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Biochemistry

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

Published: September 6, 2017 doi: 10.3791/56278
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 2, 1
1Division of Nephrology and Hypertension, and the Center for Kidney Research and Therapeutics at the Feinberg Cardiovascular Research Institute, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Surgery-Organ Transplantation, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University

Summary

ひと白血球抗原 (HLA) シーケンス臓器提供者と受信者のペア間の不一致は、臓器移植での拒絶反応の抗体の主要な原因です。レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体をプローブする個々 のドナーの HLA シーケンスに基づくカスタム抗原配列の使用をご紹介します。

Abstract

関数とグラフトの長寿は臓器移植における批判的にひと白血球抗原 (HLA) に対する免疫学的拒絶反応の制御の成功に依存します。適合ガイドラインとして既存のいずれかを示す抗 HLA 免疫の検査に基づいているまたはde novoが主要な移植の障壁を構成する HLA 抗体を生成します。現在のテストは、〜 100 事前に選択された組換え HLA 抗原の固定セットを使って移植血清を調べる単一抗原ビーズ (SAB) プラットフォームに基づいて構築されます。しかし、人間まで多様な HLA 型は、同じ HLA シーケンスの組み合わせを共有することができます一卵性双生児以外ないの 2 人が存在します。HLA タイピングと直接配列の高度な技術は、間ドナーの DNA シーケンスの不整合をキャプチャすることが正確に、受信者の HLA、SAB 試金、シーケンスの表現、その限られた変化のためには正確に検出することができます。ドナーの HLA 不一致に対して同種抗体。我々 は個人ごとに抗ドナー HLA 抗体の特徴を検出して別の技術を使用して相補的な手法を開発しようとしました。スクリーニング ツールは移植後血清抗体関連型拒絶反応のリスクを評価するために臓器の受信者をプロービングのためドナー HLA 派生系列のカスタム ペプチド配列です。ドナーと受信者の 1 つのペアの 1 つの配列に 600 のユニークなペプチドまでに基づいて行われますドナーの HLA タンパク質配列、各ペプチド、15 アミノ酸配列で、少なくとも 1 つの不一致残渣を運ぶします。これらのアレイで前と移植後の血清の抗原パターンを比較するパイロット実験で抗 HLA も関与する免疫抗原を特定することができました解像度の信号を検出することができました。パーソナライズされたこれら抗原配列は臓器移植におけるドナーの HLA 抗原の高分解能の検出を許可します。

Introduction

世界中で日常的に行われている臓器置換療法は、数百万の命を救っています。固形臓器移植、米国で 100万人あたり約 100 人の患者で発生します毎年、大きい数はまだ待ちでいる臓器 (器官によって提供される情報によると供給の厳しい不足を受信する間調達および移植ネットワーク - OPTN/全米: optn.transplant.hrsa.gov)。臓器移植臓器の廃棄物の削減し、命を救うために規制されて、科学的なツールこれらの規制を通知するために使用は有効性で限られています。例えば、科学界は完全に HLA 分子の非常に多型の状態を認識し、高解像度入力し、シーケンス ベース (SBT) を用いた DNA の正確な遺伝子検査は、近年1,で開発されている2します。 ただし、alloantibody 試験方法がまだできていない抗原プローブとして多様な個々 の HLA のシーケンスを生成します。標準的なテストはこの頃不変のパネルを使用するを構成する HLA の共通の変形の ~ 100 の対立抗原の A、B、C、DQ、DP、DR は人口3,4,5,6シーケンスします。頻繁に実際のドナーの HLA シーケンスに含まれていないテストパネル、移植医師と外科医は、ドナーの実際のシーケンスと対応する「標準」の共有類似性に基づいてドナー固有反応性を推論する強制することで、テストは、7、8を設定します。その結果、信頼性の高い抗体テスト結果9,10、11,12に基づいて拒否リスク見積もりを行うに困難な場合があります。したがって、新しい個人的にカスタマイズのテスト同種抗体が緊急に必要な13,14 です。

HLA 遺伝子は免疫応答6にキー関数がある主要組織適合遺伝子複雑な (MHC) の受容体をエンコードします。HLA 遺伝子ヒトゲノム6の最も多型の遺伝子が知られています。DNA の急速な進歩による HLA 遺伝子、対立遺伝子の新しい亜種のための戦略をシーケンス (または対立遺伝子と単に呼ばれる)、爆発的な速度で15、16が発見されています。2017 年 3 月 16,755 検証された対立遺伝子入金されていた IMGT/HLA データベース (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html) にどの 12,351 のクラスのだったらと 4,404 クラス II グループの。対照的にだけ少し以上 100 の異なる対立遺伝子は臓器移植における同種抗体を検出する使用標準的な単一抗原ビーズ (SAB) のアッセイで表されます。SAB 法はフローサイトメトリーを用いた Luminex プラットフォームに基づいて構築されます。アッセイを利用して生産、マイナーなバッチ変動以外の抗原の不変のセットからは、研究所5の個人間でしっかり抗血清テストを標準化できます。しかし、このテストはドナー シーケンスが不在であるときに特にドナーの対立遺伝子に対する具体的開発すべて同種抗体をキャプチャできません、SAB から設定します。真のシーケンスに基づくドナー抗原のカスタム生産が望ましいが、必要な生産の合理化及び試験手順の技術的な課題が残っています。

最近腎移植科目17のフィージビリティスタディにおける代替方法論について述べる。メソッドは、配列形式の事前調査のペプチド抗原を使用し、被験者の血清、移植後。各アレイは、スポット合成法18,19,20,21,22,23各 15 の抗原ペプチドを生成することを使用して構築されたカスタムされました。アミノ酸の長さは、完全に基づいてそれぞれの臓器ドナーの HLA 対立遺伝子 a、B、C、DQA1、DQB1 DRB1。スポット合成標準 fmoc 保護化学22を使用してセルロース膜で運営され、何百もの完全に自動化されたロボット システム19,21と並行してカスタム ペプチドを作り出すことができます。膜配列は、ストリッピングと reprobing サイクルの複数のラウンドを耐えることができます。私たちの回顧的研究17(すなわち前に、と移植後) 時系列で収集ストアド移植抗血清と抗原パターンの変化を検出します。ここ製造、抗血清の調査と結果分析して配列設計を含むワークフローのプロトコルの技術を説明します。メソッドは、同種移植ドナーの HLA 分子に特定の線形エピトープに対する抗体を検出するため。

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Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、ノースウェスタン大学制度検討委員会によって承認されている (IRB プロトコル #: STU00104680)。 図 1 にプロトコルの全体的なワークフローを示します

。

1。 ドナーと受信者 HLA シーケンスのバイオ情報解析

  1. 15 IMGT/HLA データベースからシーケンスを取得 します。
    1. 臓器提供者とその受信者の両方の取得 HLA タイピング レポート
      。 メモ: は、機密の医療記録を保護するために適切な手順を利用してください。通常、研究プロトコルまたは実験的テストの制度審査委員会 (IRB) の承認は、機関の IRB ガイドラインごとに必要なです。HLA レポートの (高または低解像度) の入力 PCR ベースまたは (SBT) を入力シーケンスに基づく場合は、1.1.3 の手順に直接行きます。/HLA ゲノム シーケンスからシーケンスが得られた場合、完了している場合、これらのシーケンスを直接使用代わりに。時折、だけ不完全な入力や結果のシーケンスを使用できる場合は、1.1.2 追加の手順に従ってください。割り当てるには、" 不足している " 1.1.2 の手順に従って web ツールを介して遺伝子
      2. 。
    2. を使用して検索リンク - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html、あいまいな対立遺伝子の組み合わせ次の web を開き、“ あいまいな対立遺伝子の組み合わせ検索ツール ” 仮説の対立遺伝子を取得する関数。1.1.3 をステップに進みます。対立遺伝子名を入力します
      3. 。
    3. は、次のように IMGT/HLA 対立遺伝子クエリ フォームを開く web リンク - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html、および入力件名 ’ s 対立遺伝子名 (それぞれ個別に、 図 2 に示すように、) に、“ 検索” ボックス。クリックして、“ 今の対立遺伝子の検索 ” ボタン。HLA 対立遺伝子名は標準的な名前付けシステムを使用する必要があります (すなわち A *, A * 01, A * 01:01:01:01 と A * 01010101 のような任意の以前の名称).
    4. は、画面に表示される一致する対立遺伝子名を探します。対立遺伝子] ボタンをクリックします
      5. 。
    5. コピー、" 蛋白質シーケンス "、ヘッダー行の下にテキスト ドキュメントに貼り付けると " > の対立遺伝子名 "。効果的に、テキスト文書は、対立遺伝子名とシーケンスの FASTA (高速すべて) 形式
      6. 。
  2. 遺伝子に基づく多重を行うドナーと受信者/患者の対立遺伝子のアラインメント。
    1. 1 遺伝子 (すなわち DQB1 * 03:01:01:01)、一度にコピー、ドナーと患者の FASTA シーケンス (ドナーから 2 つ) と 2 つの患者からの 4 対立遺伝子すべてのテキスト ドキュメントに貼り付けます。この時点で、それは特異的患者対立遺伝子名からドナーの対立遺伝子名を示すために重要な (オプション小文字; 対上の差動の利用が含まれてまたはドナー vs を個別にマークする各対立遺伝子名に特徴的なプレフィックスまたはサフィックスの拡張機能を作成します。患者遺伝子)。順序は、シーケンスのペア間の類似性のレベルによるとシャッフルされます配置を次のための入力の順序は重要ではありません
      2. 。
    2. コピーと貼り付けの FASTA のシーケンスは、上から (として 図 3 に見られる) フォーマット、“、入力シーケンスを入力 ” クラスター オメガ ウェブサイト上のボックス: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
      3. 。 クリックして
    3. " あなたの仕事を提出 " パラメーターの標準設定を使用して: よう " PROTEINŔ と " 番号 w/Clustal "。クリックして配置を実行 " 送信 "。4 つのシーケンスの位置合わせが画面 ( 図 4) で表示されます
      4. 。
  3. ドナー固有の不一致をマークします
    。 注: 特に留意されここに与えられた allelic シーケンスはないシーケンス HLA のタイピングの結果に基づいていたこと。したがって、特定のドナー-受信者ペアに関連するシーケンス変化を見逃す可能性があります危険があります。この潜在的な問題をより軽減してより多くの移植センターが正確な高解像度入力を採用し、DNA の配列を直接します。
    1. コピー配置テキストをテキスト ドキュメントに貼り付けるし、新しい文書を作成します。一直線に並べられたファイルの形式が乱れている場合は、フォント スタイルおよびサイズを変更することによって形式を修正: 常に使用 " Courier New " 行に合わせて小型サイズのフォント。書式の問題を解決した後に、文書を保存します
      2. 。
    2. は、ドナーに一意に属するすべての不一致残基を識別するために一直線に並べられたシーケンスを手動で検査します。それぞれ特徴的なフォントの色を使用してこれらのドナー固有残基のマークします
      3. 。
    3. ドナーのすべての文字に下線を引く ' s ・ シーケンス 14 残基を拡張両方のアップとマークされたドナー固有不一致の下流 (不一致の 1 残基マイナス 15 アミノ酸ペプチドとして算出).
  4. 重複シリーズ 15 mer ペプチド シーケンスを派生します
    。 注: 15 mer ペプチドを選ぶ理由は、長さ 4-9 アミノ酸をされている典型的なエピトープの一般的な知識に基づいていた。したがって、我々 が適用、" の移動ウィンドウを " 手順 4 アミノ酸 ( 図 1)、15 アミノ酸長さの私達の選択のステップ サイズの左 15-4 = 11 アミノ酸シリーズの任意の隣接のペプチドが重なる。エピトープされません誤って、理論的には、この 11 アミノ酸重複です、長さ最大 9 アミノ酸のすべての免疫エピトープをカバーするのに十分な " を分割 " 配列の部分配列のみで半分に。
    1. 順番に派生するためのテンプレートは 4 残基シリーズの任意の 2 つの隣接のシーケンスの間で重複する一連の 15 のアミノ酸配列を短い下線付きシーケンスを使用します
      2. 。
    2. コピーと貼り付け列形式でスプレッドシート ( 図 5) にこれらの 15 のアミノ酸配列を伴うドナー対立遺伝子の対応する名前を含む表記列。Aa 残基の位置を含める追加の列が役立つことがあります
      3. 。
  5. 1.1.3 からの手順を繰り返します 1.3。 各 HLA の対立遺伝子 (すなわち、 A、B、C、DQA1、DQB1、DRB1 と DP) ドナーの 15 aa 短いシーケンスを派生するドナーと受信者のペアの。
    6. 。
  6. コピー ドナーのすべての対立遺伝子からすべての 15 aa シーケンスの長く連続的な列を作成するマスター ワークシートにすべての列を貼り付けると。(ペプチド配列) のドキュメント内の行の合計数を書き留めます
    7. 。

2。カスタム配列レイアウトおよび生産の設計

  1. 生成ペプチド シーケンス対応する対立遺伝子をスプレッドシート召し。配列 20 行があり、30 個の列と最大 20 × 30 = 600 を保持できるペプチドのスポット。ペプチドの記録の合計数に応じて、1 つの特定のドナーから 1.5 をステップし、劉 ら しようとした 2 つの例と私たちの過去の経験に基づきます。 17, 600 スポット配列は、〜 2 別の移植例から生成されるすべての系列を保持できます。
    1. 合理的計画最も eペプチド配列の 600 スポット形式内のセットに合わせて効率的な方法です
      2. 。
    2. 場合は以上 1 つのサブジェクトは 1 つの全体の配列に合うことができる、最初のドナー後に空行を挿入 ' 30 (配列の行にスポットの数) によって分けることができる行の合計数に合わせて s シーケンス
      3. 。
    3. シーケンスの最初のセットの最後の空行の直後移植症例からシーケンスの内容の全体の列に貼り付けます
      4. 。
    4. は、配列が満たされ、これ以上の場合は、600 点を超えることがなく追加できるまで、この手順を繰り返します。下部には、入力する空の行全体が残っている場合 " 移動 " 空の行で 2 つのドナー セット間に配置されます。この広い空きケース間ステップ 3.2 簡単に - 次の合成の完了後膜の切削加工になります。以下します
      5. 。
  2. 配列レイアウトのコンテキストでペプチッド シーケンスをプログラムします。スポット シンセサイザーのプログラムはテキスト形式のシーケンス (1 行 1 つペプチッド シーケンス)、直接対立遺伝子名、aa の余分な列を除いた単純なテキスト ドキュメントとして 2.1.4 ステップから結果のスプレッドシートを保存することによって得ることができます。位置 など).
    3. スポット シンセサイザーを介して
  3. 実行の自動化されたペプチッド配列合成。合成操作全体が Kudithipudi ら 21 の詳細です。2 つの配列の fmoc 保護合成は、4 〜 5 日
    4. 。

3。プローブと個々 の時系列から Reprobe 抗血清を用いた移植受信者

。

注: 600 スポット膜配列の寸法 〜 7 cm × 13 cm。合成後に、少なくとも 2 つは直接光から守られるとき年の配列を室温で乾燥膜として格納できます。繰り返し使用するため、長寿を維持するために膜の過剰な折りたたみを避ける

。
  1. エタノール膜配列を水分補給し、ペプチド スポット Ponceau S とステンド グラスを可視化
    1. Rehydrate 膜配列ペプチド李 ら に最適化された段階的な手順を運ぶ 24.
      1. 100% エタノール 20 mL に配列膜を浸漬します
        2. 。
      2. 追加 20 mL 蒸留水 50% エタノールの解決策を希釈し、15 分間室温でインキュベート
      3. 3 回 100% 水 40 mL に浸漬ソリューションを変更し、各時間 15 分を孵化させなさい
        4. 。
      4. など 3 回各 5 分の TBST (トリス緩衝生理食塩水 0.1%)、20 mL に、適切な作業バッファーで洗浄
        5. 。
    2. Ponceau S 染色合成ペプチドを視覚化する配列の
      1. ハイドレイトされた配列に直接前作り出された Ponceau S 溶液 20 mL を追加し、~ 30 インキュベート揺れで s
        2. 。
      2. ド背景 Ponceau S 色を染色する膜を連続的に蒸留実行水。過程で、赤い色のペプチド スポットが表示されます可能性があります
        3. 。
      3. は、個々 の場合に配列のセクション間慎重に切断することによって各ドナーの配列の一部を切り離します。各配列の向きをマークします
        4. 。
  2. 前ブロック配列。
    1. ブロック 20 ml 5% の膜、無脂肪牛乳 TBST バッファーに溶解します。この牛乳ベースのソリューションを解除 Ponceau S 色を染色さらに。ペプチドの明確なイメージを達成するために数回ミルク バッファーを交換します
      2. 。
    2. 記録のために、手持ちのカメラ (例 図 6) を使用して配列の Ponceau S イメージの写真を撮ます
      3. 。
    3. 5% 無脂肪牛乳 4 ° C 夜間、またはロッキング 2 時間室温で膜をブロックしたままです
      4. 。
  3. 移植血清加温配列
    。 注: それはする必要があります阻止帯として知られている現象を指摘や血清抗体分析における補体依存干渉からフック効果があります。この問題を回避するためにオプション血清前処理工程は、血清サンプルの EDTA または熱不活化といえます。
    1. ブロック バッファーを削除し、20 ml の TBST の膜を洗浄する 3 回次の日 5 分たびにします
      2. 。
    2. 追加の 20 μ L を 20 mL の 2.5% の受信者の粗野な血清の TBST バッファーでミルクし、室温で 2-3 h の膜と孵化します。注プロービングのこの初期のラウンドで、時系列の最後の移植後血清 (または可能性が高い最も感作血清) を使用まずをお勧めします。これはシリーズは、特に中古移植時点から以前の標本がある時間をかけて開発する傾向がある同種抗体の少ないさまざまな仮定に基づいています。このように、信号干渉の可能性 " 繰越 " ラウンドをプロービング間移植に対する免疫応答による本当に開発された alloantibody の反応性は明確に区別することができます
      3. 。
  4. TBST の 20 mL を使用して配列を洗浄し、二次抗体とインキュベートします。
    1. 3 回 10 分間膜を洗浄するたびにします
      2. 。
    2. 別 2 のための 1% のミルクを添加した TBST バッファー内の 1: 10,000 の希釈でヤギ抗ひと IgG HRP (西洋わさびペルオキシダーゼ) 二次抗体と加温
  5. 洗浄し、しみを開発。
    1. 10 分の tbst 3 回膜を洗浄するたびにします
      2. 。
    2. (1 分) の膜を開発する過酸化水素の溶液の 5 mL と混合強化実行化学発光 (ECL) たてルミノール溶液 5 mL を使用しています
      3. 。
    3. 視覚化 ECL 信号 (すなわち、 ChemiDoc イメージング システムや Azure C600)、適切な撮像素子を使用しています
      4. 。
  6. スキャンし、しみを定量化します。
    1. 開発のイメージ ( 図 7、下の画像) を保存し、スポットの強度の定量化を実行します
      2. 。

4。臨床のタイム シリーズにわたって抗血清の反応性を比較します

。
  1. ストリップの配列。
    1. この時点で、すべての回で濡れている膜を維持します
      2. 。
    2. は、20 ml 37 ° C、20 分、buffer の商業ストリップの孵化によって膜を除去し、3 回 10 分ずつの tbst 膜を洗い流し。ブロック (ステップ 4.2) とプロービング (4.3) のステップ別の時点で撮影した患者の血清を使用してを繰り返します
      3. 。
  2. ブロック除去膜
    。 注: 次の除去、膜は、時系列で同じ患者からの血清のプロービングの別のラウンド、再利用できます。
    1. 5% ミルク バッファーを使用する前に膜をブロック (3.2 を参照).
  3. Reprobe (3.3 3.6 から手順を繰り返します; 図 7、上の画像の例では) 同じ時系列データから異なる血清
    。 注: ストリップの配列は、別血清試料を reprobe するし使用できます。配列を除去し、そのパフォーマンスを失うことがなくサイクルを reprobing の最大 20 ラウンドの再利用できることを示したので、ペプチドが膜の支持のマトリックスに共役した、大します
    4. 。
  4. 配列の長期貯蔵。
    1. ストア TBS バッファー内膜は、防腐剤としてアジ化/w ナトリウム 0.02% を添加しました。長期保存用密閉されたビニール袋を使用します。少なくとも 2 年間は直接光からの保護の下で 4 ° C でウェット膜を格納できます
      2. 。

5。データ集録および解析

  1. 手動で肯定的な抗原ペプチドに注釈を付けます。
    1. 抗体陽性信号を示すスポットを見つけて、グリッド ポジションのそれぞれを確認します
      2. 。
    2. 肯定的なペプチドは、マスター ワークシートの対応する行を強調表示します
      3. 。
  2. マスター ワークシート ( 図 7 下部のリスト) に記載されているペプチド配列を取得します。1.4.1 の手順に記載されている設計の原則に従って。、隣接シリアル スポットが大幅に重複するシーケンスを共有 (15-4 = 11)、連続シリーズのペプチドによる反応性エピトープを共有可能性がありますしたがって。
    1. 連続した任意の肯定的なスポットを強調表示します
      2. 。
  3. シリーズの各ペプチドのエピトープの最小長さを決定します。
    1. 任意の潜在的共有エピトープ配列が重複する反応性ペプチドのセグメントに基づいてハイライトします
      2. 。
  4. 構造モデル抗原エピトープ。
    1. 取得のプロトタイプ HLA 結晶構造蛋白質構造データバンク、次から web リンク: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do です
      2. 。
    2. ソフトフェア (www.pymol.org からダウンロード) にプロトタイプ HLA 構造を表示します
      3. 。
    3. 地図 " またはモデル反応性ペプチド配列 ( 図 8) を強調することによって抗ドナー エピトープ プロトタイプ HLA 分子の 3 D 構造を発見しました。クリックして " 表示 "、" 背景 "、選択と " 白 "。行き、イメージを保存する " ファイル " と " の画像に名前を付けて " ファイル形式を選択し、" png ".
  5. 結果を報告し、対応する対立遺伝子に反応性エピトープを割り当てます
    6. 。
  6. 比較単一抗原ビーズ (SAB) の結果に結果を配列は、使用可能な場合します
    。 注: 単一の対立抗原を使用して SAB テスト HLA 蛋白質の固定パネルに向かって抗体反応を測定します。抗体反応を示す個々 のペプチドは、特定の HLA の対立遺伝子は、SAB パネルにも含まれている場合は SAB 結果と配列の直接比較を許可に属しています。ペプチドのエピトープは、お手元の全体的な反応性に大きく貢献することを示唆している結果の相関性の高レベルを示した私たちの以前の研究 17さらに、配列の結果はまた、特異性のアミノ酸レベルを明らかにします。 HLA 研究所から
    1. 取得 SAB の結果かどうかについての情報を提供して、ドナーの対立遺伝子が患者の血清、移植後に反応。ステップ 5.5 からの結果。配列に基づく分析も対応するドナー遺伝子 alloantibody 反応陽性に関する情報を提供します
      2. 。
    2. SAB の比較と配列の結果
      3. 。

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Representative Results

スクリーニング法17配列を使用して元の研究では、腎臓移植の 5 科目の合計を登録しました。入力結果の私達のコホートとはそれぞれのドナーの HLA を得た。自分の病歴や SAB テストから対立遺伝子の抗体価も私たちに利用できた。これらの 5 人の患者の私たちのパイロット研究で考案した 2 つの異なる方法論: ペプチドとカスタムされたパーソナライズされた配列の固定パネルから成る標準的な配列は、ドナーと受信者の各ペア。この後者のパーソナライズされたプロトコルがこの記事と動画のもので記述されている最初の方法は、技術的には個々 の移植の特異性の高レベルを達成するためにアレイ プラットフォームのパフォーマンスを検証することを許可されていた中、ドナー特異的抗体 (DSA) の包括的な検診は、しばしば貧しい移植結果5,25,26関連付けます。

パーソナライズされた配列が 5 例17の 2 つに適用された、メソッドの全体的なワークフローを説明するためここで我々 に焦点を当てるこれらの 2 人の患者 (すなわち PTN #4) の一つ。カスタム ペプチド配列を作るためのキー技術には、スポットのシンセサイザーが含まれます。膜 (図 1) の特殊派生の細胞外マトリックスに直接 fmoc 保護合成法を用いたペプチドは、完全に自動化されたロボット システムです。我々 は、個々 の臓器ドナーの HLA 系列から生成されるペプチドの大規模なセットをアセンブルするシンセサイザーの柔軟性を悪用しました。連続エピトープ「分割」と抗体の反応性を失う状況を避けるために十分なカバレッジを持つために我々 は 15 4 シリアル ペプチドの「ウォーキング」デザインに従って従ってすべてすぐに隣接するペプチド間の重複の 11 残基を =抗体のエピトープの典型的な長さをカバーするのに十分な常にシリーズ 4-9 aa の長さ (図 1) と推定されます。

テンプレート HLA シーケンスは EMBL-EBI (欧州バイオインフォマティクス研究所) で管理されるリポジトリ データベースから直接ダウンロードされました。たとえば、PTN #4 ドナーの hla-dqb1 * 03:01:01:01 対立遺伝子 (図 2の web ページ イラスト) で検索されました。併せて、我々 は個別にドナーの対立遺伝子の hla-dqb1 2 番目のシーケンスをダウンロード * 02: 自身、hla-dqb1 PTN #4 のそれらと同様、01:01、* 4:02 と * 5:01。多重配列アライメントを行った Clustal オメガの web 機能 (図 3) を使用します。生成された配置ファイルがすべて一致しないアミノ酸残基が同定されたから (図 4) を得られた (ドナーの残基が強調表示されます)。次に、我々 はテンプレート シーケンスのすべての彼の不一致の残基をカバーする十分が長かったドナー (下線部分) をマークしました。上記、ペプチドの 3 つのシリーズのようこれらのテンプレートのシーケンスと次の「ウォーキング」デザインに基づいて各 15 hla-dqb1 長さで aa が導出されました。ドナーの HLA-A、B、C、DQA1、DRB1 の対立の残りの部分にこのプロセスが繰り返された (DRA1 と DP は適切なカルテの都合により除外された) 彼の受信者の対応する対立遺伝子と比較して。最後に、合計 202 ペプチド PTN #4 移植後血清をプロービング用配列 (ペプチッド シーケンス図5 ワークシートおよび図 6に配列図) を作るために入隊したし、の結果を比較しました。彼の前の移植血清 (図 7) のそれに続く reprobing から得られる。202 のペプチドのうち 10 示した抗体信号の合計に関連付けられているどのドナー固有の残基 (受信者から不一致) 片移植後 HLA K197 W243、I306 E87 * 52:01、B * 52:01、- C * 3:04 と DQA1 * 5:01 があるように見えた抗体反応性 (図 7の赤い文字で示される残基) を扇動することに関与しています。

さらに、従来の SAB テストと比較して配列メソッドの主な利点の 1 つです、エピトープ情報を容易に取得できます、図 7に示すように、(劉らで別の配列の結果からすべての 5 人の患者の HLA DQA1 と DQB1 抗体反応性エピトープを比較しました。17) すべて DQA1 および DQB1 ヘテロダイマー (図 8) の共結晶構造にモデル化することによって。幸いに、β 1 鎖として知られている構造の顕著なセグメントは、5 ケース コホート、非常に高いチャンス (3/5 の患者 2,3,5) 同種移植の主題の間で抗体で対象とする「ホット スポット」です。

Figure 1
図 1.レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体を検出する抗原 HLA ベース配列メソッドの全体的なスキーム。(適応してから変更した劉ら17)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.データ リポジトリのウェブサイト
HLA シーケンスを取得する次の web サイトを参照してください: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
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Figure 3
図 3。複数の蛋白質シーケンス Clustal オメガ web ベースのツールを使用して受信者 hla-dqb1 対立遺伝子対ドナーの配置です。
患者 #4(PTN#4) DQB1 のシーケンスのコピーとペースト * 0201 と 3:01 とドナーの DQB1 * 4:02 と 5:01 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ に FASTA 形式で (イラスト、DQB1 * 5:01 PTN #4 と DQB1 の * 3:01 のドナーは、入力ボックスに表示されます).出力形式の「STEP2」で「Clustal w/数字」オプションを選択し、、配置を実行します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.比較ドナーと患者/受信者 HLA DQB1 およびペプチド合成用テンプレート シーケンスの選択。
ドナーのシーケンスは、太字、赤のフォントでドナー固有の不一致、またブラック ボックスで強調表示されます。(下線) ペプチドを派生するテンプレート シーケンスは、これらドナー固有の残基を含んでいます。(この図では、適応し、 Liuet アルから変更されました。17)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5.ドナー HLA ペプチドのスプレッドシートのマスター ワークシートの説明例です。
ペプチド配列の位置は、行と列の座標で示されます。ペプチド配列を使用して、ロボット スポット シンセサイザーを使用して合成をプログラムします。(受信者の対応する対立遺伝子からの不一致) ドナー固有残基は太字で強調表示されている、下線します。全長 hla-dqb1 シーケンスに対応するペプチドの開始および終了位置が示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6.配列セクションのイメージが Ponceau S. のステンド グラス
すべてのスポット エリアの間でペプチド濃度が同じペプチド、間のアミノ酸組成の違いによる色の明るさの格差を注意してください。(画像は例示例では、この実際の研究からのものではない) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7.ドナー-特定の HLA A、B、C、DQ、PTN #4 で一致しないエピトープの DR 配列研究。
シリアルのペプチドは、一致しない残基 (図4 DQB1 例) をカバーするドナーのシーケンスから派生しました。配列は移植後血清をプローブに使用された (下のしみ: ポスト テキサス州)、その後移植前血清 (上部のしみ: 前テキサス州) 同じ患者から。移植後プロービングから強力なスポットの 4 つのセットは (下のしみ) の赤い線でマークされて、血清が (上の汚点) では青い線でマークされてのみ関連付けられていた 2 つの中型の強度スポット事前移植中。下の表からは移植後血清に反応性が、ペプチド配列に対応です。ドナー固有 (一致しない) 残基のそれぞれの対立遺伝子の K197 W243、I306 E87 は赤い文字で、強い抗体反応性を示すペプチドは太字フォント。この図は適応され、劉らから変更17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8.HLA DQ 抗原構造の場所。
HLA DQ8 の共結晶構造は、テンプレートとして使用されました。構造は DQA1 および抗原ペプチド(A)と DQB1 サブユニットで構成されていた。Α-ヘリックスと β 鎖タンパク質の二次構造は、パネル(B)で表示されます。いずれかの 5 つの血清と反応した DQA1 および DQB1 ペプチド共結晶構造に位置していた ( AとB: 青の網かけ)。3 つの β ストランド、β 1、β6、β12 (紺b)、複数のペプチド (短い赤い線 DQA1 のリニアの aa の位置に対応する)、によって表されるそれぞれは複数患者サンプル (劉ら元の結果と反応しました。17). すべて 6 DQB1 ペプチド (太字) #5 #3 #2 患者の抗体に反応は β 1 の「ホット スポット」セグメントにある ( b: 赤い矢印で指摘した)。この図は劉らから適応されました。17.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明した点配列の設計は alloantibody 移植臓器のドナーの HLA 抗原に対する特異性に関する実験的研究。クリニックで広く使われる既存の SAB アッセイと対照をなして抗原配列方法個々 のドナーの真の HLA シーケンスに対応できる柔軟性のあるデザインの主要な利点があります。新しいプラットフォームをあいまいさ16,27せず正確な HLA allelic シーケンス測定値を生成することが間もなく急速の DNA 解析技術のポテンシャル、指定されたデータベースの潜在的なを悪用します。リポジトリの HLA 系列15世界の人口の。私たちの現在の配列スクリーニングのプロトコルを移植血清のいくつかのパイロット研究の成功をベースに開発されました。ここで我々 はこの段階で、プロトタイプの配列が臨床診断アプリケーションのための研究使用のためにのみ構築されることを強調すべき。

SAB と抗原配列の別の注目すべき違いは、後者が alloantigenicity18 に関する貴重な情報を提供することが、HLA シーケンスの 15 aa セグメント内で潜在的な抗原エピトープを区別するために解像度を高く.ただし、その折り畳み構造を適応する全体蛋白質の抗原を提示する SAB とは異なり抗原配列のみ組み込まれています短いペプチッド、折り畳み式の立体構造についての情報を除外します。したがって、配列のみ立体配座のエピトープを認識する抗体を検出できない、いくつかは抗体による拒絶反応28,29に関連するすべての機能性エピトープの大半を構成すると信じて。それでも、他のコンテキストでそれらのペプチドなどの線形のエピトープに対する抗体行動はウイルス抗原応答で悪用されているし、ワクチンの設計30,31。我々 も注意してください、患者試料の限られた数、配列の検出感度性能 SAB の超過の臨床進行中17早くドナー特異的抗体の検出が可能抗体関連型拒絶反応。これはお手元と比較するとアレイのローカル抗原ペプチドの高モル濃度のため、します。抗体関連型拒絶反応の臨床的および病理学的証拠が明らかに私達を示した以前17間 SAB 反応検出されない場合、この機能は場合に特に役立ちます。しかし、パーソナライズされたこのテストは標準の SAB テストよりも時間がかかることを指摘することが重要です。抗原ペプチドの設計を開始する前に、オルガンと (提案) 受信者のドナーの HLA シーケンスを取得テストの配列が必要です。これで、配列と抗体の結果を得るための別の 7 〜 8 時間を生成するいくつかの日。したがって、時間のかかる手順は適していません死体ドナーによる臓器移植のため抗体検査の主な目的は、移植前の評価ではなく、移植、ドナー特異的抗体の出現を決定する限り、既存の抗体。

アレイ法は、抗原エピトープを検出するに既存の SAB テストから大幅に改善を持っていた。さらに、5 の移植患者における反応性エピトープを HLA DQ、17の 5 人の患者のうち 3 人に発生したその β 1 鎖で少なくとも 1 つの顕著な「ホット スポット」エピトープを指摘した我々 のテンプレート構造にマップする試みをしました。興味深いことに, HLA DQA1 および DQB1 の β 1 鎖、抗原提示凹 (図 8)、移植拒絶反応32のコンテキストで抗原性が知られている場所の溝にあります。したがって、拡張移植コホート研究でパーソナライズされた抗原配列手法の将来の探査が HLA 分子の抗原のホット スポットに貴重な洞察力をもたらすことを期待しています。これら特定のホット スポット、将来ドナーと受信者間の HLA 遺伝子の高精度 DNA シーケンスの入力と併せて考慮するときのカタログは最終的に許容ミスマッチ プログラムを通して事前移植決定を支援します。33, より効果的にカタログ化されたホット スポットの近くのある不一致を避けるためのもの。

要約すると、抗原配列特定の抗 HLA 同種抗体の検出のための好みのデザインの探求に当社オリジナルの研究17は、その種の最初だった。研究の焦点は、配列設計と実装は、潜在的な将来の技術のためのプロトタイプとして役立ったの可能性だった。私たちのパイロット研究は、有望な臨床検体からの結果を生成するだけでなく、また全体的なコストとテストの速度を見積もることができました。私たちの現在の実験室の設定で 1 つのパーソナライズされたアレイの生産コストは下 reprobing サイクル性能の損失なしの最大 20 ラウンドに時間をかけて、配列を使用してできるので 1 回分の料金は、$1,000 米ドル、です。移植対象の広範なコホートでアレイ プロトコルの追加テストが 1 日は、臨床で使用できるメソッドをさらに合理化することが可能です。

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Disclosures

利害の衝突が宣言されていません。

Acknowledgments

我々 に感謝夫妻ショーン李とスポットでそのような支援のためにカナダの西部大学の興李アレイ生産。サンプル サービスを提供する組織適合性コア、北西の包括的な移植センターの大学スタッフに感謝しております。この作品は、補助ノースウェスタン メモリアル ボード ホスピタル、JJ にノースウェスタン大学によって提供される学部スタートアップ資金、部分的にサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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