Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 2, 1
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Summary

Syftet med protokollet är att presentera en optimerad förfarande för inrättande av ett in vitro- blod - hjärnbarriären (BBB) modell baserad på primära svin hjärnan endotelceller (pBECs). Den modellen visar hög reproducerbarhet, hög täthet, och är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel läkemedelsutveckling.

Abstract

Syftet med detta protokoll presenterar en optimerad förfarande för rening och odling av pBECs och att upprätta in vitro- blod - hjärnbarriären (BBB) modeller baserade på pBECs i mono-kultur (MC), MC med Astrocyten denvillkorade medium (ACM), och Beröringsfri samtidig kultur (NCC) med astrocyter av svin eller råtta ursprung. pBECs var isolerade och odlade från fragment av kapillärerna från de hjärnan cortices av tamsvin 5-6 månader gammal. Dessa fragment var renas genom noggrann borttagning av hjärnhinnorna, isolering och homogenisering av grå substans, filtrering, enzymatisk nedbrytning och centrifugering. För att ytterligare minska kontaminerande celler, odlades kapillär fragment med puromycin-innehållande medium. När 60-95% konfluenta, pBECs växande från kapillär fragment var anpassade till genomsläpplig membranfilter infogar och etablerade i modellerna. För att öka barriär täthet och BBB karakteristiska fenotyp av pBECs, cellerna behandlades med följande differentiering faktorer: membran diffusionskoefficient 8-CPT-cAMP (här förkortad cAMP), hydrokortison och en inhibitor för phosphodiesterasetyp, RO-20-1724 (RO). Förfarandet genomfördes under en period av 9-11 dagar, och vid fastställandet av NCC modellen, astrocyterna odlades 2-8 veckor i förväg. Efterlevnad av förfarandena som beskrivs i protokollet har möjliggjort inrättandet av endotel lager med mycket begränsad paracellular permeabilitet, med NCC modell visar en genomsnittlig transendothelial elektrisk resistans (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, och paracellular permeabilitet (Papp) för Lucifer gul 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm SEK-1 (menar ± SEM, n = 55). Ytterligare utvärdering av denna pBEC fenotyp visade bra uttryck för den snäva Junktional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin och adherens junction proteinet p120 catenin. Den modell som presenteras kan användas för en rad studier av BBB vid hälsa och sjukdom och med mycket restriktiva paracellular permeabilitet, denna modell är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel.

Introduction

Cellulära struktur och funktion på blod - hjärnbarriären

På gränssnittet i cirkulations- och centrala nervsystemet (CNS) fungerar BBB som en viktig reglerande webbplats för homoeostatic kontroll av den CNS mikromiljö, vilket är viktigt för korrekt funktion och skydd av nervsystemet. Platsen för BBB är de endothelial celler som kantar blodkärl lumen. I hjärnan kapillärerna, endothelial celler bildar komplexa intercellulära åtsittande föreningspunkter och starkt polariserade uttrycksmönster av särskilt inflödet och utflödet transportörer säkerställa mycket specifika molekylär transport mellan blod och hjärna 1. De strukturella komponenterna i åtsittande föreningspunkt komplexen innehålla proteiner från occludin och claudin familj, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin, och tillhörande Junktional adhesionsmolekyler (JAMs). Claudin 5 är särskilt viktigt i paracellular Junktional begränsningen. Induktion och underhåll av detta karakteristiska BBB endothelial fenotyp involvera dynamiska samspel med omgivande celler, inklusive pericyter, astrocyter, nervceller och källaren membranen, som tillsammans med hjärnan endothelial celler bildar den neurovaskulära enhet (NVU)2,3. Mekanismerna som är involverade i dessa interaktioner är ännu inte helt förstått, men inkluderar utbyte av kemiska signaler mellan celler, som möjliggör modulering av BBB permeabilitet på kort sikt och inducerar långsiktiga BBB funktioner4. Astrocyter särskilt är kända för att bidra till den hjärna endotelceller fenotypen och är en källa till reglerande faktorer såsom gliaceller som härrör neurotrofa faktor (som påverkar intracellulära cAMP)5, basic fibroblast tillväxtfaktor6, hydrokortison7och omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β)8. Effekten av TGF-β, har dock varit omdebatterade9.

Från In Vivo att In Vitro BBB

In vivo studier fortsätta att ge värdefull information om BBB biologi. Cell kultur modeller kan dock ge ytterligare insikter och utgöra användbara verktyg för att förstå detaljerade molekylära och funktionella aspekter av BBB vid både hälsa och sjukdom. Även om de komplexa interaktioner mellan de celltyper och beståndsdelarna i BBB är svårt att fullt ut uppnå i in vitro- modeller, har det varit, sen första rening av hjärnan endotelceller och tillämpningen av dessa i mono-kulturer 10 , 11 , 12, omfattande utveckling av rening förfaranden och tillväxt villkor av BBB cell kultur modeller, vilket resulterar i större likheter med den in-vivo -barriären. BBB vanligen används in vitro- modeller är baserade på primära celler av gnagare, svin och nötkreatur ursprung och förevigade cellinjer. Varje modell har olika fördelar och nackdelar. För jämförelse- och modell val används validering markörer såsom uttryck för BBB enzymer, transportörer, receptorer och strukturella proteiner för att skapa översikter över nuvarande etablerade modeller1.

Syftet med protokollet

Ett viktigt inslag i BBB är barriären täthet och hög TEER, men ett stort antal av de tillgängliga modellerna återspeglar inte väl i vivo nivåerna. Införliva utveckling och optimering bidrag från flera laboratorier, är syftet med detta protokoll att presentera en metod för att fastställa en hög TEER i vitro BBB modell baserad på primära pBECs i MC med eller utan ACM eller i NCC med primär astrocyter råtta eller svin. De tillämpade förfarandena och inrättandet av modellen inkluderar ansträngningar för att eliminera kontaminerande celler och förbättra differentieringen av pBECs in i en BBB fenotyp. Detta arbete har resulterat i bildandet av tillförlitliga, högkvalitativa TEER modeller med låg paracellular permeabilitet och bra funktionella uttryck för nyckel snäva Junktional proteiner, transportörer och receptorer. Dock astrocyterna är en bidragande faktor till den hjärna endotelceller fenotypen, representerar tre olika villkoren för kulturen tre olika fenotyper av hjärnan endotelceller. NCC modellen är särskilt användbar för studier av vissa specialiserade mekanismer som är involverade i läkemedelsutveckling, transportstudier och intracellulära människohandel, samt för undersökning av cell-cell interaktioner där maximal uttryck för BBB funktioner är fördelaktiga.

Ursprung och historia av protokollet

Den pBEC modellen beskrivs här baseras till stor del på svin-modellen utvecklad vid Eisai Laboratories (London) av Dr Louise Morgan och kollegor, som bygger på en framgångsrik tidigare nötkreatur hjärnan endotelceller modell13. Den ursprungliga framställningsmetoden cellen var en två-stegs filtrering med nylon nät för att fånga de microvesselsna, följt av ett subculturing steg för att förbättra branschrenheten. I den tidigare utvecklingen av metoden, optimal BBB fenotyp och barriär täthet uppnåddes genom tillväxt i kompletterade medium, inklusive ACM. Ytterligare ändringar av metoden har gjorts av R. Skinner i Prof N. Rothwell's lab i Manchester UK14,15. Metoden antogs av Abbott laboratoriet, KCL London, där Patabendige gjorde det betydligt enklare att förbereda genom att undvika användning av astrocyter eller ACM och genom att eliminera kontaminerande celler såsom pericyter med puromycin. De första tidningarna bekräftade att MC modellen bevaras flera viktiga funktioner i vivo BBB, inklusive effektiv åtsittande föreningspunkter, membran transportsystem och receptor-medierad transcytos16,17 , 18 , 19 , 20. senare S. Yusof igen testade Astrocyten samtidig kultur och fann det betydligt bättre TEER, så detta är den föredragna varianten som för närvarande används i Abbott lab21. Modellen har nu framgångsrikt lab i Århus, där ytterligare ändringar har överförts till den M. Nielsen och introducerade (protokollet), inklusive förenkla grå materia utvinning, använda endast en mesh filtrering steg, och ett enda filter beläggning att kombinera kollagen och Fibronektin. Tillämpade förfarandet för isolering av svin astrocyter (protokollet) baserades på protokoll som utvecklats av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrivs av Thomsen et al22. TEER och andra egenskaper för den modell som genereras i London och Aarhus är liknande, som lånar förtroende till uppfattningen att modellen överförs lätt mellan labs och svarar väl på noggrann observation och rationalisering av metod steg. Faktiskt, S. Yusof har nu etablerat MC modellen i ett tropiskt land (Malaysia)23, som involverade ytterligare justering för lokala förhållanden och vävnad källor.

Fördelar över alternativa metoder och för närvarande etablerade modeller

PBECs jämfört med hjärnan endothelial celler av nötkreatur och gnagare ursprung, och ger fördelen av att ha en lägre frekvens av förlust av den i vivo BBB fenotyp efter isolering24. PBECs är dessutom kan bilda relativt snäva endotelceller hinder, även när den odlas i MC (800 Ω cm2)16 jämfört med vanligt rapporterade nivåerna för enskiktslager av cellinjer som bEND.5 och bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27och cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32, cslutet (300-800 Ω cm2)28,29,30, och primära hjärnan endotelceller i mus (100-300 Ω cm2)SS = ”xref” > 33,34,35,36 och råtta (100-300 Ω cm2)37,38. TEER har emellertid visat beroende på förfarandena som rening och kultur. I de flesta fall visar tillägg av ACM eller samtidig kultur med astrocyter särskiljande effekter på endotelceller och en ökning i täthet av endotel lager1. Dock med insatser för att optimera de culturing villkor, endast de nötkreatur-baserade modellerna har visat TEER värden jämförbara till svin-baserade modeller (genomsnitt av 800 Ω cm2 i MC, upp till 2500 Ω cm2 i Astrocyten samtidig kultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Som modeller baserat på primära nötkreatur hjärnan har endotelceller visat stora variationer, både mellan och inom laboratorier14,45,46,47,48, reproducerbarhet kan vara ett problem. I den pBEC modellen redovisas här, har de bidragande laboratorierna uppnått mycket liknande TEER och paracellular permeabilitet värden med låg variabilitet, både i och mellan laboratorier. Därför bör det vara möjligt för andra laboratorier för att upprätta en robust modell med låg variabilitet med metoden presenteras här. Förutom att bilda snäva endotelceller lager, har modeller med pBECs tidigare validerats av uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner, funktionella BBB transportörer, receptorer och enzymer och visat lämplighet för en rad studier15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Dessutom opublicerade transkriptom data på samtidig kulturerna av pBECs visar en förväntad profil av BBB transportörer och receptorer (opublicerade resultat, Nielsen et al.).

Svin-baserade BBB modellen har ytterligare en fördel som genomet, anatomi, fysiologi och sjukdomsprogression av gris återspeglar den mänskliga biologin i högre grad än andra etablerade modeller60, som är gynnsamma funktioner för den läkemedelsindustrin. Som svin hjärnor är en gemensam biprodukt från köttindustrin, utgör de en lättillgänglig källa av hjärnan endotelceller, vilket minimerar antalet djur behövs för experiment, och ger en hög rening avkastning från en svin hjärna. Även om rening och odling av primära celler är något tidsödande och kräver sakkunskap för standardisering i inställningen upp modellen, generera primärceller de mest tillförlitliga BBB-modellerna. Förevigade cellinjer kan inte vara ett substitut, som viktiga egenskaper såsom barriär täthet, transportören uttrycket profiler och mikromiljö förordning inte återspeglar den experimentella fynd i vivo61, 62. in vitro -modeller ger fördelen med live-cell imaging med högre upplösning, möjliggör visualisering av intracellulära processer genom att låta ett nära förhållningssätt till urvalet eller observerade cellerna, med mål med högre förstoring och bättre optisk kvalitet63. Detta är inte fallet för användning av 2-foton mikroskopi i levande djur. In vitro- modeller ger dessutom möjlighet att transfect celler, möjliggör visualisering av märkta proteiner och utredning av deras handel.

Tillämpningar av modellen

Funktionen av BBB inte är fast och kan anpassas dynamiskt både fysiologi och patologi. I många neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa, observeras inflammatoriska och infektiösa sjukdomar, störningar och ökad permeabilitet i BBB64,65,66,67 . För att minska och förebygga sjukdomsutveckling och efterföljande skador, är identifiering och karakterisering av de molekylära mekanismerna bakom moduleringen av BBB av stor betydelse. I detta sammanhang tillförlitlig in vitro- modeller är i hög efterfrågan av läkemedelsindustrin, och dessutom spela en viktig roll i att förutsäga BBB permeabilitet av läkemedel till CNS. Alla in vitro- modell som fungerar som en permeabilitet skärm ska visa en restriktiv paracellular väg, ett fysiologiskt realistiska cell arkitektur och funktionella uttryck för transportören mekanismer68. Visat i tidigare studier16,17,57, och av paracellular permeabilitet och uttrycket av TJ och AJ proteiner här, den presenterade modellen uppfyller alla dessa kriterier och är lämplig för en rad av BBB studier av både normal fysiologi och patologi. Styrkan i den presenterade metoden för rening och odling omfattar en kombination av enkelhet och reproducerbarhet och förmågan att inbegripa astrocytic inflytande med en resulterande robust och tillförlitlig hög TEER i vitro BBB modell. För detta ändamål, astrocyter av svin och råtta ursprung har visat sig öka BBB fenotypen av pBECs i ett liknande sätt22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

svin hjärnor var erhålls som biprodukter av danska livsmedelsindustrin. Danska slakterier är under strikt övervakning och observation av det danska ministeriet för miljö och god mat.

råttor används för isolering av astrocyter var uppfödd och grupp-inrymt i lokala djuranläggningen vid en omgivande temperatur 22 ° C - 23 ° c och på en 12/12 h mörk/ljus cykel under kontroll av veterinär och enligt danska regler för försöksdjur. Råttorna var avlivas innan de offrades i enlighet med internationella riktlinjer för etiska användningen av djur (Europeiska gemenskapernas direktiv av den 24 November 1986; 86/609/EEG) och danska riktlinjer. Inga in-vivo-experiment på djur eller mänskliga material användes i dessa experiment.

Obs: följande är ett pBEC huvudsakliga protokoll som beskriver (steg 1) rening, (steg 2) odling och (steg 3), TEER mätningar. För installation av en NCC med astrocyter, presenteras en omväxlande protcol (Steg4) som beskriver rening och odling av råtta och svin astrocyter.

1. rening av svin hjärnan kapillärerna

  1. samla 8-10 hjärnor från 5-6-månad-gammal tamsvin (t.ex. från ett närliggande slakteri) och transportera dem på is till laboratoriet. Vi rekommenderar att du börjar följande rening inom 2-3 h för uppsägning av djuret.
  2. Placera hjärnor i en steril flow bänk och försiktigt tvätta dem med 1 L PBS i en bägare som placeras på ice.
  3. Försiktigt bort hjärnhinnorna från en hjärna i taget med böter-tip pincett och överföra hjärnhinnorna-fria hjärnor till en annan 1-litersbägare med PBS placeras på is. Att förlänga den tid det tar kan försvåra borttagning. Den ungefärliga tid som används för varje hjärna bör vara 10-15 min.
  4. Med en skalpell, skrapa bort grå substans från en hjärna i taget och överföra det isolera materialet till petriskålar (8,8 cm 2) innehållande 20 mL DMEM näringsämne blandning F-12 (DMEM/F-12) placeras på is. Isolera som mycket grå substans som möjligt utan att återkalla vit substans material. För inledande fragmentering, kör grå hjärnsubstans materialet genom en 50 mL spruta utan nål. Fortsätt alla hjärnor och pool insamlade grå material. Att förlänga den tid det tar kan försvåra borttagning. Den ungefärliga tid som används för varje hjärna bör vara 10-15 min.
  5. Överför isolerade grå hjärnsubstans materialet till kvarnen röret av en handhållen vävnad Homogenisatorer i förhållandet 50/50 med DMEM/F-12 media. Homogenisera materialet genom att göra 8 upp och ner stroke med en lös mortelstöt, följt av 8 upp och ner stroke med en tight mortelstöt. Fortsätta tills alla isolerade material har varit homogeniserad, sedan överföra Homogenatet till en 500 mL-flaska och späd med DMEM/F-12 till cirka 450 mL totalvolym.
  6. Filtrerar Homogenatet använder en 500 mL-blå-cap flaska med filterhållare och 140 µm filter-mesh och isolera kapillärer genom att köra vävnaden genom filtret. Använd ett filter per 50 mL av Homogenatet och tvätta varje filter med DMEM/F-12 efteråt.
  7. Plats, det kapillär-innehållande filter i petriskålar med en matsmältningen lösning av trypsin/EDTA (2,5% trypsin, 0,1 nM EDTA i PBS), kollagenas CLS2 (2 000 E/mL) och DNAS 1 (3 400 U/mL) i DMEM/F-12. Använd 1 petriskål (8,8 cm 2, 20 mL lösning) per 3 filter maskor.
  8. Plats i petriskålar vid 37 ° C för 1 h i orbitalskak vid 180 rpm eller hetsa dem försiktigt varje 10 min. Efter 1 h, tvätta kapillärerna från filtren med fjädring från petriskål med 1 mL pipett.
  9. Dela upp fjädringen från de 3 rätterna i 2 50 mL rör och stoppa matsmältningen genom att tillsätta 10 mL DMEM/F-12 i varje 50 mL tub.
  10. De cell-suspensioner Centrifugera vid 250 x g, 4 ° C i 5 min. Aspirera supernatanterna och slamma varje pellet i 10 mL DMEM/F-12. Lägga till en ytterligare 20 mL DMEM/F12 i varje rör. Upprepa två gånger detta centrifug.
  11. Låt rören svalna på is för 5 min och överföra lösningarna till 2 nya 50 mL tuber.
  12. Centrifugera de cell-suspensioner på 250 x g, 4 ° C i 5 minuter och resuspendera varje pellet i 8-10 mL (ca 1 mL/hjärnan används) frysning lösning bestående av 10% DMSO i FBS.
  13. Överför cellsuspensionen till cryovials, med 1 mL per cryovial. I genomsnitt resulterar en rening i 1 injektionsflaska per hjärna används, som i genomsnitt tillhandahåller endotelceller för 12-16 vändskär. Lägg rören i en frysning förpackning vid-80 ° C i minst 4 timmar upp till över natten. Efteråt, lagra cryovials i en cryotank med flytande kväve.
    Försiktighet: Flytande kväve har extremt låga temperaturer. Vänligen bära lämpliga skydd.

2. Odling av primära pBECs (8-10 dagar)

  1. Ursprungliga kultur (3-5 dagar)
    dag 1
    1. att optimera förutsättningarna för fastsättning av pBECs, utföra beläggning av en T75 mätkolv genom att lägga till en lösning med final koncentrationer av kollagen IV (150 µg/mL) och Fibronektin (50 µg/mL) i ddH 2 O till kolven, att se till att lösningen täcker hela ytan. Använd 10 mL för varje T75 kolv. Inkubera vid 37 ° C under 2 h.
      Obs: Beläggningen kan utföras strax före användning eller upp till en vecka innan och lagras med PBS vid 4 ° C. Beläggningen får inte torka ut, eller det kommer inte längre utgöra en lämplig fastsättning och tillväxt yta.
    2. Förbereda 16 mL pBEC tillväxt medium bestående av DMEM/F-12 kompletteras med 10% plasmaderiverade serum (PDS), penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 µg/mL) och heparin (15 U/mL). Komplettera mediet med puromycin (4 µg/mL) för endotelceller. Vara medveten om att puromycin behandling endast kan användas för högst 5 dagar.
    3. Alikvot det förberedda mediet i två 15 mL rör mängder om 6 mL och 10 mL.
    4. Ta en injektionsflaska med kapillärer från flytande kväve (steg 1.13) och Tina kapillärerna genom användning av en 37 ° C vattenbad eller lägga till 750 µL av det förberedda mediet från alikvoten som 6 mL. Om upptining genom att lägga till medium, Pipettera försiktigt upp och ner för att Tina och homogenisera suspensionen. När tinas, överföra cellsuspensionen till 6 mL medium alikvotens.
    5. För att ta bort frysning medium, snurra kapillärerna ner på 250 x g, 4 ° C för 7 min.
    6. Noggrant Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 1-2 mL av alikvoten som 10mL. När nytt tillfälligt, överför lösningen till 10mL medium alikvotens.
    7. Överför kapillär till belagda T75 kolven och luta försiktigt kolven för att säkerställa jämn fördelning över ytan. Placera T75 kolven vid 37 ° C, 5% CO 2.
      Dag 2
    8. Efter natten inkubation, förbereda 10 mL pBEC odlingsmedium kompletteras med puromycin (4 µg/mL) för en T75 kolv och utföra en medellång förändring. Tänk på att alla medelstora lösningar för celler bör vara före värms till 37 ° C före användning.
      Obs: Alternativt en medellång förändring kan vara utförda 4-6 h efter plätering när kapillärer bör har kopplat till ytan. Inkubera cellerna tills 60-95% sammanflödet uppnås, vanligtvis 3-5 dagar efter upptining. Gör inte allow celler att nå 100% sammanflödet Undvik kontakt-hämning som kan stoppa ytterligare cell tillväxt.
      Dag 4-6
    9. När den önskade konfluens uppnås, passage endotelceller att högpermeabla membran skär (se avsnitt 2.2). Om den önskade konfluens inte uppnås på dag 4, utförs förändringen av medium. Senast dag 6 bör celler vara passaged vidare till högpermeabla membran skären. Om det krävs konfluens inte uppnås genom dag 6, cellerna är inte lämpliga för experimentell användning.
      Obs: beredning av astrocyter för NCC: när du konfigurerar samtidig kultur modellen, 2 - 8 veckor gamla astrocyter i kultur (se avsnitt 4) bör förberedas för samtidig kultur modellen genom att utföra en medellång förändring på dagen innan passaging endotelceller till skär. För varje Astrocyten Tja, förbereda 1500 µL av Astrocyten odlingsmedium bestående av DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS, penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 µg/mL) och sedan utföra medium ändringen.
  2. Tillväxt av pBECs på högpermeabla membran infogar (5 dagar)
    dag 4-6
    1. Förbered högpermeabla membran skär (12-well platta med skär av 1,12 cm 2 yta, 0,4 µm porer) för sådd av pBEC genom beläggning med kollagen IV (500 µg/mL) och Fibronektin (100 µg/mL) i ddH 2 O. användning cirka 300 µL för varje sätt och se till att lösningen omfattar hela odlingsytan. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i minst 2 h.
    2. Bereda 30 mL pBEC odlingsmedium (för media sammansättning, se avsnitt 2.1.2) utan puromycin.
    3. Aspirera medium från pBEC kultur i T75 kolven och tvätta försiktigt två gånger med 5 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i rumstemperatur.
    4. Trypsinize cellerna genom att lägga till 2 mL Trypsin-EDTA-lösning (2,5% trypsin, 0,1 nM EDTA i PBS) till T75, och Placera kolven vid 37 ° C, 5% CO 2 för 5-7 min.
    5. Kopplas loss hjärnan endotelceller, knacka försiktigt på sidan av T75 kolven med fingertopparna, så småningom lämnar överlevande och starkare-fästa pericyter på ytan av kolven. Visuellt undersöka lossnar under ett mikroskop. När 80% avlossning observeras, stoppa trypsinization genom att tillsätta 5 mL medium.
    6. Överför cell lösningen till en 15 mL tub med en 10 mL pipett och spinn ner hjärnan endotelceller genom centrifugering vid 250 x g, 4 ° C i 7 minuter.
    7. Försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1mL medium. När tillfälligt, tillsätt ytterligare 2 mL av medium att föra den totala volymen 3 mL
    8. räkna antalet celler manuellt med hjälp av en cell som räknar kammare eller en automatisk cell räknar systemet. Bered en cell 2,2 x 10 5 celler/mL medium, vilket resulterar i en slutlig sådd densitet 1,1 x 10 5 celler/infoga.
    9. Ta bort beläggning lösning från högpermeabla membran skären och överföra 500 µL cellsuspension till varje insats. Lägg till enda medium på ett av skären, och använda detta sätt som en ' filtrera endast ' kontroll för TEER mätningar.
    10. Upprätta endotelceller antingen i MC, MC med ACM, NCC med astrocyter på följande sätt:
      1. för MC: lägga till 1500 µL av pBEC tillväxt medium/ACM per brunn av 12-väl plattan under högpermeabla membran skären. Placera högpermeabla membran skären vid 37 ° C, 5% CO 2 och inkubera i 2 dagar.
      2. För NCC: överföring infogar till brunnar med astrocyter uppdateras med Astrocyten odlingsmedium dagen innan. Placera högpermeabla membran skären vid 37 ° C, 5% CO 2 och inkubera i 2 dagar.
        Obs: Vara medveten om användningen av olika medietyper i botten brunnarna av de tre modellerna.
        Dag 6-8
    11. Dag 2, ändra media på de högpermeabla membran skär med pBECs. Förbereda 500 µL av pBEC odlingsmedium per skär och noggrant utföra ändringen för att minimera störningar av det cell-lagret. Inkubera cellerna i två dagar. Tänk på att media ändringen utförs på skär endast, och inte på botten brunnar.
  3. Stimulering med differentiering faktorer (1-2 dagar)
    dag 8-10
    1. för var och en av de olika modellerna, stimulering media bör förberedas enligt följande:
      1. för MC: för varje Infoga och Tja, förbereda 500 µL av pBEC tillväxt medium innehållande cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM).
        MC: Förbereda dessutom 1500 µL av pBEC tillväxt medium innehållande cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM).
        MC med ACM: Tina 1500 µL av ACM och komplettera med cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM).
      2. För NCC: för varje insats, förbereda 500 µL av pBEC tillväxt medium innehållande cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM). För varje Astrocyten väl, förbereda 1500 µL av DMEM/F-12 kompletteras med penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 µg/mL), heparin (15 U/mL), cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM).
    2. För var och en av de olika modellerna, utföra media exchange enligt följande:
      1. för MC: noggrant aspirera medium från brunnar och skär och Lägg differentiering mediet till både fack, med 500 µL för varje insats och 1500 µL för varje brunn. Vara medveten om att störningar på vardera sidan av insatsen kan påverka och störa celllagrar.
      2. För NCC: noggrant aspirera medium från brunnar och lägga till 750 µL differentiering medium per brunn. Noggrant aspirera medium från skär och tillsätt 500 µL differentiering medium per skär. Lägg sedan till det återstående 750 µL differentiering mediet varje Astrocyten väl.
    3. För alla modeller: placera cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2 och inkubera med differentiering medium förrän nästa dag.
      Obs: Tänk att astrocyterna är från denna punkt som höll i serumfritt medium för NCC med astrocyter,.

3. TEER mätningar

  1. dagen efter stimulerande celler med differentiering medium, förbereda vävnad motstånd mätsystemet kammare för TEER mätningar genom att skölja kammaren två gånger med ddH 2 O, en gång med 70% EtOH för 5 min och 2 gånger med ddH 2 O.
  2. Lägga till 4 mL DMEM/F-12 till vävnad motstånd mätning kammaren, ansluta den till systemet och kalibrera i cirka 30 min enligt följande inställningar: R = 0, Test R = 1000, Mode = R.
  3. Utföra mätningarna som TEER genom att noggrant placera skären i vävnad motstånd mätning kammaren. För varje insats, utför mätningar i tre exemplar och beräkna den genomsnittliga Ω cm 2.
    Obs: För samtidig kultur-modellen, TEER värden förväntas nå > 500 Ω cm 2. Om lämplig TEER nivå inte nås på den första dagen av mäta TEER, lägga till nya differentiering faktorer (cAMP (250 µM), hydrokortison (550 nM) och RO (17,5 µM)) och mäta TEER igen på följande dag. När lämpliga nivåer uppnås, bör modellen vara redo för planerade experimentet. Tänk på att cellerna vilar för minst 3 h innan du utför experimentet att återhämta sig efter TEER mätningar. Efter stimulering, TEER värden i allmänhet är acceptabla för 24-48 h efter stimulering.
    Obs: En alternativ och snabbare metod med styv STX - 100C elektrod paret också poster hög TEER i denna modell 81. Den flexibla STX2-electrode par ger mindre tillförlitliga avläsningar.

4. FÖRBEREDELSE av ASTROCYTER för BERÖRINGSFRI samtidig kultur: Alternativ metod

  1. Rening av astrocyter
    1. för varje råtta hjärna används, coat 2 T75 kolvar genom att tillsätta 10 mL av poly-L-lysin (5 µg/mL) i ddH 2 O till varje T75-kolv. Inkubera kolvar vid 37 ° C i 30 min.
    2. Isolering av astrocyter kan utföras enligt följande:
      1. råtta astrocyter:
        1. Decapitate 2 1 - 2 dagar gamla råttor med en godkänd metod.
        2. Skinnet av skallen från nacken mot näsan, och styckade på benet med en sagittal incision.
        3. Öppna skallen med böjd pincett, ta ut hjärnan och placera den i en 15 mL tub (1 rör) med 11 mL DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS och gentamycin sulfate (125 µg/mL).
        4. Försiktigt bort hjärnhinnor med böter-tip pincett och avbryta hjärnan materialet med 1 mL pipett.
      2. Svin astrocyter:
        1. erhålla 1 hjärna från en 5-6-månad-gammal tamsvin.
        2. Försiktigt hjärnhinnorna från hjärnan med hjälp av fine-tip pincett eller händerna.
        3. Samla 4 g grå materia från hjärnan och placera bitar i 1-2 mL DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS och gentamycin sulfat (125 µg/mL) i en petriskål. Om bitarna är stora, finhacka med skalpeller eller pincett.
        4. Avbryta isolerade materialet med 1 mL pipett, flytta den till en 15 mL tube (rör 1) och fyll med DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS och gentamycin sulfate (125 µg/mL) till en total volym på 11 mL.
        5. Fortsätta homogenisering isolerade materialet med en lång nål som bifogas en 10 mL-spruta och stänga upp och ned 3 gånger. Vänta tills den stora bitar har bosatt sig i botten av röret, sedan samla 7 mL medium från toppen av röret (tub 1).
        6. Filtrera 7 mL cellsuspension genom en 40 µm nylon filter till en ny 50 mL tub (tub 2).
        7. Lägga till 7 mL medium till tube 1 med hjärnan. Fortsätt till homogenisering och filtrering från steg 4.1.2.2.5-6 tills volymen av filtrerade cellsuspension i tub 2 är ca 35 mL.
    3. Ta bort beläggning lösningen från T75 kolvar [step 4.1.1]. En snabb tvagning med 5 mL PBS efter inkubation med poly-L-lysin kan användas för att se till att cellerna inte skadas av några toxiska effekter av beläggning lösningen.
    4. Dela och utsäde isolerade Astrocyten lösningen lika mellan T75 kolvar. Inkubera kolvar vid 37 ° C, 5% CO 2 för 3-5 dagar.
  2. Odling astrocyter och förbereda NCC med endotelceller (3 veckor)
    1. Ursprungliga kultur
      1. efter 3-5 dagars inkubation, utföra en medellång förändring genom noggrant aspirera medium och lägga till 10 mL DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS och gentamycin sulfate (125 µg/mL).
        Obs: Efter första medium, medium bör bytas var femte dag. Under de första 2 veckorna, skaka kolvar och tvätta cellerna grundligt med PBS när du ändrar mediet. Detta stöd i avlägsnandet av kontaminerande mikroglia.
      2. Efter 3 veckor av odling, trypsinize cellerna genom att lägga till 2 mL Trypsin-EDTA lösning till botten av varje T75 kolv, och inkubera dem vid 37 ° C, 5% CO 2 för 5-7 min.
      3. Stoppa trypsinization genom att tillsätta 5 mL medium, överför cell lösningen till ett 15 mL rör och centrifugera astrocyterna vid 250 x g, 4 ° C för 7 min.
      4. Noggrant avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna i frysning lösning som består av 10% DMSO i FBS.
      5. Räkna antalet celler och förbereda en cell lösning av 4.0 x 10 6 celler/mL. Frysa cellerna i cryovials att tillsätta 1 mL per injektionsflaska.
    2. Tillväxt i högpermeabla membran infoga System botten Wells (2-12 veckor)
      1. förbereda 12 brunnar för tillväxten av astrocyterna genom att tillsätta 1 mL av poly-L-lysin (5 µg/mL) i ddH 2 O till varje brunn. Placera plattorna vid 37 ° C under 2 h.
      2. För varje 12-well platta, förbereda 25 mL Astrocyten odlingsmedium (DMEM låg glukos kompletteras med 10% FBS och penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 µg/mL)).
      3. Låt injektionsflaskan av astrocyter från flytande kväve och Tina cellerna genom att lägga till 750 µL DMEM låg glukos medium. Pipettera försiktigt upp och ner för att Tina och homogenisera suspensionen. När tinas, överför cellsuspensionen-till en 15-mL tub och tillsätt medium till en total volym på 7 mL.
        Försiktighet: Flytande kväve är extremt låg temperatur, så bär personlig skyddsutrustning såsom handskar.
      4. För att ta bort frysning medium, snurra kapillärerna ner på 250 x g, 4 ° C för 7 min.
      5. Noggrant Aspirera supernatanten och Slamma upp cellerna i medium.
      6. Ta bort beläggningen från brunnarna i de 12 plattorna och överföra cellsuspensionen till brunnarna med 1 mL per brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Uppdatera mediet var tredje dag och odla cellerna i minst 2 veckor innan du använder cellerna för samtidig kultur med endotelceller. Cellerna kan användas för samtidig kultur för upp till 12 veckor efter upptining, med optimal ålder att vara 2-8 veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering av BBB In Vitro modeller

I metoden presenteras, optimerad genomfördes odling av pBECs och upprättandet av högpermeabla membran infoga systemet med MC eller utan ACM eller NCC med astrocyter (figur 1) för 9-11 dagar (figur 2). För urval av endotelceller, en inledande kultur av renat kapillär fragment kombinerades med puromycin behandling för högst 5 dagar, vilket eliminerat de flesta kontaminerande celler och främjade tillväxten av spolformad endotelceller från den Kapillär fragment (figur 3A-C). På dag 4-6, hade pBECs frodats till en konfluens 60-95%, växer som icke-överlappande, kontakt-hämmade, longitudinellt anpassat celler. När cellerna hade nått den önskade konfluens, pBECs var klädd på kollagen IV och Fibronektin belagda högpermeabla membran infoga filter membran (1.12 cm2 yta, 0,4 µm porer) på en densitet 1,1 x 105 celler/Infoga, på som de normalt bildas konfluenta enskiktslager efter 4 dagar (dag 8-10 inlägg isolering). När samtidig odling pBECs, var astrocyter råtta eller svin ursprung klädd på poly-L-lysin belagd botten brunnar för minst 2 veckor innan du börjar NCC (figur 3D). Vid fastställandet av NCC, har erfarenheten visat att astrocyterna odlade för 2-8 veckor ge bästa stöd för att främja den BBB fenotypen i pBECs; inom denna tid bildade astrocyterna konfluenta kulturer med celler arrangerade i en honeycomb-liknande struktur (figur 3E-F). På dag 4 i högpermeabla membran infoga systemmodell (dag 8-10 inlägg isolering), celler stimuleras med cAMP, hydrokortison och RO att öka barriär täthet och BBB karakteristiska uttryck mönster av snäva Junktional proteiner, transportörer, och receptorer.

Karakterisering av pBEC fenotyp och Paracellular permeabilitet

Visuella cell inspektion kombinerat med TEER mätning är rutinmässigt de mest tillförlitliga sätten att bedöma konfluens och täthet av endotelceller lagret växer på högpermeabla membran skären före experiment. Figur 4 visar resultaten från två serier av experiment att bedöma småmolekylära läkemedel permeabilitet via BBB, styrparametrar TEER (reflekterande Joniska permeabilitet) kombinerat med uppenbara permeabilitet21 (Papp, cm s-1) av radiomärkt sackaros eller färgämne tracer Lucifer gula (LY), återspeglar paracellular permeabilitet av typiska små läkemedelsmolekyler (~ 200-600 Da). En förening av intresse med en Papp större än Papp av sackaros eller LY (beroende på den molekylära vikten av läkemedlet) kan föreslå transcellular permeabilitet och/eller transport över cellerna. Figur 4 visar att högpermeabla membran skär med pBECs odlade ovan råtta astrocyter, bra partier av pBEC (t.ex. här LY set) kommer att generera ungefär i intervallet 500-2000 Ω cm2, med några högre eller lägre. Vissa partier, särskilt under tidiga stadier av lärande protokollet, kan ha lägre ungefär runt 100-900 Ω cm2 (t.ex. här sackaros inställd). TEER mätning gör urval av filter, till exempel med start TEER > 500 Ω cm2, och över det utbud av TEER visat, Papp är relativt oberoende av TEER, tyder på ett tillräckligt tät barriär lager för dessa experiment. Protokollet för att mäta permeabilitet beror på vilken typ av solute/konstruktion. För en beskrivning av förfarandet för att mäta genomträngligheten av små molekyler i NCC, beskrivs ett protokoll som i Yusof, SR, et. Al21. Utvärdering av uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner i pBECs i NCC med råtta astrocyter visade lokalisering av claudin 5, occludin och ZO-1 längs de cell-cell-junctions, som visas genom immunofluorescens (figur 5A-C). Den adherens junction proteinet p120 catenin visade också, väldefinierade fördelning längs cell cell korsningar (figur 5 d).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av de applied in vitro BBB modellerna. Schematisk framställning av högpermeabla membran infoga systemmodeller av pBECs i MC (A), MC med ACM (B)och NCC med astrocyter (C). I MC tillämpades antingen pBEC odlingsmedium eller ACM i botten brunnar, medan i NCC, skär med pBECs placerades i brunnar med 2-8-vecka-gammal astrocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: flödesschema av de viktigaste stegen under pBEC odling och inrättandet av de presenterade modellerna. För en översikt, en tidslinje för metoden och sammanfattar denna Schematisk presentation de viktigaste stegen i culturing förfarandet i pBECs och fastställande av de presenterade modellerna, dvs MC med eller utan ACM och NCC med astrocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa tidsförloppet för ursprungliga kulturer av pBECs och rat astrocyter. Fas kontrast mikroskopi bilder av kulturer av pBECs (A-C) och astrocyter (D-F) tittade på under 5 dagar. Renat kapillär fragment på den första dagen av den ursprungliga kulturen visade förekomst av både kapillärer och kontaminerande celler (A, dag 1), som efter medium förändring på dag 2 och en extra dag av tillväxt, visade urval för pBECs, börjar sin tillväxt från kapillär fragment (B, dag 3). Konfluenta enskiktslager av pBECs uppnåddes vanligen på dag 4-6, vid vilken tid pBECs visade spolformad morfologi och anpassades longitudinellt (C). Rat astrocyter seedade i nedre brunnar normalt frodats till konfluenta lager inom 5 dagar (D-F)och användes för NCC modeller efter 2 veckors tillväxt. Skalstapeln för alla bilder: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: åtsittande föreningspunkt integritet pBECs. Uppenbara permeabilitet (Papp) av pBECs till paracellular markörer sackaros (MW 342,5 14C-märkt, 14,8-25,9 GBq/mmol) och Lucifer gul (MW 521.57, 10 µg mL-1), plottas mot TEER. pBECs odlades på 1,12 cm2 högpermeabla membran infoga filter ovanför råtta astrocyter i botten av brunnen och markörer till apikala kammaren. Efter 1 timme vid 37 & nr 730; C, utseende av markör i basal kammaren var uppmätta och apikala-till-basala Papp (x 10-6 cm SEK-1) beräknas. TEER mättes > 3 h innan P-appmed STX100C EVOM elektroder, korrigerat för Tom genomsläpplig infoga membranfiltret med motstånd 150 Ω. genomsnittliga TEER för Lucifer gul datauppsättningen var 1249 ± 80 Ω cm2 (menar ± SEM, n = 55). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Immunocytochemical karakterisering av pBECs. För pBECs odlas på 1,12 cm2 högpermeabla membran infoga infogas filter ovanför råtta astrocyter i bas väl, immunofluorescens mikroskopi analys av åtsittande föreningspunkt komponenter (A) Claudin 5 (B) Occludin (C) ZO-1, och adherens junction proteinet (D) p120 catenin visade väldefinierade lokalisering i cell cell korsningar och avslöjade konfluenta hjärnan endotelceller lager med spolformad, icke-överlappande celler. Skalstapeln för alla bilder: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rening och spridning av pBEC

Under förfarandet för rening inkluderar kritiska steg snabbt och effektivt avlägsnande av hjärnhinnorna och separation av vita och grå materia, vilket är viktigt för rening avkastning och renhet och för korrekt fastställande av modellen. För presenteras i vitro BBB modellen med pBECs, har vi förbättras och förenklas en rening förfarande baserat på mekanisk homogenisering av isolerade grå hjärnsubstans, selektivt filtrering för isolering av microvesselsna, matsmältningen med kollagenas , DNase och trypsin, med en inledande kultur av microvessel fragment. I allmänhet är en av de stora utmaningarna under rening och odling av primära celler eliminering av kontaminerande celler. Erfarenhet av rening av primära hjärnan endotelceller har antytt att grundlig borttagning av både hjärnhinnor och Vit hjärnsubstans resulterar i förbättrad renhet och avkastning av kapillärer, liksom ökade endotelcellstillväxt och uttryck för BBB egenskaper. Därför försiktig borttagning av hjärnhinnorna (inklusive inuti sulci) i protokollet presenterade utformades för att säkerställa avlägsnande av leptomeningeal celler (som har fibroblast-liknande egenskaper) samt arteriell och arteriolär glatta muskelceller, som växer snabbare än endothelial celler i kultur. Jämväl, minimering av vit substans materialet resulterade i renare endotelceller kulturer, med färre kontaminerande celler växer från isolerade kapillär fragment. Men detta förenklade och snabb metod tillämpas för isolering sänker avkastningen av isolerade kapillärer och optimering av grå hjärnsubstans isolering kan avsevärt förbättra avkastningen av varje hjärna. En täthetlutning, som ingår i en alternativ rening protokoll69, kan användas för att isolera gratis endotelceller och förbättra endotelceller renhet, men det är tidskrävande och kan jämväl lägre avkastningen. Båda metoderna rening har använts i stor utsträckning och kännetecknas, och har egenskaper som genererar hög TEER pBEC modeller i både MC och Astrocyten samtidig kultur (normalt 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

För att fastställa enskiktslager med hög paracellular restriktivitet, har erfarenheten visat att pericyter måste elimineras från den endothelial kulturer16. Svin hjärnan pericyter generellt växa nedanför de pBEC lagrarna och orsakar inte hål i endotel lager, som observerats för kulturer av råtta hjärnan endotelceller72,73. Pericyter i pBEC kulturer gör, dock tenderar att påverka morfologi av endotelceller, vilket visas bredare och med oregelbundna cell internatelever16. Eftersom hjärnan endotelceller express effluxtransportörer (t.ex. P-glykoprotein) högre än andra celltyper i microvesselsna, kan antalet kontaminerande celler minskas genom puromycin behandling74. Använda dessutom plasmaderiverade serum (PDS) i stället för fetal- eller neonatal kalv härstammar serum gynnar tillväxten av endotelceller, som PDS har en lägre koncentration av tillväxtfaktorer som trombocyt-härrör tillväxtfaktor och vaskulär endotelial tillväxt faktor, som visat sig öka BBB permeabilitet och stimulera angiogenes14,75,76,77. Genom att införa en inledande kultur av isolerade kapillär fragment och kombinerar detta med puromycin behandling (4 µg/mL) och användning av PDS, lyckades vi kraftigt minska antalet kontaminerande celler kvar efter rening, så att därefter vi kunde upprätta snäva endotelceller enskiktslager på högpermeabla membran skären. För att säkerställa bästa tillbehöret av endotelceller på både kultur och högpermeabla membran infoga ytor, har det observerats att en beläggning blandning av kollagen typ IV (från placenta hos människa) och Fibronektin kraftigt ökar spridningen avkastningen och kombinerade blandningen gynnades därför över den traditionella metoden med bara kollagen typ I78.

Differentiering av celler och inrättandet av en hög TEER In Vitro BBB modell

PBECs i MC behålla generellt många BBB nyckel dragen efter isolering, så att samtidig kultur med astrocyter inte är nödvändigt för att förmå funktionella åtsittande föreningspunkter och nå hög TEER värden16,57. Insatser för att optimera förutsättningarna för differentiering av endotelceller in BBB fenotyp inkluderar användning av serum-innehållande medium kompletteras med 8-CPT-cAMP, hydrokortison7 (ökar den intracellulära cAMP nivåerna13) och RO 20-1724 (att bibehålla den intracellulära cAMP), som enligt tidigare fynd74,79 grupp framgångsrikt förbättrat barriär täthet ökade TEER och kanske också bidragit till att återställa en mer i vivo som genuttryck profil80. Dock användning av hydrokortison för skärpning av endothelial lagret kan ändra svaret av endotelceller på vissa stimuli, och i syfte att använda modellen för utredning av Svaren till chemo- och cytokiner vid inflammation, den användning av hydrokortison kan behöva undvikas.

Jämförande studier med MC, MC med ACM och Astrocyten kulturer tillsammans i båda deltagande laboratorier och på andra håll, det har visats att astrocytic bidrag är kan förbättra endothelial BBB funktioner och öka barriär täthet 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. för att uppnå sådan hög uttryck för BBB fenotyp i pBECs, vi etablerade en NCC med astrocyter och fann att både svin och råtta primära astrocyter var fördelaktigt, som också observerats i andra laboratorier22. Under etableringen av Astrocyten penningförfalskning, har erfarenheten visat att renhet och ålder av Astrocyten kulturer påverkar den resulterande endotel barriär tätheten, wITH optimal ålder astrocyterna är 2-8 veckor, vilket korrelerar med en observerad förändring i Astrocyten morfologi över tid. Dagen före om inrättande av NCC, är en medium förändring för astrocyterna avsett att avlägsna skadliga metaboliter och låt tillräckligt med tid för astrocyterna att släppa stimulering och signalering faktorer påverka barriär. När samtidig odling av endotelceller och astrocyter i högpermeabla membran infoga systemet, är det viktigt att ägna särskild uppmärksamhet åt hanteringen av barriären modellen. Under medellång förändring, måste både ambition och tillägg av mediet och förehavanden av skären göras noggrant för att minimera störningar i endotel barriären.

Reproducerbarhet och tillförlitlighet

En stor utmaning när du använder primära celler för fastställande av in vitro- modeller är att uppnå hög reproducerbarhet mellan kulturer. Sådan standardisering kan uppfyllas genom val av metod, användning av högkvalitativa verktyg och reagenser, och erfarenhet av lokalt. Hög reproducerbarhet med låg sats till sats variation för den presenterade metoden är därför starkt beroende av strikt efterlevnad av förfaranden som beskrivs.

Uppnå en god reproducerbarhet mellan partier och injektionsflaskor under TEER mätningar, en vävnad motstånd mätning kammare eller epitelial Voltmätare med styv miniatyr elektroder, snarare än flexibel chopstick elektroder kan användas, vilket minskar den variabiliteten hos observerade TEER värden. Förutom att uppnå höga TEER värden (figur 4), bekräftas tillförlitligheten i den presenterade modellen genom motsvarande låga små koncentrationsgradient permeabilitet (figur 4) och immunocytochemical karakterisering av pBECs (figur 5 ).

Begränsningar av tillämpad metod och modell

Användningen av transgena och miniatyr svin har ökat under de senaste decennierna, men mängden i vivo data är fortfarande begränsad jämfört med data tillgängliga för gnagare modeller, och därför kan utgöra en utmaning för in vitro- svin uppgifterna med i vivo resultat. Dock som biologin av grisen återspeglar mänskliga biologin närmare än många etablerade laboratoriedjur och transgena svin modeller för etablerade studera neurologiska sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom har nu varit84, tillgången på i vivo data förväntas bli mindre problematiskt med tiden.

En begränsning av nuvarande högpermeabla membran infoga system modellerar av BBB är oförmågan att efterlikna blodflödet i microvesselsna. In vivo, skjuvspänningen har visat att påverkar många aspekter av endotelceller fysiologi såsom division, differentiering, migration och apoptos85,86, och påverka viktiga BBB egenskaper såsom uttrycket av Junktional proteiner, och induktion och polarisering av transportörer61,85,87. För att införa sådana villkor, kan nyutvecklade mikroflödessystem system anses88,89,90.

En användbar metod för att korrigera för effekten av lagrets unstirred vatten (aqueous gränsskikt) från in vitro- permeabilitet data är att härleda den förutspådda 'inneboende permeabilitet' i vivo, använder den programvara baserad strategi21. Denna programvara kan också användas för detaljerad permeabilitet data analys21.

Framtida tillämpningar och riktningar för metoden

Eftersom komponenterna i neurovaskulära enhet har visat sig spela en viktig roll i inducera och bibehålla BBB funktioner, och ingen nuvarande in vitro- modellen har ännu kunnat fullt efterlikna de i vivo villkor, viktiga beståndsdelar och interaktioner kan fortfarande saknas. Aktuella insatser utveckla den presenterade modellen innefattar upprättande av triple-kultur modeller med både astrocyter pericyter och experiment att kombinera celler av olika arter. Införlivandet av pericyter har hittills inte har observerats att avsevärt öka TEER nivåerna av barriären. Dock har syngena svin modeller observerats för att vara jämförbar med tredubbla kulturerna med svin hjärnan endotelceller, råtta astrocyter och råtta pericyter avseende barriär täthet och uttryck av hallmark proteiner kännetecken av hjärnan endotelet22. För att utveckla en modell baserat på mänskliga celler, framtida utvecklingen av in vitro- BBB modeller för läkemedelsutveckling och leverans kan åberopa härledningen av mänskliga pluripotenta stamceller och adulta stamceller eller stamceller celler21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapportera någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen och Niels M. Kristiansen för tekniskt bistånd och stiftelsen Lundbeck bevilja nummer R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Medicin fråga 127 blod - hjärnbarriären (BBB) centrala nervsystemet (CNS) neurovaskulära enhet (NVU) svin hjärnan endotelceller (pBECs) transendothelial resistans (TEER) mono-kultur (MC) beröringsfri samtidig kultur (NCC) primär cell isolering intracellulära människohandel läkemedelsutveckling neurodegenerativa sjukdomar
Förbättrad metod för inrättandet av ett <em>In Vitro</em> blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,… More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter