Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 2, 1
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Summary

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה מציג את הליך בלתי אופטימליים לטיהור ודה הטיפוח של pBECs ולהקים במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודלים בהתבסס על pBECs, מונו-תרבות (MC), MC ממוזגים אסטרוציט בינונית (ACM), ו תרבות משותפת (NCC) עם האסטרוציטים של חזירי ללא מגע או עכברוש מקור. pBECs היו מבודדים ותרבותית של שברי נימים מ cortices המוח של חזירים במשפחה בת 5-6 חודשים. קטעים אלה היו מטוהרת על-ידי הסרת זהיר של קרומי המוח, בידוד המגון של החומר האפור, סינון, עיכול אנזימטי צנטריפוגה. לחסל עוד תאים מזהמים, שברי נימי היו תרבותי עם puromycin המכילות בינוני. כאשר 60-95% confluent, pBECs גדל מן השברים נימי היו passaged את קרום חדיר המסנן מוסיף והקימו במודלים. כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB פנוטיפ אופייני של pBECs, התאים שטופלו הגורמים בידול הבאים: ממברנה permeant 8-CPT-מחנה (מחנה מקוצר כאן), הידרוקורטיזון, מעכב phosphodiesterase, RO-20-1724 (RO). ההליך בוצע על פני תקופה של 9-11 ימים, בעת יצירת מודל NCC, האסטרוציטים היו תרבותי 2-8 שבועות מראש. ההקפדה ההליכים המתוארים בפרוטוקול אפשרה את הקמת שכבות אנדותל עם חדירות paracellular מוגבלת מאוד, עם NCC המודל מראה על ממוצע transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER) 1249 ± Ω 80 ס מ 2, ו paracellular חדירות (Papp) עבור לוציפר צהוב 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 ס מ סק-1 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). הערכה נוספת של פנוטיפ pBEC הזה הראה ביטוי טוב claudin חזק חלבונים מהחיבור 5, זואי-1, occludin ו adherens של catenin p120 של צומת חלבון. המודל המוצג יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים של BBB על בריאות ומחלה, עם החדירות paracellular מאוד מגבילה, מודל זה מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת.

Introduction

המבנה התאי ותפקוד מחסום הדם - מוח

-הממשק של הדם ומרכזי מערכת העצבים (CNS), BBB משמש אתר רגולטורי המפתח לשליטה homoeostatic של microenvironment מערכת העצבים המרכזית, שהוא חיוני לתפקוד תקין והגנה של מערכת העצבים. האתר של BBB הוא התאים אנדותל המצפים לומן כלי דם. נימים המוח, תאי אנדותל ליצור מורכבות המערכת צמתי צר, ביטוי חזק מקוטב דפוסים של מובילי זרם, בזרימת מסוים להבטיח תחבורה מולקולרי ספציפי מאוד בין הדם של המוח 1. מרכיביה המבניים של מתחמי צמוד לצומת לכלול חלבונים מן המשפחה occludin, claudin, zonula occludens (זואי) חלבונים, cingulin, ומקושרת מולקולות אדהזיה מהחיבור (ריבות). Claudin 5 חשוב במיוחד ההגבלה מהחיבור paracellular. תחזוקה של פנוטיפ אנדותל האופיינית הזאת BBB לערב דינמי אינטראקציות עם התאים שמסביב, כולל pericytes, האסטרוציטים, נוירונים, את הקרומים המרתף, אשר יחד עם המוח אנדותל תאים טופס נוירו-וסקולריים יחידה (NVU)2,3. המנגנונים המעורבים אינטראקציות אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, אבל כוללים חילופי אותות כימיים בין תאים, אשר מאפשר אפנון של BBB חדירות בטווח הקצר ומשרה BBB לטווח ארוך כולל4. האסטרוציטים במיוחד ידועים לתרום ותפקיד תאי אנדותל המוח, הם מקור של גורמים רגולטוריים כגון פקטור (להשפיע על מחנה תאיים) גליה נגזר neurotrophic5, בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה6, הידרוקורטיזון7, הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β)8. עם זאת, ההשפעה של TGF-β, כבר התווכחו9.

In Vivo במבחנה BBB

מחקרים in vivo להמשיך לספק מידע רב ערך על BBB ביולוגיה. עם זאת, מודלים התרבות התא יכול לספק תובנות נוספות ומהווים כלים שימושיים להבנת היבטים פונקציונליים המולקולריים מפורט של BBB על בריאות ומחלה. יחסי גומלין מורכבים סוגי תאים ומרכיבים של BBB אמנם קשה להשיג באופן מלא דגמים במבחנה , היה, מאז הטיהור הראשון של תאי אנדותל המוח ויישום של אלה בתרבויות-מונו 10 , 11 , 12, פיתוח נרחב של תהליכי טיהור, תנאי הגידול של BBB תא מודלים תרבות, וכתוצאה מכך דמיון גדול עד המחסום ויוו . הדגמים BBB נפוץ במבחנה מבוססים על ראשי תאים של מכרסמים, חזירי, ומקור שור ועל שורות תאים מונצח. כל דגם כולל החסרונות והיתרונות שונים. השוואה ומודל בחירה, סמני אימות כגון הביטוי של BBB אנזימים, שנאים, קולטנים חלבונים מבניים משמשות ליצירת סקירות ויצר מודלים הנוכחית1.

מטרת הפרוטוקול

תכונה חשובה אחת של BBB מכשול מהבלוטות ומניעת TEER גבוהה, אך מספר גדול של הדגמים זמינים ואינם משקפים היטב את רמות ויוו . שילוב תרומות פיתוח ואופטימיזציה של מספר מעבדות, המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה להקמת גבוהה TEER במבחנה BBB מודל המבוסס על pBECs ראשי MC עם או בלי ACM, או NCC עם ראשי האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי. הליכים שהוחל והקמת המודל כוללות מאמצים לחסל תאים מזהמים וכדי לשפר את הבידול של pBECs לתוך הפנוטיפ BBB. עבודה זו הובילה להקמת מודלים TEER אמינים, עם חדירות נמוכה paracellular וביטוי פונקציונליים טוב של מפתח חלבונים מהחיבור חזק, שנאים, קולטנים. עם זאת, כפי האסטרוציטים גורם תורם פנוטיפ תא אנדותל המוח, שלושה מצבים שונים של תרבות מייצגים שלוש פנוטיפים שונים של תאי אנדותל המוח. מודל NCC שימושית במיוחד עבור מחקרים של מנגנונים מיוחדים מסוימים מעורב גילוי תרופות, מחקרים תחבורה וסחר תאיים, כמו גם עבור חקירת האינטראקציות תא-תא איפה ביטוי מכסימלי של BBB תכונות יתרון.

מקור והיסטוריה של הפרוטוקול

המודל pBEC המתוארים כאן מבוסס במידה רבה על המודל חזירי שפותחה במעבדות Eisai (לונדון) על ידי ד ר לואיס מורגן ועמיתיו, חישבת בהתבסס על מוצלחת קודמת המוח שור תא אנדותל דגם13. שיטת ההכנה התא המקורי היה רשתות שינוי סינון בשני שלבים באמצעות ניילון כדי לתפוס את microvessels, ואחריו צעד subculturing כדי לשפר את טוהר. בפיתוח קודמות של השיטה, אטימות פנוטיפ ומכשול BBB אופטימלית הושגו על ידי גידול בינוני שהושלם, כולל ACM. שינויים ותיקונים נוספים לשיטת נעשו על ידי ר' סקינר במעבדה של פרופ ' / ח' ש רותוול מנצ'סטר בבריטניה14,15. השיטה אומצה על ידי המעבדה אבוט, אשלגן כלורי לונדון, שם Patabendige עשה את זה משמעותי יותר פשוט להכין על ידי הימנעות משימוש האסטרוציטים או ACM בהריגת תאים מזהמים כמו pericytes עם puromycin. העיתונים הראשון אישר כי דגם MC נשמר כמה תכונות חשובות של ה- ויוו BBB, כולל צמתי צר יעיל, מערכות תחבורה ממברנה קולטן בתיווך transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. אח כ ס Yusof שוב נבדק תרבות משותפת אסטרוציט ונמצא זה לשפר באופן משמעותי TEER, אז זה הגרסה המועדפת כיום בשימוש המעבדה אבוט21. המודל כבר עכשיו בהצלחה להעביר את נילסן מ מעבדה בארהוס, איפה היו שינויים ותיקונים נוספים הציג (פרוטוקול זה), כולל גריי מפשט משנה החילוץ, באמצעות שלב סינון רשת אחת בלבד, וצעד ציפוי מסננים יחידה שילוב של קולגן, fibronectin. ההליך שימושית עבור בידוד של חזירי האסטרוציטים (פרוטוקול זה) התבססה על פרוטוקולים שפותחה על ידי המעבדה טי Moos באולבורג, שתואר על ידי תומסון ואח22. את TEER ומאפיינים אחרים של המודל שנוצר ב לונדון וב אהרחוס דומים, אשר מקנה בטחון לרעיון המודל בקלות מועברים בין מעבדות ומגיב היטב כדי התבוננות מעמיקה, רציונליזציה של שיטת השלבים. אכן, Yusof ס הקימה כעת דגם MC במדינה טרופית (מלזיה)23, אשר מעורבים התאמה נוספת עבור תנאים מקומיים ומקורות רקמות.

יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות וכיום הקימה מודלים

בהשוואה לתאי אנדותל מוח של פרה ומקור מכרסמים, pBECs לספק את היתרון של בעל שיעור נמוך יותר של אובדן ויוו BBB פנוטיפ בעקבות בידוד24. יתר על כן, pBECs מסוגלים להרכיב את המחסומים אנדותל צר יחסית, אפילו כאשר גדל ב- MC (Ω 800 ס מ2)16 לעומת רמות בדרך כלל דיווחו על monolayers של שורות תאים כגון bEND.5 ו- bEND.3 (50 Ω ס מ2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω ס מ2)28,29,30, ואת cerebEND (500 Ω ס מ2)29,31,32, ומוח ראשוניים תאי אנדותל של העכבר (100-300 Ω ס מ2)האס. אס = "xref" > 33,34,35,36 , עכברוש (100-300 Ω ס מ2)37,38. עם זאת, TEER מראה תלות על ההליכים טיהור ותרבות. ברוב המקרים, התוספת של ACM או תרבות משותפת עם האסטרוציטים מראה השפעות המבדילים על תאי אנדותל ועלייה ב אטימות של שכבות אנדותל1. ובכל זאת, עם מאמצים כדי למטב את התנאים culturing, רק המודלים מבוססי שור הראו ערכי TEER להשוות המודלים מבוססי-חזירי (ממוצע של 800 Ω ס מ2 ב- MC, עד 2500 Ω ס מ2 בתרבות שיתוף אסטרוציט)13 ,39,40,41,42,43,44,45. כמו הדגמים בהתבסס על מוח ראשוניים שור תאי אנדותל הראו וריאציות גדול, בין ובתוך מעבדות14,45,46,47,48. הפארמצבטית יכול להיות בעיה. במודל pBEC שדווחו פה, המעבדות התורמים השיגו TEER דומה מאוד וערכי חדירות paracellular עם השתנות נמוך, והן בין מעבדות. ומכאן, זה צריך להיות אפשרי עבור מעבדות אחרות להקים מודל חזקים עם השתנות נמוך באמצעות השיטה המוצגת כאן. בנוסף ויוצרים שכבות אנדותל חזק, מודלים עם pBECs יש בעבר מאומתים על-ידי ביטוי של חלבונים צומת חזק, מובילי BBB פונקציונלי, רצפטורים, אנזימים והפגינו התאמה למגוון רחב של מחקרים15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. יתר על כן, transcriptome שלא פורסמו נתונים על תרבויות המשנה pBECs מציגה פרופיל הצפוי של מובילי BBB, קולטנים (שלא פורסמו תוצאות, נילסן. et al.).

המודל מבוסס על חזירי BBB יש יתרון נוסף כמו הגנום, אנטומיה, פיזיולוגיה, ומשקפים התקדמות המחלה של החזיר הביולוגיה האנושית ברמה גבוהה מאשר דגמים אחרים הוקמה60, אשר הם חיוביים כולל בתעשייה הפרמצבטית. כמו חזירי המוח הם תופעת לוואי נפוצה של תעשיית הבשר, הם מהווים מקור נגיש בקלות של המוח תאי אנדותל, צמצום מספר בעלי חיים לצורך הניסויים, וגם לספק תשואה גבוהה טיהור מהמוח חזירי אחד. למרות טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא במידה מסוימת זמן רב ודורש מומחיות התקינה מתארגנת המודל, ראשי תאים מפיקים הדגמים BBB הכי אמין. שורות תאים מונצחים לא יכול להיות תחליף, כמו תכונות חשובות כגון מכשול אטימות, פרופילי ביטוי טרנספורטר, ורגולציה microenvironment אינן משקפות את ממצאי הניסוי ויוו61, 62. מודלים במבחנה לספק יתרון לחיות תאים הדמיה עם רזולוציה גבוהה יותר, כך ויזואליזציה של תהליכים תאיים מאפשר מתן אפשרות גישה בסמיכות לתאי שנדגמו או שנצפה, באמצעות מטרות עם הגדלה גבוהה יותר, איכות אופטית טובה יותר63. זה אינו המקרה לשימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים בבעלי חיים. יתר על כן, במבחנה מודלים מספקים את היכולת transfect תאים, המאפשר ויזואליזציה של חלבונים מתויג והחקירה של סחר שלהם.

יישומים של המודל

הפונקציה של BBB אינו קבוע, יכול להיות מאופנן באופן דינמי פיזיולוגיה והן פתולוגיה. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל ניווניות, במחלות דלקתיות וזיהומיות, הפרעה, חדירות מוגברת של BBB נצפית64,65,66,67 . על מנת להפחית ולמנוע התקדמות המחלה ונזק עוקבות, זיהוי ואפיון של המנגנונים המולקולריים שבבסיס של האפנון של BBB הם בעלי חשיבות גדולה. בהקשר זה, מודלים אמינים במבחנה יש ביקוש גבוה על ידי תעשיית התרופות, יתר על כן תפקיד חשוב בחיזוי BBB החדירות של סמים על מערכת העצבים. כל במבחנה דגם הגשה המסך חדירות צריך להציג מסלול paracellular מגבילים, ארכיטקטורה התא מבחינה פיזיולוגית מציאותי, ביטוי פונקציונאלי של טרנספורטר מנגנונים68. הפגינו ב מחקרים קודמים16,17,57, ועל ידי paracellular חדירות וביטוי של טי-ג'יי, ג'יי חלבונים כאן, המודל הציג עונה על כל הקריטריונים האלה ומתאים לטווח של BBB מחקרים בולטים בשני פיזיולוגיה נורמלי בפתולוגיה. נקודות החוזק של שיטת טיהור וטיפוח הציג כוללים שילוב של פשטות, הפארמצבטית ואת היכולת לכלול astrocytic להשפיע בדגם שנוצר עמיד ואמין גבוהה TEER במבחנה BBB. בשביל זה מטרה, האסטרוציטים של חזירי ואלשין מקור הוכחו להגדיל את ותפקיד BBB של pBECs בצורה דומה22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המוח חזירי התקבלו כמו תוצרי לוואי של תעשיית המזון הדנית. משחטות דנית נמצאים תחת השגחה קפדנית והתבוננות על ידי הדני המשרד לאיכות הסביבה ועל האוכל.

חולדות בשימוש עבור בידוד של האסטרוציטים היו בשבייה, קבוצה-שוכנו במתקן של בעלי חיים מקומיים בטמפרטורת החדר של 22 ° C - 23 ° C, על מחזור כהה/אור 12/12 h תחת פיקוח של הוטרינר ולפי דנית תקנות חיות המעבדה. העכברושים היו מורדמים לפני הם הוקרבו לפי הנחיות בינלאומיות על השימוש האתית של חיות (קהילות אירופה םיאנתל של 24 בנובמבר 1986; 86/609/EEC) והנחיות הדנית. אין ויוו ניסויים על בעלי חיים או חומר אנושי שימשו בניסויים אלה.

הערה: להלן הוא פרוטוקול הראשי pBEC המתארת טיהור (שלב 1), (שלב 2) טיפוח ומדידות (שלב 3) TEER. עבור ההתקנה של NCC עם האסטרוציטים, מוצג של protcol חלופי (שלב 4) המתארת טיהור והטיפוח של עכברוש, האסטרוציטים חזירי.

1. טיהור של נימים המוח חזירי

  1. לאסוף מוחות 8-10 מ 5-6-בן חודש חזירים מקומיים (למשל מהמשחטה הסמוך) ולהעביר אותם על קרח למעבדה. אנו ממליצים על התחלת הפרוצדורה טיהור הבאה בתוך 2-3 h של סיום של החיה.
  2. המוחות בכל ספסל זרימה סטרילי מקם ולשטוף אותם עם 1 ליטר PBS ב גביע על קרח בעדינות
  3. בזהירות להסיר את קרומי המוח מהמוח אחד בכל פעם באמצעות מלקחיים פיין-עצה, להעביר את המוח ללא קרומי המוח עוד גביע 1 ליטר עם PBS המוטלות על קרח. הרחבת לוקחים את הזמן יכול לסבך את ההסרה. הזמן המשוער המשמש עבור כל המוח צריך להיות מינימום 10-15
  4. באמצעות אזמל, לגרד את חומר אפור מהמוח אחד בכל פעם, להעביר את החומר המבודד פטרי (8.8 ס מ 2) המכילות 20 מ"ל תערובת מזין DMEM F-12 (DMEM/F-12) מניחים על קרח. בודד כמו החומר האפור הרבה ככל האפשר ללא נסיגה חומר חומר לבן. עבור הפיצול הראשוני, להפעיל את החומר החומר האפור באמצעות מזרק 50-mL בלי מחט. המשיכו בשביל כל המוחות ואת מאגר החומר נאסף החומר האפור. הרחבת לוקחים את הזמן יכול לסבך את ההסרה. הזמן המשוער המשמש עבור כל המוח צריך להיות מינימום 10-15
  5. להעביר את החומר המבודד החומר האפור הצינור מטחנה של מהמגן רקמת כף יד על יחס של 50/50 עם מדיה DMEM/F-12. Homogenize את החומר על-ידי הפיכת 8 למעלה ולמטה משיחות עם כבעלי רופף, ואחריו 8 למעלה ולמטה משיחות עם כבעלי חזק. ממשיכים עד שכל מבודד החומר היה הומוגני, ואז להעביר את homogenate בקבוק 500-mL, לדלל עם DMEM/F-12 כ אחסון סה כ 450 מ ל-
  6. לסנן את homogenate באמצעות בקבוק כובע כחול 500-mL עם בעל מסנן, מסנן מיקרומטר 140-mesh ולבודד נימים על-ידי הפעלת הרקמה דרך המסנן. השתמש במסנן אחד לכל 50 מ של homogenate. ולשטוף את כל מסנן עם DMEM/F-12 לאחר מכן.
  7. המקום המכיל נימי מסננת בתוך צלחות פטרי עם פתרון עיכול של טריפסין/EDTA (2.5% טריפסין, 0.1 EDTA nM ב- PBS), collagenase CLS2 (2,000 U/mL) ו- DNase 1 (3,400 U/mL) ב- DMEM/F-12. השתמש פטרי 1 (8.8 ס מ 2, פתרון 20 מ ל) לכל רשתות סינון 3.
  8. למקם את צלחות פטרי ב 37 ° C עבור h 1 ב תפקודי לב / נשימה-180 סל ד או מערבבים אותם בעדינות כל 10 דקות. לאחר 1 h, לשטוף את הנימים של המסננים עם השעיה מ הפטרי באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
  9. לפצל את המתלים של 3 מנות 50-mL 2 צינורות ולעצור את העיכול על-ידי הוספת 10 מ"ל DMEM/F-12 כל שפופרת 50-mL-
  10. צנטריפוגה התא-המתלים ב x 250 g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. תשאף את supernatants, מחדש להשעות כל גלולה ב 10 מ"ל של DMEM/F-12. להוסיף עוד 20 מ של DMEM/F12 כל שפופרת. חזור על שלב זה צנטריפוגה פעמיים.
  11. תן הצינורות לקרר בקרח במשך 5 דקות ולהעביר את הפתרונות 2 צינורות חדשים של 50 מ ל.
  12. Centrifuge התא-המתלים ב x 250 g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מחדש להשעות כל גלולה ב- 8-10 מ ל (כ 1 mL/המוח משמש) של הקפאה פתרון בהיקף של 10% דימתיל סולפוקסיד ב FBS.
  13. להעביר התליה תא cryovials, באמצעות 1 מ"ל לכל cryovial. בממוצע, הוא לטיהור תוצאות מבחנה 1 לכל המוח משמש, בממוצע מתן תאי אנדותל עבור מוסיף 12-16. מקם את הבקבוקונים בקופסה הקפוא ב-80 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות עד לילה. לאחר מכן, לאחסן את cryovials cryotank עם חנקן נוזלי.
    התראה: חנקן נוזלי יש בטמפרטורות נמוכות מאוד. בבקשה לענוד הגנה הולמת.

2. טיפוח של ראשי pBECs (8-10 ימים)

  1. התרבות הראשונית (3-5 ימים)
    1 יום
    1. כדי למטב את התנאים עבור החזקה של pBECs, לבצע ציפוי של בקבוקון T75 על-ידי הוספת פתרון עם סופי ריכוזים של קולגן הרביעי (150 µg/mL) ו- fibronectin (µg 50/מ"ל) ב- ddH 2 O על הבקבוק, לוודא כי הפתרון מכסה את כל המשטח. השתמש 10 מ ל כל הבקבוק T75. דגירה ב 37 ° C עבור ה 2
      הערה: הציפוי ניתן לבצע רק לפני השימוש או עד שבוע לפני, המאוחסן עם PBS ב 4 º C. הציפוי לא חייבים להתייבש, או זה כבר לא יהוו משטח מתאים מצורף וצמיחה.
    2. להכין 16 מ"ל של צמיחה pBEC בינוני המורכב DMEM/F-12 בתוספת 10% נגזר פלזמה סרום (PDS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), הפרין (15 U/mL). תוספת המדיום עם puromycin (4 µg/mL) כדי לבחור עבור תאי אנדותל. שים לב כי הטיפול puromycin יכול לשמש רק לתקופה מקסימלית של 5 ימים.
    3. Aliquot המדיום מוכן כרכים 6 מ ל ו- 10 מ ל שני צינורות 15 מ"ל.
    4. מביא את בקבוקון עם נימים חנקן נוזלי (שלב 1.13), להפשיר את נימי הדם על ידי שימוש באמבט מים 37 ° C או על-ידי הוספת 750 µL של המדיום מוכן aliquot 6-mL. אם מפשיר על-ידי הוספת בינוני, בזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי להפשיר homogenize ההשעיה. כאשר הקרת, להעביר התליה תא המדיום 6-mL aliquot.
    5. כדי להסיר את ההקפאה בינוני, ספין הנימים למטה ב 250 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות
    6. וארוקן את תגובת שיקוע ובזהירות מחדש להשעות את צניפה ב 1-2 מ ל aliquot 10-mL. כאשר מחדש מושעה, להעביר את הפתרון המדיום 10-mL aliquot.
    7. להעביר את המתלים נימי הבקבוקון T75 מצופה ותטה בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח חלוקה שוויונית על פני השטח. במקום את הבקבוקון T75 בגיל 37 ° C, 5% CO 2.
      יום 2
    8. לאחר דגירה לילה, להכין מדיום הגידול של pBEC 10 מ ל בתוספת puromycin (4 µg/mL) עבור הבקבוק T75 אחת ולבצע שינוי בינוני. שים לב כי כל הפתרונות בינוני המוחלים על תאים צריך להיות מראש ומחוממת ל- C ° 37 לפני השימוש.
      הערה: לחלופין, שינוי בינוני יכול להיות בביצוע 4-6 h פוסט-ציפוי כאשר נימים צריך להיות מצורף אל פני השטח. דגירה התאים עד 60-95% הנהרות מושגת, בדרך כלל 3-5 ימים מיום מפשיר. לא מאפשרתאים w כדי להגיע למפגש 100% כדי למנוע מגע-עיכוב זה לעצור תא בהמשך הצמיחה.
      יום 4-6
    9. כאשר confluency הרצויה מושגת, מעבר תאי אנדותל כדי קרום חדיר מוסיף (ראו סעיף 2.2). אם confluency הרצוי לא מושגת ביום 4, מבוצע שינוי של מדיום. לכל המאוחר ביום 6, התאים צריכים להיות passaged על התוספות קרום חדיר. אם confluency הנדרשים לא מושגת על ידי יום 6, התאים אינם מתאימים לשימוש ניסיוני.
      הערה: הכנת האסטרוציטים עבור NCC: בעת הגדרת המודל תרבות משותפת, 2 - 8 בת שבוע האסטרוציטים בתרבות (ראו סעיף 4) צריך להיות מוכן עבור דגם תרבות משותפת על-ידי ביצוע שינוי בינונית ביום שלפני passaging תאי אנדותל כדי מוסיף. עבור כל אסטרוציט להכין, 1500 µL של מדיום הגידול אסטרוציט המורכב DMEM נמוך הגלוקוז בתוספת 10% FBS, פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL) ולאחר מכן לבצע את השינוי בינונית.
  2. הצמיחה של pBECs על קרום חדיר מוסיף (5 ימים)
    יום 4-6
    1. קרום חדיר הכן שזורי (12-ובכן צלחת עם תותבי 1.12 ס"מ 2 פני השטח, נקבוביות מיקרומטר 0.4) זריעה של pBEC על ידי ציפוי עם קולגן הרביעי (500 µg/mL) ו- fibronectin (100 µg/mL) ב- ddH 2 O. שימוש וכ-300 µL לכל אחד להוסיף, וודא כי הפתרון מכסה את כל פני השטח גדל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך תקופה מינימלית של 2 ה
    2. להכין 30 מ של מדיום הגידול pBEC (עבור הרכב המדיה, עיין בסעיף 2.1.2) ללא puromycin.
    3. מחוק לגמרי מתרבות pBEC בתוך הבקבוק T75 ובינוניות בעדינות תשטוף פעמיים עם 5 מ"ל PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
    4. Trypsinize התאים על-ידי הוספת 2 מ של טריפסין-EDTA פתרון (2.5% טריפסין, 0.1 EDTA nM ב- PBS) T75, ומניחים את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 5-7 דק...
    5. כדי לנתק את תאי אנדותל של המוח, טפח בעדינות את הצד של הבקבוק T75 עם קצות האצבעות, בסופו של דבר עוזבים pericytes ששרדו וצירופם חזק על פני השטח של הבקבוק. לחקור באופן חזותי ניתוק תחת מיקרוסקופ. כאשר 80% ניתוק נצפית, להפסיק trypsinization על-ידי הוספת 5 מיליליטר בינונית.
    6. להעביר את הפתרון תא צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ספין למטה תאי אנדותל המוח על ידי צנטריפוגה ב 250 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.
    7. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בינוני 1 מ"ל. כשאתה מושעה, להוסיף נוספת 2 מ של מדיום כדי להביא את הנפח הכולל 3 מ ל
    8. לספור את מספר התאים באופן ידני על-ידי שימוש תא ספירת קאמרית או תא אוטומטית ספירה מערכת. להכין פתרון תא של 2.2 x 10 תאים למ"ל 5 בינוני, וכתוצאה מכך צפיפות זריעה הסופי של 1.1 x 10 5 תאים/הוספה.
    9. פתרון ציפוי להסיר התוספות קרום חדיר ולהעביר µL 500 של התליה תא כל הכנס. באחד התוספות, להוסיף בינוני בלבד ולהשתמש זו הוספה כמו ' לסנן רק ' שליטה על המדידות TEER.
    10. ליצור תאי אנדותל MC, MC עם ACM, או NCC עם האסטרוציטים באופן הבא:
      1. MC עבור: להוסיף 1500 µL של pBEC צמיחה בינוני/ACM לכל טוב של צלחת 12-ובכן מתחת הכיסויים קרום חדיר. למקם את הכיסויים קרום חדיר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, תקופת דגירה של 2 ימים.
      2. עבור NCC: העברת הוספת וולס עם האסטרוציטים רעננים עם מדיום הגידול אסטרוציט יום לפני. למקם את הכיסויים קרום חדיר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, תקופת דגירה של 2 ימים.
        הערה: להיות מודעים השימוש של סוגי מדיה שונים בהבארות התחתון שלושה דגמים.
        יום 6-8
    11. ביום 2, שינוי בתקשורת על התוספות קרום חדיר עם pBECs. להכין µL 500 של pBEC מדיום הגידול לכל הוספה, ולבצע היטב את השינוי כדי למזער שיבושים של השכבה תא. דגירה התאים במשך יומיים. שים לב כי השינוי המדיה מתבצע על הוספת בלבד, ולא על התחתון וולס.
  3. גירוי עם גורמי הבידול (1-2 ימים)
    יום 8-10
    1. לכל אחד המודלים השונים, גירוי המדיה צריך להיות מוכן כדלקמן:
      1. MC עבור: לכל אחד הכנס ולהכין, µL 500 של מדיום הגידול pBEC המכיל מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר).
        MC: להכין בנוסף 1500 µL של מדיום הגידול pBEC המכיל מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר).
        MC עם ACM: הפשרת 1500 µL של ACM, משלימים את זה עם מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר).
      2. עבור NCC: עבור כל הוספה, להכין µL 500 של מדיום הגידול pBEC המכיל מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר). עבור כל אסטרוציט טוב, להכין 1500 µL של DMEM/F-12 בתוספת פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL), הפרין (15 U/mL), מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר).
    2. לכל אחד של מודלים שונים, לבצע החלפת המדיה כדלקמן:
      1. MC עבור: תשאף בינוני בארות, מוסיף ובזהירות להוסיף המדיום בידול לשני מדורים, באמצעות 500 µL עבור כל הוספה ו µL 1500 במשך כל. להיות מודע לכך שיבוש משני צדדיו תותב יכול להשפיע על לשבש את השכבה תא.
      2. עבור NCC: בקפידה תשאף בינוני מבארות ולהוסיף µL 750 בידול בינוני לכל טוב. בזהירות תשאף האמצעי מוסיף ולהוסיף 500 בינוני בידול µL לכל הוספה. לאחר מכן להוסיף המדיום הנותרים של בידול 750 µL אסטרוציט כל טוב.
    3. עבור כל הדגמים: למקם את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, דגירה בידול בינונית עד למחרת.
      הערה: להיות מודעים לכך עבור NCC עם האסטרוציטים, האסטרוציטים מנקודה זו המשיך במדיום נטול סרום.

3. מדידות TEER

  1. ביום אחרי מגרה תאים עם בידול בינוני, להכין את המערכת קאמרית רקמות מדידה ההתנגדות למדידות TEER על ידי שטיפה התא כפול עם ddH 2 O, פעם אחת עם 70% EtOH במשך 5 דקות 2 פעמים נוספות עם ddH 2 O.
  2. להוסיף 4 מ של DMEM/F-12 לתא המדידה ההתנגדות רקמות, לחבר אותו למערכת, כיול כ 30 דקות לפי ההגדרות הבאות: R = 0, מבחן R = 1000, מצב = R.
  3. לבצע את המדידות TEER על-ידי הצבת בקפידה את הכיסויים בקנה מידה ההתנגדות רקמות. עבור כל הוספה, לבצע מדידות שהפקידים ולחשב את הממוצע Ω ס מ 2-
    הערה: עבור המודל תרבות משותפת, TEER ערכים צפויים להגיע > Ω 500 ס מ 2. אם רמת TEER המתאימה לא הושגה ביום הראשון של מדידה TEER, להוסיף גורמים בידול ניו (מחנה (250 מיקרומטר), הידרוקורטיזון (550 ננומטר) ו- RO (17.5 מיקרומטר)) ולמדוד את TEER שוב ביום שלמחרת. כאשר רמות המתאים מושגות, המודל צריך להיות מוכן לקבל הניסוי המתוכנן. שימו לב כי התאים לנוח לפחות 3 שעות לפני ביצוע הניסוי להתאושש לאחר מדידות TEER. לאחר גירוי, TEER ערכים באופן כללי נשארים מקובל עבור 24-48 שעות לאחר גירוי.
    הערה: שיטה חלופית ומהיר באמצעות הזוג אלקטרודה STX - 100C נוקשה גם רושם TEER גבוה זה מודל 81. Ele STX2 גמישזוג ctrode נותן קריאות פחות אמין.

4. הכנה האסטרוציטים של תרבות משותפת ללא קשר: שיטה חלופית

המוח
  1. טיהור של האסטרוציטים
    1. העכברוש לכל שימוש, מעיל 2 מבחנות T75 על-ידי הוספת 10 מ"ל של פולי-L-ליזין (5 µg/mL) ב- ddH 2 O לכל . הבקבוק T75 דגירה המבחנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
    2. בידוד של האסטרוציטים יכול להתבצע כדלקמן:
      1. עכברוש האסטרוציטים:
        1. Decapitate 2 1 - 2 בן יום חולדות בשיטה שאושרו.
        2. לחתוך את העור את הגולגולת מתחיל מהצוואר לכיוון האף, ולחתוך את העצם עם חתך הווריד.
        3. לפתוח את הגולגולת עם מלקחיים מעוקל, להוציא את המוח ולמקם אותו צינור 15מל (צינור 1) 11 מ של גלוקוז נמוכה DMEM, בתוספת 10% FBS ו gentamycin סולפט (125 µg/mL).
        4. בזהירות להסיר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים פיין-עצה ו להשעות את החומר במוח באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
      2. האסטרוציטים חזירי:
        1. של המוח 1 לקבל חזיר הבית 5-6-בן חודש.
        2. הסר בזהירות את קרומי המוח של המוח באמצעות מלקחיים פיין-עצה ו/או ידיים.
        3. לאסוף 4 g של אפור, מחומר מהמוח, מניחים את החתיכות גלוקוז נמוך של DMEM 1-2 מ ל בתוספת 10% FBS ו gentamycin סולפט (125 µg/mL) של צלחת פטרי. אם החלקים אינם גדולים, מינצ ואזמלי מנתחים או מלקחיים.
        4. להשעות את חומר מבודד בעזרת פיפטה של 1 מ"ל, עובר זה 15-mL התחתית (tube 1) מילוי עם DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% FBS ו gentamycin סולפט (125 µg/mL) את הנפח הכולל של 11 mL.
        5. ממשיכים homogenizing את חומר מבודד עם מחט ארוכה המצורפת מזרק 10-mL, להשעות לאורך 3 פעמים. המתן עד החלקים גדול התיישבו בחלק התחתון של הצינור, ואז לאסוף 7 mL בינוני מהחלק העליון של הצינור (צינור 1).
        6. לסנן התליה תא 7-mL דרך מסנן ניילון 40 µm לתוך צינור 50-mL החדש (הצינור 2).
        7. ML 7 להוסיף בינוניים עד צינור 1 עם המוח. המשך את המגון ולסינון של צעדים 4.1.2.2.5-6 עד שאמצעי האחסון של השעיה תא מסוננים בצינור 2 כ 35 מ ל.
    3. להסיר הפתרון ציפוי המבחנות T75 [שלב 4.1.1]. כביסה מהירה עם 5 מ"ל PBS לאחר דגירה עם פולי-L-ליזין יכול לשמש כדי להבטיח כי התאים לא נפגעים על ידי כל ההשפעות הרעילות של הפתרון ציפוי.
    4. לחלק, זרע הפתרון אסטרוציט מבודד באופן שווה בין המבחנות T75. דגירה המבחנות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO, 2, 3-5 ימים.
  2. Culturing האסטרוציטים, הכנת NCC לתאי אנדותל (3 שבועות)
    1. התרבות הראשונית
      1. לאחר 3-5 ימי דגירה, לבצע שינוי בינונית על-ידי בקפידה כ רפה בעברית בינוני והוספת 10 מ ל של DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% FBS ו gentamycin סולפט (125 µg/mL).
        הערה: לאחר השינוי הראשון בינוני, בינוני יש לשנות כל 5 ימים. במהלך 2 השבועות הראשונים, לנער המבחנות, לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS בעת שינוי של המדיום. אפשרות זו מסייעת בעת הסרת מזהמים מיקרוגלייה.
      2. לאחר 3 שבועות של טיפוח-תרגול, trypsinize את התאים על-ידי הוספת 2 מ"ל של טריפסין-EDTA פתרון לחלק התחתון של כל מבחנה T75, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 5-7 דק...
      3. להפסיק trypsinization על-ידי הוספת 5 מ של בינוני, העברת הפתרון תא צינור 15 מ"ל, centrifuge את האסטרוציטים ב 250 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות
      4. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש תאי הקפאה פתרון בהיקף של 10% דימתיל סולפוקסיד ב FBS.
      5. לספור את מספר התאים והכן פתרון תא של 4.0 x 10 6 תאים למ"ל. להקפיא את התאים cryovials הוספת 1 מ"ל לכל בקבוקון.
    2. הצמיחה בבארות חדיר ממברנה להוסיף מערכת התחתון (2-12 שבועות)
      1. להתכונן טוב 12 צלחות צמיחה של האסטרוציטים על-ידי הוספת 1 מ"ל של פולי-L-ליזין (5 µg/mL) ב- ddH 2 O מכל קידוח. למקם את הצלחות ב 37 ° C עבור ה 2
      2. על כל צלחת 12-. טוב, הכינו 25 מ של מדיום הגידול אסטרוציט (DMEM נמוך גלוקוז בתוספת 10% FBS פניצילין (100 U/mL) ואת סטרפטומיצין (100 µg/mL)).
      3. מביאים את בקבוקון האסטרוציטים חנקן נוזלי, להפשיר את התאים על-ידי הוספת 750 µL DMEM גלוקוז נמוך בינוני. בזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי להפשיר homogenize ההשעיה. כאשר הקרת, להעביר התא-התליה צינור 15-mL ולהוסיף בינוני הנפח הכולל של 7 מ ל.
        התראה: חנקן נוזלי בטמפרטורה נמוכה מאוד, אז לענוד הגנה אישית כגון כפפות.
      4. כדי להסיר את ההקפאה בינוני, ספין הנימים למטה ב 250 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות
      5. וארוקן את תגובת שיקוע ובזהירות מחדש להשעות את התאים במדיום.
      6. להסיר את הציפוי הבארות של הלוחות טוב 12 ולהעביר התליה תא בארות באמצעות 1 מ"ל לכל טוב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      7. לרענן את המדיום בכל יום שלישי, התרבות התאים למשך תקופה מינימלית של 2 שבועות לפני השימוש בתאים תרבות משותפת עם תאי אנדותל. התאים יכולים לשמש תרבות משותפת עד 12 שבועות לאחר מפשיר, עם הגיל האופטימלי להיות 2-8 שבועות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקמתה של הדגמים במבחנה BBB

בשיטה שלו שהוצגו, אופטימיזציה, טיפוח של pBECs והקמת מערכת הוספה קרום חדיר עם MC או בלי ACM או NCC עם האסטרוציטים (איור 1) בוצע לתקופה של 9-11 ימים (איור 2). לבחירה של תאי אנדותל, תרבות הראשונית של קטעים נימי מטוהרים היה בשילוב עם טיפול puromycin לתקופה מקסימלית של 5 ימים, אשר חיסלה את רוב התאים מזהמים וקידם את הצמיחה של תאי אנדותל בצורת כישור מ צינור קפילר שברי (איור 3 א-ג). -יום 4-6, pBECs היה התרבו כדי confluency של % 60-95, גדל ככל שאינם חופפים, עכבות-קשר, מיושר longitudinally תאים. כאשר התאים הגיעו את confluency הרצויה, pBECs מצופים קולגן IV ו fibronectin מצופה קרום חדיר הוספת מסנן ממברנות (1.12 ס"מ2 פני השטח, נקבוביות מיקרומטר 0.4)-צפיפות של 1.1 x תאים5 10/הוספה, על אילו הם בדרך כלל נוצר confluent monolayers אחרי 4 ימים (יום 8-10 לפרסם בידוד). כאשר שיתוף culturing pBECs, האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי מצופים על התחתון מצופה פולי-L-ליזין בארות למשך תקופה מינימלית של 2 שבועות לפני שמתחילים את NCC (דמות תלת-ממד). בעת יצירת את NCC, הניסיון הוכיח כי האסטרוציטים תרבותי 2-8 שבועות מספק את התמיכה המיטבית לקידום של פנוטיפ BBB ב pBECs; בתוך הזמן הזה, האסטרוציטים הקים תרבויות confluent עם תאים המסודרות במבנה דמוי חלת דבש (3E איור-F). ביום 4 במודל המערכת של קרום חדיר הוספה (יום 8-10 פוסט בידוד), התאים היו מגורה עם מחנה, הידרוקורטיזון RO כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB דפוס ביטוי אופייני של חלבונים מהחיבור חזק, מובילים, ו קולטנים.

אפיון pBEC פנוטיפ, חדירות Paracellular

בדיקה חזותית תא בשילוב עם TEER מדידה דרכים באופן שגרתי האמינים ביותר להעריך את confluency ואת אטימות השכבה תא אנדותל גוברת על התוספות קרום חדיר לפני הניסויים. איור 4 מציג תוצאות שתי סדרות של ניסויים כדי להעריך מולקולה קטנה חדירות התרופה דרך BBB, בקרת פרמטרים של TEER (המשקף חדירות יוניים) בשילוב עם חדירות לכאורה21 (Papp, s ס מ-1) של סוכרוז radiolabeled או לצבוע מעקב לוציפר הצהוב (LY), המשקף paracellular חדירות של מולקולות קטנות לגמילה מסמים (~ 200-600 Da). תרכובת של עניין עם Papp גדול מ- Papp של סוכרוז או LY (בהתאם המשקל המולקולרי של התרופה) יכול להציע transcellular חדירות ו/או תעבורה על-פני התאים. איור 4 מראה כי קרום חדיר הוספת עם pBECs תרבותי מעל עכברוש האסטרוציטים, אצוות טוב של pBEC (למשל כאן LY מוגדר) יפיק TEERs טווח 500-2000 Ω ס מ2, עם כמה גבוה או נמוך. כמה סטיות תקן, במיוחד במהלך השלבים המוקדמים של למידה הפרוטוקול, ייתכן TEERs התחתון סביב 100-900 Ω ס מ2 (למשל כאן מוגדר סוכרוז). TEER מדידה מאפשר בחירה של מסננים, לדוגמה עם החל TEER > ס מ 500 Ω2, מעל טווח של TEER המוצג, Papp היא עצמאית יחסית של TEER, מעידה על שכבת מחסום חזק מספיק ניסויים אלה. הפרוטוקול למדידת חדירות תלוי בסוג של ממס/לבנות. לקבלת תיאור של ההליך למדידת חדירות של מולקולות קטנות ב- NCC, פרוטוקול המתואר Yusof, SR, ואח. al21. הערכת ביטוי החלבונים צומת חזק ב- pBECs ב- NCC עם עכברוש האסטרוציטים הראה לוקליזציה של claudin 5 occludin, זואי-1 לאורך צמתי תא-תא, כפי שהראה immunofluorescence (איור 5A-C). כמו כן, catenin p120 adherens חלבון צומת הראה הפצה מוגדרים היטב לאורך צמתי תא-תא (איור 5D).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הדגמים BBB במבחנה יישומית- ייצוג סכמטי של קרום חדיר להוסיף מערכת מודלים של pBECs MC (א), MC עם ACM (B)ו- NCC עם האסטרוציטים (C). ב במועדון, או מדיום הגידול pBEC או ACM הוחלו ב הבארות התחתון, ואילו ב- NCC, מוסיף עם pBECs הונחו בבארות עם 2-8-בת שבוע האסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרשים זרימה של השלבים העיקריים במהלך הטיפוח-תרגול pBEC והקמה של הדגמים שהוצגו. עבור סקירה וגם ציר הזמן עבור פעולת השירות, מצגת סכמטית זו מסכמת את השלבים העיקריים ההליך culturing של pBECs ואת הקמתה של הדגמים שהוצגו, קרי MC עם או בלי ACM, NCC עם האסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מסלול הזמן נציג של תרבויות הראשונית של האסטרוציטים ועכברוש, pBECs. שלב חדות תמונות מיקרוסקופ של תרבויות של pBECs (A-C) ו האסטרוציטים (D-F) צפו ב במשך 5 ימים. מטוהר שברי נימי ביום הראשון של התרבות הראשונית הראתה נוכחות של נימים והן ההרסנית תאים (A, יום 1), איזה שינוי בינוני אחרי יום 2 וביום נוספים של צמיחה, הראה מבחר pBECs, החל הצמיחה שלהם השברים נימי (B, יום 3). Monolayers confluent של pBECs הושגו בדרך כלל ביום 4-6, ובו בזמן pBECs הראו מורפולוגיה בצורת כישור, היו מיושרים longitudinally (ג). האסטרוציטים עכברוש נזרע בתחתית בארות בדרך כלל התרבו לשכבות confluent בתוך 5 ימים (D-F), שימשו לדגמי NCC לאחר 2 שבועות של צמיחה. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: צומת חזק שלמות של pBECs. חדירות נראית לעין (Papp) של pBECs לסמני paracellular סוכרוז (MW 342.5 14C-מתויג, 14.8-25.9 GBq/mmol), המותווה לוציפר צהוב (MW 521.57, µg 10 מ ל-1), נגד TEER. pBECs גדלו ב- 1.12 ס"מ2 קרום חדיר הוספת מסננים מעל עכברוש האסטרוציטים בבסיס של טוב, סמני הוסיף לתא הפסגה. לאחר שעה-37 & #730; C, המראה של סמן בבית הבליעה הבזליים היה הפסגה-כדי-הבזליים הסלסולים Papp (x 10-6 ס מ סק-1) מחושב. TEER נמדדה > h 3 לפני Papp, באמצעות אלקטרודות STX100C EVOM, תיקן עבור מסנן הוספה קרום חדיר ריק עם התנגדות 150 Ω. TEER הממוצע עבור ערכת הנתונים צהוב לוציפר היה 1249 ± 80 Ω ס מ2 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אפיון Immunocytochemical pBECs. עבור pBECs גדל על 1.12 ס"מ2 קרום חדיר הוספה מסנן מוסיף מעל עכברוש האסטרוציטים הבאר הבסיס, immunofluorescence ניתוח מיקרוסקופיה של הרכיבים צמוד לצומת Claudin () 5 (B) Occludin (ג) זואי-1. adherens צומת חלבון (D) p120 catenin הראה לוקליזציה מוגדרים היטב ובצמתים תא-תא חשף המוח confluent שכבות תאי אנדותל עם תאים בצורת כישור, שאינם חופפים. סרגל קנה מידה עבור כל התמונות: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טיהור והתפשטות של pBEC

במהלך ההליך טיהור, שלבים קריטיים כוללות הסרה מהירה ויעילה של קרומי המוח והפרדה של חומר לבן ואפור, וזה חשוב עבור טיהור ביבול ובאיכות טוהר ועבור הקמת הדגם המתאים. לדגם הציג במבחנה BBB באמצעות pBECs, יש שיפור ואנו פשוטה הליך טיהור בהתבסס על המגון מכני של החומר האפור מבודד, גודל סלקטיבית סינון עבור בידוד של microvessels, מערכת העיכול עם collagenase , DNase וטריפסין, עם תרבות הראשונית של קטעים microvessel. באופן כללי, אחד האתגרים הגדולים במהלך טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא חיסול של תאים מזהמים. ניסיון עם טיהור תאי אנדותל מוח ראשוניים מצביעים כי הסרה יסודית של קרומי המוח וגם חומר לבן תוצאות שיפור טוהר ועם תשואה של נימים, וכן גדל תא אנדותל הצמיחה וביטוי של BBB המאפיינים. מסיבה זו, זהיר הסרה של קרומי המוח (כולל בתוך sulci) בפרוטוקול הציג נועד להבטיח הסרה של תאים leptomeningeal (אשר יש תכונות כמו פיברובלסט), כמו גם של תאי שריר חלק עורקים ו arteriolar, אשר גדלים במהירות רבה יותר מאשר תאי אנדותל בתרבות. באופן דומה, וצמצום של החומר הלבן גרמו בתרבויות תא אנדותל מזוכך, עם תאים מזהמים פחות גדל מן השברים נימי מבודד. עם זאת, זה פשוטה שיטה מהירה חלה לבידוד מוריד את התשואה של נימים מבודד ו אופטימיזציה של החומר האפור בידוד יכול לשפר באופן משמעותי את התשואה של כל המוח. הדרגה צפיפות, אשר כלולה של פרוטוקול חלופי טיהור69, ניתן לבודד תאי אנדותל חינם ושיפור תא אנדותל טוהר, אבל זמן רב והוא גם יכול להוריד את התשואה. שתי השיטות לטיהור יש כבר בהרחבה בשימוש, מאופיין, ולשתף את מאפייני יצירת מודלים pBEC TEER גבוהה ב- MC והן אסטרוציט תרבות משותפת (בדרך כלל 500-1500 Ω ס מ2)7,16, 21,22,49,57,70,71.

כדי לבסס את monolayers עם paracellular גבוהה restrictiveness, הניסיון הוכיח כי חייבים לסלק pericytes של תרבויות אנדותל ה-16. המוח חזירי pericytes בדרך כלל לגדול מתחת לשכבות pBEC, ולעולם לא לגרום חורים בשכבות אנדותל, כפי שנצפה על תרבויות של עכברוש המוח תאי אנדותל72,73. Pericytes ב pBEC תרבויות לעשות, לעומת זאת, נוטים להשפיע על המורפולוגיה של תאי אנדותל, אשר מופיעים רחבה יותר, עם תאים חריגים הדיירים16. כי תאי אנדותל המוח אקספרס רמות גבוהות יותר של מובילי בזרימת (למשל P-גליקופרוטאין) מאשר סוגי תאים אחרים, microvessels, מספר התאים מזהמים יכול להיות מופחת על ידי טיפול puromycin74. בנוסף, שימוש בסרום נגזר פלזמה (PDS) יותר מאשר העגל עוברית או neonatal נגזר טובות בסרום הצמיחה של תאי אנדותל, כמו PDS יש ריכוז נמוך יותר של גורמי גדילה כמו נגזר טסית פקטורי גדילה וצמיחה אנדותל כלי הדם פקטור, אשר מוצגים כדי להגדיל את חדירות BBB ולעורר אנגיוגנזה14,75,76,77. על ידי היכרות עם תרבות הראשונית של קטעים נימי מבודד ושילוב זה עם טיפול puromycin (4 µg/mL) ושימוש PDS, הצלחנו מאוד לצמצם את מספר התאים מזהמים שנותרו לאחר הטיהור, כך לאחר מכן נוכל להקים monolayers אנדותל חזק על קרום חדיר מוסיף. על מנת להבטיח המצורף הטוב ביותר של תאי אנדותל על תרבות מנות והן קרום חדיר הוספה משטחים, זה נצפתה תערובת לציפוי של קולגן מסוג IV (מן השליה האנושית) fibronectin מגדיל מאוד התפשטות התשואות, התערובת משולב ולכן היה להעדפה על השיטה המסורתית באמצעות רק קולגן מסוג I78.

התמיינות של תאים ושל הקמת מודל TEER גבוהה במבחנה BBB

PBECs ב- MC שומרים בדרך כלל על BBB מפתח תכונות רבות בעקבות בידוד, כך תרבות משותפת עם האסטרוציטים אינה חיונית עבור גרימת צמתי צר פונקציונלי ולהשיג גבוהה TEER ערכי16,57. המאמצים כדי למטב את התנאים התמיינות של תאי אנדותל לתוך BBB פנוטיפ כוללות שימוש בסרום המכילות בינוני בתוספת 8-CPT-מחנה, הידרוקורטיזון7 (עולה תאיים מחנה רמה13), RO 20-1724 (שמירה על רמת המחנה תאיים), אשר לפי הקודם ממצאים74,79 יחד בהצלחה משופרת ההידוק מכשול, גדל TEER, ייתכן סייעו גם לשחזר יותר אין ויוו כמו ביטוי גנים פרופיל80. עם זאת, השימוש של הידרוקורטיזון עבור הידוק של שכבת אנדותל רשאית לשנות את התגובה של תאי אנדותל לגירויים מסוימים, ולצורך באמצעות המודל לחקירה של התגובות הכימותרפיה, ציטוקינים בעת דלקת, השימוש הידרוקורטיזון, ייתכן שיהיה עליך להימנע.

מחקרים השוואתיים עם MC, MC עם ACM, אסטרוציט תרבויות משותפת במעבדות שני המשתתפים ובמקומות אחרים, הוכח כי התרומה astrocytic הוא מסוגל לשיפור תכונות BBB אנדותל והגברת ההידוק מכשול 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. כדי להשיג כזה ביטוי גבוהה של BBB פנוטיפ ב- pBECs, אנחנו הוקמה NCC עם האסטרוציטים ומצא כי שניהם חזירי האסטרוציטים העיקרי חולדה היו מועיל, כמו גם נצפתה אחרים מעבדות22. במהלך הקמת אסטרוציט NCCs, הניסיון הוכיח כי הטוהר ואת הגיל של התרבויות אסטרוציט להשפיע ההדיקות המכשול אנדותל וכתוצאה מכך, with הגיל האופטימלי של האסטרוציטים להיות 2-8 שבועות, אשר עולה בקנה אחד עם החלפת נצפתה ב המורפולוגיה אסטרוציט לאורך זמן. ביום שלפני הקמת את NCC, שינוי בינונית עבור האסטרוציטים נועד להסיר מטבוליטים מזיקות, לאפשר מספיק זמן האסטרוציטים לשחרר איתות הגורמים המשפיעים על התפתחות מכשול ולניתוח. כאשר שיתוף culturing תאי אנדותל של האסטרוציטים במערכת הוספה קרום חדיר, חשוב להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי הטיפול של המודל מכשול. במהלך שינוי בינוני, השאיפה וגם תוספת של המדיום, את התנועות של התוספות חייב להיעשות בקפידה על מנת למזער שיבושים של המכשול אנדותל.

הפארמצבטית ואמינות

אתגר גדול בעת שימוש ראשוני התאים להקמת מודלים במבחנה היא להשיג הפארמצבטית גבוהה בין תרבויות. סטנדרטיזציה כזה יכול להתקיים לפי הבחירה של השיטה, השימוש בכלים איכותיים, ריאגנטים, וניסיון microdissection. הפארמצבטית גבוהה עם נמוכה וריאציה אצווה-כדי-אצווה עבור פעולת השירות הציג לכן תלויים במידה רבה הקפדה על ההליכים המתוארים.

כדי להשיג על הפארמצבטית טוב בין אצוות בקבוקונים במהלך TEER מדידות, תא המדידה של התנגדות רקמות או אפיתל מדי מתח עם אלקטרודות מיניאטורי נוקשה, יותר מאשר אלקטרודות המקל גמיש יכול לשמש, הפחתת השתנות של ערכים TEER הנצפה. בנוסף השגת ערכים גבוהים של TEER (איור 4), אישר את המהימנות של המודל הציג את המתאימה נמוכה קטנים ממס החדירות (איור 4), וכן אפיון immunocytochemical pBECs (איור 5 ).

מגבלות של שיטה יישומית, מודל

השימוש של חזירים הטרנסגניים ו זעיר גדל במהלך העשורים האחרונים, אבל כמות הנתונים בתוך vivo הוא עדיין מוגבל בהשוואה לנתוני מודלים מכרסמים, ולכן עשוי להוות אתגר להשוואת הנתונים במבחנה חזירי עם תוצאות ויוו . עם זאת, כפי הביולוגיה של החזיר משקף הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר חיות הוקמה מעבדה רבות, חזיר מהונדס מודלים עבור הלומדים מחלות נוירולוגיות כגון מחלת אלצהיימר כבר עכשיו נוסדה84, הזמינות של אין ויוו נתונים צפוי להיות פחות בעייתי עם הזמן.

מגבלה של קרום חדיר להוסיף מערכת מודלים הנוכחית של BBB הוא חוסר היכולת לחקות את זרימת הדם ב- microvessels. In vivo, גזירה הוכח כדי להשפיע על היבטים רבים של תאי אנדותל פיזיולוגיה כגון החטיבה, בידול, הגירה, אפופטוזיס85,86, וכדי להשפיע על המאפיינים החשובים של BBB כגון הביטוי של חלבונים מהחיבור, ואת אינדוקציה קיטוב של מובילי61,85,87. כדי להציג את תנאים, microfluidic פיתח מערכות יכול להיחשב88,89,90.

שיטה שימושית כדי לתקן עבור האפקט של שכבת מים unstirred (שכבת גבול מימית) מנתוני חדירות ' במבחנה הוא להפיק את החזוי 'חדירות מהותי' ויוו, באמצעות גישה מבוססת-תוכנה21. תוכנה זו יכולה לשמש גם עבור ניתוח נתונים מפורט חדירות21.

יישומים עתידיים ועל כיווני השיטה

כפי הרכיבים של יחידת נוירו-וסקולריים הוכחו תפקיד חשוב ב גרימת ושמירה על תכונות BBB, מודל לא במבחנה הנוכחי עדיין לא הצליח לחקות באופן מלא את התנאים ויוו , המרכיבים החשובים ו אינטראקציות עדיין עלול להיות חסר. המאמצים הנוכחיים בפיתוח הדגם הציג כוללים הקמת טריפל-תרבות דגמים עם האסטרוציטים, pericytes וגם ניסויים שילוב תאים של מינים שונים. תיאגוד pericytes כה לא נצפתה להגדיל באופן משמעותי את רמות TEER של המכשול. עם זאת, מודלים חזירי syngeneic נצפו דומות לאלו לשלש תרבויות באמצעות תאי אנדותל המוח חזירי, האסטרוציטים חולדה עכברוש pericytes מכשול אטימות, ביטוי של חלבונים סימן ההיכר האופייניים המוח אנדותל22. כדי לפתח מודל המבוסס על תאים אנושיים, התפתחויות עתידיות של במבחנה BBB מודלים עבור גילוי תרופות ואספקה עשוי להסתמך על ההטיה של גזע pluripotent האנושית ואת גזע בוגרים ו/או קדמון תאים21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברי הדו ח אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר אליזבת הלנה Bruun, שרה כריסטין כריסטנסן ו נילס מ Kristiansen לקבלת סיוע טכני, קרן לונדבק להעניק מספר R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

רפואה גיליון 127 מחסום הדם - מוח (BBB) מערכת העצבים המרכזית (CNS) יחידת נוירו-וסקולריים (NVU) תאי אנדותל המוח חזירי (pBECs) ההתנגדות החשמלית transendothelial (TEER) תרבות-מונו (MC) תרבות משותפת (NCC) התא הראשי ללא מגע בידוד וגדילת גילוי תרופות מחלות ניווניות
שיפור שיטה להקמת <em>במבחנה</em> מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,… More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter