Summary
Fehlanpassungen in human Leukocyte Antigen (HLA) Sequenzen zwischen Organspender und Empfänger-Paare sind die Hauptursache der Antikörper-vermittelten Ablehnung im Organ-Transplantation. Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von benutzerdefinierten Antigen-Arrays, die auf einzelnen Spendern HLA Sequenzen, Anti-Spender HLA Alloantibodies in Organempfängern Sonde basieren.
Abstract
Im Organ-Transplantation verlassen die Funktion und Langlebigkeit des Transplantats kritisch auf den Erfolg des Controllings immunologische Ablehnung Reaktivität gegen humanen Leukozyten-Antigene (HLA). Histocompatibility Leitlinien basieren auf Labortests der Anti-HLA-Immunität, die entweder als bereits bestehende präsentiert oder de Novo generierte HLA-Antikörper, die eine große Transplantation Barriere darstellen. Aktuelle Tests basieren auf einer Single-Antigen Perlen (SAB) Plattform mit einem festen Satz von ~ 100 vorausgewählten rekombinante HLA-Antigene Transplantation Sera zu untersuchen. Beim Menschen gibt es jedoch eine weit größere Vielfalt an HLA-Typen, mit keine zwei Personen als eineiige Zwillinge, die die gleiche Kombination von HLA-Sequenzen teilen können. Während fortschrittliche Technologien zur HLA-Typisierung und direkte Sequenzierung genau Fehlanpassungen in DNA-Sequenz zwischen des Spenders erfassen können und des Empfängers HLA, SAB-Assay, wegen seiner begrenzten Vielfalt in Sequenz Darstellung nicht in der Lage ist, genau zu erkennen Alloantibodies speziell gegen die Spender-HLA-Fehlanpassungen. Wir wollten eine ergänzende Methode durch eine andere Technik zu erkennen und charakterisieren Anti-Spender-HLA-Antikörper auf einer persönlichen Basis zu entwickeln. Die Screening-Tool ist eine benutzerdefinierte Peptid-Array der Spender HLA-abgeleitete Sequenzen zum sondieren nach der Transplantation Sera von der Orgel-Empfänger zur Bewertung des Risikos für die Antikörper-vermittelten Ablehnung. Auf einem einzelnen Array für ein Geber-Nehmer-paar sind bis zu 600 einzigartige Peptide auf Basis des Spenders HLA Proteinsequenzen, jedes Peptid tragen mindestens eine nicht übereinstimmende Rückstand in einer 15-amino Acid Sequenz getroffen. In unseren Pilotversuchen Antigen Muster für vor und nach der Transplantation Sera auf diese Arrays vergleichen konnten wir Anti-HLA-Signale mit der Auflösung zu erkennen, die auch uns erlaubt, die immun Epitope beteiligten genau zu bestimmen. Diese personalisierte Antigen Arrays ermöglichen hochauflösende Detektion von Spender-spezifischen HLA Epitope in Organtransplantation.
Introduction
Orgel-Ersatz-Therapie, die routinemäßig in der ganzen Welt durchgeführt wird, hat Millionen von Menschenleben gerettet. Solide Organtransplantationen tritt in etwa 100 Patienten pro million Einwohner in den USA jährlich, während eine größere Anzahl noch auf Wartelisten Spenderorgane durch eine starke Verknappung des Angebots (nach Angaben der Orgel zu erhalten Beschaffung und Transplantation Netzwerk - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation ist stark reguliert, um Orgel Abfall zu reduzieren und Leben zu retten, aber die wissenschaftlichen Werkzeuge verwendet, um diese Vorschriften zu informieren sind in ihrer Wirksamkeit begrenzt. Zum Beispiel, die wissenschaftliche Gemeinschaft voll anerkennt die höchst polymorphen Zustände der HLA-Moleküle und genaue genetische Untersuchungen der DNA mit Hilfe von hochauflösenden Typisierung und Sequenz-basierte Typisierung (SBT) entstanden in den letzten Jahren1, 2., Alloantibody Testmethoden wurden noch nicht in der Lage, die enorme Vielfalt an individuellen HLA-Sequenzen als Antigen Sonden zu produzieren. Der Standardtest nutzt heutzutage eine unveränderliche Panel ~ 100 allelische Antigene, die gängige Varianten der HLA bestehen, A, B, C, DQ, DP und DR Sequenzen in menschlichen Populationen3,4,5,6. Häufig die tatsächliche Spender HLA Sequenzen gehören nicht in Testpanel zwingen Transplantation Ärzte und Chirurgen Spender-spezifische Reaktivität basierend auf gemeinsamen Ähnlichkeiten zwischen tatsächlichen Sequenzen und entsprechenden "Standards" des Spenders ableiten der Test set7,8. Infolgedessen ist es manchmal schwierig, eine zuverlässige Schätzung der Ablehnung Risiko basierend auf Antikörper Test Ergebnisse9,10,11,12zu machen. Daher sind neue persönlich anpassbare Tests für Alloantibodies dringend benötigte13,14.
Die HLA-Gene kodieren die großen Histocompatibility komplexesten (MHC) Rezeptoren, die eine Schlüsselfunktion in Immunantworten6haben. HLA-Gene sind dafür bekannt, die meisten polymorphen Gene des menschlichen Genoms6sein. Aufgrund der rasanten Fortschritte in der DNA-Sequenzierung Strategien für die HLA-Gene, neue allelische Varianten (oder einfach als Allele bezeichnet) werden um eine explosive Geschwindigkeit15,16entdeckt. Bis März 2017 16.755 validierten Allele hatte hinterlegt worden der IMGT/HLA-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), von denen 12.351 waren Klasse ich und 4.404 waren der Klasse II. Gruppe. Im krassen Gegensatz dazu sind nur ein wenig mehr als 100 verschiedene Allele im Test standard Einzel-Antigen Perlen (SAB) vertreten, die routinemäßig zur Alloantibodies bei Organtransplantationen eingesetzt. Die EAV-Methode baut auf einem Luminex-Plattform mit Durchflusszytometrie. Da der Test einen unveränderlichen Satz von Antigenen, abgesehen von geringfügigen Charge zu Charge Variabilitäten in der Produktion nutzt kann Antiserum Test robust über Einzelpersonen und Laboratorien5standardisiert werden. Dieser Test ist jedoch nicht in der Lage zu erfassen alle Alloantibodies entwickelt speziell gegen die Spender-Allele, insbesondere dann, wenn der Spender-Sequenzen Fehlen von der EAV eingestellt. Auftragsproduktion von Geber Antigene basierend auf wahren Sequenzen sind, zwar wünschenswert bleiben es technische Herausforderungen bei der Straffung der notwendigen Produktions- und Prüfverfahren.
Eine alternative Methode in einer Machbarkeitsstudie der Nierentransplantation Themen17vor kurzem beschrie- Die Methode verwendet Peptid-Antigene in einem Array-Format zum sondieren vor und nach der Transplantation Sera der einzelnen Subjekte. Jedes Array wurde mit Hilfe der SPOT Synthese Methode18,19,20,21,22,23 , das Peptid-Antigene, jeder 15 produziert Aminosäuren in der Länge, ausschließlich anhand der jeweiligen Organspender HLA-Allele a, B, C, DQA1, DQB1 und DRB1. SPOT-Synthese wird auf einer Zellulose-Membran mit standard Fmoc-Chemie22 betrieben und produzieren Hunderte von benutzerdefinierten Peptide parallel mit einem vollautomatischen Roboteranlage19,21. Das Membran-Array kann mehrere Wahlrunden Abisolier- und reprobing Zyklen standhalten. In unserer retrospektive Studie17werden Änderungen im Antigen-Muster mit gespeicherten Transplantation Antiseren gesammelt in einer Zeitreihe (d. h. vor und nach der Transplantation) erkannt. Hier beschreiben wir die technische Protokoll für den Workflow einschließlich Array Design, Fertigung, Antiserum sondieren und Ergebnis-Analyse. Die Methode dient zur Erkennung von Alloantibodies gegen bestimmte lineare Epitope auf Transplantation Geber HLA-Moleküle.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden zugelassen von der Northwestern University Institutional Review Board (IRB-Protokoll #: STU00104680). Ein gesamter Workflow des Protokolls in Abbildung 1 dargestellt ist.
1. bioinformatische Analyse von Spender und Empfänger HLA Sequenzen
- Sequenzen aus IMGT/HLA-Datenbank abgerufen 15.
- Erhalten HLA Typisierung Berichte der Organspender und seine/ihre Empfänger.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass geeignete Verfahren zum Schutz der vertraulichen medizinischer Aufzeichnungen genutzt werden. In der Regel ist eine institutionelle Review Board (IRB) Genehmigung das Studienprotokoll oder die experimentellen Test pro IRB Richtlinien erforderlich. Wenn HLA-Berichte vom PCR-basierte Typisierung (der hohe oder niedrige Auflösung) oder Sequenzierung-basierte eingeben (SBT) waren, gehen Sie direkt zu Schritt 1.1.3. Verwenden Sie wenn Sequenzen von genomischen/HLA Sequenzierung erworben wurden, und wenn sie abgeschlossen sind, diese Sequenzen direkt statt. Gelegentlich, wenn nur unvollständige Eingabe oder Sequenzierung Ergebnisse verfügbar sind, folgen Sie den zusätzlichen Schritt 1.1.2. Zuweisen der " fehlen " Allele über das Webtool in Schritt 1.1.2 beschrieben. - Öffnen die mehrdeutige Allel-Kombinationen nach Web link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, und suchen Sie mit Hilfe der “ zweideutig Allel-Kombinationen-Such-Tool ” Funktion zum Abrufen der hypothetischen Allele. Dann fahren Sie mit Schritt 1.1.3. das Allel eingeben.
- Öffnen der Abfragemaske IMGT/HLA-Allel unter folgender Web-Link - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html und Eingabe Thema ’ s-Allel-Namen (jeweils einzeln, wie in Abbildung 2 dargestellt) in der “ Suche für ” Feld. Klicken Sie auf die “ Suche nach Allele jetzt ” Taste. HLA-Allel-Namen sollten Standardsysteme Namensgebung verwenden (d.h., A *, A * 01, A * 01:01:01:01 und alle bisherigen Bezeichnungen wie A * 01010101).
- Finden Sie den passenden Allel-Namen auf dem Bildschirm angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Allel".
- Kopie der " Proteinsequenz ", und fügen Sie ihn in ein Textdokument unter Kopfzeile des " > Allel Name ". Effektiv, das Textdokument ist in einem FASTA (FAST alle) Format Allel Namen und Reihenfolge.
- Erhalten HLA Typisierung Berichte der Organspender und seine/ihre Empfänger.
- Durchführen genbasierten Multiple Alignments der Spender und Empfänger/Patient Allele.
- Ein Gen (z. B. DQB1 * 03:01:01:01) zu einem Zeitpunkt kopieren und einfügen alle vier Allele von Spendern und Patienten FASTA Sequenzen (zwei aus dem Spender) und zwei von den Patienten in eine kombinierte Text-Dokument. An dieser Stelle ist es wichtig, differentiell Spender Allel Namen von Patienten Allel Namen bezeichnen (Optionen beinhalten differenzierte Nutzung der oberen vs. Kleinschreibung; oder erstellen Sie eine charakteristische Präfix oder Suffix Erweiterung jedem Allel Namen separat Spender Vs markieren. Patienten Allele). Die Eingabereihenfolge der Sequenzen ist nicht wichtig, weil die Ausrichtung nach die Reihenfolge entsprechend der Stufen der Ähnlichkeit zwischen zwei beliebigen Sequenzen gemischt werden wird.
- Kopieren und einfügen die Sequenzen im FASTA-(wie in Abbildung 3 zu sehen) von oben in Format die “ geben Sie Ihre Eingabesequenzen ” Box auf der Cluster-Omega-Website: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
- Klicken Sie auf " senden Sie Ihren Auftrag " mit standard-Einstellungen der Parameter: wie " PROTEINŔ und " Clustal w / Zahlen ". Führen Sie durch, indem Sie auf " senden ". Eine Ausrichtung der vier Sequenzen erscheint auf dem Bildschirm ( Abbildung 4).
- Spender-spezifische Unterschiede zu markieren.
Hinweis: Besonders anzumerken ist, dass die Allelen Sequenzen, die hier gegeben der Ergebnisse der HLA-Typisierung anhand wurden, nicht Sequenzierung. Daher besteht die Gefahr, dass die gewünschte Sequenz Variation in der bestimmten Geber-Nehmer-paar ausgelassen werden kann. Dieses potentielle Problem wird gemildert werden, da mehr und mehr Transplantationszentren genaue hochauflösende Typisierung und direkte DNA-Sequenzierung.- Kopieren und fügen Sie den Text Ausrichtung in ein Textdokument und ein neues Dokument erstellen. Wenn das Format der ausgerichteten Datei gestört ist, beheben das Format durch Schriftschnitt und Schriftgrad ändern: verwenden Sie immer " Courier New " Schriftart in kleiner Schriftgröße, die Zeilen passen. Speichern Sie das Dokument, nachdem die Formatierung Probleme gelöst sind.
- Manuell prüfen ausgerichteten Sequenzen um alle nicht übereinstimmenden Rückstände zu identifizieren, die eindeutig für den Spender gehören. Markieren Sie jedes dieser Spender-spezifische Rückstände mit einer charakteristischen Schriftfarbe.
- Unterstreichen alle Buchstaben in der Spender ' s-Sequenzen, die 14 Rückstände zu verlängern sowohl up- und unterhalb des markierten Geber-spezifische Unterschiede (berechnet als 15 Aminosäuren-Peptid minus 1 Rückstand das Missverhältnis).
- 15-Mer Peptid-Sequenzen in einer überlappenden Serie ableiten.
Hinweis: Der Grund für die Wahl 15-Mer Peptide beruhte auf das Allgemeinwissen der typische Epitope 4-9 Aminosäuren in der Länge sein. Aus diesem Grund, wenn wir angewendet eine " bewegliches Fenster " Verfahren mit einer Schrittweite von 4 Aminosäuren ( Abbildung 1), unsere Auswahl an einer 15 Aminosäure Länge links ein 15-4 = 11 Aminosäure Überschneidungen zwischen jedem benachbarten Peptide in einer Reihe. In der Theorie ist diese 11 Aminosäure Überschneidung decken alle immun Epitope von bis zu 9 Aminosäuren in der Länge, so dass keine Epitop versehentlich " Teilen " in zwei Hälften mit nur Teilsequenzen im Array.- Verwenden die unterstrichenen Sequenzen Vorlagen nacheinander ableiten 15 Aminosäure-Sequenzen in einer Reihe kurzer, die durch 4 Rückstände zwischen jeden zwei unmittelbar angrenzenden Sequenzen in der Serie überlappen.
- Kopieren und einfügen begleitet diese 15 Aminosäure-Sequenzen in einer Tabelle ( Abbildung 5) in Form einer Tabelle Spalten von Notation Spalten, die die entsprechenden Namen der Spender Allele enthalten. Eine zusätzliche Spalte aa Rückstände Positionen enthalten kann nützlich sein,.
- Wiederholen Sie die Schritte aus 1.1.3. bis 1.3. für jedes HLA-Allel (z. B. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 und DP) von Spender und Empfänger Paar 15 aa kurze Sequenzen des Spenders ableiten.
- Kopieren und fügen Sie alle Spalten in eine master-Tabelle erstellen Sie eine lange kontinuierliche Spalte alle 15 aa Sequenzen aus der Allele des Spenders. Notieren Sie sich die Gesamtzahl der Zeilen (für die Peptid-Sequenzen) in das Dokument.
2. Gestaltung von Custom Array Layout und Produktion
- erzeugen eine Tabelle mit Peptid-Sequenzen mit entsprechenden Allel Berufungen. Das Array hat 20 Zeilen und 30 Spalten und kann bis zu 20 x 30 = 600 Plätze für Peptide. Abhängig von der Gesamtzahl der Peptide verzeichneten Schritt 1.5 von einem bestimmten Spender, und aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen mit zwei Beispiele, die wir in Liu Et al. versucht hatte. 17, fasst 600 vor Ort Array alle Sequenzen von ~ 2 separate Transplantation Fällen generiert.
- Rationell planen die meisten eWeg, sich um die Sets von Peptiden in der 600-Ort Format des Arrays fit.
- , Wenn mehr als ein Fach in einer ganzen Reihe passen, fügen Sie leere Zeilen nach der erste Geber ' s-Sequenzen, die Gesamtzahl der Zeilen übereinstimmen, die durch 30 (die Anzahl der Punkte in einer Reihe auf dem Array) dividiert werden kann.
- Sofort im Anschluss an die letzte leere Zeile für den ersten Satz von Sequenzen in der gesamten Spalte der Sequenz Inhalt aus der zweite Transplantation Fall einfügen.
- Wiederholen Sie diese Schritte, bis das Array gefüllt ist und nicht mehr Fälle ohne Überschreitung der 600 Punkte hinzugefügt werden können. Wenn man ganze leere Zeilen am unteren, füllen " bewegen " die leere Zeile zwischen den zwei Spender positioniert werden. Diese weite Raum zwischen Fällen macht Schneiden der Membran nach Abschluss der Synthese leichter - nach 3.2 Schritt. unter.
- Die Peptid-Sequenzen im Zusammenhang mit der Array-Layout-Programm. Das Programm des Synthesizers SPOT nimmt ein Textformat der Sequenzen (eine Zeile einer Peptidsequenz), die direkt erreicht werden kann, speichern Sie die resultierende Tabelle aus Schritt 2.1.4 als einfache Text-Dokument (ohne die zusätzlichen Spalten für Allel Namen, aa Stellungen etc.).
- Run automatisierte Peptid-Arrays Synthese über den SPOT-Synthesizer. Der gesamte Vorgang der Synthese wird in Kudithipudi Et Al. 21 erläutert. Beachten Sie, dass Fmoc Synthese von zwei Arrays ca. 4-5 dauert Tage.
3. Sonde und Reprobe Antiseren aus einer Zeitreihe des Individuums Transplant Empfänger.
Hinweis: die 600-Ort Membran-Array hat die Maße ~ 7 cm x 13 cm. Nach der Synthese können als trockene Membranen für mindestens zwei Jahre, wenn Sie von direktem Licht abgeschirmt die Arrays bei Raumtemperatur gelagert. Vermeiden Sie übermäßige Falten der Membran, seine Langlebigkeit für die wiederholte Verwendung zu erhalten.
- Rehydrieren die Membran-Array mit Ethanol und visualisieren Peptid-Flecken Flecken mit Ponceau s
- Rehydrieren die Membran Array tragen die Peptide, die nach einem schrittweisen Verfahren optimiert in Li Et al. 24.
- tauchen die Array-Membran in 20 mL 100 % Ethanol.
- Fügen Sie 20 mL destilliertem Wasser verdünnen Sie die Lösung mit 50 % Ethanol und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Ändern die Lösung eintauchen in 40 mL 100 % Wasser dreimal und inkubieren Sie jedes Mal 15 min.
- Waschen in einem richtigen arbeiten Puffer, z. B. 20 mL TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 %), drei Mal für 5 min.
- Ponceau S-Färbung des Arrays, synthetische Peptide zu visualisieren
- 20 mL vorformulierte Ponceau S-Lösung direkt in die hydratisierten Array hinzufügen und inkubieren Sie für ~ 30 s mit zitternden.
- Run destilliertes Wasser kontinuierlich über die Membran, de-Hintergrund Ponceau S Farbe zu färben. Während des Prozesses können Peptid Flecken von roter Farbe sichtbar werden.
- Trennen die Teile des Arrays für jeden Spender durch sorgfältig schneiden zwischen den Abschnitten des Arrays für den Einzelfall. Markieren Sie die Ausrichtung der einzelnen Array.
- Rehydrieren die Membran Array tragen die Peptide, die nach einem schrittweisen Verfahren optimiert in Li Et al. 24.
- Pre-Block-Array.
- Block der Membran in 20 mL 5 % fettfreie Milch aufgelöst in TBST Puffer. Diese Milch-basierte Lösung wird weiter Ponceau S Farbe de-beflecken. Den Milch-Puffer mehrmals zu ersetzen, um die klarsten Peptid-Bilder zu erreichen.
- Für Aufzeichnungen Zwecke, nimm ein Foto von Ponceau S Bild des Arrays mit einer Handkamera (Beispiel in Abb. 6).
- Weiter blockieren der Membran in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 h mit rockigen.
- Inkubieren Array mit Transplantation Antiserum.
Hinweis: Es sollte darauf hingewiesen, dass ein Phänomen bekannt als prozone oder Hook-Effekt von Komplement-abhängige Störungen im Serum Antikörper Analyse führen kann. Um dieses Problem zu umgehen, kann eine optionale Serum Vorbehandlungsschritt mit EDTA oder Hitze Inaktivierung von Serumproben betrachtet werden.- Blockierende Puffer zu entfernen und waschen Sie die Membran mit 20 mL TBST dreimal am nächsten Tag für 5 min jedes Mal.
- Fügen Sie 20 µL des rohen Serum des Empfängers, 20 mL von 2,5 % Milch in TBST Puffer und mit der Membran für 2-3 h bei Raumtemperatur inkubieren. Beachten Sie, dass in dieser ersten Runde sondieren, wird empfohlen, dass die letzten nach der Transplantation Serum (oder wahrscheinlich am meisten sensibilisierten Serum) in der Zeitreihe Erstens verwendet wird. Dies basiert auf der Annahme, dass frühere Exemplare der Serie, besonders von Pre-Transplantation Zeitpunkten, weniger Vielzahl von Alloantibodies, die neigen, im Laufe der Zeit entwickeln. Auf diese Weise, jede Möglichkeit einer Signalstörung aus " Verschleppung " zwischen sondieren Runden von wahrhaft entwickelten Alloantibody Reaktivität durch Immunreaktionen gegen das Transplantat klar unterschieden werden können.
- Das Array mit 20 mL TBST waschen und inkubieren Sie mit Sekundärantikörper.
- Die Membran dreimal für 10 min jedes Mal zu waschen.
- Inkubation mit Ziege Anti-Human IgG-HRP (Meerrettich-Peroxidase) sekundäre Antikörper bei Verdünnung 1: 10.000 in TBST Puffer ergänzt mit 1 % Milch für ein weiteres 2 h.
- Waschen und den Fleck entwickeln.
- Membran dreimal mit TBST für 10 min jedes Mal zu waschen.
- Perform verstärkte Chemilumineszenz (ECL) mit 5 mL der Lösung Luminol frisch gemischt mit 5 mL Wasserstoffperoxid-Lösung zu entwickeln, die Membran (für 1 min).
- Visualisieren ECL-Signale mit einem geeigneten Imager (d. h. ChemiDoc Imaging Systems oder Azure C600).
- Scannen und quantifizieren den Blot.
- Die entwickelten Bilder ( Abbildung 7, unteres Bild) speichern und Quantifizierung der spot Intensität durchführen.
4. Vergleichen Sie Antiserum Reaktivität auf einer klinischen Zeitreihe.
- Streifen des Arrays.
- An diesem Punkt, halten Sie die Membran, die jederzeit nass.
- Streifen die Membran durch Inkubation mit 20 mL kommerzielle abstreifenden Puffer bei 37 ° C für 20 min und dann waschen Sie die Membran mit TBST dreimal für jeweils 10 min.. Dann wiederholen Sie die blockierende (Schritt 4.2) und Abtasten (Schritt 4.3) Schritte mit verschiedenen Serum des Patienten auf einen anderen Zeitpunkt ergriffen.
- Block abgestreift Membran.
Hinweis: Folgende abstreifen, die Membran für eine weitere Runde der Sondierung von verschiedenen Serum aus dem gleichen Patienten in einer Zeitreihe wiederverwendet werden.- Die Membran mit 5 % Milch Puffer wie zuvor zu blockieren (siehe Punkt 3.2).
- Reprobe ein anderes Antiserum aus der gleichen Zeitreihe (wiederholen Sie die Schritte von 3,3-3,6; Beispiel in Abbildung 7, oberes Bild).
Hinweis: Abgespeckte Array kann dann verwendet werden, um ein weiteres Exemplar von Serum reprobe. Da die Peptide kovalent an die unterstützenden Matrix der Membran konjugiert sind, haben wir gezeigt, dass das Array für bis zu 20 Runden Abisolier- und reprobing Zyklen ohne seine Longitudinalstudie wiederverwendet werden könnenRmance. - Langzeitlagerung von Arrays.
- Store ergänzt die Membran in TBS-Puffer mit 0,02 % w/w Natriumazid als Konservierungsmittel. Verwenden Sie einen verschlossenen Plastikbeutel für langfristige Lagerung. Bei 4 ° C unter Schutz vor direktem Licht, kann die feuchte Membran mindestens 2 Jahre gelagert werden.
5. Datenerfassung und Analyse
- manuell beschriften positive Antigen-Peptide.
- Spots, die positive Antikörper-Signale finden und bestimmen jeweils ihre Startpositionen.
- Markieren Sie die entsprechenden Zeilen in der Masterarbeitsblatt für die positive Peptide.
- Abrufen Peptid-Sequenzen in den Masterarbeitsblatt ( Abbildung 7, untere Liste) aufgeführt. Nach dem Design-Prinzip gemäß Schritt 1.4.1., benachbarten serielle Flecken Teilen deutlich überlappende Sequenzen (15: 4 = 11), daher können reaktive Epitope von Peptiden in aufeinanderfolgende geteilt werden.
- Markieren Sie irgendwelche positiven Punkte in Folge auftretende.
- Minimale Epitop Länge für jedes Peptid in einer Reihe zu bestimmen.
- Highlight keine potenziell freigegebenen Epitop Sequenzen basierend auf überlappende Segmente des reaktiven Peptide.
- Strukturell Modell Antigen Epitope.
- Erhalten Prototyp HLA Kristallstrukturen aus der Protein Data Bank finden Sie unter der folgenden Web-Link: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
- Anzeige den Prototyp HLA Struktur in Pymol (Download von www.pymol.org).
- Karte " oder Modell entdeckt Anti-Spender Epitope zu den 3D Strukturen der Prototyp-HLA-Moleküle durch die Hervorhebung der reaktive Peptid-Sequenzen ( Abbildung 8). Klicken Sie auf " Display ", dann " Hintergrund ", und wählen Sie " weiß ". Um das Bild zu speichern, gehen Sie zu " Datei " und " Bild speichern unter " und wählen Sie das Dateiformat " Png ".
- Ergebnisse und die entsprechenden Allele reaktive Epitope zuweisen.
- Vergleichen array Ergebnisse die Ergebnisse Einzel-Antigen Perlen (SAB), falls verfügbar.
Hinweis: Der EAV-Test mit einzelnen Allele Antigene misst Antikörper Reaktivität gegenüber einem Festteil HLA-Proteine. Einzelnen Peptide, die Antikörper Reaktivität zeigen gehören zu bestimmten HLA-Allele, die, wenn auch im Bedienfeld "SAB" enthalten Direktvergleich zwischen Arrays und die SAB-Ergebnisse ermöglichen. Unsere früheren Studie 17 zeigte ein hohes Maß an Korrelation zwischen den Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass die Peptid-Epitope zum allgemeinen Reaktivität der SAB Beitrag Darüber hinaus zeigen die Array-Ergebnisse auch Aminosäure-Niveaus der Spezifität.- SAB erhalten ergibt sich aus einem HLA-Labor die bietet Informationen darüber, ob und welche Spender Allele reaktive Seren von Patienten nach der Transplantation sind. Ergebnisse aus Schritt 5.5. basierend auf dem Array Analyse liefern auch Informationen über entsprechende Spender Allele positiv für Alloantibody Reaktivität.
- Vergleichen SAB und Array Ergebnisse.
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Representative Results
In der ursprünglichen Studie mit dem Array screening-Methode17schrieb wir insgesamt 5 Niere Transplantation Fächer. Wir erhalten die HLA Typisierungsergebnisse unserer Kohorte und ihre jeweiligen Geber. Ihre Krankengeschichte und Allele Antikörpertiter von SAB Tests waren auch uns zur Verfügung. In unserer Pilotstudie von diesen 5 Patienten, haben wir zwei verschiedene Methoden entwickelt: ein standard-Array bestehend aus einem Festteil Peptide und personalisierte Arrays, die benutzerdefinierte wurden gemacht für jedes Paar von Spender und Empfänger. Während die erste Methode, die uns technisch überprüft die Leistung der Array-Plattform erreichen hohe Spezifität bei einzelnen Transplantationen erlaubt hatte, ist das personalisierte Protokoll für diese Methode in diesem Artikel und Video bestimmt beschrieben. für die umfassende Überprüfung der Spender-spezifische Antikörper (DSA), die oft mit Armen Transplantat Ergebnisse5,25,26korrelieren.
Die personalisierte Arrays wurden in zwei von fünf Fällen17angewendet, und für den gesamten Workflow der Methode illustrieren, hier konzentrieren wir uns auf einer dieser zwei Patienten (nämlich PTN #4). Die Schlüsseltechnologie für die Herstellung von kundenspezifischen Peptid-Arrays beinhaltet die SPOT-Synthesizer. Es ist eine vollautomatische Roboter Peptide mit Fmoc Synthese direkt auf einer speziell abgeleiteten zellulären Matrix auf eine Membran (Abbildung 1). Wir nutzen die Flexibilität des Synthesizers, große Mengen von Peptiden abgeleitet aus einzelnen Organspendern HLA Sequenzen zu montieren. Um ausreichende Deckung, eine Situation zu vermeiden, wenn ein kontinuierliches Epitop als "split ist" und Antikörper Reaktivität verliert, folgten wir einem "walking" Design serielle Peptide 15-4 haben = 11 Rückstände von Überschneidungen zwischen jedem unmittelbar angrenzenden Peptide, also dass die Serie immer die typische Länge des Antikörpers Epitope zu decken ist schätzungsweise 4-9 aa in der Länge (Abbildung 1).
Die Vorlage HLA-Sequenzen wurden direkt aus der Repository-Datenbank gepflegt am EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) heruntergeladen. Als ein Beispiel der PTN #4 Spender HLA-DQB1 * 03:01:01:01 Allel wurde gesucht (Webseite Darstellung in Abbildung 2). In Verbindung, wir separat heruntergeladen Sequenzen für den Spender zweite HLA-DQB1 Allel von * 02: 01:01, sowie der PTN #4 selbst, HLA-DQB1 * 04:02 und * 05:01. Mehreren Sequenzalignment erfolgte dann mittels Clustal Omega-Web-Funktionen (Abbildung 3). Die resultierende Ausrichtung-Datei (Abbildung 4), aus denen alle nicht übereinstimmenden Aminosäurereste identifiziert wurden gewonnen (des Spenders Rückstände sind hervorgehoben). Als nächstes haben wir gekennzeichnet Vorlage Sequenzen (unterstrichen) des Spenders, die lang genug, um seine nicht übereinstimmende Rückstände zu decken waren. Basierend auf dieser Vorlage-Sequenzen und nach einem "walking" Design, wie beschrieben, drei Serien von Peptiden jeweils 15 aa Länge für HLA-DQB1 abgeleitet wurden. Dieser Vorgang wiederholte sich mit dem Rest des Spenders Allele der HLA-A, B, C, DQA1 und DRB1 (DRA1 und DP wurden aufgrund der Nichtverfügbarkeit von den einschlägigen klinischen Datensatz ausgeschlossen) im Vergleich zu den entsprechenden Allele von seinem Empfänger. Am Ende insgesamt 202 Peptide wurden für die Herstellung des Arrays (Peptid-Sequenzen in einem Arbeitsblatt in Abbildung 5 und eine Array-Darstellung in Abbildung 6) speziell für sondieren PTN #4 nach der Transplantation Serum angeworben, und verglichen die Ergebnisse mit denen, die von einer nachfolgenden reprobing seine Pre-Transplantation-Serum (Abbildung 7). Aus der 202 Peptide, insgesamt 10 zeigten Antikörper Signale zugeordnet nach der Transplantation Probe die Spender-spezifische Rückstände (übereinstimmende vom Empfänger) E87, I306, W243 und K197 von HLA-B * 52:01, -B * 52:01, -C * 03:04 und -DQA1 * 05:01 zu sein schien Anstiftung zu Antikörper Reaktivität (Rückstände in roten Buchstaben in Abbildung 7bezeichnet) beteiligt.
Darüber hinaus ist eine der wichtigsten Vorteile der Array-Methode im Vergleich zu den traditionellen EAV-Test, dass Epitop Informationen leicht abgerufen werden kann, wie in Abbildung 7dargestellt. Wir verglichen die Antikörper-reaktive Epitope auf HLA-DQA1 und -DQB1 aus allen fünf Patienten (von separaten Array Ergebnisse in Liu Et al. 17) indem er sie alle modellierten, Co Kristallstruktur des Heterodimer DQA1 und DQB1 (Abbildung 8). Ermutigend ist, dass ist ein prominenter Segment der Struktur bekannt als der β1-Strang einen "Hotspot", der eine viel höhere Chance (3/5 von Patienten 2,3,5) Ziel von Alloantibodies zu den Themen Haartransplantation in der 5 Fall Kohorte hatte.
Abbildung 1 . Die allgemeine Systematik der HLA-basierte Antigen Array Methode zum Nachweis von Anti-Spender HLA Alloantibodies in Organempfängern. (Angepasst und modifiziert von Liu Et al. 17) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Website für Data Repository
HLA-Sequenzen abzurufen, besuchen Sie die folgende Website: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
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Abbildung 3. Mehreren Protein-Sequenzen Ausrichtung des Spenders vs. Empfänger HLA-DQB1 Allele mit Clustal Omega Web-basierte Tool.
Kopieren und Einfügen von Sequenzen von Patienten #4(PTN#4) DQB1 * 0201 und 03:01, und des Spenders DQB1 * 04:02 und 05:01 im FASTA-Format in http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (zur Veranschaulichung, DQB1 * 05:01 von PTN #4 und DQB1 * 03:01 des Spenders werden in das Eingabefeld angezeigt) . Wählen Sie die Option "Clustal w / Zahlen" in "STEP2" für das Ausgabeformat und führen Sie Ausrichtung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Vergleich derGeber vs. Patient/Empfänger HLA DQB1 und Auswahl der Vorlage Sequenzen für die Peptidsynthese.
Der Spender-Sequenzen sind Fett, mit Spender-spezifische Unterschiede in roter Schrift und auch mit schwarzen Kästen hervorgehoben. Vorlage-Sequenzen (unterstrichen), für die Ableitung von Peptide enthalten diese Spender-spezifische Rückstände. (Diese Abbildung wurde angepasst und geändert von Liuet al. 17) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Ein anschauliches Beispiel für die Masterarbeitsblatt in einer Kalkulationstabelle Spender HLA Peptide.
Peptid-Position im Array wird zeilenweise vs. Spalte Koordinaten angezeigt. Peptid-Sequenzen werden zur Synthese mit Roboter-SPOT Synthesizer zu programmieren. Spender-spezifische Rückstände (übereinstimmende aus entsprechenden Allele des Empfängers) sind in Fettdruck hervorgehoben und unterstrichen. Die Anfangs- und Endpositionen des Peptids entspricht voller Länge HLA-DQB1 Sequenzen werden ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Bild eines Array-Sektion gebeizt mit Ponceau S
Beachten Sie die Unterschiede in der Farbintensität durch Unterschied in der Aminosäure-Zusammensetzung unter Peptide, während Peptid-Konzentrationen unter vor Ort überall identisch sind. (Das Bild ist ein anschauliches Beispiel, keiner aus dieser aktuellen Studie). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 . Spender-spezifischen HLA-A, B, C, DQ, DR Array Studie von nicht übereinstimmenden Epitopen PTN # 4.
Serielle Peptide stammen aus der Spender-Sequenzen zur Deckung nicht übereinstimmende Rückstände (ein Beispiel für DQB1 in Abbildung 4). Das Array wurde verwendet, um das Serum nach der Transplantation Sonde (untere Fleck: Post-TX) und anschließend vor Transplantation Serum (obere Fleck: Pre-TX) vom selben Patienten. Die vier Gruppen von starken Flecken aus nach der Transplantation zu sondieren sind gekennzeichnet durch rote Linien (in der unteren Fleck), während zwei mittlerer Intensität Flecken, die nur mit verbunden waren vor Transplantation Serum sind gekennzeichnet durch blaue Linien (in der oberen Blot). Die untere Tabelle zeigt die entsprechenden Peptid-Sequenzen und ihre Reaktionsfähigkeit auf das Serum nach der Transplantation. Spender-spezifischen (nicht übereinstimmende) Rückstände E87, I306, W243 und K197 ihre jeweiligen Allele sind in roten Buchstaben und Peptide zeigen starke Antikörper Reaktivität in Fett Schriftarten. Diese Zahl wurde angepasst und modifiziert von Liu Et al. 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 . Strukturellen Positionen der HLA-DQ Epitope.
Co Kristallstruktur des HLA-DQ8 diente als Vorlage. Die Struktur bestand aus einem DQA1 und DQB1-Untereinheiten zusammen mit einem Antigen-Peptid (A). Protein-Sekundärstrukturen α-Helices und β-Stränge sind im Bedienfeld " (B)gezeigt. DQA1 und DQB1 Peptide, die entweder mit einer von fünf Serum reagierten befanden sich auf dem Co Kristallstruktur ( a und b: blau schattiert). Drei β-Stränge, β1, β6 und β12 (dunkelblau in B), jeweils vertreten durch mehrere Peptide (kurze rote Linien, die lineare aa Positionen der DQA1 entspricht), reagierte mit mehreren Patienten Proben (original Ergebnisse in Liu Et Al. 17). alle sechs DQB1 Peptide (in Fettschrift) reaktive Antikörper bei Patienten #2, #3, #5 befinden sich die β1-"Hotspot"-Segment (in B: durch den roten Pfeil darauf hingewiesen). Diese Zahl wurde von Liu Et al. 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Design des hier beschriebenen Ort Arrays ist für experimentelle Studie über Alloantibody Spezifität in der Transplantationsmedizin gegen ein Organspender HLA-Antigene. Im Gegensatz zu den bestehenden SAB-Assay weitgehend verwendet in Klinik hat die Antigen-Array-Methode einen großen Vorteil im flexiblen Design, das die wahre HLA-Sequenzen des einzelnen Spenders aufnehmen können. Die neue Plattform nutzt die Potenziale der rasant fortschreitenden Technologie DNA-Sequenzierung, der bald in der Lage, genaue HLA Allelen Sequenz Messwerte ohne Mehrdeutigkeit16,27 zu produzieren und das Potenzial der benannten Datenbanken für Repository-Sequenzen HLA15 an der Weltbevölkerung. Unsere aktuelle Array-Screening Protokoll wurde basierend auf den Erfolg von mehreren Pilotstudien der Transplantation Sera entwickelt. Hier sollten wir betonen, dass zu diesem Zeitpunkt unser Prototyp-Arrays nur für Forschungszwecke, nicht für diagnostische Anwendungen in der klinischen Praxis aufgebaut sind.
Eine andere bemerkenswerte Unterscheidung zwischen SAB und unsere Antigen-Array ist, dass Letzteres hat eine höhere Auflösung zu potenziellen Antigen Epitope innerhalb der 15 aa Segmente der HLA-Sequenzen zu unterscheiden, die wertvolle Informationen über Alloantigenicity18 liefern könnte . Allerdings enthält im Gegensatz zu SAB, das ganze Protein-Antigene anpassen ihre gefalteten Strukturen präsentiert, das Antigen-Array nur kurze Peptide, die schließt Informationen über Konformationsänderungen Falten. Daher können die Arrays nicht erkennen Antikörper, die nur Konformationsänderungen Epitope erkennen, einige glauben der Mehrheit aller funktionalen Epitope relevanten Antikörper vermittelte Ablehnung28,29. Dennoch in anderen Kontexten Antikörper Aktionen gegen lineare Epitope, wie diese in kurze Peptide in virale Antigen Antworten ausgebeutet werden und im Impfstoff design30,31. Wir sollten auch beachten, dass in der begrenzten Zahl von Patientenproben getestet, die Erkennungsleistung Sensibilität unserer Array, SAB überschritten und die Erkennung von Spender-spezifische Antikörper früher17 bei den klinischen Verlauf der erlaubt Antikörper-vermittelten Ablehnung. Dies ist aufgrund der hohen Molaren Konzentration des lokalen Antigen-Peptide im Array verglichen mit SAB Diese Funktion war besonders nützlich in Fällen, wenn SAB keine Reaktivität erkannt, während klinische und pathologische Nachweis der Antikörper-vermittelten Ablehnung zeigte, wie wir zuvor17gezeigt. Es ist jedoch wichtig, darauf hinzuweisen, dass dieser personalisierten Test aufwändiger als der Standardtest SAB ist. Der Array Test fordert Erhalt der Orgel des Spenders und des Empfängers (vorgeschlagene) HLA-Sequenzen vor dem Start des Design von Antigen-Peptiden. Dann dauert es mehrere Tage, um das Array und weitere 7-8 Stunden Antikörper Ergebnisse erzielen zu produzieren. Eignet sich deshalb das langwierige Verfahren nicht für verstorbenen Spenders Transplantationen, es sei denn, der Hauptzweck der Antikörper-Test zur Bestimmung der Entstehung von Spender-spezifische Antikörper nach Transplantation, anstatt für die Pre-Transplantation-Bewertung der vorhandene Antikörper.
Die Array-Methode hatte eine erhebliche Verbesserung gegenüber den bestehenden SAB-Test bei der Aufdeckung von Antigen Epitope. Darüber hinaus haben wir versucht eine Template-Struktur der HLA-DQ, reaktive Epitope in fünf Transplantationspatienten zuordnen in dem wir mindestens einen prominenten "Hotspot" Epitop in seiner β1-Strang zur Kenntnis genommen, die in drei von fünf Patienten17aufgetreten. Faszinierenderweise befinden der β1-Stränge der HLA-DQA1 und -DQB1 sich an der Nut der Antigen-Präsentation konkav (Abbildung 8), eine Position bekannt als Antigen im Zusammenhang mit der Transplantation Ablehnung32. Daher erwarten wir, dass zukünftige Erforschung unserer personalisierten Antigen Array-Methode im erweiterten Transplantation Kohortenstudien wertvolle Einblicke auf Antigene Hotspots in HLA-Moleküle bringen wird. Ein Katalog dieser identifizierten Hotspots, wenn in Verbindung mit hochgenauen DNA-Sequenzierung Typisierung von HLA-Genen zwischen potenziellen Spendern und Empfängern, hilft letztlich vor Transplantation Entscheidungen durch akzeptable Diskrepanz Programme 33, soll effektiver gewisse Diskrepanzen in der Nähe katalogisierten Hotspots zu vermeiden.
Zusammenfassend lässt sich sagen war unsere ursprüngliche Studie17 in der Erforschung der personalisierten Design eines Antigen-Arrays für die Erkennung von spezifischen Anti-HLA Alloantibodies der erste seiner Art. Die Studie konzentrierte sich auf die Durchführbarkeit der Array-Design und Implementierung, diente als Prototyp für mögliche zukünftige Technologien. Unserer Pilotstudie nicht nur erzeugt, ermutigende Ergebnisse aus klinischen Proben, sondern auch erlaubt uns zur Schätzung der Gesamtkosten und die Geschwindigkeit des Tests. Die Produktionskosten für eine personalisierte Array in unserer aktuellen Laborumgebung ist unter 1.000 US-Dollar, was eine einmalige Gebühr ist, da das Array dann im Laufe der Zeit in bis zu 20 Runden reprobing Zyklen ohne Leistungsverlust verwendet werden kann. Es ist möglich, dass zusätzliche Untersuchungen des Protokolls Array mit einer größeren Kohorte der Transplantation Themen die Methode weiter optimieren werden, die eines Tages in der klinischen Praxis verwendet werden könnte.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei DRS. Shawn Li und Xing Li der Western University in Kanada für ihre freundliche Unterstützung mit SPOT array Produktion. Wir sind dankbar für die Mitarbeiter der Histocompatibility Kern und an der umfassenden Transplant Center der Northwestern University für die Probe Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Hilfskräfte der Northwestern Memorial Hospital und durch eine Fakultät Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Northwestern University, j.j. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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