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Biochemistry

अंग प्रत्यारोपण में एचएलए Alloantibodies का पता लगाने के लिए निजीकृत पेप्टाइड सरणियों

Published: September 6, 2017 doi: 10.3791/56278
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 2, 1
1Division of Nephrology and Hypertension, and the Center for Kidney Research and Therapeutics at the Feinberg Cardiovascular Research Institute, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Surgery-Organ Transplantation, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University

Summary

अंग दाता और प्राप्तकर्ता जोड़े के बीच मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) अनुक्रम में बेमेल अंग प्रत्यारोपण में एंटीबॉडी की मध्यस्थता अस्वीकृति का प्रमुख कारण हैं । यहां हम कस्टम प्रतिजन arrays कि व्यक्तिगत दाताओं ' एचएलए अनुक्रम के आधार पर जांच विरोधी दाता एचएलए alloantibodies अंग प्राप्तकर्ताओं में कर रहे है के प्रयोग प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

अंग प्रत्यारोपण में, समारोह और भ्रष्टाचार की लंबी उंर गंभीर मानव ल्युकोसैट एंटीजन (एचएलए) के खिलाफ प्रतिरक्षा अस्वीकृति जेट को नियंत्रित करने की सफलता पर निर्भर करते हैं । Histocompatibility दिशानिर्देश एंटी-एचएलए प्रतिरक्षण के प्रयोगशाला परीक्षणों पर आधारित होते हैं, जो या तो पूर्व-मौजूदा या de नोवो जनित एचएलए एंटीबॉडी के रूप में प्रस्तुत करते हैं जो एक प्रमुख प्रत्यारोपण बाधा का गठन करते हैं । वर्तमान परीक्षण एक एकल-प्रतिजन मोतियों (सब) मंच पर निर्मित कर रहे है का एक निश्चित सेट का उपयोग कर ~ १०० अचयनित संयोजक एचएलए एंटीजन प्रत्यारोपण सीरा जांच करने के लिए । हालांकि, मनुष्यों में वहां एचएलए प्रकार की एक बहुत अधिक विविधता मौजूद है, कोई दो समान जुड़वां जो एचएलए दृश्यों का एक ही संयोजन साझा कर सकते है के अलावा अंय व्यक्तियों के साथ । जबकि एचएलए टाइपिंग और प्रत्यक्ष अनुक्रमण के लिए उंनत प्रौद्योगिकियों ठीक एक दाता और प्राप्तकर्ता के एचएलए, सब परख, अनुक्रम प्रतिनिधित्व में अपनी सीमित किस्म के कारण के बीच डीएनए अनुक्रम में किसी भी बेमेल कब्जा कर सकते हैं, ठीक से पता लगाने में असमर्थ है alloantibodies के खिलाफ विशेष रूप से दाता एचएलए बेमेल है. हम एक अलग तकनीक का पता लगाने और विरोधी एक व्यक्तिगत आधार पर दाता एचएलए एंटीबॉडी विशेषताएं का उपयोग कर एक पूरक विधि विकसित करने की मांग की । स्क्रीनिंग उपकरण दाता एचएलए की एक कस्टम पेप्टाइड सरणी है-एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति के लिए जोखिम का आकलन करने के लिए अंग प्राप्तकर्ता के बाद प्रत्यारोपण सीरा की जांच के लिए अनुक्रम व्युत्पंन । एक दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी के लिए एक सरणी पर, अप करने के लिए ६०० अद्वितीय पेप्टाइड्स दाता एचएलए प्रोटीन दृश्यों के आधार पर किया जाता है, प्रत्येक पेप्टाइड एक 15-अमीनो एसिड अनुक्रम में एक बेमेल अवशेषों को ले जाने । हमारे पायलट प्रयोगों में पूर्व के लिए प्रतिजन पैटर्न की तुलना और बाद प्रत्यारोपण सीरा इन arrays पर, हम संकल्प है कि हम भी प्रतिरक्षा epitopes शामिल तुच्छ करने की अनुमति के साथ विरोधी एचएलए संकेतों का पता लगाने में सक्षम थे । ये निजीकृत प्रतिजन arrays दाता की उच्च संकल्प का पता लगाने-विशिष्ट एचएलए epitopes अंग प्रत्यारोपण में अनुमति देते हैं ।

Introduction

अंग प्रतिस्थापन चिकित्सा कि नियमित रूप से दुनिया भर में आयोजित किया जाता है जीवन के लाखों लोगों को बचाया है । ठोस अंग प्रत्यारोपण संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रति लाख लोगों को प्रतिवर्ष लगभग १०० रोगियों में होता है, जबकि एक अधिक से अधिक संख्या अभी भी waitlists पर है दाता आपूर्ति की एक गंभीर कमी के कारण अंगों प्राप्त करने के लिए (अंग द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी के अनुसार अधिप्राप्ति और प्रत्यारोपण नेटवर्क-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov) । अंग प्रत्यारोपण अत्यधिक आदेश में अंग अपशिष्ट को कम करने और जीवन को बचाने के लिए विनियमित है, लेकिन वैज्ञानिक उपकरण इन विनियमों को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रभावशीलता में सीमित हैं. उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक समुदाय पूरी तरह से उच्च संकल्प टाइपिंग और अनुक्रम आधारित टाइपिंग (SBT) का उपयोग कर डीएनए के एचएलए अणुओं और सटीक आनुवंशिक परीक्षणों के उच्च बहुरूपी राज्यों को पहचानता है हाल के वर्षों में विकसित किया गया है1, 2. हालांकि, alloantibody परीक्षण विधियों अभी तक प्रतिजन जांच के रूप में व्यक्तिगत एचएलए दृश्यों की विशाल विविधता का उत्पादन करने में सक्षम नहीं किया गया है । मानक परीक्षण आजकल के एक चर पैनल का उपयोग करता है ~ १०० allelic एंटीजन कि एचएलए के आम वेरिएंट के शामिल कर रहे हैं, मानव आबादियों में ए, बी, सी, डीक्यू, डीपी और डॉ जुगाड़3,4,5,6. अक्सर, वास्तविक है दाता एचएलए अनुक्रम परीक्षण पैनल में शामिल नहीं हैं, प्रत्यारोपण चिकित्सकों और सर्जनों को दाता के वास्तविक दृश्यों और इसी "मानकों" के बीच साझा समानता के आधार पर रक्तदाता अनुमान करने के लिए बाध्य परीक्षण सेट7,8. नतीजतन, यह कभी एंटीबॉडी परीक्षा परिणाम9,10,11,12के आधार पर अस्वीकृति जोखिम का एक विश्वसनीय अनुमान बनाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, alloantibodies के लिए नए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलन परीक्षण तत्काल13,14की जरूरत है ।

एचएलए जीन प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) रिसेप्टर्स कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण समारोह है6सांकेतिक शब्दों में बदलना । एचएलए जीन को मानव जीनोम६का सबसे बहुरूपी जीन माना जाता है. एचएलए जीन के लिए डीएनए अनुक्रमण रणनीतियों में तेजी से प्रगति के कारण, नए allelic वेरिएंट (या बस के रूप में alleles के लिए भेजा) एक विस्फोटक दर15,16में खोजा जा रहा है । २०१७ मार्च तक, १६,७५५ सत्यापित alleles IMGT/एचएलए डाटाबेस (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), जिनमें से १२,३५१ वर्ग मैं और ४,४०४ वर्ग के थे द्वितीय समूह के थे जमा किए गए थे । इसके विपरीत में, केवल एक छोटे से अधिक १०० अलग alleles मानक एकल प्रतिजन मोती (सब) परख है, जो नियमित रूप से अंग प्रत्यारोपण में alloantibodies का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । सब विधि एक Luminex प्रवाह cytometry का उपयोग कर मंच पर बनाया गया है । चूंकि परख एंटीजन के एक चर सेट का उपयोग करता है, के अलावा मामूली बैच के उत्पादन में variabilities बैच के लिए, आनटिसम परीक्षण मजबूती से व्यक्तियों में मानकीकृत किया जा सकता है और प्रयोगशालाओं में5भर । हालांकि, इस परीक्षण के लिए दाता alleles के खिलाफ विशेष रूप से विकसित सभी alloantibodies पर कब्जा करने में असमर्थ है, विशेष रूप से जब दाता अनुक्रम सब सेट से अनुपस्थित हैं । हालांकि सही दृश्यों के आधार पर दानदाताओं के प्रतिजनों का कस्टम उत्पादन वांछनीय है, वहां आवश्यक उत्पादन और परीक्षण प्रक्रियाओं को सरल बनाने में तकनीकी चुनौतियों रहते हैं ।

हमने हाल ही में गुर्दे प्रत्यारोपण के एक व्यवहार्यता अध्ययन में एक वैकल्पिक पद्धति17विषयों का वर्णन किया । विधि पेप्टाइड एंटीजन एक सरणी स्वरूप में पहले की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया और व्यक्तिगत विषयों के बाद प्रत्यारोपण सीरा । प्रत्येक सरणी कस्टम स्थान संश्लेषण विधि18,19,20,21,22,23 कि पेप्टाइड एंटीजन का उत्पादन का उपयोग कर बनाया गया था, प्रत्येक 15 लंबाई में अमीनो एसिड, पूरी तरह से संबंधित अंग दाता ए, बी, सी, DQA1, DQB1 और DRB1 के एचएलए alleles पर आधारित है । स्पॉट संश्लेषण मानक Fmoc-रसायन विज्ञान22 का उपयोग कर एक फाइबर झिल्ली पर संचालित है और एक पूरी तरह से स्वचालित रोबोट प्रणाली19,21के साथ समानांतर में कस्टम पेप्टाइड के सैकड़ों का उत्पादन कर सकते हैं । झिल्ली सरणी अलग करना और फिर से जांच चक्र के कई दौर झेलने कर सकते हैं । हमारे पूर्वव्यापी अध्ययन17में, हम एक समय श्रृंखला में एकत्र antisera के साथ प्रतिजन पैटर्न में परिवर्तन का पता लगाया (यानी, पहले और प्रत्यारोपण के बाद) । साथ ही हम सरणी डिजाइन, विनिर्माण, आनटिसम जांच और परिणाम विश्लेषण सहित कार्यप्रवाह के लिए तकनीकी प्रोटोकॉल का वर्णन । विधि प्रत्यारोपण दाताओं ' एचएलए अणुओं पर विशिष्ट रैखिक epitopes के खिलाफ alloantibodies का पता लगाने के लिए करना है ।

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Protocol

यहां बताई गई सभी विधियों को उत्तर पश्चिमी विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी प्रोटोकॉल #: STU00104680) द्वारा अनुमोदित किया गया है । प्रोटोकॉल का एक समग्र कार्यप्रवाह < सबल वर्ग में सचित्र है = "xfig" > चित्रा १ .

< p class = "jove_title" > 1. दाता और प्राप्तकर्ता का Bioinformatic विश्लेषण एचएलए जुगाड़

  1. IMGT/एचएलए डेटाबेस < सुप वर्ग = "xref" > 15 से प्राप्त अनुक्रम ।
    1. प्राप्त एचएलए टाइपिंग रिपोर्टों के दोनों अंग दाता और उसके प्राप्तकर्ता ।
      नोट: उचित प्रक्रियाओं को सुनिश्चित करने के लिए गोपनीय चिकित्सा अभिलेखों की रक्षा का उपयोग कर रहे हैं । सामान्यतया संस्थागत आईआरबी दिशानिर्देशों के अनुसार अध्ययन प्रोटोकॉल या प्रायोगिक परीक्षण की एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) की स्वीकृति आवश्यक होती है । यदि एचएलए रिपोर्ट पीसीआर से थे आधारित टाइपिंग (या तो उच्च या कम संकल्प के) या अनुक्रमण आधारित टाइपिंग (SBT), 1.1.3 कदम सीधे जाओ । अनुक्रम जीनोमिक/एचएलए sequencing से प्राप्त किए गए थे, और वे पूर्ण हैं, तो इसके बजाय सीधे इन अनुक्रम का उपयोग करें । जब केवल अपूर्ण टाइपिंग या sequencing परिणाम उपलब्ध हैं, कभी-कभार, अतिरिक्त 1.1.2 चरण का पालन करें । असाइन करने के लिए & #34; missing & #34; alleles वेब उपकरण के माध्यम से 1.1.2 चरण में वर्णित है ।
    2. वेब लिंक-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html के बाद अस्पष्ट एलील संयोजनों को खोलें, और & #8220 का उपयोग कर खोज; अस्पष्ट एलील युग्म खोज टूल & #8221, काल्पनिक alleles पुनर्प्राप्त करने के लिए फ़ंक्शन । फिर, 1.1.3 कदम आगे बढ़ना । एलील नाम दर्ज करने के लिए.
    3. IMGT/एचएलए एलील क्वेरी प्रपत्र को वेब लिंक-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html पर खोलें, और इनपुट विषय & #8217; s एलील नाम (प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से, यथा दर्शाए गए < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) में & #8220; खोज & #8221 के लिए; बॉक्स । & #8220 पर क्लिक करें; सर्च फॉर alleles नाउ & #8221; बटन. एचएलए एलील नाम मानक नामकरण प्रणालियों का उपयोग करना चाहिए ( अर्थात , a *, a * 01, a * 01:01:01:01, और कोई * 01010101 जैसे किसी भी पिछले पदनाम) ।
    4. स्क्रीन पर प्रदर्शित मिलान एलील नाम खोजें । एलील बटन पर क्लिक करें.
    5. कॉपी द & #34;P rotein अनुक्रम & #34;, और इसे किसी टेक्स्ट डॉक्यूमेंट के नीचे एक हेडर लाइन के नीचे & #34; & #62; एलील name & #34;. प्रभावी रूप से, पाठ दस्तावेज़ एलील नाम और अनुक्रम का एक फसता (फ़ास्ट-All) स्वरूप में है ।
  2. दाता और प्राप्तकर्ता/रोगी alleles. के जीन आधारित एकाधिक संरेखण प्रदर्शन
    1. एक जीन ( यानी, DQB1 * 03:01:01:01) एक समय में, दाता और रोगी alleles अनुक्रम के सभी चार फसता (दाता से दो और रोगी से दो) एक संयुक्त पाठ दस्तावेज़ में पेस्ट करें । इस बिंदु पर, यह महत्वपूर्ण है के लिए अंतर रोगी एलील नाम से दाता एलील नाम निरूपित (विकल्प ऊपरी बनाम निचले मामलों के विभेदक उपयोग शामिल हैं; या अलग छाप दाता बनाम एक भेद उपसर्ग या प्रत्यय विस्तार प्रत्येक एलील नाम के लिए बनाएं रोगी alleles) । अनुक्रम के इनपुट क्रम महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि निम्न संरेखण क्रम अनुक्रम के किसी भी जोड़ी के बीच समानता के स्तर के अनुसार फेरबदल किया जाएगा.
    2. की प्रतिलिपि बनाएं और फसता स्वरूप में चिपकाएं (जैसा < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ) में देखा गया है ऊपर से & #8220; अपने इनपुट अनुक्रम & #8221; बॉक्स में क्लस्टर ओमेगा वेबसाइट पर दर्ज करें: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. & #34 पर क्लिक करे; अपना काम & #34 जमा करें; पैरामीटर्स की मानक सेटिंग का उपयोग करना: जैसे & #34;P rotein & #34;; और & #34; Clustal w/संख्या & #34;. पर क्लिक करके संरेखण प्रदर्शन & #34; Submit & #34;. चार अनुक्रम का एक संरेखण स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ ).
  3. छाप दाता-विशिष्ट बेमेल.
    नोट: यह विशेष रूप से ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां दी allelic अनुक्रम एचएलए टाइपिंग के परिणाम पर आधारित थे, अनुक्रमण नहीं है । इसलिए, वहां एक जोखिम है कि विशेष दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी में प्रासंगिक अनुक्रम भिंनता याद किया जा सकता है । इस संभावित समस्या अधिक से अधिक प्रत्यारोपण केंद्रों सटीक उच्च संकल्प टाइपिंग और प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण अपनाने के रूप में कम हो जाएगा ।
    1. की प्रतिलिपि बनाएं और संरेखण पाठ को किसी पाठ दस्तावेज़ में चिपकाएं और कोई नया दस्तावेज़ बनाएं । यदि संरेखित फ़ाइल का स्वरूप गड़बड़ है, तो फ़ॉन्ट शैली और आकार बदलकर स्वरूप को ठीक करें: हमेशा उपयोग & #34; कूरियर नई & #34; फ़ॉंट छोटे प्रकार के आकार में पंक्तियों को फ़िट करने के लिए । स्वरूपण समस्याओं के हल होने के बाद दस्तावेज़ सहेजें ।
    2. मैन्युअल रूप से दाता के लिए अनन्य रूप से संबंधित सभी बेमेल अवशेषों की पहचान करने के लिए गठबंधन अनुक्रम का निरीक्षण किया । एक अलग फ़ॉन्ट रंग का उपयोग कर इन दाता-विशिष्ट अवशेषों में से प्रत्येक को चिह्नित करें ।
    3. में सभी अक्षरों को रेखांकित करना दाता & #39; s अनुक्रम है कि 14 अवशेषों का विस्तार दोनों ऊपर-और चिह्नित दाता विशिष्ट बेमेल के बहाव (के रूप में 15 एमिनो एसिड पेप्टाइड शूंय से बेमेल की 1 अवशेषों की गणना) ।
  4. 15-मेर पेप्टाइड अनुक्रम एक अतिव्यापी श्रृंखला में ।
    नोट: चुनने के लिए कारण 15-मेर पेप्टाइड्स ठेठ epitopes जा रहा है की सामान्य ज्ञान पर आधारित था 4-9 अमीनो एसिड लंबाई में. इसलिए, जब हमने एक & #34 लागू किया; चलती खिडकी & #34; 4 एमिनो एसिड के एक कदम आकार के साथ प्रक्रिया (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ), एक 15 एमिनो एसिड की लंबाई के हमारे चयन एक श्रृंखला में किसी भी पड़ोसी पेप्टाइड्स के बीच एक 15-4 = 11 एमिनो एसिड ओवरलैप छोड़ दिया. सिद्धांत रूप में, यह 11 एमिनो एसिड ओवरलैप लंबाई में अप करने के लिए 9 एमिनो एसिड की सभी प्रतिरक्षा epitopes को कवर करने के लिए पर्याप्त है, ताकि कोई epitope होगा अनजाने में & #34; भाजित & #34; सरणी पर केवल आंशिक अनुक्रम के साथ आधे में ।
    1. के रूप में रेखांकित अनुक्रम का उपयोग करें क्रमिक रूप से एक श्रृंखला है कि श्रृंखला में किसी भी दो तुरंत आसंन दृश्यों के बीच 4 अवशेषों से ओवरलैप में कम 15 एमिनो एसिड अनुक्रम प्राप्त करने के लिए टेंपलेट्स ।
    2. कॉपी और पेस्ट इन 15 अमीनो अम्ल अनुक्रम एक स्प्रेडशीट में (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 ) एक कॉलम प्रारूप में संकेतन कॉलम है कि दाता alleles के संबंधित नामों में शामिल हैं के साथ. aa अवशेष स्थिति शामिल करने के लिए एक अतिरिक्त स्तंभ उपयोगी हो सकता है ।
  5. के लिए 1.1.3 से कदम दोहराएं । १.३. के लिए प्रत्येक एचएलए एलील ( यानी, ए, बी, सी, DQA1, DQB1, DRB1 और डीपी) के दाता और प्राप्तकर्ता जोड़ी के लिए दाता के 15 एए कम जुगाड़ से निकले.
  6. की प्रतिलिपि बनाएं और सभी स्तंभों को एक मास्टर स्प्रेडशीट में चिपकाएं दाता के सभी alleles से 15 aa अनुक्रम के एक लंबे सतत स्तंभ बनाने के लिए । नीचे पंक्तियों की कुल संख्या (पेप्टाइड अनुक्रम के लिए) दस्तावेज़ में लिखें ।
< p class = "jove_title" > 2. कस्टम सरणी लेआउट और उत्पादन

  1. के डिजाइन इसी एलील आजीविकाओं के साथ पेप्टाइड दृश्यों की एक स्प्रेडशीट उत्पंन करते हैं । सरणी 20 पंक्तियों और 30 कॉलम है और पेप्टाइड्स के लिए 20x30 = 600 स्थानों के लिए पकड़ कर सकते हैं । एक विशेष दाता से कदम १.५ में दर्ज पेप्टाइड्स की कुल संख्या पर निर्भर करता है, और दो उदाहरण है कि हम लियू एट अल में की कोशिश की थी के साथ हमारे पिछले अनुभव आधारित है । < सुप वर्ग = "xref" > 17 , ६०० स्थान सरणी ~ 2 अलग प्रत्यारोपण मामलों से उत्पन्न सभी दृश्यों को पकड़ कर सकते हैं ।
    1. तर्कसंगत योजना सबसे ईfficient तरह के ६००-स्थान प्रारूप के भीतर पेप्टाइड्स के सेट फिट करने के लिए सरणी.
    2. यदि एक से अधिक विषय एक संपूर्ण सरणी में फ़िट हो सकते हैं, तो प्रथम दाता & #39; s अनुक्रम 30 (सरणी पर किसी पंक्ति में स्थान की संख्या) से विभाजित किया जा सकता पंक्तियों की कुल संख्या से मेल करने के बाद रिक्त पंक्तियाँ सम्मिलित करें ।
    3. तुरंत अनुक्रम के पहले सेट के लिए अंतिम खाली पंक्ति का पालन, दूसरा प्रत्यारोपण मामले से अनुक्रम सामग्री के पूरे कॉलम में पेस्ट करें ।
    4. सरणी भर जाता है जब तक इन चरणों को दोहराएँ और कोई और अधिक मामलों ६०० स्थानों से अधिक के बिना जोड़ा जा सकता है । यदि निचली ओर भरण के लिए संपूर्ण रिक्त पंक्तियाँ शेष हैं, तो & #34; ले जाएँ & #34; रिक्त पंक्ति को दो दाता सेट्स के बीच स्थित करने के लिए । मामलों के बीच छोड़ दिया इस व्यापक स्थान संश्लेषण के पूरा होने के बाद झिल्ली के काटने आसान बनाता है-निम्न चरण ३.२. नीचे.
  2. प्रोग्राम पेप्टाइड अनुक्रम सरणी लेआउट के संदर्भ में है । स्पॉट सिंथेसाइज़र के कार्यक्रम के अनुक्रम (एक पंक्ति एक पेप्टाइड अनुक्रम) का एक पाठ स्वरूप लेता है, जो सीधे एक साधारण पाठ दस्तावेज़ के रूप में कदम 2.1.4 से परिणामी स्प्रेडशीट को बचाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता (एलील के नाम के लिए अतिरिक्त कॉलम (ओं) के बिना, ए. ए. पदों आदि ).
  3. स्थान सिंथेसाइज़र के माध्यम से स्वचालित पेप्टाइड सरणी संश्लेषण चलाते हैं । संश्लेषण के पूरे आपरेशन Kudithipudi एट अल में विस्तृत है. < सुप वर्ग = "xref" > २१ . ध्यान दें कि दो arrays के Fmoc संश्लेषण ~ 4-5 दिन लगते हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. जांच और जांच Antisera एक व्यक्ति प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता के एक समय श्रृंखला से ।

< p class = "jove_content" > नोट: ६००-स्थान झिल्ली सरणी आयाम है ~ 7 cm x 13 cm. संश्लेषण के बाद, arrays के रूप में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है सूखी झिल्ली के रूप में कम से कम दो साल जब प्रत्यक्ष प्रकाश से ढाल । झिल्ली की अत्यधिक तह से बचने के लिए दोहराया उपयोग के लिए अपनी लंबी उंर के संरक्षण ।

  1. इथेनॉल और Ponceau एस के साथ दाग पेप्टाइड धब्बे कल्पना के साथ झिल्ली सरणी निर्जलीकरण
    1. एक stepwise ली एट अल. में अनुकूलित प्रक्रिया के बाद पेप्टाइड्स ले जाने झिल्ली सरणी निर्जलीकरण < सुप वर्ग = "xref" > २४ .
      1. १००% इथेनॉल के 20 मिलीलीटर में सरणी झिल्ली विसर्जित ।
      2. 20 मिलीलीटर आसुत जल जोड़ने के लिए ५०% इथेनॉल और 15 मिनट
        3. के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी के समाधान को पतला
      3. १००% पानी की ४० मिलीलीटर को विसर्जन समाधान बदल तीन बार और 15 मिनट की मशीन हर बार ।
      4. एक उचित काम बफर में धोने, उदाहरण के लिए, TBST के 20 मिलीलीटर (Tris-०.१%), 5 मिनट के लिए तीन बार के साथ खारा बफर प्रत्येक.
    2. Ponceau सरणी सिंथेटिक पेप्टाइड्स
      1. कल्पना के दाग एस के 20 मिलीलीटर पूर्व तैयार Ponceau एस के लिए हाइड्रेटेड सरणी के लिए सीधे समाधान और ~ मिलाते के साथ 30 एस के लिए मशीन जोड़ें ।
      2. रन लगातार पानी से झिल्ली पर de-दाग पृष्ठभूमि Ponceau एस रंग । प्रक्रिया के दौरान, लाल रंग के पेप्टाइड स्पॉट दिखाई दे सकता है ।
      3. अलग-अलग मामलों के लिए सरणी के वर्गों के बीच सावधानी से काटने के द्वारा प्रत्येक दाता के लिए सरणी के भागों पृथक । प्रत्येक सरणी.
        4. के ओरिएंटेशन को चिह्नित करें
  2. पूर्व ब्लॉक सरणी.
    1. 5% गैर वसा दूध TBST बफर में भंग की 20 मिलीलीटर में झिल्ली ब्लॉक । इस दूध आधारित समाधान आगे de-दाग Ponceau एस रंग होगा । दूध बफर कई बार बदलें क्रम में स्पष्ट पेप्टाइड छवियों को प्राप्त करने के लिए ।
      2. रिकॉर्ड रखने के प्रयोजनों के लिए
    2. , एक हाथ से आयोजित कैमरे का उपयोग सरणी की Ponceau एस छवि की एक तस्वीर ले (< मजबूत वर्ग में उदाहरण = "xfig" > चित्रा 6 ).
    3. 5% गैर-वसा दूध 4 & #176; सी रात में या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए कमाल के साथ झिल्ली के अवरुद्ध जारी रखें ।
  3. रोपाई सरणी के साथ प्रत्यारोपण आनटिसम.
    नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक घटना क्षेत्र या हुक प्रभाव के रूप में जाना जाता सीरम एंटीबॉडी विश्लेषण में पूरक निर्भर हस्तक्षेप से परिणाम हो सकता है । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, एक वैकल्पिक सीरम उपचार कदम या तो EDTA के साथ विचार किया जा सकता है या सीरम नमूनों की गर्मी निष्क्रियता ।
    1. बफर ब्लॉक हटाने और TBST के 20 मिलीलीटर के साथ झिल्ली धो 5 मिनट के लिए हर बार अगले दिन तीन बार ।
    2. Add 20 & #181; प्राप्तकर्ता के कच्चे सीरम के एल TBST बफर में २.५% दूध की 20 मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर 2-3 एच के लिए झिल्ली के साथ मशीन । ध्यान दें कि जांच के इस प्रारंभिक दौर में, यह अनुशंसित है कि पिछले बाद प्रत्यारोपण सीरम (या संभावना सबसे संवेदनशील सीरम) समय श्रृंखला में सबसे पहले प्रयोग किया जाता है । इस धारणा पर आधारित है कि श्रृंखला में पहले नमूनों, विशेष रूप से पूर्व से प्रत्यारोपण समय अंक, alloantibodies की कम विविधता है कि समय के साथ विकसित करते हैं । इस तरह, & #34 से संकेत हस्तक्षेप की कोई संभावना; कैर्री-over & #34; के बीच जांच राउंड स्पष्ट रूप से सही मायने में विकसित alloantibody भ्रष्टाचार के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के कारण जेट से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
  4. TBST के 20 मिलीलीटर का उपयोग कर सरणी धोने और माध्यमिक एंटीबॉडी. के साथ मशीन
    1. हर बार 10 मिनट के लिए तीन बार झिल्ली धो लें ।
      2. बकरी विरोधी के साथ
    2. मशीन मानव आईजीजी-एचआरपी (सहिजन peroxidase) 1 पर माध्यमिक एंटीबॉडी: 10000 कमजोर पड़ने TBST बफर में एक और 2 एच के लिए 1% दूध के साथ पूरक
  5. धो आणि विकसित ब्लाटर.
    1. हर बार 10 मिनट के लिए TBST के साथ झिल्ली तीन बार धो लें ।
    2. प्रदर्शन बढ़ाया chemiluminescence (ECL) luminol समाधान के 5 मिलीलीटर हौसले से मिलाकर पेरोक्साइड समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ मिश्रित करने के लिए झिल्ली विकसित (1 मिनट के लिए) ।
    3. visualize ECL संकेतों का उपयोग कर एक उपयुक्त imager ( यानी, ChemiDoc इमेजिंग सिस्टम या Azure C600).
  6. स्कॅन और ब्लाटर को यों ही बढ़ाता है.
    1. (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 7 , निचली छवि) और स्थान तीव्रता के ठहराव को निष्पादित करने के लिए विकसित छवियां सहेजें ।
< p class = "jove_title" > 4. एक नैदानिक समय श्रृंखला में आनटिसम जेट की तुलना करें ।

  1. पट्टी द सरणी.
    1. इस बिंदु पर, हर समय झिल्ली गीली रखें ।
    2. पट्टी पर वाणिज्यिक अलग करना बफर के 20 मिलीलीटर के साथ मशीन द्वारा झिल्ली ३७ & #176 पर 20 मिनट के लिए सी, और फिर TBST के साथ झिल्ली धो 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार । फिर अवरुद्ध (चरण ४.२) को दोहराने और एक अलग समय बिंदु पर लिया रोगी के एक अलग सीरम का उपयोग कर (चरण ४.३) कदम की जांच.
  2. ब्लॉक छीन झिल्ली.
    नोट: निंनलिखित अलग करना, झिल्ली एक समय श्रृंखला में एक ही रोगी से एक अलग सीरम की जांच के दूसरे दौर के लिए reused किया जा सकता है ।
    1. से पहले के रूप में 5% दूध बफर का उपयोग झिल्ली ब्लॉक (३.२ कदम देखें) ।
  3. पुनः जांच एक ही समय श्रृंखला से एक अलग आनटिसम (दोहराएं से कदम 3.3-3.6; में उदाहरण < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 7 , ऊपरी छवि).
    नोट: छीन सरणी तो एक और सीरम नमूना reजांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के बाद से पेप्टाइड्स झिल्ली का समर्थन मैट्रिक्स को covalently संयुग्मित हैं, हमने दिखाया है कि सरणी अलग करना और अपने perfo खोने के बिना reचक्र के 20 दौर तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैrmance
  4. लंबी अवधि के भंडारण arrays.
    1. टीबीएस बफर में झिल्ली की दुकान के साथ पूरक ०.०२% w/w सोडियम azide परिरक्षक के रूप में । लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक सील प्लास्टिक बैग का प्रयोग करें । पर 4 & #176; ग सीधी रोशनी से सुरक्षा के तहत, गीली झिल्ली को कम 2 साल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 5. डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. मैंयुअल रूप से व्याख्या सकारात्मक प्रतिजन पेप्टाइड्स ।
    1. सकारात्मक एंटीबॉडी संकेतों दिखा स्पॉट का पता लगाने और उनके ग्रिड पदों में से प्रत्येक का निर्धारण ।
    2. धनात्मक पेप्टाइड्स के लिए मुख्य कार्यपत्रक में संबंधित पंक्तियों को हाइलाइट करें ।
  2. मास्टर कार्यपत्रक में सूचीबद्ध पेप्टाइड अनुक्रम पुनर्प्राप्त करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 7 , निचली सूची). डिजाइन सिद्धांत के अनुसार कदम में उल्लिखित 1.4.1., पड़ोसी धारावाहिक स्पॉट शेयर काफी अतिव्यापी अनुक्रम (15-4 = 11), इसलिए प्रतिक्रियाशील epitopes एक लगातार श्रृंखला में पेप्टाइड्स द्वारा साझा किया जा सकता है ।
    1. सफलता में होने वाले किसी भी सकारात्मक धब्बे पर प्रकाश डाला ।
  3. एक श्रृंखला में प्रत्येक पेप्टाइड के लिए ंयूनतम epitope लंबाई निर्धारित करते हैं ।
    1. प्रतिक्रियाशील पेप्टाइड्स के अतिव्यापी खंडों पर आधारित किसी भी संभावित साझा epitope अनुक्रम हाइलाइट करें.
  4. संरचनात्मक मॉडल प्रतिजन epitopes.
    1. प्राप्त करें प्रोटोटाइप प्रोटीन डाटा बैंक से एचएलए क्रिस्टल संरचनाओं निंनलिखित वेब लिंक पर पाया: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. पयमोल में प्रोटोटाइप एचएलए संरचना प्रदर्शन (www.pymol.org से डाउनलोड) ।
    3. Map & #34; या मॉडल की खोज की गई विरोधी दाता epitopes ने क्रियाशील पेप्टाइड दृश्यों पर प्रकाश डालते हुए प्रोटोटाइप एचएलए अणुओं की 3डी संरचनाओं को (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 8 ). पर क्लिक करें & #34;D इसपलए & #34;, तो & #34; ठभूमि & #34;, व चय & #34; वेत & #34;. छवि को बचाने के लिए & #34 पर जाएं; file & #34; व & #34; सेव इमेज As & #34; और फाइल फॉर्मेट का चयन & #34;p एनजी & #34;.
  5. प्रतिवेदन परिणाम र क्रियाशील epitopes नियत alleles ।
  6. एकल-antigen मोतियों (सब) परिणामों के लिए सरणी परिणामों की तुलना करें, यदि उपलब्ध है ।
    नोट: सभी एकल allelic एंटीजन का उपयोग परीक्षण एचएलए प्रोटीन के एक निश्चित पैनल की ओर जेट एंटीबॉडी उपाय । व्यक्तिगत पेप्टाइड्स कि एंटीबॉडी जेट दिखाने के कुछ एचएलए alleles है कि, अगर भी सब पैनल में शामिल हैं, सरणी और सब के बीच सीधी तुलना परिणाम की अनुमति है । हमारा पिछला अध् < सुप वर्ग = "xref" > 17 परिणामों के बीच सहसंबंध का एक उच्च स्तर दिखाया, सुझाव है कि पेप्टाइड epitopes काफी सब के समग्र जेट के लिए योगदान । इसके अलावा, सरणी परिणाम भी एमिनो एसिड विशिष्टता के स्तर को उजागर ।
    1. एक एचएलए लैब जो कि क्या है और जो दाता alleles रोगी के बाद प्रत्यारोपण सीरा के लिए प्रतिक्रियाशील है के बारे में जानकारी प्रदान करता है से सब परिणाम प्राप्त करते हैं । चरण ५.५ से परिणाम । सरणी विश्लेषण के आधार पर भी संबंधित दाता alleles के बारे में जानकारी प्रदान alloantibody जेट के लिए सकारात्मक ।
    2. सब और सरणी परिणामों की तुलना करें ।

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Representative Results

मूल सरणी स्क्रीनिंग विधि17का उपयोग कर अध्ययन में, हम 5 गुर्दा प्रत्यारोपण विषयों की कुल नामांकित । हम हमारे पलटन और उनके संबंधित दाताओं के एचएलए टाइपिंग परिणाम प्राप्त की । उनके मेडिकल इतिहास और allelic एंटीबॉडी titers परीक्षणों से भी हमें उपलब्ध थे । इन 5 रोगियों के बारे में हमारी प्रायोगिक अध्ययन में, हम दो अलग तरीके से तैयार: एक मानक सरणी पेप्टाइड्स और व्यक्तिगत सरणियों कि कस्टम प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता जोड़ी के लिए बने थे की एक निश्चित पैनल के शामिल हैं । जबकि पहली विधि हमें तकनीकी रूप से व्यक्तिगत प्रत्यारोपण में विशिष्टता के उच्च स्तर को प्राप्त करने में सरणी मंच के प्रदर्शन को मांय करने की अनुमति दी थी, इस बाद विधि के लिए व्यक्तिगत प्रोटोकॉल इस लेख और इरादा वीडियो में वर्णित है दाता के व्यापक स्क्रीनिंग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी (डीएसए), जो अक्सर गरीब भ्रष्टाचार के परिणाम5,25,26के साथ सहसंबंधी बनाना ।

व्यक्तिगत arrays पांच मामलों में से दो को लागू किया गया17, और विधि के समग्र कार्यप्रवाह illustrating के लिए, यहां हम इन दो रोगियों (अर्थात् PTN # 4) में से एक पर ध्यान केंद्रित । कस्टम पेप्टाइड सरणी बनाने के लिए प्रमुख प्रौद्योगिकी स्पॉट सिंथेसाइज़र शामिल है । यह एक पूरी तरह से स्वचालित रोबोट प्रणाली है कि Fmoc संश्लेषण का उपयोग कर पेप्टाइड्स सीधे एक झिल्ली पर एक विशेष रूप से व्युत्पंन सेलुलर मैट्रिक्स पर (चित्रा 1) बनाता है । हम व्यक्तिगत अंग दाताओं ' एचएलए दृश्यों से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के बड़े सेट को इकट्ठा करने के लिए सिंथेसाइज़र के लचीलेपन का दोहन किया । आदेश में एक निरंतर epitope जा रहा है जब एक स्थिति से बचने के लिए पर्याप्त कवरेज करने के लिए है "विभाजन" और एंटीबॉडी जेट खो देता है, हम एक "चलने" सीरियल पेप्टाइड्स के डिजाइन के बाद 15-4 = किसी भी तुरंत आसंन पेप्टाइड के बीच ओवरलैप के 11 अवशेषों, तो कि श्रृंखला हमेशा एंटीबॉडी epitopes के ठेठ लंबाई को कवर करने के लिए लंबाई में 4-9 ए. ए. (चित्रा 1) होने का अनुमान पर्याप्त है ।

टेंपलेट एचएलए अनुक्रम सीधे संग्रह EMBL-EBI (यूरोपीय Bioinformatics संस्थान) पर बनाए रखा डाटाबेस से डाउनलोड किया गया । एक उदाहरण के रूप में, PTN # 4 है दाता एचएलए-DQB1 * 03:01:01:01 एलील के लिए खोजा गया था ( चित्रा 2में वेबपेज चित्रण) । संयोजन के रूप में, हम अलग से दाता की दूसरी एचएलए-* 02:01:01 के DQB1 एलील, साथ ही PTN के उन # 4 खुद के लिए दृश्यों को डाउनलोड, एचएलए-DQB1 * 04:02 और * 05:01 । एकाधिक अनुक्रम संरेखण तो Clustal है ओमेगा वेब कार्यों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 3) । परिणामी संरेखण फ़ाइल प्राप्त किया गया था (चित्र 4), जिसमें से सभी बेमेल एमिनो एसिड अवशेषों की पहचान की गई (दाता के अवशेषों पर प्रकाश डाला जाता है) । इसके बाद, हमने अपने सभी बेमेल अवशेषों को कवर करने के लिए पर्याप्त समय तक दाता के टेंपलेट दृश्यों (रेखांकित) को चिह्नित किया । इन टेम्पलेट अनुक्रम के आधार पर और ऊपर वर्णित के रूप में एक "घूमना" डिजाइन का पालन, लंबाई में प्रत्येक 15 aa के पेप्टाइड्स की तीन श्रृंखला एचएलए-DQB1 के लिए प्राप्त किया गया था । इस प्रक्रिया को एचएलए के दाता alleles के आराम करने के लिए दोहराया गया था-A, B, C, DQA1, और DRB1 (DRA1 और डीपी उचित नैदानिक रिकॉर्ड की अनुपलब्धता के कारण बाहर रखा गया) अपने प्राप्तकर्ता के इसी alleles की तुलना में । अंत में, कुल २०२ पेप्टाइड्स सरणी ( चित्रा 5 में एक कार्यपत्रक में पेप्टाइड अनुक्रम और चित्रा 6में एक सरणी चित्रण) विशेष रूप से PTN # 4 के बाद प्रत्यारोपण सीरम की जांच के लिए, और के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए सूचीबद्ध किया गया वे अपने पूर्व प्रत्यारोपण सीरम (चित्रा 7) के बाद पुनः जांच से प्राप्त की । २०२ पेप्टाइड्स में से, 10 की कुल के बाद प्रत्यारोपण नमूना जिसमें से दाता-विशिष्ट अवशेषों (प्राप्तकर्ता से बेमेल) के साथ जुड़े एंटीबॉडी संकेतों से पता चला E87, I306, W243 और K197 के एचएलए-ब * 52:01,-ब * 52:01,-सी * 03:04 और-DQA1 * 05:01 लग रहा था एंटीबॉडी जेट छीनकर में शामिल (अवशेषों में लाल अक्षरों में चिह्नित चित्रा 7).

इसके अतिरिक्त, एक सरणी विधि के प्रमुख लाभों के रूप में पारंपरिक सब परीक्षण की तुलना में है कि epitope जानकारी आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में चित्रा 7में दिखाया गया है । हम सभी पांच रोगियों से ( लियू एट अल में अलग सरणी परिणामों से एचएलए-DQA1 और-DQB1 पर एंटीबॉडी-प्रतिक्रियाशील epitopes की तुलना में । 17) उंहें होने से सभी DQA1 और DQB1 heterodimer (चित्रा 8) के एक सह क्रिस्टल संरचना करने के लिए मॉडलिंग की । उत्साहजनक रूप से, β1 कतरा के रूप में जाना जाता संरचना का एक प्रमुख खंड एक "हॉटस्पॉट" है कि एक बहुत अधिक मौका था (3/5 रोगियों में 2, 3, 5) 5 मामले पलटन में प्रत्यारोपण विषयों के बीच alloantibodies द्वारा लक्षित है ।

Figure 1
चित्र 1 . अंग प्राप्तकर्ताओं में एंटी-दाता एचएलए alloantibodies का पता लगाने के लिए एचएलए-आधारित antigen सरणी पद्धति की समग्र योजना । (अनुकूलित और लियू एट अल से संशोधित । 17) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 . डेटा संग्रह वेबसाइट
एचएलए अनुक्रम को पुनर्प्राप्त करने के लिए, निम्न वेब साइट पर जाएँ: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एकाधिक प्रोटीन दाता का अनुक्रम संरेखण बनाम प्राप्तकर्ता एचएलए-DQB1 alleles Clustal ओमेगा वेब आधारित उपकरण का उपयोग कर ।
कॉपी और पेस्ट रोगी #4 (PTN # 4) के DQB1 * 0201 और 03:01 के दृश्यों, और दाता के DQB1 * 04:02 और 05:01 में फसता प्रारूप में http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/(उदाहरण के लिए, DQB1 * 05:01 PTN के # 4 और DQB1 * 03:01 के दाता इनपुट बॉक्स में दिखाए जाते हैं) . आउटपुट स्वरूप के लिए "STEP2" में "Clustal w/numbers" विकल्प का चयन करें और संरेखण चलाएं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . की तुलनादाता बनाम रोगी/प्राप्तकर्ता एचएलए DQB1 और पेप्टाइड संश्लेषण के लिए टेम्पलेट अनुक्रम का चयन ।
दाता के अनुक्रम बोल्ड में हैं, दाता के साथ लाल फ़ॉंट में विशेष बेमेल और भी काले बक्से के साथ प्रकाश डाला । व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के लिए टेम्पलेट अनुक्रम (रेखांकित) इन दाता-विशिष्ट अवशेष होते हैं । (यह आंकड़ा अनुकूलित और Liuet alसे संशोधित किया गया था । 17) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 . दाता एचएलए पेप्टाइड्स की एक स्प्रेडशीट में मास्टर वर्कशीट का एक उदाहरण ।
सरणी पर पेप्टाइड स्थिति पंक्ति बनाम स्तंभ निर्देशांक द्वारा इंगित किया गया है । पेप्टाइड अनुक्रम रोबोट स्पॉट सिंथेसाइज़र का उपयोग कर संश्लेषण कार्यक्रम के लिए उपयोग किया जाता है । दाता-विशिष्ट अवशेष (प्राप्तकर्ता के इसी alleles से बेमेल) को बोल्ड में हाइलाइट किया जाता है और रेखांकित किया जाता है । पूर्ण लंबाई एचएलए-DQB1 अनुक्रम के लिए संगत पेप्टाइड के प्रारंभ और अंत स्थिति भी संकेत दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . Ponceau एस के साथ सना हुआ एक सरणी अनुभाग की छवि
नोट पेप्टाइड्स के बीच एमिनो एसिड संरचना में अंतर के कारण रंग तीव्रता में असमानता, जबकि सभी स्थान क्षेत्रों के बीच पेप्टाइड सांद्रता एक ही हैं । (छवि एक उदाहरण है, नहीं इस वास्तविक अध्ययन से एक मिसाल है.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . दाता-विशिष्ट एचएलए-A, B, C, डीक्यू, DR PTN # 4 में बेमेल epitopes के सरणी अध्ययन ।
सीरियल पेप्टाइड्स दाता के अनुक्रम से प्राप्त किए गए बेमेल अवशेषों को कवर करने के लिए ( चित्रा 4में DQB1 का एक उदाहरण) । सरणी के बाद जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रत्यारोपण सीरम (लोअर दाग: पोस्ट-tx) और बाद में पूर्व प्रत्यारोपण सीरम (ऊपरी दाग: पूर्व tx) एक ही मरीज से. के बाद से मजबूत धब्बे के चार सेट प्रत्यारोपण जांच लाल लाइनों (निचले दाग में) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, जबकि दो मध्यम तीव्रता स्पॉट है कि केवल पूर्व प्रत्यारोपण सीरम के साथ जुड़े थे नीली लाइनों (ऊपरी दाग में) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं । नीचे तालिका इसी पेप्टाइड दृश्यों और उनके बाद प्रत्यारोपण सीरम के लिए जेट से पता चलता है. दाता-विशिष्ट (बेमेल) अवशेषों E87, I306, W243 और उनके संबंधित alleles के K197 लाल अक्षरों में हैं और मजबूत एंटीबॉडी जेट दिखा पेप्टाइड्स बोल्ड फोंट में हैं । यह आंकड़ा अनुकूलित और लियू एट अल से संशोधित किया गया था । 17. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8 . एचएलए के संरचनात्मक स्थानों-डीक्यू epitopes ।
एचएलए-DQ8 के सह-क्रिस्टल संरचना एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था । संरचना एक DQA1 और एक DQB1 उपइकाई के साथ एक प्रतिजन पेप्टाइड के साथ शामिल किया गया था (a)। α-helices और β-किस्में के प्रोटीन द्वितीयक संरचनाओं पैनल में दिखाया गया है (B)। DQA1 और DQB1 पेप्टाइड्स कि या तो पांच सीरम में से एक के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की सह क्रिस्टल संरचना पर स्थित थे ( एक और में बी: नीले रंग में छायांकित). तीन β-कतरास, β1, β6 और β12 ( बीमें डार्क ब्लू), प्रत्येक कई पेप्टाइड्स द्वारा प्रतिनिधित्व (छोटे लाल लाइनों DQA1 के रैखिक ए. ए. पदों के लिए इसी), कई मरीजों के नमूनों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की (मूल परिणाम लियू एट अल. 17). सभी छह DQB1 पेप्टाइड्स (बोल्ड फ़ॉन्ट में) रोगियों में एंटीबॉडी के लिए प्रतिक्रियाशील #2, #3, #5 β1 "हॉटस्पॉट" खंड के लिए स्थित हैं ( बीमें: लाल तीर से बताया). यह आंकड़ा लियू एट अल से अनुकूलित किया गया था । 17. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित स्थान सरणी के डिजाइन एक अंग है दाता एचएलए एंटीजन के खिलाफ प्रत्यारोपण में alloantibody विशिष्टता के प्रायोगिक अध्ययन के लिए है । मौजूदा सब परख मोटे तौर पर क्लिनिक में इस्तेमाल के विपरीत, प्रतिजन सरणी विधि अपनी लचीली डिजाइन कि व्यक्तिगत दाता के सच एचएलए दृश्यों को समायोजित कर सकते में एक प्रमुख लाभ है । नए मंच तेजी से आगे बढ़ डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी है कि जल्द ही सटीक एचएलए allelic अनुक्रम रीडिंग का उत्पादन करने में सक्षम हो जाएगा की क्षमता का दोहन16,27 और नामित डेटाबेस की क्षमता वैश्विक जनसंख्या में भंडार एचएलए जुगाड़ के लिए15 . हमारे वर्तमान सरणी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रत्यारोपण सीरा के कई प्रायोगिक अध्ययन की सफलता के आधार पर विकसित किया गया था । यहां हम जोर देना चाहिए कि इस स्तर पर, हमारे प्रोटोटाइप arrays केवल अनुसंधान के उपयोग के लिए निर्माण कर रहे हैं, नैदानिक अभ्यास में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए नहीं ।

सब और हमारे प्रतिजन सरणी के बीच एक और उल्लेखनीय अंतर यह है कि बाद के लिए एक उच्च संकल्प एचएलए दृश्यों के 15 ए. ए. खंडों के भीतर संभावित प्रतिजन epitopes भेद है, जो alloantigenicity के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है18 . हालांकि, सब के विपरीत है कि पूरे प्रोटीन एंटीजन प्रस्तुत करने के लिए उनके जोड़ संरचनाओं के अनुकूल, प्रतिजन सरणी केवल कम पेप्टाइड्स, जो गठन की तह के बारे में जानकारी शामिल नहीं है शामिल हैं । इसलिए, arrays एंटीबॉडी का पता लगाने कि केवल epitopes, जो कुछ का मानना है कि सभी कार्यात्मक epitopes एंटीबॉडी मध्यस्थता अस्वीकृति28,29के लिए प्रासंगिक के बहुमत का गठन पहचान नहीं कर सकते । फिर भी, अंय संदर्भों में, रैखिक epitopes के खिलाफ एंटीबॉडी कार्रवाई, जैसे उन कम पेप्टाइड्स में, वायरल प्रतिजन प्रतिक्रियाओं में शोषण किया जा रहा है और वैक्सीन डिजाइन30,31में । हम यह भी ध्यान देना चाहिए कि, रोगी के नमूनों की सीमित संख्या में परीक्षण किया, हमारे सरणी के पता लगाने संवेदनशीलता प्रदर्शन कि सब से अधिक है और दाता का पता लगाने की अनुमति दी विशिष्ट एंटीबॉडी के नैदानिक प्रगति के दौरान17 जितनी जल्दी एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति. यह सब की तुलना में सरणी पर स्थानीय प्रतिजन पेप्टाइड्स के उच्च दाढ़ एकाग्रता के कारण है । इस सुविधा के मामलों में विशेष रूप से उपयोगी था जब सब कोई जेट का पता चला जबकि नैदानिक और एंटीबॉडी के रोग सबूत-मध्यस्थता अस्वीकृति स्पष्ट था, जैसा कि हम पहले दिखाया17। हालांकि, यह कहना है कि इस व्यक्तिगत परीक्षण और अधिक समय है मानक सब परीक्षण की तुलना में लेने के लिए महत्वपूर्ण है । सरणी परीक्षण के लिए अंग दाता और (प्रस्तावित) प्राप्तकर्ता के एचएलए अनुक्रम antigen पेप्टाइड्स के डिजाइन शुरू करने से पहले प्राप्त करने की आवश्यकता है । यह तो कई दिनों के लिए सरणी और एक और 7-8 घंटे एंटीबॉडी परिणाम प्राप्त करने के लिए उत्पादन लेता है । इसलिए, लंबी प्रक्रिया मृतक दाता प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं है, जब तक एंटीबॉडी परीक्षण के मुख्य उद्देश्य दाता के उद्भव विशिष्ट एंटीबॉडी प्रत्यारोपण के बाद निर्धारित करने के लिए है, बजाय पूर्व प्रत्यारोपण मूल्यांकन के लिए मौजूदा एंटीबॉडी की ।

सरणी विधि antigen epitopes का पता लगाने में मौजूदा सब परीक्षण से एक बड़ा सुधार था । इसके अलावा, हम एक के लिए पांच प्रत्यारोपण रोगियों में प्रतिक्रियाशील epitopes नक्शा एचएलए-डीक्यू, जिसमें हम अपने β1 किनारा है कि पांच रोगियों में से तीन में हुई में epitope "हॉटस्पॉट" के एक टेंपलेट की संरचना करने का प्रयास किया17। साज़िश, एचएलए के β1 किस्में-DQA1 और-DQB1 antigen-प्रस्तुति की गुफा (चित्रा 8), एक के लिए प्रत्यारोपण अस्वीकृति३२के संदर्भ में प्रतिजन ज्ञात स्थान की नाली में स्थित हैं । इसलिए, हम पूर्वानुमान विस्तारित प्रत्यारोपण पलटन अध्ययनों में हमारे व्यक्तिगत प्रतिजन सरणी विधि के भविष्य की खोज एचएलए अणुओं में प्रतिजनी हॉटस्पॉट पर मूल्यवान अंतर्दृष्टि उपज जाएगा । इन की पहचान के आकर्षण के एक सूची, जब भावी दाताओं और प्राप्तकर्ताओं के बीच एचएलए जीन के अत्यंत सटीक डीएनए अनुक्रमण टाइपिंग के साथ संयोजन के रूप में माना जाता है, अंततः स्वीकार्य बेमेल कार्यक्रमों के माध्यम से पूर्व प्रत्यारोपण निर्णय की सहायता करेंगे ३३, और अधिक प्रभावी ढंग से बचने के लिए लक्षित आसपास के क्षेत्र में कुछ बेमेल सूची के आकर्षण के लिए ।

संक्षेप में, हमारे मूल अध्ययन विशिष्ट विरोधी एचएलए alloantibodies का पता लगाने के लिए एक प्रतिजन सरणी के व्यक्तिगत डिजाइन की खोज में17 अपनी तरह का पहला था । अध्ययन का ध्यान सरणी डिजाइन और कार्यांवयन, जो संभावित भविष्य प्रौद्योगिकी के लिए एक प्रोटोटाइप के रूप में कार्य की व्यवहार्यता पर था । हमारे पायलट अध्ययन न केवल नैदानिक नमूनों से उत्साहजनक परिणाम उत्पंन, लेकिन यह भी हमें कुल लागत और परीक्षण की गति का अनुमान लगाने की अनुमति दी । हमारे वर्तमान प्रयोगशाला की स्थापना में एक व्यक्तिगत सरणी के उत्पादन लागत $१,००० अमरीकी डालर के तहत है, जो एक बार के बाद से सरणी तो समय पर इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से जांच चक्र के प्रदर्शन के नुकसान के बिना 20 दौर में है । यह प्रत्यारोपण विषयों की एक व्यापक पलटन के साथ सरणी प्रोटोकॉल के अतिरिक्त परीक्षण और अधिक विधि है कि एक दिन नैदानिक अभ्यास में इस्तेमाल किया जा सकता है को कारगर बनाना होगा संभव है ।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव नहीं घोषित.

Acknowledgments

हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । शॉन ली और कनाडा में पश्चिमी विश्वविद्यालय के Xing li स्थान सरणी उत्पादन के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए । हम Histocompatibility कोर पर और नमूना सेवाएं प्रदान करने के लिए पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय के व्यापक प्रत्यारोपण केंद्र में स्टाफ के सदस्यों के लिए आभारी हैं । यह काम आंशिक रूप से पश्चिमोत्तर मेमोरियल अस्पताल के सहायक बोर्ड द्वारा समर्थित किया गया है, और एक संकाय स्टार्टअप जे को पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की निधि से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).

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जैव रसायन अंक १२७ अंग प्रत्यारोपण एंटीबॉडी मध्यस्थता प्रत्यारोपण अस्वीकृति (AMR) मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) एचएलए बेमेल Alloantibody प्रतिजन सरणी स्पॉट संश्लेषण
अंग प्रत्यारोपण में एचएलए Alloantibodies का पता लगाने के लिए निजीकृत पेप्टाइड सरणियों
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S.,… More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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