Summary
İnsan lökosit antijeni (HLA) serileri organ donörü ve alıcı çiftleri arasındaki uyuşmazlıklar antikor aracılıklı ret organ nakli yapılan en önemli nedeni vardır. Burada Anti-donör HLA alloantibodies organ alıcıları içinde soruşturma için bireysel bağış HLA dizileri üzerinde temel alan özel antijen diziler kullanımı mevcut.
Abstract
Organ nakli işlevi ve greft uzun ömürlü eleştirel başarı immünolojik ret reaktivite insan lökosit antijenleri (HLA) karşı kontrol kullanır. MHC yönergeleri laboratuvar testleri önceden var olan olarak sunar anti-HLA dokunulmazlığının temel alan veya de novo bir büyük nakli engel teşkil HLA antikorlar oluşturulan. Geçerli testleri nakli sera soruşturma için ~ 100 önceden seçilmiş rekombinant HLA antijenleri sabit kümesini kullanan bir tek-antijen boncuk (SAB) platformu üzerinde inşa edilir. Ancak, insanlarda HLA türleriyle HLA dizileri aynı kombinasyonu paylaşan iki birey yoktur tek yumurta ikizleri dışında çok daha büyük çeşitli bulunmaktadır. Süre HLA yazarak ve doğrudan sıralama için gelişmiş teknolojileri tam olarak herhangi bir uyuşmazlığı bir donör 's arasında DNA dizisi içinde-ebilmek esir alma ve alıcının HLA, SAB tahlil sıra gösteriminde sınırlı onun çeşitli nedeniyle tam olarak tespit edemiyor özellikle donör HLA uyuşmazlıkları karşı alloantibodies. Farklı bir teknoloji kullanımı algılamak ve anti-donör HLA antikorlar kişiselleştirilmiş olarak niteleyen tamamlayıcı bir yöntem geliştirmek için çalıştı. Sonrası organ nakli sera antikor aracılıklı reddetme riski değerlendirmek için organ alıcısının problama için donör sıralamaları HLA kaynaklı özel peptit dizisi tarama aracıdır. İki tane verici-alıcı için tek bir dizi üzerinde en fazla 600 benzersiz peptidler vericinin HLA protein dizileri, en az bir uyumsuz kalıntı bir 15-amino asit sırayla taşıyan her peptid şeklinde yapılmaktadır. Bizim pilot deney öncesi ve sonrası organ nakli sera bu diziler üzerinde için antijen desenler karşılaştırmak için ayrıca bağışıklık epitopları yer kesin olarak belirlemek izin verdi çözünürlük ile anti-HLA sinyalleri tespit edebildik. Bunlar kişiselleştirilmiş antijen diziler izin donör özgü HLA epitopları yüksek çözünürlüklü tespiti organ nakli.
Introduction
Rutin olarak dünya çapında yapılan organ replasman tedavisi milyonlarca insanın hayatını kurtardı. Daha büyük bir sayı hala iken waitlists donör organ tedarik (Organ tarafından sağlanan bilgilere göre ciddi sıkıntısı nedeniyle almak için solid organ nakli hastalarda yaklaşık 100 ABD milyon kişi başına yılda oluşur Satın alma ve nakli ağ - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organ nakli organ atıkları azaltmak ve hayatlarını kurtarmak için son derece düzenlenir, ancak bu yönetmelik bilgilendirmek için kullanılan bilimsel araçları etkinliği sınırlı. Örneğin, bilimsel topluluk tamamen HLA moleküllerin son derece Polimorfik Birleşik tanır ve doğru genetik testleri yüksek çözünürlüklü yazarak ve serisi tabanlı (SBT) yazarak kullanarak DNA'ın son yıllarda1', geliştirilen 2. ancak, alloantibody test yöntemleri henüz bireysel HLA dizileri çok çeşitli antijen probları olarak üretmek mümkün olmamıştır. Standart test günümüzde değişmez bir panel kullanır bu HLA ortak türevleri oluşmaktadır ~ 100 allelic antijenleri ile A, B, C, DQ, DP ve DR dizileri insan nüfusu3,4,5,6'. Sık sık, gerçek vericinin HLA dizileri nakli doktorlar ve cerrahlar donör 's gerçek dizileri ve karşılık gelen "standartları" arasında paylaşılan benzerlikler dayalı donör özgü reaktivite anlaması için zorlama test panelinde dahil değildir test7,8ayarlayın. Sonuç olarak, antikor testi sonuçları9,10,11,12tarihinde dayalı ret riski güvenilir bir tahmin yapmak için bazen zordur. Bu nedenle, yeni kişisel olarak özelleştirilebilir alloantibodies için acilen gerekli13,14testlerdir.
HLA genleri bağışıklık yanıtı6' önemli bir işleve sahip MHC kompleksi (MHC) reseptörleri kodlamak. HLA genleri insan genomu6en Polimorfik genler olduğu bilinmektedir. DNA hızlı gelişmeler nedeniyle HLA genleri, yeni allelic türevleri için stratejiler sıralama (ya da sade bir şekilde gen anılacaktır) bir patlayıcı oranı15' de16keşfetti edilmektedir. Şubat 2017 ile 16,755 doğrulanmış gen IMGT/HLA veritabanı (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), hangi 12,351 sınıf yerinde yatırılan ve 4,404 sınıf II gruplar vardı. Tezat, sadece biraz 100'den fazla farklı gen alloantibodies organ nakli algılamak için rutin olarak kullanılan standart tek-antijen boncuk (SAB) tahlil temsil edilir. SAB yöntemi kullanarak Akış Sitometresi Luminex platformu üzerinde inşa edilmiştir. Tahlil antijenleri, üretim, küçük toplu iş toplu için variabilities dışında değişmez bir dizi kullanır beri anti-serum test bireyler ve laboratuvarlar5arasında sağlam standart. Ancak, bu test özellikle donör dizileri eksik olduğunda donör allelleri özellikle karşı geliştirilen tüm alloantibodies yakalamak değiştiremiyor SAB ayarla. Bağış antijenleri gerçek dizileri dayalı özel üretim olmasına rağmen arzu edilen test prosedürleri ve gerekli üretim düzene teknik zorluklar kalır.
Biz son zamanlarda bir fizibilite çalışması ve böbrek nakli konular17alternatif bir metodoloji nitelendirdi. Yöntem peptid antijenleri öncesi problama için bir dizi biçiminde kullanılan ve sera bireysel konularda sonrası nakli. Her dizi peptid antijenleri, her 15 üreten SPOT sentez yöntemi18,19,20,21,22,23 kullanılarak oluşturulan özel amino asit uzunluğunda, tamamen temel üzerinde ilgili organ bağışçı HLA gen a, B, C, DQA1, DQB1 ve DRB1. SPOT sentez standart Fmoc-kimya22 kullanarak bir selüloz membran üzerinde işletilen ve bir tam otomatik robot sistemi19,21ile paralel olarak özel peptidler yüzlerce üretebilir. Membran dizi sıyırma ve devir reprobing birden fazla mermi dayanabilir. Bizim retrospektif çalışma17' de bir saat serisi (Yani, önce ve sonra nakli) aracılığıyla toplanan saklı nakli antisera ile antijen şekillerindeki değişiklikleri algılandı. Burada tarif biz dizi tasarımı, dahil olmak üzere iş akışı için teknik iletişim kuralı imalat, Anti-serum sondalama ve sonuç analizi. Yöntem alloantibodies nakli bağış HLA moleküller üzerinde belirli doğrusal epitopları karşı algılamak için içindir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Northwestern Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (IRB iletişim kuralı #: STU00104680). Genel bir iş akışı iletişim kuralının şekil 1 ' de gösterildiği.
1. donör ve alıcı HLA dizileri Bioinformatic analizi
- dizileri IMGT/HLA veritabanından almak 15.
- Organ donörü ve seçtiğin bu kullanıcı alıcı elde HLA yazarak raporları.
Not: gizli tıbbi kayıtları korumak için uygun yordamlar kullanılan olun. Genellikle, bir kurumsal inceleme Kurulu (IRB) onay çalışma Protokolü veya deneysel test kurumsal IRB kuralları gereklidir. HLA raporları PCR tabanlı (yüksek veya düşük çözünürlük) yazarak ya da sıralama tabanlı (SBT) yazarak olsaydı, doğrudan adım 1.1.3 gidin. Genomik/HLA sıralama sıraları aldıysanız ve tam olmaları durumunda, bu dizilere doğrudan yerine kullanın. Sadece eksik yazarak veya sonuçları sıralama kullanılabilir olduğunda, zaman zaman, ek adım 1.1.2 izleyin. atamak için " eksik " allelleri 1.1.2. adımda açıklandığı web aracı ile. - Belirsiz gen kombinasyonları aşağıdaki web bağlantı - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html ve kullanarak arama açık “ belirsiz gen kombinasyonları arama aracı ” varsayımsal allelleri almak için işlev. Sonra 1.1.3 adım geçin. Gen adı girmek için.
- Aç IMGT/HLA gen sorgu formunu aşağıdaki web bağlantı - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html ve giriş konu ’ s alleli adları (her ayrı ayrı, Şekil 2 ' de gösterildiği gibi) içine “ arama için ” kutusu. Tıkırtı üstünde “ allelleri şimdi için arama ” düğmesi. HLA gen adları standart adlandırma sistemleri kullanmanız gerekir (örneğin, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 ve A * 01010101 gibi herhangi bir önceki belirtme).
- Ekranda eşleşen alleli adını bul. Alleli düğmesini tıklayın.
- Kopya " Protein sıra " ve bir üstbilgi satırı altında bir metin belgesine yapıştırın " > gen adı ". Etkili, gen adı ve sıra FASTA (FAST-All) biçiminde metin belgesidir.
- Organ donörü ve seçtiğin bu kullanıcı alıcı elde HLA yazarak raporları.
- Gen tabanlı çoklu gerçekleştirmek donör ve alıcı/hasta gen hizalamaları.
- Bir gen (Yani, DQB1 * 03:01:01:01), kopyalamak ve tüm dört allelleri donör ve hasta FASTA dizileri (iki donörden) ve iki hastadan bir Birleşik metin belgesine yapıştırın. Bu noktada, Bu differentially donör alleli adları hasta alleli adlarından belirtmek önemlidir (seçenekleri farklı üst alt durumlarda; vs dahildir veya ayrı olarak donör vs işaretlemek için her alleli adı için ayırt edici bir önek veya sonek uzantısı oluşturun. hasta gen). Giriş sırası sıralarının çünkü sipariş karıştırılan dizileri herhangi bir çiftin arasında benzerlik düzeylerine göre hizalama takip önemli değildir.
- Kopyala ve Yapıştır FASTA serilerinde biçimlendirmek (olarak görülen şekil 3) Yukarıdaki içine “ girin giriş dizilerinden ” kutusunu küme Omega Web sitesinde: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
- Tıklayın " işini göndermek " parametreleri kullanarak standart: gibi " PROTEINŔ ve " Clustal w / numaraları ". Hizalama yanında tıkırtı üstünde gerçekleştirmek " gönderme ". Dört sıralarının bir hizalama ( şekil 4) ekranda görüntülenir.
- Mark donör özgü uyuşmazlıkları.
Not: Bu özel olarak burada verilen allelic dizileri değil sıralama HLA yazarak, sonuçlarına dayalı belirtmek gerekir. Bu nedenle, ilgili sıra varyasyon belirli verici-alıcı çift kaçırmış bir risk yoktur. Bu olası sorunu olarak daha hafifletilmiş ve daha fazla organ nakli merkezleri doğru yüksek çözünürlüklü yazarak evlat edinmek ve DNA sıralama doğrudan.- Kopya ve hizalama metin bir metin belgesi içine yapıştırın ve yeni bir belge oluşturun. Hizalanmış dosyasının biçimi bozulmuştur, Biçim yazı tipi stilini ve boyutunu değiştirerek düzeltmek: her zaman kullanmak " Courier New " satırları sığdırmak için yazı tipi küçük tip boyutunda. Biçimlendirmeyle ilgili sorunlar çözüldü sonra belgeyi kaydedin.
- El ile benzersiz olarak donör ait tüm uyumsuz artıkları tanımlamak için hizalanmış dizileri inceleyin. Her bu donör özgü kalıntılarının ayırt edici bir yazı tipi rengi kullanarak işaretle.
- Tüm donör harflerle altını ' s dizileri 14 artıkları her iki up - genişletmek ve 15 amino asit peptid eksi uyuşmazlıkla 1 kalıntısı olarak aşağı işaretli donör özgü uyuşmazlıkları (Hesaplanan).
- 15-mer peptid dizileri örtüşen dizi türetmek.
Not: 15-mer peptidler seçtiğiniz için nedeni tipik epitopları 4-9 amino asit uzunluğunda olmak genel bilgisine dayanıyordu. Bu nedenle, ne zaman biz uygulanan bir " hareketli pencere " bir adım boyu 4 amino asitlerin ( şekil 1), bizim seçim bir 15 amino asit uzunluğunda yordamla yaptı 15-4 herhangi bir komşu peptidler bir dizi arasında 11 amino asit çakışma =. Böylece hiçbir epitope yanlışlıkla olacak teorik olarak, bu 11 amino asit örtüşme 9 amino asit uzunluğunda, Bütün bağışıklık epitopları karşılamak için yeterli olur " bölünmüş " dizinin yalnızca kısmi dizileri ile ikiye.- Ardışık olarak türetmek için şablonlar arasında herhangi bir iki hemen bitişik sıraları serisi 4 artıkları tarafından üst üste 15 amino asit dizileri bir dizi kısa altı çizili dizileri kullanın.
- Kopyala ve Yapıştır donör allelleri karşılık gelen adlarını içerir gösterimi sütuna göre 15 bu amino asit dizileri ( şekil 5) sütun biçiminde bir elektronik tabloya eşlik etti. AA kalıntısı pozisyonları dahil etmek için ek bir sütun yararlı olabilir.
- Tekrarlamak belgili tanımlık merdiven--dan 1.1.3. için 1.3. için donör ve alıcı çift bağış 15 aa kısa dizileri türetmek için her HLA gen (Örneğin, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 ve DP).
- Kopya ve donör tüm gen 15 aa dizileri uzun sürekli bir sütun oluşturmak için ana bir elektronik tablo tüm sütunları yapıştırın. Toplam belgedeki (peptid serileri için) satır sayısını yazın.
2. Özel dizi düzen ve üretim tasarımı
- Generate karşılık gelen alleli ile peptid sıralarının elektronik callings. Dizinin 20 satır ve 30 sütunlar vardır ve ilâ 20 x 30 = 600 tutabilir peptidler için noktalar. Peptidler kaydedilen toplam sayısına bağlı olarak belirli bir donörün 1,5 adım ve Liu ve ark denemişti iki örnek ile bizim geçmiş deneyime dayalı. 17, 600 nokta dizi ~ 2 ayrı nakli durumlarda oluşturulan tüm dizileri tutabilir.
- Rasyonel en e planıpeptidler 600 nokta biçiminde dizinin kümesi sığacak şekilde fficient yol.
- Birden fazla konu bir bütün dizi içine sığabilecek Eğer ilk donör sonra boş satır Ekle ' toplam 30 (üst üste dizi üzerinde noktaların sayısını) bölünmüş satır sayısını eşleşmesi için s sıralarını.
- Hemen son boş satırı dizileri ilk kümesi için sütunun tamamını ikinci nakli durumda sıra içindekiler yapıştırın.
- Dizi dolu ve hiçbir daha fazla vaka-ebilmek var olmak mülhak 600 noktalar aşmadan kadar bu adımları yineleyin. Tüm boş satırları alt kısmında doldurmak için bırakılırsa " hareket " iki donör kümeleri arasında konumlandırılmış olması için boş satır. Bu geniş alan durumlar arasında kalmadı 3.2 adım kesim daha kolay - takip sentez tamamlanmasından sonra membran yapar. altında.
- Peptid dizileri dizi düzeni bağlamında program. SPOT synthesizer programı doğrudan adım basit bir metin belgesi olarak 2.1.4 (olmadan alleli adları, aa için ilave sütunları elde edilen elektronik tablo kaydederek elde edilebilir (bir satır bir peptit dizisi), dizileri bir metin biçiminde olur basamak vb).
- Çalıştır otomatik peptid dizi sentez yolu ile SPOT synthesizer. Operasyonun sentezi Kudithipudi vd. 21 ' detaylı. İki dizi Fmoc sentezi ~ 4-5 öncelikli olduğuna dikkat edin gün.
3. Sonda ve Reprobe Antisera bir zaman serisi bir bireyin nakli alıcı.
Not: 600-spot membran dizi boyutları ~ 7 cm x 13 cm vardır. Sonra sentez, diziler oda sıcaklığında kuru membranlar en az iki yıl doğrudan ışık korumalı zaman saklanır. Onun uzun ömürlü tekrar tekrar kullanımı için korumak için membran aşırı katlama kaçının.
- Etanol membran diziyle rehydrate ve peptid noktalar Ponceau s ile lekeli görselleştirmek
Li ve ark. içinde en iyi duruma getirilmiş bir kademeli prosedürü izleyerek peptidler taşıyan
- rehydrate membran dizi 24.
- 20 ml % 100 etanol dizi membran bırakın.
- Ekle 20 mL distile su % 50 etanol için çözüm sulandırmak ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya için
- Daldırma çözüm için 40 mL % 100 su üç kez değiştirmek ve her zaman 15dk kuluçkaya.
- Yıkama arabellekte uygun çalışma, Örneğin, TBST (Tris arabelleğe alınmış serum % 0,1), 20 mL 5 min için üç kez.
- Sentetik peptidler görselleştirmek için dizi Ponceau S boyama
- 20 mL önceden formüle Ponceau S çözeltisi doğrudan sulu dizisine ekleyin ve ~ 30 için kuluçkaya sallayarak ile s.
- Çalıştır distile su sürekli olarak arka plan Ponceau S renk de-leke membran üzerinde. İşlemi sırasında peptid spot renkleri kırmızı renk görünür hale olabilir.
- Dizi bölümlerini her donör için dikkatli bir şekilde tek tek servis taleplerini için dizi bölümleri arasına keserek ayırın. Her dizi yönünü işaretle.
- rehydrate membran dizi 24.
- Ön blok dizi.
- Blok membran % 5'lik 20 ml yağsız süt TBST arabellekte dağıldı. Bu süt bazlı çözüm daha de-Ponceau S renk leke. Süt arabellek en net peptid görüntüleri elde etmek için birkaç kez değiştirmek.
- Kayıt tutma amaçları için el kamera ( şekil 6 örnekte) kullanarak dizi Ponceau S görüntüsünü fotoğrafını çekin.
- Membran % 5 yağsız süt gecede 4 ° C'de veya sallanan ile 2 h için oda sıcaklığında engelleme devam.
- Incubate dizi ile nakli anti-serum.
Not: Olması gerektiği prozone olarak bilinen bir fenomen belirtti veya tamamlayıcı bağımlı girişim serum antikor analizde kanca etkisi neden olabilir. Bu sorunu aşmak için bir isteğe bağlı serum tedavi öncesi adım serum numuneleri EDTA veya ısı inactivation ile kabul edilebilir.- Engelleme arabellek kaldırmak ve membran TBST 20 mL ile üç kez ertesi gün 5 min için her zaman yıkayın.
- Ekle 20 µL % 2.5 20 mL alıcıya ham serum TBST arabellekte süt ve oda sıcaklığında 2-3 h için membran ile kuluçkaya. Sondalama, bu ilk turda, zaman serisi son sonrası organ nakli serum (veya büyük olasılıkla en duyarlilasmis serum) öncelikle kullanılır önerildiğini unutmayın. Bu öncesi nakli zaman noktalarından özellikle serinin önceki örnekler zaman içinde geliştirmek eğilimi alloantibodies daha az çeşitli olması varsayımına dayanmaktadır. Bu şekilde, sinyal müdahalelerden ihtimali " etkilenmişimdir " mermi sondalama arasında gerçekten gelişmiş alloantibody reaktivite greft karşı bağışıklık yanıtı nedeniyle gelen açıkça ayırt edici olabilir.
- TBST 20 mL kullanarak dizi yıkama ve ikincil antikor ile kuluçkaya.
- Her zaman membran 10 min için üç kez yıkayın.
- Keçi Anti-insan IgG-HRP (Horseradish peroksidaz) ikincil antikor 1:10,000 seyreltme için başka bir 2 h. % 1 süt ile takıma TBST arabelleği at ile Incubate
- Yıkama ve leke geliştirmek.
- Her zaman membran TBST 10 dakika ile üç kez yıkayın.
- 5 mL membran (için 1 dk) geliştirmek için peroksit çözeltisi ile karışık taze 5 mL luminol çözeltisi kullanarak gelişmiş Perform Kemiluminesan (ECL).
- Görselleştirmek ECL sinyalleri kullanarak uygun bir Imager (Yani, ChemiDoc sistemleri görüntüleme veya Azure C600).
- İnceden inceye gözden geçirmek ve leke ölçmek.
- ( Şekil 7, düşük bir resim) gelişmiş görüntüleri kaydetmek ve miktar nokta yoğunluğunu gerçekleştirmek.
4. Anti-serum reaktivite klinik zaman serisi karşılaştırın.
- Dizi şerit.
- Bu noktada, her zaman ıslak membran devam.
- Membran ile ticari sıyırma arabelleği için 20 dk 37 ° C'de 20 mL kuluçka tarafından şerit ve membran TBST ile üç kez için 10 dk sonra yıkayın. Engelleme (Adım 4.2) ve farklı zaman noktada alınan hastanın farklı bir serum kullanan problama (Adım 4.3) adımları yineleyin.
- Blok membran çıkardı.
Not: takip striptiz, membran zaman serisi aynı hastada üzerinden farklı bir serum sondalama başka bir tur için yeniden kullanılabilir.- % 5 süt tampon daha önce olduğu gibi kullanarak membran engellemek (bkz. Adım 3.2).
- Aynı zaman serisi (3,3 3,6 gelen adımları yineleyin; örnek Şekil 7, üst görüntü) farklı bir anti-serum reprobe.
Not: Sökülen dizi sonra başka bir serum numune reprobe için kullanılabilir. Peptidler membran destekleyici Matrixe kovalent Birleşik beri dizi sıyırma ve onun perfo kaybetmeden devir reprobing 20 mermi için yeniden kullanılabilir gösterdirmance. - Dizilerin uzun süreli depolama.
- Mağaza TBS arabelleği membran ile %0,02 w/w sodyum azid koruyucu olarak takıma. Mühürlü bir plastik torba uzun süreli depolama için kullanın. Korunmak için doğrudan güneş ışığı altında 4 ° C'de ıslak membran en az 2 yıl süreyle saklanabilir.
5. Veri toplama ve analizi
- el ile pozitif antijen peptidler açıklama.
- Olumlu antikor sinyalleri gösteren noktalar bulun ve her bir kılavuz konumlarını belirlemek.
- Olumlu peptidler için ana çalışma sayfasında karşılık gelen satırı vurgular.
- Almak ana çalışma sayfasında ( Şekil 7, alt liste) listelenen peptid dizileri. 1.4.1. adımda açıklanan tasarım ilkelerine uygun., komşu seri noktalar paylaşmak önemli ölçüde örtüşen dizileri (15-4 = 11), bu nedenle reaktif epitopları peptidler tarafından ardışık sıralı paylaşılabilir.
- Art arda meydana gelen herhangi bir olumlu noktaları vurgulama.
- Bir dizi her peptid en az epitope uzunluğunu belirleyin.
- Herhangi bir potansiyel olarak paylaşılan epitope dizileri dayalı reaktif peptidler parçalarını üst üste üzerinde vurgu.
- Yapısal model antijen epitopları.
- Prototip HLA kristal yapıları üzerinden Protein veri aşağıdaki bulunan bankanın elde web link: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
- Pymol (download www.pymol.org--) prototip HLA yapısını görüntülemek.
- Harita " veya modeli reaktif peptid dizileri ( şekil 8) vurgulayarak Anti-donör epitopları prototip HLA moleküllerin 3D yapılar için keşfetti. Tıkırtı üstünde " ekran ", sonra " arka plan " ve seçin " beyaz ". Görüntü kaydetmek için gidin " dosyasının " ve " görüntü farklı kaydet " ve dosya biçimini seçin " png ".
- Rapor sonuçları ve reaktif epitopları için karşılık gelen allelleri atama.
- Karşılaştırma dizi sonuçları tek-antijen boncuk (SAB) sonuçları için varsa.
Not: tek allelic antijenleri kullanarak SAB testi antikor reaktivitesi HLA proteinlerin sabit bir panele doğru ölçer. Bu da SAB panelinde dahil dizi ve SAB sonuçları arasında doğrudan karşılaştırma izin belirli HLA gen antikor reaktivitesi göstermek bireysel peptidler ait. Bizim önceki çalışma 17 yüksek korelasyon arasında peptid epitopları SAB. genel reaktivite için önemli ölçüde katkıda bulunmak düşündüren sonuçlar gösterdi Ayrıca, dizi sonuçları da amino asit-özgüllük düzeylerini ortaya.- Elde edilir SAB olup olmadığı hakkında bilgi sağlayan ve hangi donör allelleri sonrası sera hasta nakli için reaktif bir HLA laboratuardan sonuçları. Adım 5.5 sonuçlarından. dizi üzerinde dayalı analiz de karşılık gelen donör gen alloantibody reaktivite için pozitif hakkında bilgi sağlar.
- SAB karşılaştırın ve dizi sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntem17eleme dizi kullanarak orijinal çalışmada, biz 5 böbrek nakli konu Toplam kayıtlı. Biz sonuçları bizim kohort ve onların anılan sıraya göre bağış yazarak HLA elde. Onların tıbbi geçmiş ve allelic antikor titreleri SAB testlerden da bize mevcut idi. 5 Bu hastalar bizim pilot çalışmada, biz iki farklı yöntemleri geliştirmiştir: peptidler ve özel kişiselleştirilmiş dizilerin sabit bir panel oluşan standart bir dizi her donör ve alıcı çifti için yapılmış. İlk yöntem teknik olarak bireysel nakli özgüllüğü yüksek düzeyde elde dizi platform performansını doğrulamak bize izin vermişti iken, bu makale ve video amaçlanan bu ikinci yöntem için kişiselleştirilmiş Protokolü anlatılan için kapsamlı tarama donör özgü antikor (DSA) hangi kez zavallı greft sonuçları5,25,26ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.
Kişiselleştirilmiş diziler iki beş durumlarda17uygulandı ve genel iş akışı yöntemi gösteren için burada bu iki hasta (yani PTN #4) birini ele. Özel peptid dizi yapmak için anahtar teknoloji SPOT synthesizer içerir. Doğrudan üzerine bir membran (şekil 1) özel olarak türetilmiş bir hücresel matrix Fmoc sentez kullanarak peptidler yapar tam otomatik bir robot sistemidir. Biz bireysel organ bağış HLA dizileri türetilmiş peptidler büyük kümesi birleştirmek için synthesizer esnekliğini kullandı. 15-4 için bir "yürüyüş" tasarım seri peptidler izledik sürekli epitope "ayrılmıştır" ve antikor reaktivitesi kaybederse bir durumu önlemek için yeterli kapsama sağlamak için herhangi bir hemen bitişik peptidler arasında örtüşme 11 artıkları Yani = 4-9 aa uzunluğu (şekil 1) olmak serisi her zaman antikor epitopları tipik uzunluğu karşılamak için yeterli olduğunu tahmin.
Şablon HLA dizileri doğrudan EMBL-EBI (Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü) muhafaza deposu veritabanı indirilebilir. Örnek olarak, PTN 4 bağış'ın HLA-DQB1 * 03:01:01:01 gen ( Şekil 2resimde Web sayfası) için arama. Birlikte, ayrı ayrı vericinin ikinci HLA-DQB1 alleli ile dizileri indirilen * 02: 01:01 yanı sıra o PTN #4 kendini HLA-DQB1 * 04:02 ve * 05:01. Çoklu dizi hizalaması sonra Clustal Omega'nın web işlevleri (şekil 3) kullanılarak gerçekleştirildi. Hangi üzerinden tüm uyumsuz amino asit kalıntıları tespit edilmiştir (şekil 4), elde edilen hizalama dosya elde edildi (donör artıkları vurgulanır). Ardından, şablon dizileri (onun eşleşmeyen artıkları karşılamak için yeterince uzun donör altı çizili) olarak işaretlenmiş. Bu şablon dizilere ve ardından "yürüyüş" tasarım peptidler üç dizi yukarıda açıklandığı gibi dayalı her 15 aa uzunluğu HLA-DQB1 için elde. Bu işlem vericinin allelleri HLA-A, B, C, DQA1 ve DRB1 dinlenmek için tekrar edilmiş (DRA1 ve DP hariç olarak kullanım dışı kalması uygun klinik kaydı nedeniyle) onun alıcı ilgili gen ile karşılaştırıldığında. Sonunda, Toplam 202 peptidler PTN 4 lerden sonrası organ nakli serum problama için özel dizi (peptid şekil 5 içinde çalışma ve şekil 6bir dizi çizimde serilerinde) yapmak için kayıtlı ve sonuçları ile karşılaştırıldığında Bu onun öncesi nakli serum (Şekil 7) sonraki reprobing üzerinden elde edilen. 202 peptidler dışında 10 gösterdi antikor sinyalleri toplam sonrası organ nakli numune (alıcıdan gelen eşleşmeyen) hangi donör özgü kalıntılarının E87, I306, W243 ve HLA-B K197 ilişkili * -B, 52:01 * 52:01, - C * 0304: ve - DQA1 * 05:01 gibi görünüyordu antikor reaktivitesi ( Şekil 7kırmızı harflerle gösterilir artıkları) teşvik dahil.
Ayrıca, bir dizi yöntemi ile karşılaştırıldığında geleneksel SAB test anahtar avantajları epitope bilgileri kolayca alınabilir, Şekil 7' de gösterildiği gibidir. Biz (gelen Liu ve ark. ayrı dizi sonuçlarında tüm beş hastalarda HLA-DQA1 ve - DQB1 epitopları Antikor Reaktif göre 17) onlara tüm DQA1 ve DQB1 heterodimerdir (şekil 8) Co kristal yapısı için modellenmiş olmasından. Cesaret, β1 strand bilinen yapı önemli bir bölümünün "alloantibodies nakli konular arasında tarafından hedef için şansı çok yüksektir (3/5 içinde hasta 2,3,5) 5 olgu kohort vardı bir hotspot" var.
Resim 1 . Anti-donör HLA alloantibodies organ alan kimse içinde algılamak için antijen HLA tabanlı dizi yönteminin genel düzeni. (Adapte ve değiştirilmiş gelen Liu vd. 17) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Veri deposu Web sitesi
HLA serilerini almak için aşağıdaki Web sitesini ziyaret edin: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Birden fazla protein donör Clustal Omega web tabanlı bir araç kullanarak alıcı HLA-DQB1 allelleri vs hizalamasını diziler.
Hasta # 4(PTN#4)'ın DQB1 dizisini kopyalayıp * 0201 ve 03:01 ve donör DQB1 * 04:02 ve 05:01 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ içine FASTA biçiminde (illüstrasyon, DQB1 için * 0501: PTN #4 ve DQB1 * 0301: bağış giriş kutusuna gösterilir) . "Numaraları w / Clustal" seçeneği "Adım 2" olarak çıktı biçimini seçin ve Çalıştır hizalama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Karşılaştırmadonör hasta/alıcı HLA DQB1 ve peptid sentez için şablon dizilerinin seçimi vs.
Vericinin dizileri vardır kalın, donör özgü uyuşmazlıkları kırmızı yazı ile ve aynı zamanda kara kutuları ile vurgulanır. Şablon sıraları (peptidler türetmek için altı çizili) bu donör özgü kalıntıları içerir. (Bu rakam uyarlanmış ve Liuet aldeğiştirildi. 17) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Ana çalışma sayfasında elektronik tablo donör HLA peptidler açıklayıcı bir örnektir.
Dizi peptid nokta satır ve sütun koordinatlarını tarafından belirtilmiş. Peptid dizileri sentez robot SPOT synthesizer kullanarak programlamak için kullanılır. Donör özgü artıkları (alıcının ilgili gen eşleşmeyen) kalın olarak vurgulanmış ve altı çizili. Tam uzunlukta HLA-DQB1 dizileri için karşılık gelen peptid başlangıç ve bitiş konumlarını da belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Görüntü bir dizi bölümünün lekeli Ponceau S ile
Tüm spot alanlar arasında peptid konsantrasyonları aynı olmakla birlikte renk yoğunluğu amino asit kompozisyonu peptidler arasında farklılığı nedeniyle eşitsizlik unutmayın. (Görüntü bir açıklayıcı, gerçek bu çalışmada elde değil bir örnektir.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 . Donör özgü HLA-A, B, C, DQ, DR dizi çalışma PTN # 4 eşleşmeyen epitopları.
Seri peptidler vericinin dizileri uyumsuz artıkları ( Şekil4 DQB1 örneği) kapsayacak şekilde elde edilmiştir. Dizi sonrası organ nakli serum soruşturma için kullanılan (alt leke: post-TX) ve daha sonra öncesi nakli serum (üst leke: pre-TX) aynı hastadan. Sonrası organ nakli sondalama dan güçlü noktalar dört setleri (içinde alt leke) kırmızı çizgilerle işaretlenir, yalnızca ilişkili iki Orta yoğunluk noktalar önceden nakli sırasında serum (içinde üst leke) mavi çizgilerle işaretlenir. Alt tabloda karşılık gelen peptid dizileri ve onların reaktivite sonrası organ nakli serum için. Donör özgü (eşleşmeyen) artıkları E87, I306, W243 ve onların anılan sıraya göre gen K197 kırmızı harflerle ve güçlü antikor reaktivitesi gösterilen peptidler kalın yazı tipleri vardır. Bu rakam uyarlanmış ve Liu ve ark. güncelleme 17. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 . HLA DQ epitopları yapısal yerlerini.
HLA-DQ8 ortak kristal yapısı şablon olarak kullanıldı. Yapısı, bir DQA1 ve bir DQB1 alt birimleri ile birlikte bir antijen peptid (A)oluşan. Protein ikincil yapılar α-sarmal ve β-ayrılmaktadır (B)panelinde gösterilir. Beş serum ikisiyle tepki DQA1 ve DQB1 peptidler co kristal yapısı üzerinde bulunan ( a ve b: mavi gölgeli). Üç β-lifler, β1, β6 ve β12 (koyu mavi) bher birden çok peptidler (kısa kırmızı çizgiler) DQA1 doğrusal aa konumlarına karşılık gelen, temsil tepki ile birden çok hasta örnekleri (orijinal sonuçlarında Liu vd. 17). tüm altı DQB1 peptidler (içinde kalın yazı tipi) için hastaların #2, #3, #5 Antikor Reaktif β1 "hotspot" kesimine bulunur ( b: tarafından kırmızı ok işaret). Bu rakam Liu ve ark. adapte oldu 17. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan SPOT dizi alloantibody özgüllük organlarımı'nın HLA antijenleri karşı Ekiminde deneysel incelenmesi için tasarımıdır. Geniş klinikte kullanılan varolan SAB tahlil aksine antijen array yöntemi gerçek HLA dizileri bireysel bağış ağırlayacak esnek tasarımı önemli bir avantajı vardır. Yakında doğru HLA allelic sıralı okumalar belirsizlik16,27 olmadan üretmek mümkün olacak hızla ilerleyen DNA sıralama teknolojisi potansiyelleri ve belirlenen veritabanları potansiyelini yeni platform patlatır depo için HLA15 genel popülasyonda diziler. Bizim şu anki dizi-tarama Protokolü dayalı birkaç pilot çalışmalar nakli sera başarısı olarak geliştirilmiştir. Burada bu aşamada klinik pratikte tanılama uygulamalarda araştırma kullanım için sadece bizim prototip diziler inşa edilir vurgulamak gerekir.
İkinci alloantigenicity18 hakkında değerli bilgiler sağlayabilir HLA dizilerinin 15 aa parçaları içindeki potansiyel antijen epitopları ayırt etmek için daha yüksek bir çözünürlüğe sahip SAB bizim antijen dizisi arasındaki başka bir önemli fark vardır . Ancak, tüm protein antijenleri katlanmış yapılarını adapte sunar SAB antijen dizi sadece kısa peptidler, hangi konformasyon katlama hakkında bilgi dışlayan içermektedir. Bu nedenle, diziler sadece konformasyon epitopları tanımak antikorlar algılayamaz hangi bazı fonksiyonel epitopları için antikor aracılı ret28,29ilgili tüm çoğunluğu teşkil inanıyorum. Yine de, diğer bağlamlarda içinde bu kısa peptidler gibi doğrusal epitopları karşı antikor eylemler viral antijen yanıtlarında istismar değildir ve aşı içinde30,31tasarlayın. Biz de hasta örnekleri test sınırlı sayıda, algılama hassasiyeti performans bizim dizi bu SAB aşıldı ve donör özgü antikorların tespiti er17 klinik ilerleme sırasında izin, dikkat etmelisiniz antikor aracılıklı reddi. Yerel antijen peptidler yüksek molar konsantrasyonu ile karşılaştırıldığında SAB. dizisinde nedeniyle bu Ne zaman biz daha önce17gösterdiğim gibi klinik ve patolojik kanıtları reddedilmeyi antikor aracılıklı belirgin iken hiçbir reaktivite SAB tespit bu özelliği durumlarda özellikle yararlıdır. Ancak, bu kişiselleştirilmiş test standart SAB test fazla zaman alır işaret etmek önemlidir. Dizi testi antijen peptidler tasarımına başlamadan önce donör ve (önerilen) alıcının HLA diziler organ alma gerektirir. Daha sonra dizi ve antikor sonuçları elde etmek için başka bir 7-8 saat üretmek için birkaç gün alır. Donör özgü antikor ekimi takiben ortaya çıkması belirlenmesi için yerine öncesi nakli değerlendirme için antikor testi temel amacı olmadığı sürece bu nedenle, uzun yordamı ölen donör nakil için uygun değildir Varolan antikor.
Array yöntemi içinde antijen epitopları hafiye varolan SAB test büyük bir iyileşme vardı. Ayrıca, biz beş nakli hastalarda reaktif epitopları HLA-DQ hangi biz üç beş hasta17dışında meydana gelen onun β1 strand içinde en az bir önemli "hotspot" epitope kaydetti, şablon yapısını eşlemek için bir girişimde. Çoğu intriguingly konularda, HLA-DQA1 ve - DQB1 β1 ipliklerini sunum antijen içbükey (şekil 8), organ nakli ret32bağlamında antijenik olduğu bilinen bir konuma groove bulunur. Bu nedenle, biz bizim kişiselleştirilmiş antijen dizi yönteminde genişletilmiş nakli kohort çalışmalar gelecek keşif HLA molekülleri antijenik etkin noktalar üzerinde değerli bilgiler verecektir tahmin. Son derece hassas DNA sıralama HLA genleri arasındaki potansiyel bağış ve alıcıların, yazma ile birlikte düşünüldüğünde bu tanımlanan noktaları kataloğu sonuçta öncesi nakli kararları kabul edilebilir uyuşmazlığı programları aracılığıyla size yardımcı olacaktır 33, daha etkili bir şekilde katalogda hotspots bölgede belirli uyuşmazlıkları önlemek üzere tasarlanmıştır.
Özetle, türünün ilk özel anti-HLA alloantibodies algılanması için bir antijen dizinin Kişiselleştirilmiş tasarım Exploring orijinal bizim çalışma17 yaşındaydım. Çalışmanın odak dizi tasarımı ve uygulaması, potansiyel geleceğin teknolojisi için bir prototip olarak fizibilite oldu. Bizim pilot çalışma sonuçları klinik örneklerinden teşvik oluşturulan kalmayıp Ayrıca hız testi ve genel maliyetini tahmin etmek izin verdi. Kişiselleştirilmiş bir dizi geçerli bizim laboratuvar ortamında üretim maliyetinin altında $1000 dizi daha sonra zaman döngüleri performans kaybı olmadan reprobing 20 tur içinde kullanılabilir olan tek seferlik bir maliyettir YTL, var. Bu ek dizi protokolünden nakli konularda daha geniş bir kohort ile sınama daha fazla bir gün klinik uygulamada kullanılabilir yöntem düzene ki mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çakışma çıkarlarının ilan etti.
Acknowledgments
Drs. Shawn Li teşekkür ediyoruz ve XING Li nokta ile onların tür yardım için Kanada'da Western Üniversitesi dizi üretim. Örnek hizmetleri sağlamak için kapsamlı nakli Merkezi, Northwestern Üniversitesi ve MHC çekirdek personeli için minnettarız. Bu eser kısmen yardımcı kurulu kuzeybatı Memorial Hastanesi tarafından ve J.J. için Northwestern Üniversitesi tarafından sağlanan bir fakülte başlangıç Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
References
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
