van Overzichten van de huidige gevestigde modellen1.

Doel van het Protocol

Een belangrijk kenmerk van de BBB is barrière krapte en hoge TEER, maar een groot aantal van de beschikbare modellen weerspiegelen niet goed de in vivo -niveaus. Integratie van ontwikkeling en optimalisatie bijdragen van verschillende laboratoria, het doel van dit protocol is te presenteren een methode voor de vaststelling van een hoge TEER in vitro BBB model gebaseerd op de primaire pBECs in MC met of zonder ACM of in NCC met primaire astrocyten van rat of varkens oorsprong. De toegepaste procedures en de vaststelling van het model zijn inspanningen op te heffen van contaminerende cellen en ter verbetering van de differentiatie van pBECs in een BBB fenotype. Dit werk heeft geleid tot de oprichting van betrouwbare, hoge TEER modellen met lage paracellular permeabiliteit en goede functionele uitdrukking van belangrijke strakke regulates eiwitten, vervoerders en receptoren. Echter, zoals de astrocyten een factor die bijdraagt tot de hersenen endothelial cel fenotype zijn, de drie verschillende voorwaarden van cultuur vertegenwoordigen drie verschillende fenotypes van endothelial hersencellen. De NCC-model is specifiek nuttig voor studies van bepaalde gespecialiseerde mechanismen die betrokken zijn in de Geneesmiddelenontwikkeling, vervoer studies en intracellulaire mensenhandel, evenals voor onderzoek van de cel interacties waar maximale expressie van BBB functies voordelige.

Oorsprong en geschiedenis van het Protocol

Het model van de pBEC hier beschreven is grotendeels gebaseerd op de varkens model ontwikkeld bij Eisai Laboratories (Londen) door Dr. Louise Morgan en collega's, op basis van een succesvolle eerdere boviene hersenen endothelial cel model13whichis. De originele methode van cel voorbereiding was een twee-traps filtratie met behulp van nylon netten om te vangen van de microvessels, gevolgd door een subculturing stap ter verbetering van de zuiverheid. In de eerdere ontwikkeling van de methode, optimale BBB fenotype en barrière krapte werden bereikt door groei in aangevuld medium, met inbegrip van ACM. Verdere wijzigingen in de methode werden gemaakt door R. Skinner in Prof N. Rothwell van lab in Manchester UK14,15. De methode werd aangenomen door het laboratorium van Abbott, KCL Londen, waar Patabendige het aanzienlijk eenvoudiger maakte te bereiden door het vermijden van het gebruik van astrocyten of ACM en door het wegnemen van contaminerende cellen zoals pericytes met puromycin. De eerste papieren bevestigd dat de MC-model enkele belangrijke kenmerken van de in vivo BBB behouden, met inbegrip van doeltreffende strakke kruispunten, membraan vervoerssystemen en receptor-gemedieerde transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. later S. Yusof opnieuw getest Astrocyt co cultuur en het aanzienlijk verbeterd TEER, dus dit de gewenste variant die momenteel worden gebruikt in het Abbott lab21 is. Het model is inmiddels met succes overgebracht naar de M. Nielsen lab in Aarhus, waar verdere wijzigingen zijn ingevoerd (dit protocol), met inbegrip van vereenvoudiging grijs uit extractie, met behulp van slechts één mesh filtratie stap, en een Enkelfilter coating het combineren van collageen en fibronectine. De toegepaste procedure voor het isoleren van varkens astrocyten (dit protocol) was gebaseerd op protocollen ontwikkeld door het laboratorium van T. Moos in Aalborg, beschreven door Thomsen et al.22. De TEER en andere eigenschappen van het model gegenereerd in Londen en Aarhus lijken, die vertrouwen op het idee dat het model wordt gemakkelijk overgedragen tussen labs en reageert goed op zorgvuldige observatie en rationalisatie van de stappen van methode leent. Inderdaad, heeft S. Yusof nu de MC-model in een tropisch land (Maleisië)23, die verdere aanpassing voor plaatselijke omstandigheden en weefsel bronnen betrokken opgericht.

Voordelen boven alternatieve methoden en momenteel gevestigd modellen

Vergeleken met endothelial hersencellen van oorsprong van de runderen, knaagdieren, bieden pBECs het voordeel van een lager tarief van verlies van het in vivo BBB fenotype na isolatie24. Bovendien kunnen pBECs vormen vrij krap endothelial belemmeringen, zelfs als volwassen in MC (800 Ω cm2)16 in vergelijking met de vaak gerapporteerde niveaus voor monolayers van cellijnen zoals bEND.5 en bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, cvoleinding (300-800 Ω cm2)28,29,30, en cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32, en de primaire hersenen endotheliale cellen van muis (100-300 Ω cm2)SS = "xref" > 33,34,35,,36 en rat (100-300 Ω cm2)37,38. De TEER leert echter afhankelijkheid op de procedures voor zuivering en cultuur. In de meeste gevallen toont de toevoeging van ACM of co cultuur met astrocyten onderscheidende effecten op de endotheliale cellen en een toename in dichtheid van het endotheel lagen1. Echter over het streven naar het optimaliseren van de kweken voorwaarden, alleen de runderen-gebaseerde modellen hebben aangetoond TEER waarden vergelijkbaar met de varkens-gebaseerde modellen (gemiddelden voor 800 Ω cm2 in MC, maximaal 2500 Ω cm2 in Astrocyt co cultuur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Als de modellen op basis van primaire boviene hersenen hebben endotheliale cellen aangetoond grote verschillen, zowel tussen als binnen laboratoria14,45,46,47,48, reproduceerbaarheid zou een probleem zijn. In het pBEC-objectmodel gemeld hier, hebben de bijdragende laboratoria bereikt zeer vergelijkbaar TEER en paracellular permeabiliteit waarden met lage variabiliteit, zowel in als tussen laboratoria. Vandaar, moet het mogelijk zijn voor andere laboratoria tot stand brengen van een robuust model met lage variabiliteit met behulp van de methode die hier gepresenteerd. Naast het strakke endothelial lagen vormen, zijn modellen met pBECs eerder gevalideerd door expressie van strakke junction eiwitten, functionele BBB vervoerders, receptoren en enzymen en bewezen geschiktheid voor allerlei studies15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Bovendien ongepubliceerde transcriptome gegevens over de mede culturen van pBECs blijkt een verwachte Profiel van BBB vervoerders en receptoren (niet-gepubliceerde resultaten, Nielsen et al.).

De BBB varkens gebaseerde model heeft een bijkomend voordeel als het genoom, anatomie, fysiologie, en de progressie van de ziekte van het varken overeen met de menselijke biologie aan een hogere mate dan andere gevestigde modellen beschikt over60, die gunstig zijn voor de farmaceutische industrie. Als varkens hersenen een gemeenschappelijk bijproduct van de vleesindustrie zijn, vormen ze een gemakkelijk toegankelijke bron van hersenen endotheliale cellen, het aantal dieren die nodig zijn voor de experimenten, en het verstrekken van een hoge zuivering opbrengst van één varkens hersenen minimaliseren. Hoewel zuivering en teelt van primaire cellen is enigszins tijdrovend en vereist expertise voor normalisatie bij het opzetten van het model, primaire cellen genereren de betrouwbaarste BBB-modellen. Vereeuwigd cellijnen kunnen invaller, niet als belangrijke eigenschappen zoals barrière benauwdheid, vervoerder expressieprofielen en communicatie regelgeving komen niet overeen met de experimentele bevindingen in vivo61, 62. in vitro modellen bieden het voordeel van live-cel imaging met een hogere resolutie, waardoor de visualisatie van intracellulaire processen mogelijk doordat een benadering dicht naar de bemonsterde of waargenomen cellen, met doelstellingen met hogere vergroting en betere optische kwaliteit63. Dit is niet het geval voor het gebruik van twee-foton microscopie in levende dieren. In vitro modellen bieden bovendien de mogelijkheid om transfect cellen, waardoor de visualisatie van tagged eiwitten en onderzoek van hun handel.

Toepassingen van het Model

De functie van de BBB is niet vast en kan dynamisch worden gemoduleerd in zowel de Fysiologie en pathologie. In veel neurologische ziekten, met inbegrip van neurodegeneratieve, wordt ontstekings-en infectieziekten, verstoring en verhoogde permeabiliteit van de BBB waargenomen64,65,66,67 . Om te verminderen en voorkomen van de progressie van de ziekte en vervolgschade, zijn identificatie en karakterisering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de modulatie van de BBB van groot belang. In dit verband, betrouwbare in vitro modellen zijn in de hoge vraag door de farmaceutische industrie, en bovendien spelen een belangrijke rol in het voorspellen van BBB permeabiliteit van drugs naar de CNS. Een in vitro model van het bijeenkomen van een scherm van de permeabiliteit moet een restrictieve paracellular traject, een fysiologisch realistische cel architectuur en functionele expressie van vervoerder mechanismen68worden weergegeven. Aangetoond in eerdere studies16,17,57, en door paracellular permeabiliteit en expressie van TJ en AJ eiwitten hier, het gepresenteerde model voldoet aan al deze criteria en is geschikt voor een scala van BBB studies in zowel normale fysiologie en pathologie. De sterke punten van de onderhavige zuivering en cultivatie methode bestaan uit een combinatie van eenvoud en reproduceerbaarheid en de mogelijkheid om op te nemen astrocytic beïnvloeden met een resulterende robuuste en betrouwbare hoge TEER in vitro BBB model. Voor dit purpose, astrocyten van varkens en rat oorsprong is aangetoond dat het vergroten van de BBB fenotype van pBECs in een soortgelijke manier22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

varkens hersenen werden verkregen als bijproduct van de Deense voedingsindustrie. Deense slachthuizen staan onder streng toezicht en -waarneming door de Deense Ministerie voor milieu en voedsel.

gebruikt voor isolatie van astrocyten ratten werden gefokt en groep-gevestigd in de lokale dier faciliteit bij een kamertemperatuur van 22 ° C - 23 ° C en op een cyclus van 12/12 h donker/licht onder controle van de dierenarts en volgens Deens verordeningen voor lab dieren. De ratten werden euthanized voordat zij werden opgeofferd overeenkomstig internationale richtsnoeren op de ethische gebruik van dieren (Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 November 1986; 86/609/EEG) en de Deense richtsnoeren. Geen in vivo experimenten op dieren of menselijk materiaal werden gebruikt in deze experimenten.

Opmerking: Hieronder volgt een pBEC belangrijkste protocol beschrijven (stap 1) zuivering, (stap 2) kweken en (stap 3) TEER metingen. Voor de installatie van een NCC met astrocyten, een alternatieve protcol (stap 4) beschrijving van zuivering en teelt van ratten en varkens astrocyten wordt gepresenteerd.

1. zuivering van varkens hersenen haarvaten

  1. 8-10 hersenen van 5-6-maand-oude binnenlandse varkens (bv uit een nabijgelegen slachthuis) verzamelen en transporteren op ijs naar het laboratorium. We raden aan te beginnen volgt zuivering binnen 2-3 uur van beëindiging van het dier.
  2. Plaats van de hersenen in een steriele stroom bankje en voorzichtig wassen met 1 L PBS in een bekerglas geplaatst op ice.
  3. Verwijder hersenvliezen van één hersenen tegelijk met behulp van fine-tip pincet voorzichtig en de hersenvliezen-vrije hersenen overbrengen in een bekerglas van 1 L met PBS geplaatst op ijs. Verlenging van de termijnen, kan de verwijdering bemoeilijken. De geschatte tijd gebruikt voor elke hersenen moet 10-15 min.
  4. Met behulp van een scalpel, schraap grijze stof uit een brein op een moment en het geïsoleerde materiaal overbrengen in petrischalen (8.8 cm 2) met 20 mL DMEM nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12) geplaatst op ijs. Isoleren als veel grijze stof mogelijk zonder de intrekking van de witte stof materiaal. Voor eerste fragmentatie, het materiaal van de grijze stof doorlopen een 50 mL injectiespuit zonder naald. Blijven voor alle de hersenen en bundelen het materiaal verzameld grijze stof. Verlenging van de termijnen, kan de verwijdering bemoeilijken. De geschatte tijd gebruikt voor elke hersenen moet 10-15 min.
  5. Het materiaal geïsoleerd grijze stof overbrengen in de grinder-buis van de homogenizer van een hand-held weefsel in een verhouding van 50-50 met DMEM/F-12 media. Meng het materiaal door 8 op en neer beroertes met een losse stamper, gevolgd door 8 op en neer beroertes met een strakke stamper. Blijven totdat alle geïsoleerd materiaal heeft geweest gehomogeniseerd, vervolgens het homogenaat overbrengen in een fles van 500 mL en Verdun met DMEM/F-12 tot ongeveer 450 mL totaalvolume.
  6. Filteren het homogenaat met behulp van een fles van 500 mL blauw-cap met filterhouder en 140 µm filter-mesh en haarvaten isoleren door het uitvoeren van het weefsel door het filter. Gebruik een filter per 50 mL homogenaat en daarna wassen van elk filter met DMEM/F-12.
  7. Plaats de capillaire-bevattende filters in petrischalen met een oplossing van de spijsvertering van de trypsine/EDTA (2,5% trypsine, 0,1 nM EDTA in PBS), collagenase CLS2 (2.000 U/mL) en DNase 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Gebruik 1 petrischaal (8.8 cm 2, 20 mL oplossing) per 3 filter mazen.
  8. Plaats van de petrischaaltjes bij 37 ° C gedurende 1 uur op een roteerschudapparaat op 180 rpm of roer ze voorzichtig om de 10 min. Na 1 h, afwassen de haarvaten van de filters met de schorsing van de petrischaal met behulp van een precisiepipet 1 mL.
  9. De schorsing van de 3 schotels gesplitst in 2 50 mL tubes en stoppen van de spijsvertering door toevoegen van 10 mL DMEM/F-12 aan elke buis van 50 mL.
  10. De cel-schorsingen Centrifugeer bij 250 x g, 4 ° C gedurende 5 min. gecombineerd het supernatant en resuspendeer elke pellet in 10 mL DMEM/F-12. Voeg een verdere 20 mL DMEM/F12 aan elke buis. Herhaal deze stap centrifuge tweemaal.
  11. Laat de buizen op het ijs gedurende 5 minuten afkoelen en breng de oplossingen 2 nieuwe buizen van 50 mL.
  12. De cel-schorsingen op 250 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten centrifugeren en resuspendeer elke pellet in 8-10 mL (ongeveer 1 mL/hersenen gebruikt) van de ijskoude oplossing bestaande uit de 10% DMSO in FBS.
  13. De celsuspensie overbrengen in cryovials, met behulp van 1 mL per cryovial. Gemiddeld resulteert een zuivering in 1 flesje per hersenen gebruikt, gemiddeld endotheliale cellen voorziet in 12-16 inzetstukken. Schakel de flesjes in een bevriezing bij-80 ° C gedurende ten minste 4 h tot overnachting. Daarna, het opslaan van de cryovials in een cryotank met vloeibare stikstof.
    Let op: Vloeibare stikstof heeft extreem lage temperaturen. Neem adequate bescherming dragen.

2. Teelt van primaire pBECs (8-10 dagen)

  1. Eerste cultuur (3-5 dagen)
    dag 1
    1. voor het optimaliseren van de voorwaarden voor bevestiging van pBECs, coating van een kolf T75 uitvoeren door het toevoegen van een oplossing met finale concentraties van collageen IV (150 µg/mL) en fibronectine (50 µg/mL) in ddH 2 O aan de kolf, ervoor te zorgen dat de oplossing het hele oppervlak omvat. Gebruik 10 mL voor elke T75 kolf. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 h.
      Opmerking: De coating kan worden uitgevoerd net voor gebruik of tot een week vóór en opgeslagen met PBS bij 4 ° C. De coating moet niet uitdrogen, of een geschikt oppervlak voor gehechtheid en groei zal niet meer uitmaken.
    2. Bereiden 16 mL van pBEC groei medium bestaande uit DMEM/F-12 aangevuld met 10% plasma bereide serum (PDS), penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) en heparine (15 U/mL). Een aanvulling op het medium met puromycin (4 µg/mL) om voor endotheliale cellen te selecteren. Let erop dat de puromycin behandeling kan alleen worden gebruikt voor een maximum van 5 dagen.
    3. Aliquot het bereid medium in 6 mL en 10 mL volumes in twee buizen van 15 mL.
    4. Breng een flesje met haarvaten van vloeibare stikstof (stap 1.13) en de haarvaten ontdooien door gebruik van een waterbad 37 ° C, of door het toevoegen van 750 µL van het bereid medium van het afgepipetteerde deel. 6 mL. Als ontdooien door toevoeging van medium, Pipetteer zorgvuldig op en neer om te ontdooien en meng de schorsing. Wanneer ontdooid, de celsuspensie overbrengen in het 6-mL medium aliquoot.
    5. Als u wilt verwijderen van bevriezing medium, spin de haarvaten neer op 250 x g, 4 ° C voor 7 min.
    6. Zorgvuldig gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 1-2 mL van het monster 10mL. Wanneer opnieuw geschorst, breng de oplossing aan het 10-mL medium aliquoot.
    7. Spoel van de capillaire suspensie in de kolf T75 gecoate en voorzichtig het kantelen van de kolf zodat gelijke verdeling over het oppervlak. Plaats de kolf T75 bij 37 ° C, 5% CO 2.
      Dag 2
    8. Na een incubatieperiode van overnachting, 10 mL pBEC groeimedium aangevuld met puromycin (4 µg/mL) voor één T75 kolf voorbereiden en uitvoeren van een middelgrote verandering. Let erop dat alle middelgrote oplossingen die zijn toegepast op cellen voorverwarmde tot 37 ° C vóór gebruik moet.
      Opmerking: Als alternatief, een middelgrote verandering kan worden uitgevoerd 4-6 h na plating wanneer haarvaten moeten zijn gekoppeld aan het oppervlak. Incubeer de cellen tot 60-95% samenvloeiing is bereikt, meestal 3-5 dagen na het ontdooien. Doen niet allow cellen te bereiken 100% samenvloeiing Voorkom contact-remming, dat kan stoppen verdere cel groei.
      Dag 4-6
    9. Wanneer de gewenste confluentie wordt bereikt, passage de endotheliale cellen permeabel membraan inserts (zie punt 2.2). Als de gewenste confluentie, niet wordt bereikt op dag 4 de verandering van medium wordt uitgevoerd. Op de laatste dag 6, moeten cellen worden gepasseerd op de inserts permeabel membraan. Als de vereiste confluentie niet door dag 6 bereikt wordt, de cellen zijn niet geschikt voor experimenteel gebruik.
      Opmerking: voorbereiding van astrocyten voor NCC: bij het instellen van de co cultuur model, 2 - 8 weken oude astrocyten bij cultuur (zie punt 4) moeten voorbereid zijn de co cultuur-model door het uitvoeren van een middelgrote verandering op de dag vóór de endotheliale cellen inzetstukken passaging. Voor elke Astrocyt goed, 1500 µL van Astrocyt groeimedium voor te bereiden dat bestaat uit DMEM lage glucose aangevuld met 10% FBS, penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 µg/mL) en voer de middellange verandering.
  2. Groei van de pBECs op de permeabele membraan wordt ingevoegd (5 dagen)
    dag 4-6
    1. voorbereiden permeabel membraan (12-well plaat met inzetstukken van 1.12 cm 2 oppervlakte, 0.4 µm poriën) wordt ingevoegd voor zaaien van pBEC door de coating met collageen IV (500 µg/mL) en fibronectine (100 µg/mL) in ddH 2 O. gebruik ongeveer 300 µL voor elk invoegen, en ervoor te zorgen dat de oplossing heeft betrekking op het gehele oppervlak van de groeiende. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor een minimum van 2 h.
    2. Bereiden 30 mL pBEC groeimedium (voor media compositie, zie punt 2.1.2) zonder puromycin.
    3. Middellange van pBEC cultuur in de kolf T75 en voorzichtig wassen tweemaal met 5 mL steriele PBS bij kamertemperatuur gecombineerd.
    4. Trypsinize van de cellen door toevoeging van 2 mL trypsine-EDTA-oplossing (2,5% trypsine, 0,1 nM EDTA in PBS) naar de T75, en plaats de kolf bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 5-7 minuten
    5. Loskoppelen van de endotheliale cellen van hersenen, tik zachtjes op de kant van de T75 kolf met vingertoppen, uiteindelijk verlaten overlevende en sterkere-verbonden pericytes op het oppervlak van de kolf. Visueel onderzoek detachement onder een microscoop. Wanneer 80% detachement wordt waargenomen, stoppen trypsinebehandeling door toevoeging van 5 mL medium.
    6. De cel oplossing overbrengen in een tube van 15 mL met behulp van een 10 mL pipet en spin down de endotheliale cellen van hersenen door centrifugeren 250 x g 4 ° C gedurende 7 minuten.
    7. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1mL medium. Wanneer de account is geschorst, voeg een verdere 2 mL medium toe zodat het totale volume 3 mL
    8. handmatig tellen van het aantal cellen door gebruik van een cel tellen kamer of een automatische cel tellen systeem. Bereid de oplossing van een cel voor 2.2 x 10 5 cellen/mL medium, wat resulteert in een definitieve seeding dichtheid van 1.1 x 10 5 cellen/invoegen.
    9. Coating oplossing verwijderen uit de permeabel membraan inserts en 500 µL van de celsuspensie elke invoegen. Voeg enige medium op een van de inserts, en gebruik deze invoegen als een ' filter alleen ' controle voor de meting van het TEER.
    10. Stellen de endotheliale cellen MC, MC met ACM, of in de NCC met astrocyten op de volgende manier:
      1. voor MC: toevoegen 1500 µL van pBEC groei medium/ACM per putje van de plaat van de 12-well onder de inserts permeabel membraan. Plaats de inserts permeabel membraan bij 37 ° C, 5% CO 2 en incubeer gedurende 2 dagen.
      2. Voor NCC: overdracht voegt aan putjes met astrocyten vernieuwd met Astrocyt groeimedium eergisteren. Plaats de inserts permeabel membraan bij 37 ° C, 5% CO 2 en incubeer gedurende 2 dagen.
        Opmerking: Zich bewust zijn van het gebruik van verschillende soorten media in de putten van de onderkant van de drie modellen.
        Dag 6-8
    11. Op dag 2, het wijzigen van de media op de permeabel membraan inzetstukken met pBECs. Bereiden 500 µL van pBEC groeimedium per invoegen en de verandering om te minimaliseren van de verstoring van de cellaag zorgvuldig uit te voeren. Incubeer de cellen gedurende twee dagen. Let erop dat de verandering van de media wordt uitgevoerd op voegt alleen, en niet op de bodem wells.
  3. Stimulatie met differentiatie factoren (1-2 dagen)
    dag 8-10
    1. voor elk van de verschillende modellen, stimulatie media moet worden voorbereid als volgt:
      1. voor MC: voor elk invoegen en 500 µL van pBEC groeimedium cAMP (250 µM), hydrocortison met goed, voor te bereiden (550 nM) en RO (17,5 µM).
        MC: Bereiden bovendien 1500 µL van pBEC groeimedium met cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) en RO (17,5 µM).
        MC met ACM: 1500 µL van ACM ontdooien en te vullen met cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) en RO (17,5 µM).
      2. Voor NCC: voor elke toevoeging, bereiden 500 µL van pBEC groeimedium met cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) en RO (17,5 µM). Voor elk goed Astrocyt, bereiden 1500 µL van DMEM/F-12 aangevuld met penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) en heparine (15 U/mL), cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) en RO (17,5 µM).
    2. Uitvoeren voor elk van de verschillende modellen, media exchange als volgt:
      1. voor MC: zorgvuldig gecombineerd medium uit putten en inserts en voeg het differentiatie-medium aan beide compartimenten, met behulp van 500 µL voor elke toevoeging en 1500 µL voor elk putje. Let erop dat verstoring aan weerszijden van het donormateriaal kan beïnvloeden en de cellaag verstoren.
      2. Voor NCC: zorgvuldig gecombineerd medium uit putten en 750 medium van de differentiatie van de µL per putje toe te voegen. Zorgvuldig gecombineerd medium uit inzetstukken en 500 µL differentiatie medium per invoegen toe te voegen. Voeg vervolgens de resterende 750 µL differentiatie medium aan elke Astrocyt goed.
    3. Voor alle modellen: plaats de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 en incubeer met differentiatie medium tot de volgende dag.
      Opmerking: Let erop dat voor de NCC met astrocyten, astrocyten vanaf dit punt gehouden in serumvrij middellange zijn.

3. TEER metingen

  1. op de dag nadat stimulerende cellen met differentiatie medium, voorbereiden op het weefsel weerstand meetsysteem kamer TEER metingen door het spoelen van de zaal twee keer met ddH 2 O, één keer met 70% EtOH voor 5 min en 2 keer met ddH 2 O.
  2. Toevoegen van 4 mL van DMEM/F-12 naar de weefsel weerstand meting vergaderzaal, aansluiten op het systeem en kalibreren voor ongeveer 30 min per de volgende instellingen: R = 0, Test R = 1000, Mode = R.
  3. De TEER metingen door zorgvuldig de inserts te plaatsen in de vergaderzaal van weefsel weerstand meting uitvoeren Voor elke toevoeging, het uitvoeren van metingen in drievoud en berekenen van de gemiddelde Ω cm 2.
    Opmerking: Het model co cultuur TEER waarden naar verwachting bereiken > 500 Ω cm 2. Als het passende niveau van de TEER niet op de eerste dag bereikt is van het meten van TEER, toevoegen nieuwe differentiatie factoren (cAMP (250 µM), hydrocortison (550 nM) en RO (17,5 µM)) en TEER te meten op de volgende dag opnieuw. Wanneer passende niveaus worden bereikt, is het model moet klaar zijn voor de geplande experiment. Wees ervan bewust dat de cellen gedurende ten minste 3 uur rusten moeten voordat u het experiment om te herstellen na TEER metingen uitvoert. Na stimulatie, TEER waarden in het algemeen blijven aanvaardbaar voor 24-48 h na stimulatie.
    Opmerking: Een alternatieve en snellere methode met behulp van de rigide STX - 100C elektrode paar ook hoge TEER in dit model 81 vastgelegd. De flexibele STX2-electrode paar geeft minder betrouwbaar lezingen.

4. VOORBEREIDING van ASTROCYTEN voor CONTACTLOOS co cultuur: Alternatieve methode

  1. Zuivering van astrocyten
    1. voor elke rat hersenen gebruikt, jas 2 T75 kolven door het toevoegen van 10 mL van poly-L-lysine (5 µg/mL) in ddH 2 O aan elk T75 kolf. Incubeer de kolven bij 37 ° C gedurende 30 minuten
    2. Isolatie van astrocyten kan als volgt worden uitgevoerd:
      1. Rat astrocyten:
        1. Decapitate 2 1 - 2 dag oude ratten met behulp van een erkende methode.
        2. Knippen van de huid uit de schedel vanaf de nek naar de neus, en snijd het bot met een Sagittaal incisie.
        3. Openen van de schedel met gekromde pincet, nemen de hersenen en breng dit in een tube van 15 mL (buis 1) met 11 mL lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS en gentamycine sulfaat (125 µg/mL).
        4. Verwijder voorzichtig met behulp van fine-tip pincet hersenvliezen en het opschorten van het materiaal van de hersenen met behulp van een precisiepipet 1 mL.
      2. Varkens astrocyten:
        1. 1 verkrijgen van hersenen van een 5-6-maand-oude varken.
        2. Verwijder voorzichtig de hersenvliezen van de hersenen met behulp van fine-tip pincet en/of handen.
        3. Verzamelen 4 g grijs deeltjes van de hersenen en leg de stukjes in 1-2 mL DMEM lage glucose aangevuld met 10% FBS en gentamycine sulfaat (125 µg/mL) in een petrischaal. Als de stukken groot zijn, het gehakt met scalpels of verlostang.
        4. Schorten de geïsoleerde materiaal met behulp van een precisiepipet 1 mL, verplaatsen naar een 15-mL tube (buis 1) en vul met lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS en gentamycine sulfaat (125 µg/mL) tot een totaal volume van 11 mL.
        5. Blijven homogenisatie van het geïsoleerde materiaal met een lange naald gekoppeld aan een 10 mL spuit en schorten op en neer 3 keer. Wacht totdat de grote stukken hebben geregeld in de onderkant van de buis, dan 7 mL medium verzamelen vanaf de bovenkant van de buis (buis 1).
        6. De 7-mL celsuspensie filtreer door een filter van 40 µm nylon in een nieuwe 50 mL tube (buis, 2).
        7. Toevoegen 7 mL middellange tot buis 1 met de hersenen. De homogenisering en de filtratie van stappen 4.1.2.2.5-6 totdat het volume van de gefilterde celsuspensie in buis 2 is ongeveer 35 mL.
    3. De coating oplossing verwijderen uit de T75 kolven [stap 4.1.1]. Een snelle wassen met 5 mL PBS na incubatie met poly-L-lysine kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen niet door eventuele toxische effecten van de coating-oplossing worden berokkend.
    4. Verdelen en zaad van de oplossing van de geïsoleerde Astrocyt gelijkelijk tussen de T75 kolven. De kolven bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 3-5 dagen broeden.
  2. Culturing astrocyten en voorbereiding NCC met endotheliale cellen (3 weken)
    1. Eerste cultuur
      1. 3-5 dagen incubatie, voer na een middellange verandering zorgvuldig zuigen medium en het toevoegen van 10 mL van lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS en gentamycine sulfaat (125 µg/mL).
        Opmerking: Na de eerste middellange verandering, medium moet worden gewijzigd om de 5 dagen. Tijdens de eerste 2 weken, schudden de kolven en wassen van de cellen grondig met PBS bij het wijzigen van het medium. Dit helpt bij het verwijderen van contaminerende microglia.
      2. Na 3 weken van de teelt, de cellen door toevoeging van 2 mL trypsine-EDTA-oplossing naar de onderkant van elke kolf T75, trypsinize en incubeer hen bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 5-7 minuten
      3. Stoppen trypsinebehandeling door toevoeging van 5 mL van medium, breng de oplossing van de cel voor een tube van 15 mL en centrifugeer de astrocyten bij 250 x g, 4 ° C voor 7 min.
      4. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in oplossing bestaande uit de 10% DMSO in FBS bevriezing.
      5. Het aantal cellen tellen en bereid een mobiele oplossing van 4.0 x 10 6 cellen/mL. Bevriezen van de cellen in de cryovials toevoeging van 1 mL per flacon.
    2. Groei in permeabele membraan invoegen systeem onder Wells (2-12 weken)
      1. groei van astrocyten 12-Wells-platen voorbereiden door toevoeging van 1 mL van poly-L-lysine (5 µg/mL) in ddH 2 O aan elk putje. Plaats de platen bij 37 ° C gedurende 2 h.
      2. Voor elke 12-well plaat, bereiden Astrocyt groeimedium (DMEM lage glucose aangevuld met 10% FBS en penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 µg/mL)) 25 mL.
      3. Brengen de flacon van astrocyten van vloeibare stikstof en ontdooien van de cellen door 750 µL DMEM lage glucose medium toe te voegen. Pipetteer zorgvuldig op en neer om te ontdooien en meng de schorsing. Wanneer ontdooid, de celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en voeg middellange tot een totaal volume van 7 mL.
        Let op: Vloeibare stikstof is extreem lage temperatuur, dus het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen.
      4. Als u wilt verwijderen van bevriezing medium, spin de haarvaten neer op 250 x g, 4 ° C voor 7 min.
      5. Zorgvuldig gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in middellange.
      6. De coating verwijderen uit de putten van de 12 goed platen en de celsuspensie putjes met behulp van 1 mL per putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Vernieuwen het medium elke derde dag en cultuur van de cellen gedurende ten minste 2 weken vóór de cuvetten voor co cultuur met endotheliale cellen. De cellen kunnen worden gebruikt voor co cultuur tot 12 weken na het ontdooien, met de optimale leeftijd 2-8 weken worden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oprichting van de BBB In Vitro modellen

In de gepresenteerde, geoptimaliseerde methode, werd teelt van pBECs en de vestiging van de ordening van de invoegen permeabel membraan met MC of zonder ACM of NCC met astrocyten (Figuur 1) uitgevoerd voor een periode van 9-11 dagen (Figuur 2). Voor de selectie van endotheliale cellen, een eerste cultuur van gezuiverde capillaire fragmenten werd gecombineerd met de puromycin behandeling voor een maximum van 5 dagen, die geëlimineerd meeste contaminerende cellen en bevorderen de groei van de spindel-vormig endotheliale cellen van de capillaire fragmenten (figuur 3A-C). Op dag 4-6, pBECs had zich verspreid naar een confluentie van 60-95%, groeien als niet-overlappende, contact-geremd, overlangs uitgelijnde cellen. Wanneer de cellen had bereikt de gewenste confluentie, pBECs werden verguld over collageen IV en fibronectine gecoat permeabel membraan invoegen filter membranen (1.12 cm2 oppervlakte, 0.4 µm poriën) bij een dichtheid van 1.1 x 105 cellen/invoegen, op die zij normaal gevormd confluente monolayers na 4 dagen (dag 8-10-plaatsen van isolatie). Wanneer samen kweken pBECs, waren astrocyten van rat of varkens oorsprong verguld op poly-L-lysine gecoat bodem putten voor een minimum van 2 weken voordat de NCC (figuur 3D). Bij de vaststelling van de NCC, heeft de ervaring geleerd dat astrocyten gekweekt voor 2-8 weken de beste ondersteuning bieden voor bevordering van het fenotype van de BBB in pBECs; binnen deze termijn vormde de astrocyten confluente culturen met cellen in een honingraat-achtige structuur (figuur 3E-F) gerangschikt. Op dag 4 in permeabel membraan invoegen systeemmodel (dag 8-10 post isolatie), werden de cellen gestimuleerd met cAMP, hydrocortison en RO de barrière krapte en BBB karakteristiek expressiepatroon van strakke regulates eiwitten, vervoerders, te verhogen en receptoren.

Karakterisatie van pBEC fenotype en Paracellular permeabiliteit

Visuele cel inspectie gecombineerd met TEER meting zijn regelmatig de meest betrouwbare manieren om de confluentie en de dichtheid van het endotheel cellaag groeien op de permeabel membraan inserts voorafgaand aan experimenten te beoordelen. Figuur 4 toont de resultaten van twee series van experimenten te klein molecuul drug permeabiliteit via de BBB, beoordelen de afstellingsparameters van TEER (als gevolg van Ionische permeabiliteit) gecombineerd met de schijnbare permeabiliteit21 (Papp, cm s-1) van radiolabeled sacharose of de kleurstof tracer Lucifer geel (LY), als gevolg van paracellular permeabiliteit van typische kleine drug moleculen (~ 200-600 Da). Een verbinding van belang met een Papp groter is dan de P-app van sacharose of LY (afhankelijk van het molecuulgewicht van de drugs) zou kunnen duiden transcellulair permeabiliteit en/of vervoer over de cellen. Figuur 4 laat zien dat in permeabel membraan wordt ingevoegd met pBECs gekweekt boven rat astrocyten, goede batches van pBEC (b.v. hier de LY ingesteld) genereert ganisaties in de reeks 500-2000 Ω cm2, met een paar hoger of lager. Sommige partijen, met name tijdens de vroege stadia van het leren van het protocol, wellicht lager ganisaties rond 100-900 Ω cm2 (bijvoorbeeld hier de sacharose ingesteld). Meting van het TEER staat selectie van filters, bijvoorbeeld bij het starten van TEER > 500 Ω cm2, en over het bereik van TEER komt te staan, Papp is relatief onafhankelijk van TEER, indicatief voor een laag voldoende strakke barrière voor deze experimenten. Het protocol voor het meten van de permeabiliteit is afhankelijk van de aard van de opgeloste stof/construct. Voor een beschrijving van de procedure voor het meten van de permeabiliteit van kleine molecules in NCC, wordt een protocol beschreven in Yusof, SR, et. al21. Evaluatie van meningsuiting van de strakke junction eiwitten in pBECs in NCC met rat astrocyten toonde lokalisatie van claudin 5, occludin en ZO-1 langs de kruispunten van de cel, zoals aangegeven door immunofluorescentie (figuur 5A-C). Het adherens junction eiwit p120 catenine bleek ook, welomschreven distributie langs de kruispunten van de cel (figuur 5D).

Figure 1
Figuur 1: schematische weergave van de toegepaste modellen voor in vitro BBB. Schematische weergave van de permeabele membraan systeemmodellen van pBECs invoegen in MC (A), MC met ACM (B)en NCC met astrocyten (C). In de MC, werden pBEC groeimedium of ACM toegepast in de bodem putten, dat in de NCC, inzetstukken met pBECs in de putjes met 2-8-week-oude astrocyten werden geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: stroomschema van de belangrijkste stappen tijdens de teelt van de pBEC en de oprichting van de gepresenteerde modellen. Voor een overzicht en de tijdlijn voor de methode, deze schematische presentatie geeft een overzicht van de belangrijkste stappen in de kweken procedure van pBECs en vestiging van de gepresenteerde modellen, dat wil zeggen MC met of zonder ACM en NCC met astrocyten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: vertegenwoordiger tijdsverloop van oorspronkelijke culturen van pBECs en rat astrocyten. Fase contrast microscopie beelden van de culturen van pBECs (A-C) en de astrocyten (D-F) bekeken meer dan 5 dagen. Capillaire fragmenten op de eerste dag van de oorspronkelijke cultuur toonde aanwezigheid van haarvaten zowel contaminerende cellen gezuiverd (A, dag 1), welke na middellange verandering op dag 2 en een extra dag van groei, toonde selectie voor pBECs, hun groei vanaf de capillaire fragmenten (B, dag 3). Confluente vettapijten van pBECs werden meestal bereikt op dag 4-6, waarna pBECs toonde spindel-vormig morfologie en werden lengterichting uitgelijnd (C). Rat astrocyten zaadjes in bodem wells zich normaal verspreid aan confluente lagen binnen 5 dagen (D-F), en werden gebruikt voor NCC modellen na 2 weken van de groei. Schaal bar voor alle foto's: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Tight junction integriteit van pBECs. Schijnbare permeabiliteit (Papp) van pBECs aan paracellular markeertekens sacharose (MW 342.5 14C-gelabelde, 14,8-25,9 GBq/mmol) en gele Lucifer (MW 521.57, 10 µg mL-1), uitgezet tegen de TEER. pBECs werden geteeld op 1.12 cm2 permeabel membraan invoegen filters boven rat astrocyten bij de basis van het goed en markeringen toegevoegd aan de apicale kamer. Na 1 uur bij 37 & #730; C, verschijning van markering in de basale kamer was gemeten en apicaal-naar-basale Papp (x 10-6 cm sec-1) berekend. TEER werd gemeten > 3 h voordat Papp, met behulp van STX100C EVOM de elektroden, gecorrigeerd voor de blanco permeabel membraan invoegen filter met weerstand 150 Ω. gemiddelde TEER voor de gele Lucifer gegevensset was 1249 ± 80 Ω cm2 (bedoel ± SEM, n = 55). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: immunocytochemische karakterisering van pBECs. Voor pBECs geteeld op 1.12 cm2 permeabel membraan invoegen filter wordt ingevoegd boven rat astrocyten in de basis goed, immunofluorescentie microscopie analyse van de componenten van de strakke junction (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, adherens junction eiwit (D) p120 catenine toonde welomschreven lokalisatie op cel-cel kruispunten en geopenbaard confluente hersenen endothelial cel lagen met spindel-vormig, niet-overlappende cellen. Schaal bar voor alle foto's: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zuivering en proliferatie van pBEC

Tijdens de procedure van de zuivering omvatten kritische stappen snelle en effectieve verwijdering van hersenvliezen en scheiding van de witte en grijze materie, die belangrijk is voor de opbrengst van de zuivering en de zuiverheid en de juiste instelling van het model. Voor het gepresenteerde in vitro BBB model met behulp van pBECs, hebben we verbeterd en vereenvoudigd een zuivering procedure op basis van mechanische homogenisering van geïsoleerde grijze stof, grootte-selectieve filtering voor isolatie van microvessels, spijsvertering met collagenase , DNase en trypsine, met een initiële cultuur van microvessel fragmenten. In het algemeen, is een van de belangrijkste uitdagingen tijdens de zuivering en teelt van primaire cellen de afschaffing van contaminerende cellen. Ervaring met zuivering van primaire endothelial hersencellen heeft aangegeven dat grondige verwijdering van zowel de hersenvliezen en de resultaten van de witte stof in verbeterde zuiverheid en rendement van haarvaten, evenals grotere endothelial celgroei en expressie van BBB kenmerken. Om deze reden, zorgvuldige verwijdering van de hersenvliezen (inclusief binnen Sulcus (hersenanatomie)) in het gepresenteerde protocol werd ontworpen om verwijdering van leptomeningeale cellen (die fibroblast-achtige eigenschappen hebben), alsmede van arteriële en arteriolar zachte spiercellen, die groeien sneller dan endotheliale cellen in cultuur. Evenzo, minimalisering van het witte stof materiaal resulteerde in zuiverder endothelial celculturen, met minder verontreinigende cellen groeien uit de geïsoleerde capillaire fragmenten. Echter dit vereenvoudigd en snelle methode toegepast voor isolatie verlaagt het rendement van geïsoleerde haarvaten en optimalisatie van grijze stof isolatie het rendement van elke hersenen aanzienlijk zouden kunnen verbeteren. Een verloop van de dichtheid, die is opgenomen in een alternatieve zuivering protocol69, kan worden gebruikt bij het opsporen van vrije endotheliale cellen en endothelial cel zuiverheid te verbeteren, maar het is tijdrovend en kan ook het rendement lager. Beide methoden zuivering zijn uitvoerig gebruikt en gekenmerkt, en delen van de kenmerken van het genereren van hoge TEER pBEC modellen in zowel MC en Astrocyt co cultuur (normaal 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

Teneinde monolayers met hoge paracellular quotaregeling, is gebleken dat pericytes moet worden geëlimineerd uit het endotheel culturen16. Varkens hersenen pericytes over het algemeen groeien onder de lagen van pBEC en geen gaten in de endotheliale lagen, zoals waargenomen voor culturen van rat hersenen endotheliale cellen72,73. Pericytes in pBEC culturen, echter doen de neiging om invloed op de morfologie van de endotheliale cellen, die breder lijken en met onregelmatige cel boarders16. Omdat endothelial hersencellen express hogere niveaus van efflux vervoerders (bijvoorbeeld P-glycoproteïne) dan andere celtypes in de microvessels, kan het aantal contaminerende cellen worden verminderd door puromycin behandeling74. Bovendien, gebruik van plasma bereide serum (PDS) in plaats van foetale of neonatale kalf afgeleid serum gunsten de groei van endotheliale cellen, zoals de PDS een lagere concentratie van groeifactoren zoals bloedplaatjes afkomstige groei factor en vasculaire endothelial groei heeft factor, die staan te verhogen van BBB permeabiliteit en angiogenese14,75,76,77te stimuleren. Door de invoering van een oorspronkelijke cultuur van geïsoleerde capillaire fragmenten en dit te combineren met puromycin behandeling (4 µg/mL) en het gebruik van PDS, erin we sterk terugdringen van het aantal contaminerende cellen die overblijven na de zuivering, zodat daarna we konden strakke endothelial monolayers op permeabel membraan inzetstukken vast. Met het oog op de beste bevestiging van endotheliale cellen op zowel cultuur gerechten en permeabel membraan invoegen oppervlakken, geconstateerd dat een coating mengsel van collageen type IV (van menselijke placenta) en fibronectine de proliferatie verhoogt opbrengsten, en de gecombineerde mengsel was daarom favoriet over de traditionele methode met behulp van alleen collageen type ik78.

Differentiatie van cellen en de oprichting van een hoge TEER In Vitro BBB Model

De pBECs in MC behouden in het algemeen veel BBB belangrijkste functies na het isoleren, zodat co cultuur met astrocyten niet essentieel is voor inducerende functionele strakke kruispunten en het bereiken van hoge TEER waarden16,57. Streven naar het optimaliseren van de voorwaarden voor de differentiatie van de endotheliale cellen in BBB fenotype is inclusief het gebruik van de serum-bevattende medium aangevuld met 8-CPT-cAMP, hydrocortison7 (verhogen van het intracellulaire cAMP niveau13) en RO 20-1724 (behoud van het intracellulaire cAMP niveau), die volgens eerdere bevindingen74,79 samen succesvol verbeterd de barrière krapte en gestegen van TEER, en kan ook hebben bijgedragen tot een herstel van een meer in vivo als genexpressie profiel80. Echter, het gebruik van hydrocortison voor de aanscherping van de endothelial laag kan het wijzigen van de reactie van de endotheliale cellen op bepaalde prikkels, en met het oog op het gebruik van het model voor onderzoek van de reacties op de chemo- en cytokinen tijdens ontsteking, de gebruik van hydrocortison wellicht worden vermeden.

Uit vergelijkende studies met MC MC met ACM en Astrocyt culturen samen in zowel de deelnemende laboratoria en elders, is gebleken dat astrocytic bijdrage staat endothelial BBB functies te verbeteren en het vergroten van de barrière krapte is 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. met het oog op een dergelijke hoge uitdrukking van BBB fenotype in pBECs, wij een NCC met astrocyten opgericht en vond dat zowel varkens en rat primaire astrocyten waren gunstig, zoals ook in andere laboratoria22waargenomen. Tijdens de totstandbrenging van de Astrocyt NCCs, heeft de ervaring geleerd dat de zuiverheid en de leeftijd van de Astrocyt culturen de resulterende endothelial barrière krapte, w beïnvloedenITH de optimale leeftijd van de astrocyten wordt 2-8 weken, die correleert met een waargenomen verandering in de Astrocyt morfologie na verloop van tijd. Op de dag vóór de vaststelling van de NCC, beoogt een middellange verandering voor de astrocyten verwijderen schadelijke metabolieten en voldoende tijd voor de astrocyten stimulatie en signalering factoren beïnvloeden de ontwikkeling van de barrière vrij te laten. Wanneer kweken mede de endotheliale cellen en de astrocyten in het permeabel membraan invoegen systeem, is het belangrijk om speciale aandacht aan de behandeling van het model van de barrière. Tijdens middellange verandering, moeten zowel ambitie als toevoeging van het medium en de bewegingen van de inserts zorgvuldig gebeuren om te minimaliseren van de verstoring van het endotheel blok.

Reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid

Een grote uitdaging bij het gebruik van primaire cellen voor de vaststelling van in vitro modellen is om hoge reproduceerbaarheid tussen culturen. Dergelijke normalisatie kan worden voldaan door de keuze van de methode, gebruik van hoge kwaliteit instrumenten en reagentia, en ervaring in microdissection. De hoge reproduceerbaarheid met lage-charges-variatie voor de onderhavige methode is daarom sterk afhankelijk van de strikte naleving van de beschreven procedures.

Om een goede reproduceerbaarheid tussen partijen en flesjes tijdens TEER metingen, een weefsel weerstand meting kamer of epitheliale voltmeters met stijve miniatuur elektroden, in plaats van flexibele chopstick elektroden kunnen worden gebruikt, vermindering van de variabiliteit van de waargenomen waarden van TEER. Naast het bereiken van hoge waarden van de TEER (Figuur 4), is de betrouwbaarheid van het gepresenteerde model bevestigd door de bijbehorende lage kleine opgeloste permeabiliteit (Figuur 4), en de immunocytochemische karakterisering van de pBECs (Figuur 5 ).

Beperkingen van de toegepaste methode en Model

Het gebruik van transgene en miniatuur varkens is toegenomen in de afgelopen decennia, maar de hoeveelheid in vivo gegevens is nog steeds beperkt in vergelijking met de gegevens die beschikbaar zijn voor knaagdieren modellen, en daarom kan een uitdaging voor het vergelijken van de gegevens in vitro varkens met in vivo resultaten. Maar, zoals de biologie van het varken menselijke biologie nauwer dan vele gevestigde proefdieren weerspiegelt en transgene varken modellen voor studeren neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer hebben inmiddels tot stand brengen84, de beschikbaarheid van in vivo gegevens naar verwachting komen minder problematisch met de tijd.

Een beperking van de huidige modellen van het systeem van de invoegen van de permeabel membraan van de BBB is het onvermogen om na te bootsen de bloedstroom in microvessels. In vivo, schuifspanning gebleken beïnvloeden vele aspecten van het endotheel celfysiologie zoals division, differentiatie, migratie en apoptosis85,86, en invloed uitoefenen op belangrijke BBB kenmerken zoals de expressie van regulates eiwitten, en de inductie en polarisatie van vervoerders61,85,,87. Invoering van zulke omstandigheden, kunnen de nieuw ontwikkelde microfluidic systemen worden beschouwd als88,89,90.

Een handige methode om te corrigeren voor het effect van de ongemengde water laag (waterige grenslaag) uit in vitro permeabiliteit gegevens is voor het afleiden van de voorspelde 'intrinsieke permeabiliteit' in vivo, met behulp van de software gebaseerde aanpak21. Deze software kan ook worden gebruikt voor gedetailleerde permeabiliteit data analyse21.

Toekomstige toepassingen en aanwijzingen voor de methode

Als de onderdelen van de neurovasculaire eenheid is aangetoond dat ze spelen een belangrijke rol in induceren en onderhouden van BBB functies, en nog geen huidige in vitro model geweest kundig voor volledig na te bootsen de in vivo voorwaarden, belangrijke bestanddelen en interacties kunnen nog steeds zijn verdwenen. Huidige inspanningen bij de ontwikkeling van het gepresenteerde model behoren tot de oprichting van triple-cultuur modellen met zowel astrocyten pericytes en experimenten van de verschillende soorten cellen worden gecombineerd. Opneming van pericytes tot nu toe niet heeft geconstateerd is aanzienlijk verhogen het niveau van de TEER van de barrière. Echter zijn syngeneic varkens modellen waargenomen vergelijkbaar te verdrievoudigen culturen met varkens endothelial hersencellen, rat astrocyten en rat pericytes met betrekking tot barrière krapte en expressie van hallmark eiwitten karakteristiek van de hersenen Endotheel22. Oog op de ontwikkeling van een model op basis van menselijke cellen, toekomstige ontwikkelingen van in vitro BBB modellen voor drugontdekking en levering op de afleiding van menselijke pluripotente stamcellen en volwassen stamcellen vertrouwen kunnen en/of progenitor cells21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs wil erkennen Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen en Niels M. Kristiansen voor technische bijstand, en de Stichting Lundbeck verlenen nummer R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Geneeskunde kwestie 127 bloed - hersenbarrière (BBB) centrale zenuwstelsel (CNS) neurovasculaire eenheid (NVU) varkens endothelial hersencellen (pBECs) signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER) mono-cultuur (MC) contactloze co cultuur (NCC) oplaadbare batterij isolatie intracellulaire mensenhandel drugontdekking neurodegeneratieve ziekten
Verbeterde methode voor de vaststelling van een <em>In Vitro</em> bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,… More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter