Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

Abstract

השתלת איברים, הפונקציה ואריכות ימיהם של השתל באורח קשה להסתמך על ההצלחה של שליטה דחייה אימונולוגי תגובתיות נגד אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (הלע). הנחיות histocompatibility מבוססות על בדיקות מעבדה anti-הלע חסינות, המציג כמו קיימים גם או דה נובו שנוצר הלע נוגדנים המהווים מכשול השתלת הגדולות. בדיקות הנוכחי בנוי על פלטפורמה חרוזים יחיד-אנטיגן (SAB) באמצעות סט קבוע של אנטיגנים שנבחרו מראש ~ 100 הלע רקומביננטי כדי לחקור להשתלות סרה. עם זאת, אצל בני אדם קיימים מגוון גדול של סוגי הלע, עם אין שני אנשים שאינם תאומים זהים אשר יכולים לשתף אותו צירוף של רצפי הלע. ואילו טכנולוגיות מתקדמות הלע הקלדת ורצף ישירה בדיוק יכול ללכוד כל אי-התאמות ברצף ה-DNA בין תורם הלע של הנמען, וזמינותו SAB, בשל מגוון מוגבל בייצוג רצף, אין אפשרות לזהות במדויק alloantibodies ובמיוחד נגד התורם הלע התאמות. אנחנו ביקשו לפתח שיטה משלימים באמצעות טכנולוגיה שונים כדי לזהות ולאפיין התורם נגד נוגדנים הלע על בסיס אישי. הכלי ההקרנה הוא מערך פפטיד מותאם אישית של התורם נגזר הלע רצפי דורשים בדיקה שלאחר ההשתלה סרה של הנמען איברים כדי להעריך את הסיכון לדחייה בתיווך נוגדנים. על מערך יחיד עבור זוג התורם-נמען אחד, עד 600 פפטידים ייחודי מתקבלות של התורם הלע חלבון רצפים, כל פפטיד נושאת משקעים שאינם תואמים אחד לפחות ברצף חומצה אמינו 15. בניסויים הטייס שלנו כדי להשוות בין אנטיגן תבניות עבור קדם והשתלות שלאחר סרה על מערכים אלה, היינו מסוגלים לזהות אנטי-הלע אותות עם הרזולוציה המתאימה גם מאפשרת לנו לאתר את epitopes החיסון המעורבים. אלה אישית אנטיגן מערכים לאפשר זיהוי ברזולוציה גבוהה של epitopes הלע תורם ספציפי בהשתלת איברים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איברים טיפול זה מבוצע באופן שגרתי ברחבי העולם הציל חייהם של מיליוני אנשים. השתלת איברים מוצקים מתרחשת בחולים כ-100 לכל מיליון אנשים בארה ב מדי שנה, בעוד מספר גדול עדיין נמצאים על waitlists לקבל תורם איברים עקב מחסור חמור האספקה (על פי המידע הנמסר על ידי איבר המין השתלת רשת - OPTN/בוועדה ורכש: optn.transplant.hrsa.gov). איברים להשתלות הוא מאוד מווסתות על מנת לצמצם בזבוז איברים, להציל חיים, אבל בכלים מדעיים נהגו ליידע את התקנות האלה מוגבלים היעילות. למשל, הקהילה המדעית מזהה באופן מלא ארצות רב-צורתיות מאוד של מולקולות הלע, בדיקות גנטיות מדויק של ה-DNA באמצעות הקלדת ברזולוציה גבוהה המבוססת על רצף הקלדה (SBT) פותחו בשנים האחרונות1, 2. עם זאת, שיטות בדיקה alloantibody טרם מסוגל לייצר במגוון עצום של רצפים הלע נפרדים כמו אנטיגן הגששים. במבחן סטנדרטי כיום משתמשת לוח מחזוריים של אנטיגנים allelic ~ 100 זה המורכב מעובדים וריאציות נפוצות של הלע, A, B, C, DQ, DP וד ר רצף אוכלוסיות האדם3,4,5,6. לעתים קרובות, רצפים הלע של התורם בפועל אינם כלולים בלוח של הבדיקה, מכריח ההשתלות לרופאים ומנתחים להסיק תגובתיות תורם ספציפי המבוסס על קווי דמיון משותפים בין רצפים בפועל של התורם המתאים "תקני" מבחן להגדיר7,8. כתוצאה מכך, זה לפעמים מאתגר לבצע אומדן אמין של דחייה סיכון לפי נוגדנים בדיקת תוצאות9,10,11,12. לכן, חדש באופן אישי בדיקות הניתנות להתאמה אישית עבור alloantibodies הן בדחיפות13,14.

הגנים הלע לקודד histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) קולטנים יש פונקציה מפתח תגובות חיסוניות6. הלע גנים ידועים להיות הגנים רב-צורתיות ביותר של הגנום האנושי6. בשל התקדמות מהירה ב- DNA רצף אסטרטגיות על הגנים הלע, גרסאות חדשות allelic (או פשוט המכונה אללים) מתגלים בגיל קצב נפץ15,16. על ידי 2017/03, אללים המאומת 16,755 היה הופקדה למסד הנתונים של IMGT/הלע (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), של אילו 12,351 היו של הכיתה, 4,404 היו של class II קבוצות. בניגוד מוחלט, רק קצת יותר מ-100 אללים שונים מיוצגים וזמינותו אנטיגן יחיד רגיל חרוזים (SAB), אשר משמש באופן שגרתי כדי לזהות alloantibodies השתלת איברים. השיטה SAB בנוי על פלטפורמה Luminex באמצעות cytometry זרימה. מאז וזמינותו מנצל ערכה מחזוריים של אנטיגנים, מלבד קטין variabilities אצווה כדי אצווה בייצור, הבדיקה נסיוב החיסון יכול להיות robustly סטנדרטית על פני יחידים ועל -פני מעבדות5. עם זאת, במבחן זה אין אפשרות ללכוד כל alloantibodies שפותחה במיוחד כנגד אללים התורם, במיוחד כאשר רצפי התורם נעדרים מתוך SAB הגדר. ייצור מותאם אישית של אנטיגנים התורמים המבוססת על רצף נכון אמנם רצוי, נותרו אתגרים טכניים ייעול הייצור הדרושים ובדיקות הליכים.

אנחנו לאחרונה תיאר מתודולוגיה חלופי במחקר היתכנות של השתלת כליות נושאים17. השיטה להשתמש פפטיד אנטיגנים בתבנית המערך דורשים בדיקה מראש, שלאחר ההשתלה סרה של נושאים בודדים. כל המערך היה מותאם אישית נבנה באמצעות נקודה סינתזה שיטת18,19,20,21,22,23 שמייצר פפטיד אנטיגנים, כל 15 חומצות אמינו אורך, לחלוטין המבוסס על הלע אללים התורם איברים בהתאמה של A, B, C, DQA1, DQB1 ו DRB1. סינתזה ספוט מופעל על קרום תאית באמצעות Fmoc-כימיה תקן22 והוא יכול לייצר מאות פפטידים מותאם אישית במקביל מערכת רובוטית אוטומטית לחלוטין19,21. המערך קרום יכול לעמוד מספר סבבי בנוכחות אחר, reprobing מחזורי. מחקר רטרוספקטיבי שלנו17, הבחנו שינויים בדפוסי אנטיגן עם אנטיגן להשתלות מאוחסנות שנאספו בסדרה זמן (קרי, לפני ואחרי השתלת). במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול טכני עבור זרימת העבודה כולל מערך עיצוב, ייצור, חיטוט בנסיוב וניתוח התוצאות. השיטה מיועדת לגילוי alloantibodies נגד epitopes ליניארית ספציפי על הלע מולקולות השתלת התורמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן הלוח מוסדיים סקירה (פרוטוקול IRB #: STU00104680). זרימת עבודה הכוללת של הפרוטוקול מודגם באיור 1.

1-ניתוח Bioinformatic של התורם ואת המטופל הלע רצפים

  1. לאחזר רצפים ממסד IMGT/הלע 15.
    1. הלע לקבל דוחות הקלדה של התורם איברים וגם הנמען שלו.
      הערה: ודא הליכים ראוי להגן על סודיות הרישומים הרפואיים מנוצלים. בדרך כלל, נדרש אישור לוח סקירה מוסדיים (IRB) של פרוטוקול המחקר או את הבדיקה הניסיונית לכל המוסדיים הנחיות IRB. אם הלע דוחות מבוססי ה-PCR הקלדה (של רזולוציה גבוהה או נמוכה) או מבוססי רצפי הקלדה (SBT), עבור ישירות אל שלב 1.1.3. אם רצפים, התקבלו רצף גנומית/הלע, ואם הם להשלים, השתמש רצפי אלה ישירות. לעיתים, כאשר הושלמו רק בהקלדה או רצף תוצאות זמינים, בצע בצעד הנוסף 1.1.2. כדי להקצות " חסר " אללים באמצעות הכלי באינטרנט שמתואר בשלב 1.1.2.
    2. פתח השילובים אלל רב-משמעי בעקבות אינטרנט קישור - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, וחפש באמצעות “ רב-משמעי בכלי החיפוש של שילובים אלל ” פונקציה כדי לאחזר את אללים היפותטי. לאחר מכן, המשך לשלב 1.1.3. כדי להזין את השם אלל.
    3. פתח את הטופס שאילתה אלל IMGT/הלע במקומות הבאים קישור האינטרנט - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html ונושא קלט ’ s אלל שמות (כל אחד בנפרד, כפי שמוצג באיור 2) לתוך “ חיפוש עבור ” התיבה. לחץ על “ חיפוש של אללים עכשיו ” לחצן. הלע אלל שמות צריך להשתמש במערכות למתן שמות סטנדרטי (כלומר A *, א * 01, A * 01:01:01:01, וכינוים כל הקודם כמו A * 01010101).
    4. למצוא את השם אלל תואמות המוצג על המסך. לחץ על לחצן אלל.
    5. להעתיק " חלבון רצף ", והדבק אותה לתוך מסמך טקסט מתחת לשורת הכותרת " > אלל שם ". ביעילות, הוא מסמך טקסט בתבנית FASTA (מהיר-כל) של השם אלל, רצף.
  2. לבצע מבוסס-גנים מרובים במערכים של אללים תורמים, נמען/החולה. ג'ין
    1. אחד (קרי, DQB1 * 03:01:01:01) בכל פעם, להעתיק ולהדביק כל ארבע אללים של תורמים, החולה FASTA הרצף (שני מהתורם) ושניים מן המטופל לתוך מסמך טקסט משולב. בנקודה זו, חשוב לציון באופן שונה התורם אלל בשמות משמות אלל החולה (אפשרויות כוללות שימוש דיפרנציאלי העליון לעומת מקרים התחתונה; או ליצור סיומת קידומת או סיומת הבחנה לכל שם אלל בנפרד לסמן התורם vs. החולה אללים). סדר קלט של הרצף אינה חשובה כי בעקבות יישור הצו גרר בהתאם לרמות של דמיון בין כל זוג של רצפים.
    2. העתק והדבק רצפי FASTA לעצב (כפי שנראה באיור 3) מלמעלה לתוך “ להזין את רצף הקלט ” תיבת באתר אומגה האשכול: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. לחץ על " להגיש את העבודה שלך " באמצעות ההגדרות הרגילות של פרמטרים: כגון " PROTEINŔ, " Clustal עם מספרי ". לבצע יישור על-ידי לחיצה על " שלח ". ישור של הרצף ארבע מוצג על המסך ( איור 4).
  3. לסמן תורם ספציפי אי-התאמות.
    הערה: במיוחד יצוין כי הרצפים allelic שניתנו כאן היו מבוססות על תוצאות הלע להקליד, לא רצף. לכן, אין סיכון רצף הרלוונטיים וריאציה בזוג התורם-נמען מסוים עשויים לפספס. אפשרות לפתור בעיה פוטנציאלית זו יותר, יותר מרכזי השתלות לאמץ הקלדת ברזולוציה גבוהה מדויקת ולכוון רצפי DNA.
    1. העתק, הדבק את הטקסט יישור לתוך מסמך טקסט, ליצור מסמך חדש. אם התבנית של הקובץ מיושר מופר, לתקן את התבנית על-ידי שינוי סגנון הגופן ואת גודל: תמיד להשתמש " Courier New " גופן בגודל קטן כדי להתאים את השורות. שמור את המסמך לאחר יפתרו את בעיות העיצוב.
    2. לבדוק ידנית את רצפי מיושר לזהות את כל שאריות לא תואמת באופן ייחודי שייך התורם. לסמן את כל שאריות אלו תורם ספציפי באמצעות צבע גופן הבחנה.
    3. למתוח קו תחתון תחת כל האותיות בקטע התורם ' s רצף זה להרחיב את שאריות 14 שניהם למעלה – ומחושבים במורד הזרם של אי התאמות מסומן תורם ספציפי (כמו 15 פפטיד חומצת אמינו מינוס 1 שאריות לחוסר ההתאמה).
  4. להפיק 15-מר פפטיד רצפי סדרות חופפים.
    הערה: הסיבה לבחירת 15-מר פפטידים היה מבוסס על הידע הכללי של טיפוסי epitopes להיות 4-9 חומצות אמינו אורך. לכן, כאשר אנחנו מוחלים " החלון נע " הליך עם גודל צעד של חומצות אמינו 4 ( איור 1), הבחירה שלנו באורך 15 חומצת אמינו נשארו 15-4 = 11 חומצת אמינו חפיפה בין כל פפטידים שכנות בסדרה. בתיאוריה, חפיפה 11 חומצת אמינו זו מספיקה לכסות כל מערכת החיסון epitopes של עד 9 חומצות אמינו אורך, כך epitope לא יהיה בטעות " לפצל " לשניים רק חלקי רצפים במערך.
    1. להשתמש רצפי בקו תחתון את תבניות להפיק ברצף קצר 15 רצפי חומצות אמינו בסדרה חופפים על ידי שאריות 4 בין כל שני סיקוונסים ומייד בסמוך בסדרה.
    2. העתק והדבק רצפי חומצות אמינו 15 אלה לתוך גיליון אלקטרוני ( איור 5) בתבנית עמודה מלווים בסימון עמודות הכוללות לשמות המקבילים של אללים התורם. עמודה נוספת כדי לכלול שאריות aa עמדות עשויה להיות שימושית.
  5. חזור על השלבים מ 1.1.3. כדי 1.3. עבור כל אלל הלע (קרי, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 ו DP) של התורם, הזוג הנמען להפיק את רצפי קצר aa 15 של התורם.
  6. העתקה והדבקה של כל העמודות לתוך גיליון אלקטרוני מאסטר כדי ליצור עמודה מתמשך זמן רב של כל הרצף aa 15 מתוך כל אללים התורם. תרשום את המספר הכולל של שורות (עבור הרצפים פפטיד) במסמך.

2. תכנון מותאם אישית מערך פריסת הייצור

  1. צור גיליון אלקטרוני של רצפי פפטיד עם אלל המתאימים אציליים. המערך כולל 20 שורות ועמודות 30 והוא יכול להכיל עד 20 x 30 = 600 מקומות פפטידים. בהתאם למספר הכולל של פפטידים טלקוה צעד 1.5 מתורם מסוים אחד, המבוסס על ניסיון העבר עם שתי דוגמאות זה ניסינו ליו ואח. 17, המערך ספוט 600 יכול להכיל את כל רצפי שנוצר מ ~ 2 ההשתלות נפרד מקרים.
    1. לתכנן בצורה הגיונית ביותר eדרך fficient כדי להתאים את ערכות של פפטידים בתוך הפורמט 600-ספוט של המערך.
    2. אם נושא אחד או יותר יכול להתאים לתוך מערך שלם אחד, להוסיף שורות ריקות לאחר התורם הראשון ' s רצפים כדי להתאים את המספר הכולל של שורות ניתן לחלק לפי 30 (מספר המקומות בשורה במערך).
    3. מייד לאחר השורה הריקה שעבר על הקבוצה הראשונה של רצפים, הדבק העמודה כולה רצף תוכן מהתיק ההשתלה השניה.
    4. חזור על שלבים אלה עד במערך מלא, אין עוד מקרים יכולים להתווסף מבלי לחרוג המקומות 600. אם שורות ריקות שלמות נותרו כדי למלא בתחתית, " להעביר " השורה הריקה למקם בין התורם שתי קבוצות. זה נותר בין המקרים שטח רחב גורם חיתוך של קרום לאחר סיום של הסינתזה יותר קל - בעקבות צעד 3.2. מתחת.
  2. לתכנת את פפטיד רצפים בהקשר של פריסת מערך. התוכנית של סינתיסייזר המקום לוקח תבנית טקסט של הרצף (שורה אחת אחת פפטיד רצף), אשר ניתן לקבל ישירות על-ידי שמירת הגיליון המתקבל משלב 2.1.4 כמסמך טקסט פשוט (ללא עמודות נוספות לשמות אלל, aa עמדות וכו).
  3. סינתזה
  4. בניהול מערך פפטיד אוטומטית באמצעות סינתיסייזר המקום. כל הפעולה של הסינתזה מפורט Kudithipudi et al. 21. שימו לב כי Fmoc סינתזה של שני מערכים לוקח ~ 4-5 ימים.

3. החללית ואת Reprobe אנטיגן מסידרה זמן של הפרט השתלת הנמען.

הערה: המערך 600-spot ממברנה יש את הממדים ~ 7 ס"מ x 13 ס"מ. לאחר הסינתזה, מערכי של ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר כמו ממברנות יבשות לפחות 2 שנים כאשר מפני אור ישיר. למנוע קיפול מוגזמת של קרום כדי לשמר את תוחלת החיים שלה לשימוש חוזר.

  1. נוזלים המערך קרום עם אתנול והמחש כתמים פפטיד צבעונית עם צבע מאכל פונסו ס מערך
    1. נוזלים הקרום נושאת את פפטידים בעקבות הליך stepwise אופטימיזציה ב- Li. et al. 24.
      1. לטבול את הקרום מערך ב- 20 מ ל 100% אתנול.
      2. הוסף 20 מ"ל מים כדי לדלל את הפתרון 50% אתנול, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות מזוקקים
      3. לשנות את הפתרון טבילה 40 מ ל 100% מים שלוש פעמים וגם דגירה 15 דקות בכל פעם.
      4. שטיפת במאגר ראוי לעבוד, למשל, 20 מ של TBST (טריס באגירה תמיסת מלח עם 0.1%), שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    2. צבע מאכל פונסו S מכתים של המערך להמחיש peptides סינתטי
      1. להוסיף 20 מ של פתרון S צבע מאכל פונסו ניסח מראש ישירות המערך רטוב, תקופת דגירה של ~ 30 s ברעידות.
      2. בניהול מזוקקים מים באופן רציף על פני קרום מבטל את כתם צבע מאכל פונסו S צבע רקע. במהלך התהליך, פפטיד כתמים של צבע אדום עשוי להיות גלוי.
      3. להפריד בין חלקיו של המערך עבור כל תורם על ידי חיתוך בזהירות בין המקטעים של המערך במקרים בודדים. לסמן את הכיוון של כל מערך.
  2. מערך לחסום מראש.
    1. לחסום הקרום ב- 20 מ של 5% שומן חלב מומס מאגר TBST. פתרון זה מבוסס על חלב עוד יותר מבטל את צבע מאכל פונסו S צבע הכתם. להחליף את המאגר חלב מספר פעמים על מנת להשיג את התמונות פפטיד הברור ביותר.
    2. למטרות שמירת רשומות, לצלם תמונה של תמונת צבע מאכל פונסו S של המערך בעזרת מצלמה ידניים (למשל איור 6).
    3. ממשיכים חסימה של הקרום בחלב דל שומן 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם נדנדה.
  3. Incubate מערך עם השתלת נסיוב.
    הערה: זה צריך להיות ציין כי תופעה הידועה prozone או האפקט הוק העלולות לנבוע הפרעות המשלים תלוית בניתוח נוגדנים בסרום. כדי לעקוף בעיה זו, צעד pretreatment סרום אופציונלי יכול להיחשב עם איון או EDTA או חום הדוגמאות סרום.
    1. להסיר חסימה מאגר ולשטוף את הקרום עם 20 מ של TBST שלוש פעמים ביום המחרת עבור 5 דקות בכל פעם.
    2. µL להוסיף 20 של הסרום גולמי של הנמען 20 מ ל 2.5% חלב במאגר TBST, דגירה עם הקרום במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. שימו לב כי בסבב הראשוני הזה של חיטוט, מומלץ כי סרום שלאחר ההשתלה שעברה (או סרום סביר ביותר sensitized) בסדרת הזמן משמש קודם כל. זה מבוסס על ההנחה כי דגימות קודמות בסדרה, בעיקר מן נקודות הזמן שלפני ההשתלה, יש פחות מגוון alloantibodies הנוטים לפתח עם הזמן. בדרך זו, כל אפשרות של הפרעה לאותות מן " carry-over " בין חיטוט סיבובים יכול להיות ההלניסטי alloantibody האמיתית המתפתחת תגובתיות עקב תגובות מערכת החיסון נגד השתל.
  4. דגירה עם נוגדנים משניים וקונטה המערך באמצעות 20 מ של TBST.
    1. לרחוץ את הקרום שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
    2. Incubate עם עז נגד IgG-HRP (חזרת peroxidase) נוגדנים משניים-דילול 1:10,000 במאגר TBST בתוספת חלב 1% עבור ה 2 אחר
  5. שטיפת ולפתח את האבן החשופה.
    1. לרחוץ את הקרום שלוש פעמים עם TBST 10 דקות בכל פעם.
    2. Chemiluminescence בצע משופרת (ECL) באמצעות 5 מ של פתרון הלומינול טריים מעורבבים עם 5 מ ל תמיסה לפתח הקרום (עבור 1 דקות).
    3. ECL להמחיש אותות באמצעות של imager מתאימים (קרי, מערכות הדמיה ChemiDoc או תכלת C600).
  6. סרוק ולכמת את האבן החשופה.
    1. להציל את התמונות המפותחות ( איור 7, תמונה נמוכה יותר) ולבצע כימות עוצמת ספוט.

4. משווים בנסיוב תגובתיות בין סדרה זמן קליני.

  1. להפשיט את המערך.
    1. בנקודה זו, לשמור על קרום רטובה כל הזמן.
    2. להתפשט הקרום על ידי המקננת עם 20 מ של מאגר הפשטת מסחרי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. ואז אני חוזר את החסימה (שלב 4.2) ואת השלבים (שלב 4.3) החקרנית באמצעות נסיוב שונה של המטופל נלקח בנקודת זמן שונות.
  2. בלוק הפשיטו ממברנה.
    הערה: בעקבות להתפשט, הקרום חוזר לסיבוב נוסף של חיטוט של נסיוב שונה מן המטופל אותו בסדרה זמן.
    1. לחסום את הקרום באמצעות מאגר חלב 5% כמו קודם (ראה שלב 3.2).
  3. Reprobe של נסיוב שונה מאותה הסדרה זמן (חזור על שלבים מ- 3.3-3.6; בדוגמה באיור 7, התמונה העליונה).
    הערה: המערך הפשיטו יכול לשמש לאחר מכן כדי reprobe היכנס סרום. מאז פפטידים נמצאים covalently מצומדת למטריקס התומכים של הקרום, הראינו כי המערך ניתן להשתמש בהם עבור עד 20 סיבובים של בנוכחות אחר, reprobing מחזורי מבלי לאבד את perfo שלהrmance.
  4. אחסון לטווח ארוך של מערכי.
    1. חנות הקרום במאגר TBS בתוספת 0.02% אזיד הנתרן w/w כמו משמר. להשתמש בשקית פלסטיק אטומה לאחסון לטווח ארוך. ב 4 ° C תחת הגנה מפני אור ישיר, קרום רטוב ניתן לאחסן במשך לפחות שנתיים.

5. חדרי קירור והקפאה וניתוח

  1. באופן ידני ביאור פפטידים אנטיגן חיוביות.
    1. לאתר נקודות מציג אותות נוגדנים חיובי ולקבוע את כל העמדות ברשת שלהם.
    2. לסמן על השורות המתאימות של גליון העבודה הראשי עבור פפטידים חיובי.
  2. לאחזר רצפים פפטיד ברשימה גליון העבודה הראשי ( איור 7, הרשימה התחתונה). על פי עקרון העיצוב המתוארים שלב 1.4.1., כתמים טורי שכנות לשתף חופפים באופן משמעותי רצפים (15-4 = 11), ולכן תגובתי epitopes עשוי להיות משותף על ידי פפטידים בסדרה רצופים.
    1. לסמן מספרים חיוביים המתרחשים ברצף.
  3. לקבוע אורך epitope מינימלי עבור כל פפטיד בסדרה.
    1. סימון כל רצפי epitope שעשויות להיות משותף המבוסס על חפיפת מקטעים של פפטידים תגובתי.
  4. מבנית דגם אנטיגן epitopes.
    1. להשיג אב טיפוס הלע קריסטל מבנים מן בנק מידע החלבונים נמצאו במקומות הבאים קישור האינטרנט: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. להציג את האבטיפוס הלע מבנה Pymol (הורד מ- www.pymol.org).
    3. מפה " או דגם גילה התורם אנטי epitopes למבנים תלת-ממדי של מולקולות הלע אב-טיפוס על-ידי הדגשת הרצף פפטיד תגובתי ( איור 8). לחץ על " תצוגה ", ואז " רקע ", ובחר " לבן ". כדי לשמור את התמונה, ללכת " קובץ " ואת " שמור תמונה בשם ", בחר את תבנית הקובץ " png ".
  5. לדווח על תוצאות והקצה epitopes תגובתית אללים התואם.
  6. השווה מערך תוצאות על פי התוצאות יחיד-אנטיגן חרוזים (SAB), אם הוא זמין.
    הערה: הבדיקה SAB באמצעות אנטיגנים allelic יחיד מודד נוגדן תגובתיות לקראת פאנל קבוע של חלבונים הלע. פפטידים בודדים המראים נוגדן תגובתיות שייכים מסוים אללים הלע זה, אם כללה גם בחלונית ' שבת ', מאפשרות השוואה ישירה בין המערך לבין התוצאות SAB. המחקר הקודם שלנו 17 הראו רמה גבוהה של מתאם בין התוצאות, רומז כי epitopes פפטיד באופן משמעותי לתרום תגובתיות הכללית של SAB. בנוסף, התוצאות מערך חושפים גם רמות חומצת אמינו היחודיות.
    1. קבל SAB תוצאות מהמעבדה הלע אשר מספק מידע המציין אם, אילו אללים התורם תגובתי שלאחר השתלה סרה של המטופל. תוצאות שלב 5.5. בהתבסס על המערך ניתוח גם לספק מידע בנוגע אללים התורם המתאים חיובי עבור תגובתיות alloantibody.
    2. ית SAB להשוות תוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במחקר המקורי באמצעות המערך הקרנת שיטת17, אנחנו נרשם סכום כולל של 5 נושאים השתלת כליה. . השגנו את הלע הקלדת תוצאות של עמיתינו ושל תורמים המתאימים שלהם. נוגדנים allelic titers מבדיקות SAB וההיסטוריה הרפואית שלהם היו גם בפנינו. במחקר פיילוט שלנו מהחולים הללו 5, המצאנו שתי מתודולוגיות שונות: מערך רגיל המורכב פאנל קבוע של פפטידים ומערכים אישיים שהיו מותאמים אישית שנעשו עבור כל זוג התורם ואת המטופל. בעוד השיטה הראשונה איפשר לנו לאמת טכנית את הביצועים של פלטפורמת מערך בהשגת רמות גבוהות היחודיות של השתלות בודדים, פרוטוקול מותאמים אישית עבור שיטה זו האחרון המתואר במאמר זה ווידאו מיועד להקרנה מקיף של נוגדנים ספציפיים התורם (DSA), אשר לעיתים קרובות לתאם עם שתל עני תוצאות5,25,26.

מערכי אישית של הוחלו על שניים מתוך חמישה מקרים17, הממחישות את זרימת העבודה הכללית של השיטה, כאן אנחנו להתמקד אחד מהחולים הללו שני (כלומר ניידת #4). הטכנולוגיה מפתח עבור ביצוע מערך פפטיד מותאם אישית כרוכה סינתיסייזר של המקום. זה מערכת רובוטית אוטומטית לחלוטין פפטידים באמצעות סינתזה Fmoc ישירות על גבי מטריצה הסלולר במיוחד נגזר על קרום (איור 1). נוכל לנצל את הגמישות סינתיסייזר להרכיב קבוצות גדולות של פפטידים שמקורם הלע רצפים של תורמי איברים בודדים. על מנת לקבל כיסוי מספיק כדי למנוע מצב בעת epitope רציפה להיות "מתחלק" ומאבד נוגדן תגובתיות, עקבנו אחר עיצוב "הליכה" של פפטידים טורי יש 15-4 = 11 שאריות של חפיפה בין פפטידים ומייד בסמוך כלשהו, אז הסדרה היא תמיד מספיקות לכיסוי האורך האופייני של נוגדן epitopes מוערך aa 4-9 אורך (איור 1).

רצפי הלע תבנית הורדו ישירות ממסד הנתונים של מאגר ומתוחזק על EMBL-EBI (מכון ביואינפורמטיקה האירופית). לדוגמה, התורם של ניידת #4 של הלע-DQB1 * אלל 03:01:01:01 נבדקה להמחשה (דף אינטרנט באיור2). בשילוב, הורדנו בנפרד רצפי אלל הלע-DQB1 השני של התורם של * 02: 01:01, כמו גם אלה של ניידת #4 עצמו, הלע-DQB1 * 04:02, * 05:01. עימוד רצפים מרובים ואז בוצעה באמצעות פונקציות אינטרנט של Clustal אומגה (איור 3). הקובץ יישור וכתוצאה מכך היה המתקבלים (איור 4), אשר זוהו כל שאריות חומצה אמינית לא תואמת (שאריות של התורם מודגשים). בשלב הבא, סימנו רצפים תבנית (תחתון) של התורם שהיו ארוכה דיה כדי לכסות את כל שאריות לא תואמת שלו. מבוסס על רצפי תבנית אלה, בעקבות עיצוב "הליכה" כמתואר לעיל, שלוש סדרות של פפטידים כל 15 aa אורך נשאבו עבור הלע-DQB1. תהליך זה חזר על עצמו לשאר אללים של התורם של הלע-A, B, C, DQA1 ו- DRB1 (DRA1 ו DP היו נכלל עקב אי-זמינות של הרשומה הרלוונטית קלינית) בהשוואה אללים התואם הנמען שלו. בסוף, סך של פפטידים 202 גויסת להכנת המערך (רצפי פפטיד גליון עבודה באיור 5 ואיור מערך איור6) במיוחד עבור הבדיקה שלאחר ההשתלה סרום של ניידת #4, להשוות את התוצאות עם אלה המתקבל reprobing עוקבות של נסיוב שלפני ההשתלה שלו (איור 7). מחוץ פפטידים 202, סך של 10 נוגדן הראה אותות הקשורים הדגימה שלאחר ההשתלה של איזה שאריות תורם ספציפי (תואמים למקבל) E87, I306, W243 ו- K197 הלע-B * 52:01, -B * 52:01, - C * 03:04 ו- DQA1 * 05:01 שנראה מעורב הסתה נוגדן תגובתיות (שאריות מסומן באותיות אדומות איור7).

בנוסף, אחד היתרונות העיקריים של שיטת מערך לעומת הבדיקה SAB המסורתי הוא כי epitope ניתן בקלות לקבל מידע, כפי שמוצג באיור 7. השווינו את epitopes נוגדן-תגובתי על הלע-DQA1 ו- DQB1 של כל חמשת המטופלים (מתוך תוצאות נפרד מערך ליו ואח 17) על-ידי כל מעוצבת למבנה גביש שותף של heterodimer DQA1 ו- DQB1 (איור 8). . Encouragingly, קטע בולט של מבנה המכונה סטרנד β1 הוא "חמה" היה הרבה סיכוי גבוה יותר (3/5 בתוך חולים 2,3,5) כדי להיות ממוקד על ידי alloantibodies בין הנושאים להשתלות במדגם במקרה 5.

Figure 1
איור 1 . המזימה של אנטיגן מבוססי הלע מערך שיטה לגילוי התורם אנטי הלע alloantibodies ב עוגב נמענים. (מותאם, ששונה מ ליו. et al. 17) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . באתר מאגר נתונים
כדי לאחזר הלע רצפים, בקר באתר האינטרנט הבא: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. חלבון מספר רצף היישור של התורם לעומת אללים הלע-DQB1 נמען באמצעות כלי מבוסס-אינטרנט Clustal אומגה.
העתקה והדבקה של רצפים של החולה 4(PTN#4) של # DQB1 * 0201, 03:01, ושל DQB1 של התורם * 04:02, 05:01 בתבנית FASTA לתוך http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (להמחשה, DQB1 * 05:01 של ניידת #4, DQB1 * 03:01 התורם מוצגים בתיבת קלט) . בחר באפשרות "Clustal עם מספרים" ב "שלב 2" עבור תבנית פלט ולהפעיל יישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . השוואה שלהתורם לעומת החולה/נמען הלע DQB1 ומבחר של תבנית רצפים של פפטיד סינתזה.
רצפים של התורם נמצאים עם תורם ספציפי אי-התאמות בגופן אדום מודגש והדגשתי גם עם תיבות שחורות. תבנית רצפים (תחתון) שיניעו פפטידים מכילים שאריות אלה תורם ספציפי. (איור זה הותאם, שונה Liuet al. 17) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . דוגמה להמחשה של גליון העבודה הראשי בגיליון של התורם הלע פפטידים.
פפטיד תפקיד במערך מזוהה באמצעות שורה לעומת טור קואורדינטות. פפטיד רצפים משמשים כדי לתכנת באמצעות סינתיסייזר ספוט רובוטית סינתזה. שאריות תורם ספציפי (תואמים של אללים המקביל של המטופל) מסומן באותיות מודגשות, עם קו תחתון. מיקומי ההתחלה והסיום פפטיד המייצגים רצפים באורך מלא הלע-DQB1 גם מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . התמונה של מקטע מערך צבעונית עם צבע מאכל פונסו S
הערה הבדלים בעוצמת הצבע בשל הבדל בהרכב חומצת אמינו בין פפטידים, בעוד פפטיד ריכוזים בין כל האזורים ספוט זהים. (התמונה היא דוגמה להמחשה, לא את אחד מן המחקר בפועל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 . תורם ספציפי הלע-A, B, C, DQ, ד ר מערך המחקר של epitopes לא תואמת ניידת # 4.
פפטידים טורי נגזר רצפים של התורם לכסות שאריות לא תואמת (דוגמה DQB1 באיור4). המערך שימש כדי לחקור את הנסיוב שלאחר ההשתלה (כתם התחתון: פוסט-TX), לאחר מכן את הנסיוב להשתלה מראש (כתם העליון: טרום-TX) מן המטופל באותו. ארבע קבוצות של כתמים חזק של חיטוט שלאחר ההשתלה מסומנים באמצעות קווים אדומים (ב האבן החשופה נמוך יותר), בעוד שני כתמים בעוצמה בינונית, כי היו רק המשויכות מראש השתלת סרום מסומנים באמצעות קווים כחולים (ב האבן החשופה העליון). הטבלה התחתונה מציגה את רצפי פפטיד המתאימים תגובתיות שלהם כדי הסרום שלאחר ההשתלה. תורם ספציפי (לא תואם) שאריות E87, I306, W243 ו- K197 של אללים בהתאמה שלהם הם באותיות אדומות, פפטידים מציג תגובתיות חזקה נוגדן נמצאים גופנים מודגשים. איור זה היה מותאם, שונה של ליאו. et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 . מיקומי מבנית של epitopes הלע-DQ.
מבנה משותף של הלע-DQ8 שימש כתבנית. המבנה היה מורכב DQA1 ו subunits DQB1 יחד עם פפטיד אנטיגן (א). מבנה החלבונים המשני של α-helices וβ-גדילי מוצגים בחלונית (B). פפטידים DQA1 ו- DQB1 הגיבו או שאחד הסרום חמש היו ממוקמים על המבנה קריסטל שיתוף ( A , B: מוצללים בכחול). 3 β-גדילי, β1, β6, β12 (כחול כהה ב'), אחד מיוצג על ידי פפטידים מרובים (קצר קווים אדומים המתאים למיקום aa ליניארי של DQA1), הגיבה עם דגימות מספר המטופלים (תוצאות המקורי בליו. et al. 17)-כל שש DQB1 פפטידים (בגופן מודגש) תגובתי ל נוגדנים אצל חולים #2, #3, #5 ממוקמים את פלח "נקודה חמה" β1 ( ב': באמצעות החץ האדום). איור זה היה ממאמרו של ליו. et al. 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העיצוב של המערך במקום המתואר כאן הוא במחקר ניסיוני היחודיות alloantibody ב השתלת נגד אנטיגנים הלע של תורם איברים. בניגוד וזמינותו SAB הקיימים בשימוש נרחב במרפאה, שיטת מערך אנטיגן יש יתרון גדול בעיצוב גמיש שיכול להכיל את רצפי הלע האמיתי של התורם בודדים. הפלטפורמה החדשה מנצלת את הפוטנציאל של הטכנולוגיה רצפי DNA המתקדם במהירות כי בקרוב יוכלו להפיק קריאות רצף allelic הלע מדויק ללא עמימות16,27 ואת הפוטנציאל של מסדי נתונים ייעודי עבור מאגר הלע רצף15 באוכלוסייה הכללית. פרוטוקול ההקרנה-מערך הנוכחי שלנו פותחה בהתבסס על ההצלחה של מספר מחקרים פיילוט של sera להשתלה. כאן אנחנו צריכים להדגיש כי בשלב זה, מערכים אב-טיפוס שלנו בנויים רק לשימוש מחקר, לא עבור יישומים האבחון הקלינית.

הבחנה נוספת הבולטים בין SAB שלנו מערך אנטיגן הוא האחרון יש רזולוציה גבוהה יותר להבחין epitopes אנטיגן פוטנציאליים בתוך המקטעים aa 15 של רצפים הלע, אשר יכול לספק מידע רב ערך על alloantigenicity18 . עם זאת, בניגוד SAB המציג כל חלבונים אנטיגניים להסתגל מבנים מקופל שלהם, המערך אנטיגן רק משלבת פפטידים קצרים, אשר אינו כולל מידע אודות קיפול הסתגלותי. לכן, מערכי אינו יכול לזהות נוגדנים רק לזהות הסתגלותי epitopes, אשר יש הרואים מהווים רוב של כל epitopes תפקודית הרלוונטיים נוגדן מתווכת-דחייה-28,-29. ובכל זאת, בהקשרים אחרים, פעולות נוגדנים נגד epitopes ליניארית, כגון פפטידים קצרים, בתוך האלה אינן מנוצלות בתגובות אנטיגן ויראלי ולעצב בחיסון30,31. צריך גם לציין, במספר מוגבל של דגימות החולה נבדק, איתור רגישות הביצועים של מערך שלנו חריגה של SAB ואסור זיהוי נוגדנים ספציפיים התורם במוקדם17 במהלך ההתקדמות קליני של בתיווך נוגדנים דחייה. זאת בשל ריכוז מולרי גבוהה של אנטיגן המקומי פפטידים במערך לעומת SAB. תכונה זו הייתה מועילה במיוחד במקרים כאשר SAB זיהה אין תגובתיות בזמן קליניים ופתולוגיים הראיות מדחייה בתיווך נוגדנים היה לכאורה, כפי שהראנו בעבר17. עם זאת, חשוב לציין כי בדיקה אישית זו היא אורכת זמן רב יותר מן הבחינה SAB סטנדרטי. הבדיקה מערך מחייב קבלת האיבר רצפים הלע של התורם, של המטופל (המוצע) לפני שמתחילים את העיצוב של פפטידים אנטיגן. ואז לוקח כמה ימים כדי לייצר את המערך, עוד 7-8 שעות כדי להשיג תוצאות נוגדנים. לכן, הליך ממושך אינה מתאימה להשתלה הנפטר התורם, אלא אם כן המטרה העיקרית של הבדיקה נוגדן לקביעת הופעתה של נוגדנים ספציפיים התורם בעקבות השתלת, ולא על הערכה טרום השתלה קיימים נוגדנים.

שיטת המערך היה שיפור משמעותי מן הבחינה SAB הקיים באיתור אנטיגן epitopes. יתר על כן, עשינו בניסיון למפות epitopes תגובתי חמישה חולים להשתלות מבנה תבנית של הלע-DQ, שבו ציינו epitope בולטות "נקודה חמה" אחד לפחות ב- strand שלה β1 שהתרחשו במהלך שלושה מתוך חמשת המטופלים17. מסקרן, גדילי β1 הלע-DQA1 ו- DQB1 ממוקמים לקצב של אנטיגן-מצגת קעורה (איור 8), מיקום ידוע antigenic בהקשר של דחייה השתלת32. לפיכך, אנו צופים כי בעתיד חקר שיטת המערך שלנו אנטיגן אישית במחקרים עוקבה מורחב להשתלות תניב תובנות על נקודות חמות antigenic ב הלע מולקולות. קטלוג של נקודות חמות אלה שזוהו, כאשר נחשב בשיתוף עם ומדויקים DNA רצף הקלדה של גנים הלע בין תורמים פוטנציאליים נמענים, בסופו של דבר יסייע להשתלה מראש החלטות באמצעות תוכניות אי-התאמה מקובל 33, נועד כדי למנוע ביעילות רבה יותר הבדלים מסוימים בסביבה כדי נקודות חמות מקוטלג.

לסיכום, שלנו המחקר המקורי17 בחקר העיצוב מותאם אישית של מערך אנטיגן גילוי של אנטי ספציפי-הלע alloantibodies היה הראשון מסוגו. המוקד של המחקר היה על הכדאיות של מערך תכנון ויישום, אשר שימש בתור אב-טיפוס טכנולוגיה עתידית פוטנציאלית. מחקר פיילוט שלנו לא רק שנוצר על ידי עידוד תוצאות מדגימות קלינית, אלא גם מאפשרת לנו להעריך את העלות הכוללת ואת המהירות של הבדיקה. עלות הייצור מערך אישית אחד בסביבה שלנו-מעבדה הנוכחי הוא תחת $ USD 1,000, אשר עלות חד פעמית מאז המערך יכול לשמש לאורך זמן עד 20 סיבובים של reprobing מחזורים ללא הפסד של ביצועים. זה אפשרי כי בדיקות נוספות של פרוטוקול מערך עם עמית רחבה של נושאים ההשתלה לייעל עוד יותר השיטה יום אחד שיכול לשמש בפרקטיקה הקלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין התנגשויות אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים ד"ר שון Li, Li Xing של אוניברסיטת ווסטרן בקנדה לסיוע שלהם אדיב עם ספוט מערך הייצור. אנחנו אסירי תודה לחברי הצוות הליבה Histocompatibility ובבית את מקיף השתלת סנטר של אוניברסיטת נורת'ווסטרן למתן שירותים לדוגמה עבודה זו ייצורם נתמך בחלקה על ידי עזר הלוח של נורת'ווסטרן ממוריאל החולים, ועל ידי קרן הפעלה סגל המסופקים על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן כדי ג'יי ג'יי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21, (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14, (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5, (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63, (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14, (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20, (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374, (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3, (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19, (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15, (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15, (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83, (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2, (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6, (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15, (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77, (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117, (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19, (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78, (2), 190-193 (2004).
אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter