Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

Published: September 24, 2017 doi: 10.3791/56277

Summary

Målet med protokollen er å presentere en optimalisert prosedyre for etablering av en i vitro blod - hjerne barrieren (BBB) modell basert på primære svin hjernen endotelceller (pBECs). Modellen viser høy reproduserbarhet, høy tetthet, og er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel i stoffet funnet.

Abstract

Målet med denne protokollen presenterer en optimalisert prosedyre for rensing og dyrking av pBECs og i vitro blod - hjerne barrieren (BBB) modeller basert på pBECs i mono-kultur (MC), MC med astrocytter-conditioned medium (ACM), og ikke-kontakt co kultur (NCC) med astrocyttene av svin eller rotte opprinnelse. pBECs ble isolert og kultivert fra fragmenter av kapillærer fra hjernen halvdelene av innenlandske griser 5-6 måneder gammel. Disse fragmentene ble renset ved forsiktig fjerning av meninges, isolasjon og homogenisering av grå materie, filtrering, enzymatisk fordøyelsen og sentrifugering. For å ytterligere eliminere skadelige celler, kapillære fragmenter ble kultivert med puromycin som inneholder mediet. Når 60-95% confluent, pBECs fra kapillær fragmenter ble passaged til gjennomtrengelig membran filter setter inn og etablerte modeller. For å øke barriere tetthet og BBB karakteristiske fenotypen av pBECs, cellene ble behandlet med følgende differensiering faktorer: membran permeant 8-CPT-cAMP (her forkortet cAMP), hydrocortisone og en fosfodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). Prosedyren ble utført over en periode på 9-11 dager, og når etablerende NCC modellen, astrocyttene ble kultivert 2-8 uker i forveien. Overholdelse av beskrevet prosedyrene i protokollen har tillatt etableringen av endothelial lag med svært begrenset paracellular permeabilitet, med NCC modell viser en gjennomsnittet transendothelial motstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, og paracellular permeabilitet (Papp) for Lucifer gule av 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sek-1 (mener ± SEM, n = 55). Videre evaluering av denne pBEC fenotypen viste godt uttrykk for tett junctional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin og adherens krysset protein p120 catenin. Modellen presentert kan brukes for en rekke studier av BBB i helse og sykdom, og med svært restriktive paracellular permeabilitet, denne modellen er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel.

Introduction

Mobilnettet strukturen og funksjonen til blod - hjerne barrieren

På grensesnittet av sirkulasjons og sentrale nervesystemet (CNS) fungerer BBB som viktige forskrifter nettsted for homoeostatic kontroll over CNS-microenvironment som er avgjørende for riktig funksjon og beskyttelse av nervesystemet. Stedet for BBB er endotelceller foring på blod fartøy lumen. I hjerne blodkar, endotelceller form komplekse intercellulære stramt veikryss og sterkt polarisert uttrykk mønstre av bestemt tilstrømningen og middelklasseinnbyggere transportører sikre svært spesifikke molekylær transport mellom blod og hjernen 1. Strukturelle komponenter i tett krysset komplekser inkluderer proteiner fra occludin og claudin, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin og tilknyttede junctional vedheft molekyler (syltetøy). Claudin 5 er spesielt viktig i paracellular junctional begrensning. Induksjon og vedlikehold av denne karakteristiske BBB endothelial fenotypen involverer dynamisk samspill med omkringliggende celler, inkludert pericytes, astrocyttene, nerveceller og kjelleren membraner, som sammen med hjernen endothelial celler skjemaet i nevrovaskulære enhet (NVU)2,3. Mekanismene som er involvert i disse samhandlingene er ennå ikke fullt ut forstått, men inkluderer utveksling av kjemiske signaler mellom cellene, som tillater modulering av BBB permeabilitet på kort sikt og induserer langsiktige BBB funksjoner4. Astrocyttene spesielt er kjent for å bidra til hjernen endothelial celle fenotypen og er en kilde til regulatoriske forhold som glial-avledet nevrotropisk faktor (påvirke intracellulær leiren)5, grunnleggende fibroblast vekstfaktor6, Hydrocortisone7og transformere vekstfaktor β (TGF-β)8. Effekten av TGF-β, men har vært omdiskutert9.

Fra i Vivo In Vitro BBB

I vivo studier fortsette å gi verdifull informasjon om BBB biologi. Men kan cellen kultur modeller gi ytterligere innsikt og utgjør nyttige verktøy for å forstå detaljert molekylære og funksjonelle aspekter av BBB i både helse og sykdom. Selv om de komplekse interaksjonene mellom celletyper og bestanddeler av BBB er vanskelig å fullt oppnå i vitro modeller, har det vært, siden første rensing av hjernen endotelceller og anvendelse av disse i mono-kulturer 10 , 11 , 12, av rensing prosedyrer og vekst ansettelsesbetingelser BBB celle kultur modeller, som resulterer i større likhet med Gaspar i vivo barrieren. De brukte i vitro BBB modellene er basert på primær celler gnager, svin og bovin opprinnelse og udødeliggjort linjer. Hver modell har forskjellige fordeler og ulemper. For sammenligning og modell valg brukes validering markører som uttrykk for BBB enzymer, transportører, reseptorer og strukturelle proteiner til å opprette oversikter av gjeldende etablerte modeller1.

Formålet med protokollen

En viktig funksjon i BBB er barriere tetthet og høy TEER, men mange av de tilgjengelige modellene reflekterer ikke godt i vivo nivåene. Innlemme utvikling og optimalisering bidrag fra flere laboratorier, er målet med denne protokollen å presentere en metode for å opprette en høy TEER i vitro BBB modell basert på primære pBECs MC med eller uten ACM eller NCC med primær astrocyttene rotte eller svin opprinnelse. Anvendt prosedyrer og etableringen av modellen inkluderer innsats å eliminere skadelige celler og forbedre differensiering av pBECs i en BBB fenotypen. Dette arbeidet har resultert i etableringen av pålitelig, høy TEER modeller med lav paracellular permeabilitet og god funksjonelle uttrykk for viktige stram junctional proteiner, transportører og reseptorer. Men som astrocyttene er en medvirkende faktor til hjernen endothelial celle fenotypen, representerer i tre ulike betingelser kultur tre Norge av hjernen endotelceller. NCC modellen er spesielt nyttig for studier av enkelte spesialiserte mekanismer involvert i stoffet funnet, transport studier og intracellulær menneskehandel, og etterforskning av celle-celle interaksjoner der maksimal uttrykk BBB funksjoner er fordelaktig.

Opprinnelsen og historien til protokollen

Den pBEC modellen beskrevet her er hovedsakelig basert på porcine modell utviklet ved Eisai Laboratories (London) av Dr. Louise Morgan og kolleger, whichis basert på en vellykket tidligere bovin hjernen endothelial celle modell13. Den opprinnelige metoden celle forberedelser var en to-trinns filtrering bruker nylon maskene for å fange microvessels, etterfulgt av et subculturing skritt for å forbedre renhet. I tidligere utvikling av metoden, optimal BBB fenotypen og barriere tetthet ble oppnådd ved vekst i supplert medium, inkludert ACM. Ytterligere modifiseringer å metoden ble gjort av R. Skinner i Prof N. Rothwell lab i Manchester UK14,15. Metoden ble innført av Abbott laboratoriet, KCL London, hvor Patabendige gjorde det betraktelig enklere å forberede ved å unngå bruk av astrocyttene eller ACM og eliminere skadelige celler som pericytes med puromycin. Første avisene bekreftet at MC modellen bevart flere viktige funksjoner av i vivo BBB, inkludert effektive stramt veikryss, membran transportsystemer og reseptor-mediert transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. senere S. komme igjen testet astrocytter co kultur og funnet det forbedret TEER, så dette er den foretrukne varianten som brukes i Abbott lab21. Modellen har nå blitt overført til M. Nielsen lab i Århus, hvor ytterligere modifiseringer ha blitt introdusert (dette protocol), inkludert forenkle grå rolle utvinning, bruker bare ett nett filtrering trinn, og en enkelt filter belegg kombinere kollagen og fibronectin. Bruk fremgangsmåten for isolering av svin astrocyttene (denne protokollen) var basert på protokoller utviklet av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrevet av Thomsen et al22. TEER og andre egenskaper for modellen generert i London og Århus er lik, som gir tillit til forestillingen om at modellen er lett overføres mellom laboratorier og svarer godt til forsiktig observasjon og rasjonalisere trinn. Faktisk, S. PPLive nå etablert MC-modell i et tropisk land (Malaysia)23, som involverte ytterligere justering for lokal betingelser og vev kilder.

Fordelene over alternativ metoder og nå etablert modeller

PBECs sammenlignet med hjernen endotelceller av storfe og gnager opprinnelse, og gir fordelen av å ha en lavere pris for tap av i vivo BBB fenotypen etter isolasjon24. Videre er pBECs stand til å danne relativt stramt endothelial barrierer, selv når dyrket i MC (800 Ω cm2)16 sammenlignet med vanlig rapporterte nivåene for monolayers av cellelinjer som bEND.5 og bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, ende (300-800 Ω cm2)28,29,30, og cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32og primære hjernen endotelceller mus (100-300 Ω cm2)ss = "xref" > 33,34,35,36 og rotten (100-300 Ω cm2)37,38. TEER har imidlertid vist avhengighet på rensing og kultur prosedyrene. I de fleste tilfeller viser tillegg av ACM eller co kultur med astrocyttene unike effekter på endotelceller og en økning i tetthet av endothelial lag1. Likevel med arbeid med å optimalisere culturing forholdene, bare storfe-baserte modeller har vist TEER verdier sammenlignes med svin-baserte modeller (gjennomsnitt 800 Ω cm2 i MC, opp til 2500 Ω cm2 i astrocytter co kultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Som modeller basert på primære bovin hjernen har endotelceller vist store variasjoner, både mellom og innenfor laboratorier14,45,46,47,48, reproduserbarhet kan være et problem. I pBEC modell rapporterte her, har bidrar laboratoriene oppnådd svært lik TEER og paracellular permeabilitet verdier med lav variasjon, både i og mellom laboratorier. Derfor bør det være mulig for andre laboratorier for å etablere en robust modell med lave variasjon med metoden presenteres her. I tillegg danner stramt endothelial lag, har modeller med pBECs tidligere blitt godkjent av uttrykk for tett krysset proteiner, funksjonelle BBB transportører, reseptorer og enzymer og demonstrerte egnethet for en rekke studier15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. videre upubliserte transcriptome data på co kulturer av pBECs viser en forventet profil av BBB transportører og reseptorer (upubliserte resultater, Nielsen et al.).

Den svin-baserte BBB modellen har flere fordeler som genom, anatomi, fysiologi, og sykdomsprogresjon av grisen gjenspeile menneskets biologi i større grad enn andre etablerte modeller har60, som er gunstig for den farmasøytisk industri. Som svin hjernen er et vanlig biprodukt av kjøttet industrien, utgjør de en lett tilgjengelig kilde til hjernen endotelceller, minimere antall dyr trengte eksperimenter, og gir en høy rensing avkastning fra én svin hjerne. Selv om rensing og dyrking av primære celler er litt tidkrevende og krever kompetanse for standardisering i å sette opp modellen, generere primære celler mest pålitelige BBB modellene. Udødeliggjort cellelinjer kan ikke være en erstatning, som viktige egenskaper som barriere tetthet, transporter uttrykket profiler og microenvironment regulering ikke reflekterer eksperimentelle resultatene i vivo61, 62. in vitro modeller gir fordelen av live-celle tenkelig med høyere oppløsning, gjør visualisering av intracellulær prosesser mulig ved at en nærhet tilnærming til samplet eller observert cellene, bruker mål med høyere forstørrelse og bedre optisk kvalitet63. Dette er ikke tilfelle for bruk av to-fotonet mikroskopi i levende dyr. Videre gir i vitro modeller muligheten til å transfect celler, slik at visualisering av merket proteiner og undersøkelse av deres handel.

Anvendelser av modellen

Funksjonen til BBB er ikke fast, og kan være dynamisk modulert både fysiologi og patologi. I mange nevrologiske sykdommer, inkludert nevrodegenerative, er provoserende og smittsomme sykdommer, avbrudd og økt permeabilitet av BBB observert64,65,66,67 . For å redusere og forebygge sykdomsprogresjon og påfølgende skade, er identifikasjon og karakterisering av molekylære mekanismer underliggende modulering av BBB av stor betydning. I denne sammenheng, pålitelig i vitro modeller er i høy etterspørsel av legemiddelindustrien, og videre spille viktige roller i å forutsi BBB permeabilitet av narkotika til CNS. Noen i vitro modell som en permeabilitet skjerm skal vise en restriktiv paracellular sti, fysiologisk realistisk celle arkitektur og funksjonelle uttrykk for transporter mekanismer68. Vist i tidligere studier16,17,57og paracellular permeabilitet og uttrykk for TJ og AJ proteiner her, presentert modellen oppfyller alle disse kriteriene og er egnet for en rekke av BBB studier i både normale fysiologi og patologi. Styrke av presentert rensing og dyrking metoden er en kombinasjon av enkelhet og reproduserbarhet og evnen å inkludere astrocytic innflytelse med resulterende robust og pålitelig høy TEER i vitro BBB modell. For dette formål, astrocyttene av svin og rotte opprinnelse har vist seg å øke BBB fenotypen av pBECs i en lignende måte22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

svin hjernen ble innhentet som biprodukter av danske næringsmiddelindustrien. Danske slakterier er under strengt oppsyn og observasjon av danske Miljøverndepartementet og mat.

rotter brukes for isolering av astrocyttene ble avlet og gruppe plassert i lokale dyr anlegget ved en omgivelsestemperatur på 22 ° C - 23 ° C og en 12/12 h mørke/lys syklus under inspeksjon av veterinær og ifølge dansk regler for lab dyr. Rotter var euthanized før de ble ofret i samsvar med internasjonale retningslinjer for etisk bruk av dyr (europeiske samfunn rådsdirektiv av 24 November 1986, 86/609/EEC) og danske retningslinjer. Ingen i vivo eksperimenter på dyr eller human materiale ble brukt i disse eksperimentene.

Merk: følgende er en pBEC viktigste protokoll som beskriver (trinn 1) rensing, (trinn 2) dyrking og (trinn 3) TEER målinger. En alternativ protcol (trinn 4) beskriver rensing og dyrking av rotte og svin astrocyttene presenteres for oppsett av en NCC med astrocyttene,.

1. rensing av svin hjernen kapillærene

  1. samle 8-10 hjerner 5-6-måneden-gamle nasjonale griser (f.eks fra en nærliggende slakteriet) og transportere dem på is til laboratoriet. Vi anbefaler at du starter rensing fremgangsmåten innen 2-3 timer etter avslutning av dyret.
  2. Plasser hjernen i en steril flow benk og forsiktig vaske dem med 1 L PBS i et beaker plassert på ice.
  3. Nøye fjerne meninges fra én hjerne samtidig med fin-spissen tang og overføre meninges-fri hjernen til en annen 1 liters kanne med PBS plassert på is. Utvide tiden kan komplisere fjerning. Den omtrentlige tiden brukes for hver hjernen skal 10-15 min.
  4. Bruker en skalpell, skrape av grå materie fra én hjerne samtidig og overføre isolert materialet til Petri retter (8,8 cm 2) som inneholder 20 mL DMEM næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F-12) plassert på is. Isolere som mye grå materie som mulig uten uttak hvit substans materiale. For første fragmentering, kjøre grå materie materialet gjennom 50 mL sprøyter uten en nål. Fortsett alle hjernen og basseng samlet grå materie materialet. Utvide tiden kan komplisere fjerning. Den omtrentlige tiden brukes for hver hjernen skal 10-15 min.
  5. Overføring isolert grå saken materiale til jeksel tube en håndholdt vev homogenizer i forholdet 50/50 med DMEM/F-12 media. Homogenize materialet ved 8 opp og ned slag med en løs støter, etterfulgt av 8 opp og ned slag med en stram støter. Fortsett til alle isolert materiale har blitt homogenisert, overføre homogenate til en 500-mL flaske og fortynn med DMEM/F-12 til omtrent 450 mL totalvolum.
  6. Filtrere homogenate med en 500-mL blå-cap flaske med filterholderen og 140 µm filter-mesh og isolere kapillærene ved å kjøre vevet gjennom filteret. Bruk ett filter per 50 mL av homogenate og vask hvert filter med DMEM/F-12 etterpå.
  7. Sted i kapillær inneholder filtre i Petri retter med en fordøyelsen løsning av trypsin/EDTA (2,5% trypsin, 0.1 nM EDTA i PBS), collagenase CLS2 (2000 U/mL) og DNase 1 (3400 U/mL) i DMEM/F-12. Bruk 1 Petriskål (8,8 cm 2, 20 mL løsning) per 3 filteret nett.
  8. Plasser Petri retter ved 37 ° C i 1 time på en orbital shaker på 180 rpm eller rør dem forsiktig hvert 10 min. Etter 1 h, vaske kapillærene av filtrene med suspensjon fra Petriskål ved hjelp av en 1 mL pipette.
  9. Delt suspensjon fra 3 retter i 2 50 mL rør og stoppe fordøyelsen ved legge 10 mL DMEM/F-12 til hver 50 mL tube.
  10. Sentrifuge av celle-suspensjon på 250 x g, 4 ° C for 5 min. Sug opp supernatants og å avbryte hver pellet 10 mL av DMEM/F-12. Legge til en ytterligere 20 mL DMEM/F12 i hver retning. Repeter dette sentrifuge to ganger.
  11. Rør avkjølt på is 5 min og overføre løsninger til 2 nye 50 mL rør.
  12. Sentrifuge av celle-suspensjon på 250 x g, 4 ° C i 5 minutter, og å suspendere hver pellet i 8-10 mL (ca 1 mL/hjernen brukes) av frysing løsning med 10% DMSO i FBS.
  13. Overføre celle suspensjon til cryovials, med 1 mL per cryovial. I gjennomsnitt resulterer en renselse i 1 hetteglass per hjernen brukes, gjennomsnittlig gir endotelceller for 12-16 innsettinger. Plass ampullene i en fryser ved-80 ° C i minst 4 h opp over natten. Etterpå, lagre cryovials i en cryotank med flytende nitrogen.
    Forsiktig: Flytende nitrogen har svært lave temperaturer. Vennligst ha passende beskyttelse.

2. Dyrking av primære pBECs (8-10 dager)

  1. Første kultur (3-5 dager)
    dag 1
    1. å optimalisere betingelsene for feste av pBECs, utføre belegg av en MT75 kolbe ved å legge til en løsning med siste konsentrasjoner av kollagen IV (150 µg/mL) og fibronectin (50 µg/mL) i ddH 2 O kolbe, sørge for at løsningen dekker hele overflaten. Bruk 10 mL for hver MT75 kolbe. Inkuber ved 37 ° C i 2 h.
      Merk: Belegget kan utføres bare før bruk eller opptil en uke før og lagres med PBS på 4 ° C. Belegget må ikke tørke ut, eller det vil ikke lenger være en passende vedlegg og vekst overflate.
    2. Forberede 16 mL pBEC vekst medium bestående av DMEM/F-12 supplert med 10% plasma-avledet serum (PDS), penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 µg/mL) og heparin (15 U/mL). Supplere mediet med puromycin (4 µg/mL) til å velge for endotelceller. Vær oppmerksom på at puromycin behandling kan bare brukes for maksimalt 5 dager.
    3. Aliquot forberedt mediet i 6 mL og 10 mL volumer i to 15 mL rør.
    4. Bringe ampuller med kapillærer fra flytende nitrogen (trinn 1.13) og tine kapillærene ved bruk av et vannbad 37 ° C eller legge til 750 µL av forberedt medium fra 6-mL aliquot. Hvis tining ved å legge til middels, Pipetter forsiktig opp og ned å tine og homogenize suspensjon. Når tint, overføre celle suspensjon til 6-mL medium aliquot.
    5. Hvis du vil fjerne frysing medium, spin kapillærene ned på 250 x g, 4 ° C i 7 min.
    6. Nøye Sug opp nedbryting og re suspendere pellet i 1-2 mL 10-mL aliquot. Når re suspendert, overføre løsningen til 10-mL medium aliquot.
    7. Overføre kapillær suspensjon til belagt MT75 kolbe og tilt forsiktig flasken for å sikre lik distribusjon over overflaten. Plasser MT75 kolbe 37 ° C, 5% CO 2.
      Dag 2
    8. Etter overnatting inkubasjon forberede 10 mL pBEC oppblomstringen medium med puromycin (4 µg/mL) for en MT75 kolbe og utføre en medium endring. Vær oppmerksom på at alle middels løsninger brukt på celler skal forvarmes 37 ° c før bruk.
      Merk: Alternativt en medium endring kan være utført 4-6 h etter plating når kapillærene bør ha festet til overflaten. Inkuber cellene til 60-95% samløpet er oppnådd, vanligvis 3-5 dager fra tining. Gjør ikke Tillatw celler å nå 100% samløpet for å unngå kontakt-hemming som kan stoppe videre celle vekst.
      Dag 4-6
    9. Når de ønsket confluency er oppnådd, passasje endotelceller gjennomtrengelig membran setter inn (se avsnitt 2.2). Hvis den ønskede confluency ikke er oppnådd på dag 4, utføres endring av medium. På siste dag 6, skal cellene være passaged på gjennomtrengelig membran skivene. Hvis den nødvendige confluency ikke er oppnådd etter dag 6, cellene er ikke egnet for rekreasjonsbruk.
      Merk: utarbeidelse av astrocyttene for NCC: Når co kultur modellen, 2 - 8 uke gamle astrocyttene i kultur (se Seksjon 4) bør være forberedt for co kultur modellen ved å utføre en medium endring på dagen før passaging endotelceller setter inn. For hver astrocytter Vel, forberede 1500 µL av astrocytter vekst medium bestående av DMEM lav glukose supplert med 10% FBS, penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 µg/mL) og deretter utføre middels endringen.
  2. Vekst av pBECs på gjennomtrengelig membran setter (5 dager)
    dag 4-6
    1. forberede gjennomtrengelig membran setter inn (12-vel plate med innlegg av 1,12 cm 2 areal, 0.4 µm porene) for såing av pBEC av belegg med kollagen IV (500 µg/mL) og fibronectin (100 µg/mL) i ddH 2 O. Bruk ca 300 µL for hvert sett, og kontroller at løsningen dekker hele voksende overflaten. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2 i minst 2 h.
    2. Forberede 30 mL av pBEC vekst medium (media komposisjon, se delen 2.1.2) uten puromycin.
    3. Sug opp medium fra pBEC kultur i MT75 flasken og forsiktig vaske to ganger med 5 mL steril PBS ved romtemperatur.
    4. Trypsinize cellene ved å legge til 2 mL Trypsin-EDTA løsning (2,5% trypsin, 0.1 nM EDTA i PBS) til MT75, og plassere kolbe ved 37 ° C, 5% CO 2 i 5-7 min.
    5. Koble til hjernen endotelceller, trykk forsiktig på siden av MT75 kolbe med fingertuppene, slutt og overlevende og sterkere-feste pericytes på overflaten av flasken. Visuelt undersøke avdeling under et mikroskop. Når 80% avdeling er observert, stoppe trypsinization ved å legge til 5 mL av medium.
    6. Overføre celle løsningen til en 15 mL tube bruker 10 mL pipette og spinn ned hjernen endotelceller med sentrifugering 250 x g, 4 ° C i 7 minutter.
    7. Nøye fjerne nedbryting og resuspend pellet i 1mL medium. Når suspendert, legge en ytterligere 2 mL medium å bringe det totale volumet til 3 mL
    8. teller antall celler manuelt ved bruk av en celle teller kammer eller en automatisk celle teller system. Forberede en celle løsning av 2.2 x 10 5 celler/mL medium, noe som resulterer i en siste seeding tetthet av 1,1 x 10 5 celler/insert.
    9. Fjerne belegg løsningen fra gjennomtrengelig membran skivene og overføre 500 µL av cellen suspensjon hvert sett inn. På en av skivene, legger du til eneste medium og bruker dette sette som en ' filtrere bare ' kontroll for TEER målingene.
    10. Etablere endotelceller i MC, MC med ACM, eller NCC med astrocyttene på følgende måte:
      1. For MC: legge 1500 µL pBEC vekst medium/ACM per brønn av 12-vel plate under gjennomtrengelig membran skivene. Plasser gjennomtrengelig membran skivene 37 ° C, 5% CO 2 og ruge for 2 dager.
      2. For NCC: overføring setter inn brønner med astrocyttene oppdatert med astrocytter oppblomstringen medium dagen før. Plasser gjennomtrengelig membran skivene 37 ° C, 5% CO 2 og ruge for 2 dager.
        Merk: Vær oppmerksom på bruk av forskjellige medietyper i brønnene som bunnen av de tre modellene.
        Dag 6-8
    11. På dag 2, endre media på gjennomtrengelig membran skivene med pBECs. Forberede 500 µL av pBEC vekst medium per sett inn, og nøye utføre endringen for å minimere avbrudd av cellen laget. Inkuber cellene i to dager. Vær oppmerksom på at media endringen er utført setter bare, og ikke på bunnen brønner.
  3. Stimulering med differensiering faktorer (1-2 dager)
    dag 8-10
    1. For hver av de ulike modellene, stimulering media bør være forberedt som følgende:
      1. For MC: For hver sette inn og vel, forberede 500 µL av pBEC vekst medium som inneholder leiren (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM).
        MC: Forberede i tillegg 1500 µL av pBEC vekst medium som inneholder leiren (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM).
        MC med ACM: tine 1500 µL ACM og supplere det med cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM).
      2. For NCC: hver innsetting, forberede 500 µL av pBEC vekst medium som inneholder leiren (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM). For hver astrocytter godt, forberede 1500 µL av DMEM/F-12 med penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 µg/mL), heparin (15 U/mL), leiren (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM).
    2. For hver av de ulike modellene, utføre media utveksling som følger:
      1. For MC: nøye Sug opp mediet brønner og setter inn og legge differensiering mediet til både avdelinger, bruker 500 µL hver innsetting og 1500 µL for hver brønn. Vær oppmerksom på at avbrudd på hver side av sette kan påvirke og forstyrre celle laget.
      2. For NCC: nøye Sug opp medium fra brønner og legge til 750 µL differensiering medium per brønn. Nøye Sug opp mediet setter inn og legge til 500 µL differensiering medium per sett inn. Deretter legge den gjenværende 750 µL differensiering mediet til hver astrocytter godt.
    3. For alle modeller: plasserer cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 og Inkuber med differensiering mellom før neste dag.
      Merk: Vær oppmerksom på at for NCC med astrocyttene, astrocyttene er heretter holdt i serum-free medium.

3. TEER målinger

  1. dagen etter stimulerende celler med differensiering medium, forberede vev motstand målesystem-kammer TEER målinger ved skylling kammeret to ganger med ddH 2 O, én gang med 70% EtOH etter 5 min og 2 ganger med ddH 2 O.
  2. Legge til 4 mL DMEM/F-12 til vev motstand måling chamber, koble den til systemet og kalibrere i ca 30 min etter følgende innstillinger: R = 0, Test R = 1000, Mode = R.
  3. Utføre TEER målinger ved nøye plassere skivene i vev motstand måling kammeret. Hver innsetting, utføre målinger i tre eksemplarer og beregne den gjennomsnittlige Ω cm 2.
    Merk: For co kultur modellen, TEER verdier er forventet å nå > 500 Ω cm 2. Hvis riktig TEER nivå ikke nås på den første dagen å måle TEER, legge til nye differensiering faktorer (cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) og RO (17.5 µM)) og måle TEER igjen på dagen. Når riktig nivå er oppnådd, skal modellen være klar for planlagte eksperimentet. Vær oppmerksom på at cellene skal hvile i minst 3 timer før å gjenopprette etter TEER målinger. Etter stimulering, TEER verdier generelt forblir akseptabelt for 24-48 h etter stimulering.
    Merk: En alternativ og raskere metode bruker stive STX - 100C elektrode paret også registrerer høy TEER i denne modellen 81. Den fleksible STX2 electrode par gir mindre pålitelige opplesninger.

4. Forberedelse av ASTROCYTTENE FOR NON-kontakt co kultur: Alternative metoden

  1. Rensing av astrocyttene
    1. For hver rat hjernen brukes, coat 2 MT75 flasker ved å legge 10 mL av poly-L-lysine (5 µg/mL) i ddH 2 O til hver MT75 kolbe. Inkuber flasker på 37 ° C for 30 min.
    2. Isolasjon av astrocyttene kan utføres som følger:
      1. rotte astrocyttene:
        1. Decapitate 2 1 - 2 dagers gammel rotter ved hjelp av en godkjent metode.
        2. Kutt huden av skallen fra nakken mot nesen, og kutte bein med et sagittal snitt.
        3. Åpne skallen med buet tang, ta ut hjernen og plasserer den i en 15 mL tube (rør 1) med 11 mL DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og gentamycin sulfate (125 µg/mL).
        4. Nøye fjerne meninges med fin-spissen tang og suspendere hjernen materiale ved hjelp av en 1 mL pipette.
      2. Svin astrocyttene:
        1. få 1 hjernen fra en 5-6-måneden-gamle innenlandske gris.
        2. Forsiktig fjerne meninges fra hjernen med fin-spissen pinsett og/eller hendene.
        3. Samle 4 g av grå materie fra hjernen og plassere brikkene på 1-2 mL DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og gentamycin sulfate (125 µg/mL) i en Petriskål. Hvis bitene er store, hakke med skalpeller eller tang.
        4. Suspendere det isolerte materialet ved hjelp av en 1 mL pipette, flytte den til en 15-mL tube (rør 1) og fyll med DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og gentamycin sulfate (125 µg/mL) til et totalt volum på 11 mL.
        5. Fortsette homogenisere isolert materialet med en lang nål knyttet til en 10-mL sprøyte og stoppe opp og ned 3 ganger. Vent til de store stykker har avgjort i bunnen av røret, og deretter samle 7 mL medium fra toppen av tunnelbanen (tube 1).
        6. Filtrerer 7-mL celle suspensjon gjennom et 40 µm nylon filter til en ny 50 mL tube (rør 2).
        7. Legge til 7 mL middels til rør 1 med hjernen. Fortsett homogenisering og filtrering fra trinn 4.1.2.2.5-6 til volumet av filtrerte celle suspensjon i rør 2 er ca 35 mL.
    3. Fjerne belegg løsningen fra MT75 flasker [trinn 4.1.1]. En rask vask med 5 mL PBS etter inkubasjon med poly-L-lysine kan brukes til å sikre at cellene ikke er skadet av alle toksiske effekter av belegg løsningen.
    4. Deles og frø isolert astrocytter løsningen likt mellom MT75 flasker. Inkuber flasker på 37 ° C, 5% CO 2 i 3-5 dager.
  2. Dyrking astrocyttene og forbereder NCC med endotelceller (3 uker)
    1. Første kultur
      1. etter 3-5 dager med inkubering, utføre en medium endring ved nøye aspirating middels og legge 10 mL av DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og gentamycin sulfate (125 µg/mL).
        Merk: Etter første middels, middels bør endres hvert 5 dager. Under de første to ukene, riste flasker og vask cellene grundig med PBS ved endring mediet. Dette hjelpemidler i fjerning av forurensende microglia.
      2. Etter 3 uker med dyrking, trypsinize cellene ved å legge til 2 mL Trypsin-EDTA løsning på bunnen av hver MT75 kolbe, og ruge på 37 ° C, 5% CO 2 i 5-7 min.
      3. Stoppe trypsinization ved å legge til 5 mL av medium, overføre celle løsningen på en 15 mL tube og sentrifuge astrocyttene 250 x g, 4 ° C i 7 min.
      4. Nøye fjerne nedbryting og å suspendere cellene i iskaldt løsning med 10% DMSO i FBS.
      5. Teller antall celler og forberede en celle løsning av 4.0 x 10 6 celler/mL. Fryse cellene i cryovials legger 1 mL per medisinglass.
    2. Vekst i gjennomtrengelig membran sette systemet bunnen brønner (2-12 uker)
      1. forberede 12-vel plater for vekst av astrocyttene ved å legge 1 mL av poly-L-lysine (5 µg/mL) i ddH 2 O i hver brønn. Plasser platene på 37 ° C i 2 h.
      2. For hver 12-vel plate, forberede 25 mL astrocytter oppblomstringen medium (DMEM lav glukose supplert med 10% FBS og penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 µg/mL)).
      3. Bringe ampullen av astrocyttene fra flytende nitrogen og tine cellene ved å legge til 750 µL DMEM lav glukose medium. Pipetter forsiktig opp og ned for å tine og homogenize suspensjon. Når tint, overføre celle-suspensjon slik 15-mL og legge medium til et totalt volum på 7 mL.
        Forsiktig: Flytende nitrogen er ekstremt lav temperatur, så bruke personlig verneutstyr som hansker.
      4. Hvis du vil fjerne frysing medium, spin kapillærene ned på 250 x g, 4 ° C i 7 min.
      5. Nøye Sug opp nedbryting og å suspendere cellene i medium.
      6. Fjerne belegget fra brønnene av 12 godt platene og overføre celle suspensjon brønner med 1 mL per brønn. Inkuber cellene på 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Oppdatere mediet hver tredje dag og kultur celler for minst 2 uker før du bruker cellene for co kultur med endotelceller. Cellene kan brukes for co kultur 12 uker etter tining, med optimale alder er 2-8 uker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering av BBB In Vitro modeller

I metoden presentert, optimalisert ble dyrking av pBECs og etablering av gjennomtrengelig membran sett inn systemet med MC eller uten ACM eller NCC med astrocyttene (figur 1) gjennomført i en periode på 9-11 dager (figur 2). Utvalg av endotelceller, en innledende kultur av renset kapillær fragmenter ble kombinert med puromycin behandling for maksimalt 5 dager, som eliminert mest forurensende celler og fremmet veksten av spindel-formet endotelceller fra den kapillær fragmenter (figur 3A-C). På dag 4-6, hadde pBECs proliferated til en confluency på 60-95%, vokser som ikke overlapper hverandre, kontakt-hemmet, langs justert celler. Når cellene hadde nådd den ønskede confluency, pBECs var belagt på kollagen IV og fibronectin belagt gjennomtrengelig membran sett inn filteret membraner (1,12 cm2 areal, 0.4 µm porene) på en tetthet av 1,1 x 105 celler/insert, på de vanligvis dannet confluent monolayers etter 4 dager (dag 8-10 legge isolasjon). Når co dyrking pBECs, var astrocyttene rotte eller svin opprinnelse belagt på poly-L-lysine belagt bunnen brønner i minst 2 uker før NCC (figur 3D). Når etablering NCC, har erfaring vist at astrocyttene kultivert for 2-8 uker gir den beste støtten for å fremme BBB fenotypen i pBECs; innen fristen dannet av astrocyttene confluent kulturer med celler ordnet i en honeycomb-lignende struktur (figur 3E-F). På dag 4 i gjennomtrengelig membran sett inn systemmodellen (dag 8-10 innlegg isolasjon), celler ble stimulert med leiren, hydrocortisone og RO å øke barriere tetthet og BBB karakteristiske uttrykksmønster stram junctional proteiner, transportører, og reseptorer.

Karakterisering av pBEC fenotypen og Paracellular permeabilitet

Synlig celle inspeksjon kombinert med TEER måling er rutinemessig de sikreste måtene å vurdere confluency og tetthet av endothelial celle laget vokser på gjennomtrengelig membran skivene før eksperimenter. Figur 4 viser resultater fra to serie eksperimenter å vurdere små molekyl narkotika permeabilitet gjennom BBB, kontrollparameterne av TEER (reflekterer ioniske permeabilitet) kombinert med tilsynelatende permeabilitet21 (Papp, cm s-1) radiolabeled sukrose eller fargestoff tracer Lucifer gule (LY), reflekterer paracellular permeabilitet av typiske små stoffet molekyler (~ 200-600 Da). En blanding av interesse med en P-app større enn Papp sukrose eller LY (avhengig av molekylvekt av stoffet) kan foreslå transcellular permeabilitet og/eller transport over cellene. Figur 4 viser at i gjennomtrengelig membran setter inn med pBECs kultivert over rotte astrocyttene, god grupper av pBEC (f.eks her i LY satt) vil generere TEERs i området 500-2000 Ω cm2, med noen høyere eller lavere. Noen grupper, spesielt i tidlige stadier av læring protokoll, kan ha lavere TEERs rundt 100 – 900 Ω cm2 (f.eks her i sukrose satt). TEER måling innrømmer utvalg av filtre, for eksempel med å starte TEER > 500 Ω cm2, og over området TEER vises, Papp er relativt uavhengig av TEER, om et tilstrekkelig stram barriere-lag for disse eksperimentene. Protokollen for å måle permeabilitet, avhenger av typen stoff/konstruksjon. For en beskrivelse av fremgangsmåten for å måle permeabilitet av små molekyler i NCC, beskrevet en protokoll i PPLive, SR, et. Al21. Evaluering av uttrykk for tett krysset proteinene i pBECs i NCC med rotte astrocyttene viste lokalisering av claudin 5, occludin og ZO-1 langs de celle-celle knutepunktene, som vist av immunofluorescence (figur 5A-C). Adherens junction protein p120 catenin viste også, veldefinerte distribusjon langs de celle-celle knutepunktene (figur 5 d).

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av anvendt i vitro BBB modellene. Skjematisk fremstilling av den gjennomtrengelig membranen inn modeller av pBECs i MC (A), MC med ACM (B)og NCC med astrocyttene (C). I MC, ble pBEC oppblomstringen medium eller ACM brukt i bunnen brønnene, mens i NCC, setter inn med pBECs var plassert i brønner med 2-8-uke-gamle astrocyttene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: flyt diagram av de viktigste trinnene under pBEC dyrking og etablering av presentert modeller. For en oversikt og tidslinjen for metoden oppsummerer skjematisk presentasjonen de viktigste trinnene i culturing prosedyren for pBECs og etablering av presentert modeller, dvs MC med eller uten ACM og NCC med astrocyttene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant gang løpet av første kulturer av pBECs og rotten astrocyttene. Fase kontrast mikroskopi bilder av kulturer av pBECs (- vekselstrøm) og astrocyttene (D-F) vises over 5 dager. Renset kapillær fragmenter på den første dagen i den første kulturen viste både kapillærene og forurensende celler (A, dag 1), som etter medium endring på dag 2 og en ekstra dag for vekst, viste valg for pBECs, deres vekst fra kapillær fragmenter (B dag 3). Confluent monolayers av pBECs var vanligvis oppnås på dag 4-6, da pBECs viste spindel-formet morfologi og ble justert langs (C). Rotte astrocyttene seeded i bunnen brønner normalt proliferated confluent lag innen 5 dager (D-F), og ble brukt for NCC modeller etter 2 uker med vekst. Skala bar for alle bildene: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tett krysset integritet pBECs. Tilsynelatende permeabilitet (Papp) av pBECs til paracellular markører sukrose (MW 342.5 14C-merket, 14,8-25,9 GBq/mmol) og Lucifer gul (MW 521.57, 10 µg mL-1), plottet mot TEER. pBECs var vokst på 1,12 cm2 gjennomtrengelig membran sett inn filtre over rotte astrocyttene i bunnen av brønnen og markører lagt til apikale kammeret. Etter 1 time på 37 & #730; C, utseende på markøren i basale kammeret ble målt og apikale til basal Papp (x 10-6 cm sek-1) beregnet. TEER ble målt > 3t før Papp, bruker STX100C EVOM elektroder, korrigert for sett inn tom gjennomtrengelig membran filteret med motstand 150 Ω. gjennomsnittlig TEER for Lucifer gule datasettet var 1249 ± 80 Ω cm2 (mener ± SEM, n = 55). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Immunocytochemical karakteristikk av pBECs. For pBECs dyrket på 1,12 cm2 gjennomtrengelig membran settes setter filter over rotte astrocyttene base brønnen, immunofluorescence mikroskopi analyse av de tette krysset komponentene (A) Claudin 1-5 (B) Occludin (C) ZO, og adherens krysset protein (D) p120 catenin viste veldefinerte lokalisering på celle-celle veikryss og avslørt confluent hjernen endothelial celle lag spindel-formet, ikke-overlappende cellene. Skala bar for alle bildene: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rensing og spredning av pBEC

Under den rensing prosedyren er avgjørende skritt rask og effektiv fjerning av meninges og separasjon av hvite og grå materie, som er viktig for rensing avkastning og renhet og for riktig etableringen av modellen. Presentert i vitro BBB modellen med pBECs, har vi forbedret og forenklet en rensing prosedyren basert på mekanisk homogenisering av isolerte grå materie, størrelse-selektiv filtrering for isolering av microvessels, fordøyelsen med collagenase , DNase og trypsin, med en innledende kultur av microvessel. Generelt, er en av de store utfordringene i rensing og dyrking av primære celler eliminering av forurensende celler. Erfaring med rensing av primære hjernen endotelceller har indikert at grundig fjerning av både meninges og hvit substans resulterer i økt renhet og avkastning på kapillærene, samt økt endotelial cellevekst og uttrykk for BBB egenskaper. Av denne grunn forsiktig fjerning av meninges (inkludert inne sulci) i presentert protokollen ble utformet for å sikre fjerning av leptomeningeal celler (som har fibroblast-lignende egenskaper), samt arterielle og arterioler glatt muskelceller, som vokser raskere enn endotelceller i kultur. Likeledes, minimering av hvit substans resulterte i renere endothelial cellekulturer, med færre forurensende celler fra isolert kapillær fragmenter. Men dette forenklet og rask metode brukt isolering senker avkastningen av isolerte kapillærer, og optimalisering av grå materie isolasjon kan forbedre avkastningen av hver hjernen. Tetthet gradering, som er inkludert i en alternativ rensing protokollen69, kan brukes til å isolere gratis endotelceller og forbedre endothelial celle renhet, men det er tidkrevende og likeledes kan redusere avkastningen. Begge disse metodene for rensing er mye brukt og preget, og dele egenskapene til generere høy TEER pBEC modeller i både MC og astrocytter co kultur (normalt 500-1500 Ω cm2)7,16, 21,,22,,49,,57,,70,,71.

For å opprette monolayers med høy paracellular restrictiveness, har erfaring vist at pericytes må elimineres fra endothelial kulturer16. Svin hjernen pericytes vanligvis vokser under pBEC lag og forårsaker ikke hull i endothelial lag, som observert i kulturer av rotte hjernen endotelceller72,73. Pericytes i pBEC kulturer gjøre, men pleier å påvirke morfologi av endotelceller, som vises bredere og med uregelmessig celle landegrenser16. Fordi hjernen endotelceller express høyere nivåer av middelklasseinnbyggere transportører (f.eks P-glykoprotein) enn andre celletyper i microvessels, reduseres antallet forurensende celler ved puromycin behandling74. I tillegg bruk av plasma-avledet serum (PDS) i stedet for fosterets eller neonatal kalv avledet serum favoriserer veksten av endotelceller, som PDS har en lavere konsentrasjon av vekstfaktorer som blodplater-avledet vekst faktor og vaskulær endotelial vekst faktor, som er vist å øke BBB permeabilitet og stimulere angiogenese14,75,76,77. Ved å innføre en innledende kultur av isolerte kapillære og kombinert med puromycin behandling (4 µg/mL) og bruk av PDS, lykkes vi i noe som reduserer antall forurensende celler igjen etter rensing slik at etterpå vi kunne opprette stramt endotelial monolayers på gjennomtrengelig membran setter inn. For å sikre best feste endotelceller både kultur retter og gjennomtrengelig membran sett inn overflater, har det vært observert at en belegg blanding av kollagen type IV (fra menneskelige morkaken) og fibronectin øker sterkt spredning gir og kombinert blandingen ble derfor favoriserte over den tradisjonelle metoden bruker bare kollagen type I-78.

Differensiering av celler og etablering av en høy TEER In Vitro BBB modell

PBECs i MC beholder vanligvis mange BBB nøkkelfunksjoner etter isolasjon, slik at co kultur med astrocyttene ikke er avgjørende for inducing funksjonelle stramt veikryss og oppnå høy TEER verdier16,57. Arbeid med å optimalisere betingelsene for differensiering av endotelceller i BBB fenotypen inkluderer bruk av serum inneholder medium med 8-CPT-cAMP, hydrocortisone7 (økende intracellulær leiren nivå13) og RO 20-1724 (opprettholde intracellulær cAMP nivået), som i henhold til tidligere funn74,79 sammen ble forbedret barriere tetthet og økt TEER, og kan også ha bidratt til å gjenopprette en mer i vivo som genuttrykk profil80. Men bruk av hydrocortisone for den innstramming av endothelial laget kan endre svar endotelceller visse stimuli, og for å bruke modellen for undersøkelse av svar til chemo- og cytokiner under betennelse, den Bruk av hydrocortisone må unngås.

Komparative studier med MC MC med ACM og astrocytter co kulturer i begge de deltakende laboratoriene og andre steder, har det vært vist at astrocytic bidrag er i stand til å forbedre endothelial BBB funksjonene og øke barriere tetthet 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. for å oppnå så høy uttrykk for BBB fenotypen i pBECs, vi etablert en NCC med astrocyttene og fant at både svin og rotten primære astrocyttene var gunstig, som også observert i andre laboratorier22. Under etableringen av astrocytter NCCs, har erfaring vist at renhet og alder av astrocytter kulturer påvirke resulterende endothelial barriere tetthet, wi. en optimal alder av astrocyttene blir 2-8 uker, som samsvarer med en observert endring i astrocytter morfologi over tid. Dagen før etablering NCC, er en middels endring for astrocyttene ment å fjerne skadelige metabolitter og la astrocyttene å løslate stimulering og signalnettverk faktorer som påvirker barriere utvikling. Når co dyrking av endotelceller og astrocyttene i gjennomtrengelig membran sett inn systemet, er det viktig å betale spesiell oppmerksomhet til håndtering av barriere modellen. Under medium endring, må både aspirasjon og tillegg av mediet og bevegelser av skivene gjøres nøye for å minimere avbrudd av endothelial barrieren.

Reproduserbarhet og pålitelighet

En stor utfordring ved primær celler for å etablere i vitro modeller er å oppnå høy reproduserbarhet mellom kulturer. Slike standardisering kan oppfylles ved valg av metode, bruk av høy kvalitetsverktøy og reagenser, og erfaring i microdissection. Den høye reproduserbarhet med lav parti til parti variasjon for presentert metoden er derfor svært avhengig av strenge overholdelse beskrevet prosedyrene.

Å oppnå en god reproduserbarhet mellom grupper og ampuller under TEER målinger, en vev motstand måling kammer eller epithelial voltmetre med stive miniatyr elektroder, snarere enn fleksible spisepinne elektrodene kan brukes, redusere den variasjon av observerte TEER verdier. Tillegg til høye TEER verdier (Figur 4), er påliteligheten til presentert modellen bekreftet ved tilsvarende lav lite stoff permeabilitet (Figur 4) og immunocytochemical karakterisering av pBECs (figur 5 ).

Begrensninger av anvendt metode og modell

Bruk av transgene og miniatyr griser har økt i løpet av de siste tiårene, men mengden i vivo data er fortsatt begrenset sammenlignet data tilgjengelig for gnager modeller, og derfor utgjør en utfordring for sammenligne i vitro svin dataene i vivo resultater. Men, som biologi grisen gjenspeiler menneskets biologi nærmere enn mange etablerte forsøksdyr, og transgene gris modeller for studere nevrologiske sykdommer som Alzheimers sykdom har nå blitt etablert84, tilgjengeligheten av vivo data forventes å bli problematisk med tid.

En begrensning av gjeldende gjennomtrengelig membran sett inn systemmodeller av BBB er manglende evne til å etterligne blodstrømmen i microvessels. I vivo, skjæring stress har blitt vist å påvirke mange aspekter av endothelial celle fysiologi som divisjon, differensiering, migrasjon og apoptose85,86, og å påvirke viktige BBB egenskaper som uttrykket junctional proteiner, induksjon og polarisering av transportører61,85,87. For å innføre slike forhold, kan nyutviklet microfluidic systemer betraktes88,89,90.

En nyttig metode for å korrigere effekten av unstirred vann laget (vandig grenselag) i vitro permeabilitet data er å utlede den anslåtte iboende permeabilitet i vivobruker programvare basert tilnærming21. Denne programvaren kan også brukes for detaljert permeabilitet data analyse21.

Framtidige applikasjoner og veibeskrivelse for metoden

Komponentene i nevrovaskulære enhet har vist seg å spille viktige roller i inducing og opprettholde BBB funksjoner, og ingen gjeldende i vitro modell er ennå kjøpedyktig fullt etterligne i vivo forutsetningene, viktige bestanddeler og interaksjoner kan fremdeles mangler. Dagens innsats i å utvikle presentert modellen inkluderer etablering trippel-kultur modeller med både astrocyttene og pericytes, og eksperimenter kombinere celler av ulike arter. Innlemmelse av pericytes har så langt ikke blitt observert å betydelig øke TEER nivåene av barrieren. Men er syngeneic svin modeller observert for å være sammenlignbare å tredoble kulturer svin hjernen endotelceller, rotte astrocyttene og rotten pericytes forhold til barriere tetthet og uttrykk for hallmark proteiner karakteristisk for hjernen endotelet22. For å utvikle en modell basert på menneskelige celler, fremtidige utviklingen av in vitro BBB modeller for stoffet funnet og levering kan stole på avledning av menneskelig pluripotent stamceller og voksen stilk og/eller progenitor celler21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen og Niels M. Kristiansen for teknisk assistanse, og Lundbeck grunnlaget gi nummer R155-2013-14113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Medisin problemet 127 blod - hjerne barrieren (BBB) sentralnervesystemet (CNS) nevrovaskulære enhet (NVU) porcine hjernen endotelceller (pBECs) transendothelial motstand (TEER) mono-kultur (MC) ikke-kontakt co kultur (NCC) primære celle isolasjon intracellulær smugling medisiner nevrodegenerative sykdommer
Forbedret metoden for etablering av en <em>In Vitro</em> blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nielsen, S. S. E., Siupka, P.,More

Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter