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Biochemistry

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

Abstract

장기 이식, 기능 및 장 수는 이식의 비판적으로 의존 인간 백혈구 항 원 (HLA)에 대 한 면역 거부 반응 제어 성공. 실험실 테스트 안티-HLA 면제, 기존으로 선물의 기반으로하는 조직 적합성 지침 또는 드 노 보 주요 이식 장벽을 구성 하는 HLA 항 체를 생성. 현재 테스트 ~ 100 미리 재조합 HLA 항 원에 대 한 고정된 된 이식 세라 프로브를 사용 하 여 단일 원 구슬 (SAB) 플랫폼을 기반으로 합니다. 그러나, 인 간에 있는 HLA 종류, 쌍둥이 이외의 HLA 시퀀스의 동일한 조합을 공유 하는 수 없이 두 개인의 훨씬 더 큰 다양 한을 존재 한다. HLA 타이핑과 직접 시퀀싱 기술 DNA 순서는 기증자의 사이 어떤 불일치를 정확 하 게 캡처할 수 있습니다 받는 사람의 HLA, SAB 분석 결과 시퀀스 표시에서 그것의 한정 된 다양성 때문이 정확 하 게 감지할 수 있는 동안 기증자의 HLA 불일치에 대 한 구체적으로 alloantibodies입니다. 우리가 감지 하 고 개인으로 반대로 기증자 HLA 항 체의 특성 다른 기술을 사용 하 여 보완 방법을 개발 하고자 했다. 검사 도구는 주문 펩 티 드 항 체 중재 거절에 대 한 위험을 평가 하기 위해 기관 수령인의 포스트 이식 세라 프로 빙에 대 한 기증자 HLA 파생 된 시퀀스의. 한 기증자 받는 쌍에 대 한 단일 배열에 600 독특한 펩 티 드까지 만들어집니다 기반으로 기증자의 HLA 단백질 시퀀스에 15-아미노 산 성 순서로 하나 이상 일치 하지 않는 찌 꺼 기를 들고 각 펩 티 드. 사전 및 사후 식을 세라가이 배열에 대 한 항 원 패턴을 비교를 우리의 파일럿 실험, 또한 관련 된 면역 epitopes를 정확 하 게 우리를 허용 하는 해상도와 안티-HLA 신호 수 있었습니다. 이러한 맞춤 항 배열 장기 이식 기증자 특정 HLA epitopes의 고해상도 검출 허용.

Introduction

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전 세계에 걸쳐 정기적으로 실시 하는 기관 대체 요법 수백만의 목숨을 저장 하고있다. 동안 큰 번호 아직도 대기에 기증자 기관 (기관에 의해 제공 된 정보에 따르면 공급의 심각한 부족으로 인해 받을 수 단단한 장기 이식, 매년 미국에서 백만 명 당 약 100 환자에서 발생 조달과 이식 네트워크-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). 장기 이식 기관 낭비 하 고, 생명을 구할 높은 규제는 하지만 이러한 규정을 알려 하는 데 사용 하는 과학적인 도구 효과에서 제한 됩니다. 예를 들어, 과학계는 완전히 HLA 분자의 높은 다형 상태를 인식 하 고 고해상도 입력 하 고 (SBT) 입력 시퀀스 기반을 사용 하 여 DNA의 정확한 유전 테스트 최근 몇 년 동안1, 에서 개발 되었습니다 그러나 2., alloantibody 검사 방법 아직 되지 않은 항 원 조사로 개별 HLA 시퀀스의 광대 한 다양 한 생산할 수 있게. 현재는 불변 패널을 사용 하는 표준 시험 ~ 100 유전자 항 원 HLA의 일반적인 이체의 구성 하는의 A, B, C, DQ, DP와 박사는 인구3,4,,56시퀀스. 자주, 실제 기증자의 HLA 시퀀스에에서 포함 되지 않은 강제 이식 의사와 외과 기증자의 실제 시퀀스와 해당 "표준" 사이의 공유 유사성에 따라 기증자 특정 반응성 추론 테스트 패널에는 테스트 설정7,8. 따라서, 그것은 때로는 거부 위험 항 체 테스트 결과9,10,,1112에 따라 신뢰할 수 있는 평가 하도록 도전. 따라서, 새로운 개인적으로 alloantibodies에 대 한 사용자 정의 테스트는 긴급 하 게 필요한13,14.

HLA 유전자는 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 수용 체를 면역 반응6에 있는 주요 기능을 인코딩합니다. HLA 유전자 인간 게놈6의 가장 다형성 유전자 알려져 있습니다. DNA의 급속 한 발전으로 인해 시퀀싱 HLA 유전자의 새로운 유전자 변형에 대 한 전략 (또는 단순히 대립 유전자 라고 합니다)는 폭발적인 속도15,16에서 발견 되 고 있다. 3 월 2017 년까지 16,755 검증된 대립 했다 입금 되었습니다 IMGT/HLA 데이터베이스 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)에 12,351의 클래스의 했다 내가 하 고 4,404 클래스 II 그룹의 했다. 강한 대조에서는,만 조금 100 가지 대립 유전자는 일상적으로 장기 이식에서 alloantibodies를 검색 하는 데 사용 되는 표준 단일 원 구슬 (SAB) 분석 결과에 표시 됩니다. SAB 메서드 cytometry 사용 Luminex 플랫폼을 기반으로 합니다. 이후 분석 결과 활용 생산, 작은 일괄 처리에 배치 variabilities 외 항, 불변 집합 개인 및 실험실5를 통해 튼튼하게 원으로 테스트 표준화 수 있다. 그러나,이 테스트는 특히 기증자 시퀀스는 결 석 하는 경우 기증자 대립 유전자에 대 한 구체적으로 개발 하는 모든 alloantibodies를 캡처할 수는 SAB에서 설정. 진정한 시퀀스에 따라 기증자의 항 원의 사용자 지정 생산 하는 데 필요한, 하지만 필요한 생산을 합리화 하 고 테스트 절차에 기술적도 전에 남아 있다.

우리는 최근 신장 이식 과목17의 타당성 조사에서 다른 방법론을 설명합니다. 메서드와 사전 조사에 대 한 펩 티 드 항 원은 배열 형식에 사용 후 세라 개별 과목의 이식. 각 배열이 했다 자리 합성 방법18,19,20,21,22,23 펩 티 드 항 원, 각 15 생산을 사용 하 여 사용자 지정 길이, 아미노산 완전히 기반으로 각 장기 기증자의 HLA 대립 유전자 a, B, C, DQA1, DQB1, DRB1. 자리 합성 표준 Fmoc 화학22 를 사용 하 여 셀 루 로스 멤브레인에 운영 되 고 완전 자동화 된 로봇 시스템19,21병행에서 사용자 지정 펩 티 드의 수백을 생산할 수 있다. 막 배열 스트립 및 사이클 reprobing의 여러 라운드를 견딜 수 있습니다. 우리의 회고전 연구17, 우리는 저장된 이식 antisera (즉, 이식 전후) 시계열에서 수집 된 항 원 패턴의 변화를 감지. 여기 우리는 제조, 원으로 조사 및 결과 분석 배열 디자인을 포함 하 여 워크플로에 대 한 기술 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 특정 선형 epitopes 이식 기증자의 HLA 분자에 대 한 alloantibodies를 감지 하는 위한 것입니다.

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Protocol

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여기 설명 된 모든 방법을 노스웨스턴 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다 (IRB 프로토콜 #: STU00104680). 프로토콜의 전반적인 흐름은 그림 1에 나와.

1. 기증자와 받는 사람 HLA 시퀀스 Bioinformatic 분석

  1. IMGT/HLA 데이터베이스에서 시퀀스 검색 15.
  2. 장기 기증자와의 받는 사람 모두의 얻을 HLA 타이핑 보고서
      .
      참고: 기밀 의료 기록 보호 하기 위해 적절 한 절차를 활용 해야 합니다. 일반적으로, 연구 프로토콜 또는 실험 테스트의 기관 평가 위원회 (IRB) 승인이 기관 IRB 지침 당 필요 합니다. PCR 기반 입력 (높은 또는 낮은 해상도) 또는 시퀀싱 기반 입력 (SBT)에서 HLA 보고서 라면 1.1.3 단계로 직접 이동 합니다. 시퀀스/HLA 게놈 시퀀싱에서 가져온 그리고 그들은 완벽 한 이러한 시퀀스 직접 대신 사용 합니다. 때때로, 단지 불완전 한 입력 또는 시퀀싱 결과 사용할 수 있는 추가 단계 1.1.2 따라. 할당 하는 " 누락 된 " 단계 1.1.2에서에서 설명한 웹 도구를 통해 대립.
    1. 오픈 웹을 다음과 같은 모호한 대립 유전자 조합 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, 및 사용 하 여 검색 된 “ 모호한 대립 유전자 조합 검색 도구 ” 가상 대립 유전자를 검색 하는 기능. 그런 다음, 1.1.3 단계를 진행 합니다. 대립 유전자 이름을 입력 하려면.
    2. 다음 IMGT/HLA 대립 유전자 쿼리 양식을 열고 웹 링크-http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html, 및 입력된 제목 ’ s 대립 유전자 이름 (각각 개별적으로, 그림 2와 같이)에 “ 검색 대 한 ” 상자. 클릭은 “ 지금 대립 유전자에 대 한 검색 ” 단추. HLA 대립 유전자 이름이 표준 명명 시스템을 사용 해야 합니다 (, A *, A * 01, A * 01:01:01:01, 및 A * 01010101 같은 어떤 이전 지정).
    3. 찾을 일치 하는 대립 유전자 이름을 화면에 표시. 대립 유전자 버튼을 클릭 합니다.
    4. 복사는 " 단백질 시퀀스 ", 헤더 줄의 아래 텍스트 문서에 붙여 넣습니다 그리고 " > 대립 유전자 이름 ". 효과적으로, 텍스트 문서는 대립 유전자 이름 및 시퀀스의 FASTA (빠른-모든) 형식.
  3. 유전자 기반 다중 수행 기증자와 받는 사람/환자 대립 유전자의 정렬.
  4. 하나
      유전자 (즉, DQB1 * 03:01:01:01) 한 번에 복사 하 고 텍스트 문서에 기증자와 환자 FASTA 시퀀스 (기증자에서 2)와 두 개의 환자에서의 모든 4 개의 대립 유전자를 붙여 넣습니다. 이 시점에서, 그것은 차동 환자 대립 유전자 이름에서 기증자 대립 유전자 이름을 표시 하는 것이 중요 (옵션 차동 사용 낮은 경우; 대 위를 포함 하거나 별도로 기증자 대 표시 각 대립 유전자 이름에 구별 접두사 또는 접미사 확장을 만듭니다. 환자 대립 유전자)입니다. 정렬 순서는 순서의 어떤 쌍 든 지 사이 유사성 수준에 따라 단행 될 것입니다 다음 때문에 시퀀스의 입력된 순서가 중요 하지 않습니다.
    1. 복사 및 붙여넣기 FASTA에 시퀀스 형식으로 위에서 (로 그림 3에서 본)는 “ 입력된 시퀀스를 입력 ” 클러스터 오메가 웹사이트에 상자: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    2. 클릭 " 작업을 제출 " 매개 변수의 표준 설정을 사용 하 여:와 같은 " PROTEINŔ 및 " 숫자 승 Clustal ". 클릭 하 여 정렬 수행 " 제출 ". 4 시퀀스의 정렬 화면 ( 그림 4)에 표시 됩니다.
  5. 기증자 전용 불일치 표시.
    참고: 그것은 특별히 지적 한다 여기에서 주어진 유전자 시퀀스 시퀀싱 하지를 HLA 입력의 결과에 근거 했다 그. 따라서, 특정 기증자 받는 쌍에서 관련 시퀀스 변화를 놓칠 수 있습니다 위험이 있다. 이 잠재적인 문제 이상으로 완화 될 것 이다 더 많은 이식 센터 정확한 고해상도 입력을 채택 하 고 DNA 시퀀싱을 직접.
    1. 복사 맞춤 텍스트를 텍스트 문서에 붙여 하 고 새 문서를 만듭니다. 정렬 된 파일의 포맷을 방해 하는 경우 글꼴 스타일과 크기를 변경 하 여 형식을 수정: 항상 사용 " Courier New " 행에 맞게 작은 종류 크기에 글꼴. 서식 문제를 해결 한 후 문서를 저장.
    2. 수동으로 고유 기증자에 게 속해 있는 모든 일치 하지 않는 잔류물을 식별 하는 정렬 된 시퀀스를 검사 합니다. 각 구별 글꼴 색을 사용 하 여 이러한 기증자 특정 잔류물의 표시.
    3. 기증자에 있는 모든 문자를 밑줄 ' s 시퀀스는 14 잔류물 모두 최대-확장 및 표시 된 기증자 전용 불일치의 다운스트림 (계산 불일치의 1 잔류물 마이너스 15 아미노산 펩타이드로).
  6. 겹치는 시리즈 15-메 르 펩 티 드 순서 파생.
    참고: 15-메 르 펩 티 드를 선택 하는 이유는 전형적인 epitopes 되 고 길이 4-9 아미노산의 일반적인 지식에 근거 했다. 따라서, 적용 될 때 우리는 " 이동 창 " 프로시저 4 아미노산 ( 그림 1), 15 아미노산 길이 우리의 선택의 스텝 크기를 왼쪽으로 15-4 = 11 아미노산 겹치는 어떤 이웃 펩 티 드 시리즈에서. 이론,이 11 아미노산 오버랩은 길이, 최대 9 아미노산의 모든 면역 epitopes를 커버 하기에 충분 아니 epitope 실수로 수 있도록 " 분할 " 배열에만 부분 시퀀스 반.
    1. 밑줄이 시퀀스를 사용 하 여 서식 파일을 순차적으로 파생 짧은 시리즈에서 시리즈에서 어떤 두 개의 인접 한 시퀀스 간의 4 잔류물에 의해 중복 15 아미노산 시퀀스.
    2. 복사 및 붙여넣기 스프레드시트 ( 그림 5)는 열 형식에서에 이러한 15 아미노산 시퀀스 기증자 대립 유전자의 해당 이름을 포함 하는 표기법 열 동반. Aa 잔류물 위치를 포함 하는 추가 열이 유용할 수 있습니다.
  7. 1.1.3에서 단계를 반복. 1.3. 각 HLA 대립 유전자 (즉, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1, DP) 기증자의 15 aa 짧은 시퀀스를 파생 하는 기증자와 받는 사람 쌍의에 대 한.
  8. 복사 열을 만드는 긴 연속의 모든 15 aa 시퀀스는 기증자의 모든 대립 유전자에서 마스터 스프레드 시트에 모든 열을 붙여 넣습니다. 문서에서 (펩 티 드 순서)에 대 한 행의 총 수를 적어 둡니다.

2. 사용자 지정 배열 레이아웃 및 생산의 디자인

  1. 생성 해당 대립 유전자와 펩 티 드 순서의 스프레드시트 부름. 배열 20 행 및 30 열 및 20 x 30 = 600까지 저장할 수 있는 펩 티 드에 대 한 명소. 펩 티 드에 기록의 총 수에 따라 하나의 특정 기증자 로부터 1.5 단계 그리고 우리 류 에 시도 했다 두 예제와 함께 우리의 과거의 경험을 기반으로. 17, 600 자리 배열 ~ 2 별도 이식 케이스에서 생성 된 모든 시퀀스를 저장할 수 있습니다.
    1. 합리적으로 가장 e 계획600-자리 형식의 배열 내에서 펩 티 드의 세트에 맞게 fficient 방법.
    2. 하나 이상의 주제는 하나의 전체 배열에 넣을 수 있는, 첫 번째 기증 후 빈 행을 삽입 ' 30 (배열에 있는 행에 관광 명소의 수)로 나눈 수 있는 행의 총 수에 맞게 s 시퀀스.
    3. 즉시 다음 시퀀스의 첫 번째 집합에 대 한 마지막 빈 행, 두 번째 이식 사건에서 시퀀스 내용의 전체 열에 붙여 넣습니다.
    4. 는 배열의 가득 아니 더 많은 경우 600 관광 명소를 초과 하지 않고 추가할 수 있습니다 때까지 이러한 단계를 반복 합니다. 전체 빈 행 하단에 작성 하는 경우 " 이동 " 두 기증자 세트 사이 위치를 빈 행. 이 넓은 공간을 경우 사이 왼쪽 게 3.2 단계 쉽게-다음 종합의 완료 후 막의 절단. 아래.
  2. 배열 레이아웃의 맥락에서 펩 티 드 순서를 프로그램. 자리 합성기의 프로그램은의 시퀀스 (한 행 한 펩 티 드 순서), (대립 유전자 이름, aa에 대 한 추가 열 없이 간단한 텍스트 문서로 2.1.4 단계에서 결과 스프레드시트를 저장 하 여 직접 얻을 수 있는 텍스트 형식 위치 ).
  3. 실행 자동화 된 펩 티 드 배열 합성 자리 합성기를 통해. 종합의 전체 작업은 Kudithipudi 외. 21에 상세 하다. 참고 두 배열의 Fmoc 합성 걸립니다 ~ 4-5 일.

3. 프로브 및 개인의 시간 시리즈에서 Reprobe Antisera 이식 받는.

참고: 600-자리 막 배열 크기 ~ 7 cm x 13 cm는. 합성, 후 배열은 저장할 수 있습니다 실 온에서 건조 막으로 적어도 2 년 때 직접 빛 으로부터 차폐 된. 반복된 사용에 대 한 그의 장 수를 유지 하기 위해 막의 과도 한 접는 방지.

  1. Rehydrate 에탄올 막 배열 및 펩 티 드 명소 Ponceau S.로 얼룩진 시각화
      막 rehydrate
    1. 배열 단계적 절차 리 에 최적화 된 펩 티 드를 들고 24.
      1. 100% 에탄올 20 mL에 배열 막 몰입할.
      2. 추가 20 mL 증류수 50% 에탄올으로 솔루션을 희석 하 여 15 분에 대 한 실 온에서 품 어
      3. 세 번 100% 물 40 mL를 집중 솔루션을 변경 하 고 각 시간 15 분을 품 어.
      4. 예를 들어, 5 분에 대 한 세 번 20ml (Tris 버퍼 염 0.1%), TBST의 적절 한 작업 버퍼에서 세척.
    2. Ponceau S 합성 펩 티 드를 시각화 하는 배열의 얼룩
      1. 수산화 배열에 직접 사전 공식화 Ponceau S 솔루션의 20 mL를 추가 하 고 ~ 30 품 어 떨고 s.
      2. 실행 증 류 물 지속적으로 드 배경 Ponceau S 색 얼룩을 막. 과정에서 펩 티 드 명소 붉은 색의 표시 될 수 있습니다.
      3. 개별 사례에 대 한 배열의 섹션 사이 신중 하 게 절단 하 여 각 기증자에 대 한 배열 부분을 구분 합니다. 각 배열의 방향을 표시.
  2. 사전 블록 배열.
    1. 블록 5%의 20 mL에 막 비-지방 우유 TBST 버퍼에 녹아. 이 우유 기반 솔루션 Ponceau S 컬러 드 얼룩 추가 됩니다. 깨끗 한 펩 티 드 이미지를 달성 하기 위해 여러 번 우유 버퍼를 교체.
    2. 기록 유지 목적을 위해 휴대용 카메라 (예를 들어 그림 6 참조)를 사용 하 여 배열의 Ponceau S 이미지의 사진의 찍을.
    3. 계속 5% 비-지방 우유 또는 락 2 h에 대 한 실 온에서 하룻밤에 4 ° C에서에 막의 차단.
  3. 이식 원으로 품 배열.
    참고: 그것은 이어야 한다 현상 prozone 라고 주의 또는 후크 효과 혈 청 항 체 분석에서 보완-종속 간섭에서 발생할 수 있습니다. 이 문제를 우회 하는 선택적 세럼 전처리 단계 혈 청 샘플의 EDTA 또는 열 비활성화로 여겨질 수 있다.
    1. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 세척 TBST의 20 mL와 함께 막 세 번 다음 날 5 분 동안 각 시간.
    2. 2.5%의 20 mL를 받는 조 혈 청의 추가 20 µ L TBST 버퍼에 우유와 실 온에서 2-3 h에 대 한 막으로 품 어. 그의이 초기 라운드에서 것이 좋습니다 마지막 포스트 이식 혈 청 (또는 가능성이 가장 민감하게 혈 청) 시계열에서 사용 첫째 note. 이 사전 이식 시간 포인트에서 특히 시리즈에서 이전 표본 적은 다양 한 alloantibodies 시간이 지남에 개발 하는 경향이 있다고 가정 기반으로 합니다. 이 이렇게에서 신호 방해의 어떤 가능성 든 지 " 이성 " 라운드 프로브 사이 이식에 대 한 면역 반응으로 인해 진정으로 개발 된 alloantibody 반응에서 명확 하 게 구분할 수 있습니다.
  4. TBST의 20 mL를 사용 하 여 array를 세척 하 고 2 차 항 체로 품 어.
    1. 씻어 3 시간 10 분 동안 막 때마다.
    2. 또 다른 2 헤에 대 한 1% 우유와 함께 보충 TBST 버퍼에 1:10,000 희석에 염소 안티 인간 IgG-HRP (양 고추냉이 과산화 효소) 이차 항 체와 품
  5. 세척 하 고 오 점 개발.
    1. 씻어 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막 때마다.
    2. 갓 luminol 솔루션의 5 mL을 사용 하 여 수행 향상 된 화학 (ECL) 과산화 수소 솔루션 개발 (1 분)에 대 한 막의 5 mL와 혼합.
    3. 시각화 ECL 적합 한 영상 (즉, ChemiDoc 이미징 시스템이 나 Azure C600)를 사용 하 여 신호.
  6. 스캔 및 오 점 계량.
    1. 개발된 이미지 ( 그림 7, 낮은 이미지)를 저장 하 고 자리 강도의 정량화를 수행.

4. 임상 시계열 원으로 반응성 비교.

  1. 스트립 배열.
    1. 이 시점에서 계속 항상 젖은 막.
    2. 20 분 동안 37 ° C에서 상업 스트립 버퍼의 20 mL와 함께 배양 하 여 멤브레인을 제거 하 고 10 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막 씻어. 다음 차단 (4.2 단계)와 다른 시간에 찍은 환자의 다른 혈 청을 사용 하 여 검색 (4.3 단계) 단계를 반복.
  2. 블록 제거 막.
    참고: 다음 스트립, 막의 시간 시리즈에서 동일한 환자에서 다른 혈 청의 또 다른 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다.
    1. 이전 5% 우유 버퍼를 사용 하 여 막 차단 (단계 3.2 참조).
  3. 같은 시계열 (3.3-3.6에서 반복 단계, 그림 7, 위 이미지에서에서 예제)에서 다른 원으로 reprobe.
    참고: 제거 배열 다음 다른 혈 청 견본 reprobe를 사용할 수 있습니다. 이후는 펩 티 드 covalently 막의 지원 매트릭스를 활용은, 우리 배열 스트립과 그 perfo를 잃지 않고 사이클 reprobing의 최대 20 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다 보였다rmance.
  4. 배열의 장기 저장.
    1. 저장소 TBS 버퍼에 막 부식으로 0.02 %w / w 나트륨 아 지 드와 함께 보충. 봉인된 된 비닐 봉투를 사용 하 여 장기 보관을 위해. 직접적인 빛에서 보호에서 4 ° C에서 젖은 막 적어도 2 년 동안 저장할 수 있습니다.

5. 데이터 수집 및 분석

  1. 수동으로 주석을 긍정적인 항 원 펩 티 드.
    1. 긍정적인 항 체 신호를 보여주는 관광 명소를 찾아서 각 그들의 격자 위치 결정.
    2. 긍정적인 펩 티 드에 대 한 마스터 워크시트에서 해당 행을 강조.
  2. 검색 마스터 워크시트 ( 그림 7, 하단 목록)에 나열 된 펩 티 드 순서. 단계 1.4.1에서에서 설명 하는 디자인 원리에 따르면., 크게 겹치는 순서를 공유 하는 인접 직렬 명소 (15-4 = 11), 따라서 반응 epitopes 공유할 수 펩 티 드 연속 시리즈에서.
    1. 연속적으로 발생 하는 어떤 긍정적인 반점 든 지 강조.
  3. 일련 있는 각 펩 티 드에 대 한 최소 epitope 길이 결정.
    1. 어떤 잠재적으로 공유 피토 프 시퀀스 세그먼트 반응 펩 티 드의 중복에 따라 하이라이트.
  4. 구조적 모델 항 원 epitopes.
    1. 얻을 프로토 타입 HLA 크리스탈 구조 단백질 데이터 은행에서 다음에 발견 웹 링크: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Pymol (www.pymol.org에서 다운로드)에 HLA 구조 프로토 타입을 표시.
    3. 지도 " 또는 모델 반응 펩 티 드 순서 ( 그림 8)를 강조 표시 하 여 프로토 타입 HLA 분자의 3D 구조에 반대로 기증자 epitopes를 발견. 클릭 " 표시 ", 다음 " 배경 ", 선택 하 고 " 화이트 ". 이미지를 저장 하려면 " 파일 " 및 " 다른 이름으로 이미지 저장 " 파일 포맷을 선택 " png ".
  5. 결과 보고 하 고 해당 대립 유전자에 반응 epitopes를 할당할.
  6. 비교 가능한 경우 단일 원 구슬 (SAB) 결과 결과 배열.
    참고: SAB 테스트 사용 하 여 단일 유전자 항 원 HLA 단백질의 고정된 패널 쪽으로 항 체 반응을 측정 합니다. 개별 펩 티 드 항 체 반응을 보여 주는 또한 SAB 패널에 포함 된 경우 배열와 SAB 결과 사이의 직접 비교를 허용 하는 특정 HLA 대립 유전자에 속한다. 우리의 이전 연구 17 펩 티 드 epitopes SAB.의 전반적인 반응에 크게 기여 하는 것을 건의 결과 간의 상관 관계의 높은 수준을 보였다 또한, 배열 결과 또한 아미노산-특이성의 레벨을 공개. 여부에 대 한 정보를 제공 하 고 어떤 기증자 대립 후 이식 환자의 혈 청을 반응
    1. 얻기 SAB HLA 실험실에서 결과. 단계 5.5에서에서 결과입니다. 배열에 따라 분석 또한 alloantibody 반응성에 대 한 긍정적인 해당 기증자 대립 유전자에 대 한 정보를 제공.
    2. 비교 SAB 및 배열 결과.

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Representative Results

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원래 연구 방법17상영 하는 배열을 사용 하 여, 우리는 신장 이식 과목 5 과목의 총 등록. 우리는 입력 결과 우리의 코 호트의 및 그들의 각각 기증자의 HLA를 얻은. 그들의 병력 및 유전자 항 체 titers SAB 테스트에서 우리에 게 제공 했다. 이 5 환자의 우리의 파일럿 연구에서 두 개의 다른 방법론 고안: 각 기증자와 받는 사람 쌍에 대 한 사용자 지정 된 펩 티 드 및 맞춤의 고정된 패널의 구성 표준 배열 만든. 이 후자의 방법에 대 한 맞춤된 프로토콜이 기사와 의도 비디오에서 설명 하는 첫 번째 방법은 기술적으로 개별 이식에 특이성의 높은 수준을 달성 배열 플랫폼의 성능을 확인 하기 위해 우리를 허용 했다, 기증자 특정 항 체 (DSA)의 포괄적인 검사는 종종 가난한 이식 결과5,,2526상관.

개인된 배열 5의 경우17, 두에 적용 된 그리고 방법의 전체 워크플로 보여주는, 여기 우리가에 초점을이 두 환자 (즉 PTN #4) 중 하나. 주문 펩 티 드 배열 만들기 위한 핵심 기술을 자리 합성기를 포함 한다. 그것은 펩 티 드 Fmoc 합성 막 (그림 1)에 특별히 파생된 세포 매트릭스에 직접 사용 하는 완전 자동화 된 로봇 시스템. 우리는 개별 장기 기증자의 HLA 시퀀스에서 파생 된 펩 티 드의 큰 세트를 조립 하는 합성기의 유연성을 악용. 연속 epitope "분할 되 고" 고 항 체 반응 때 상황을 피하기 위해 충분 한 적용 하려면, 우리는 "산책" 디자인 직렬 펩 티 드의 15-4 따라 그래서 어떤 인접 한 펩 티 드 사이 오버랩의 11 잔류물을 = 시리즈는 항상 항 체 epitopes의 전형적인 길이 커버 하기에 충분 한 길이 (그림 1)에서 4-9 aa를 것으로 추정.

서식 파일 HLA 시퀀스 EMBL-에 비 (유럽 생물 정보학 연구소)에서 유지 관리 하는 저장소 데이터베이스에서 직접 다운로드 했다. 예를 들어, PTN # 4의 기증자의 HLA DQB1 * 03:01:01:01 대립 유전자 (웹 페이지 그림 그림2에서)에 대 한 검색. 함께, 우리는 별도로의 기증자의 두 번째 HLA DQB1 대립 유전자에 대 한 시퀀스를 다운로드 * 02: 자신, HLA DQB1 PTN # 4의 그들 뿐만 아니라 01:01, * 04시 02분와 * 05시 01분. 여러 열 정렬 다음 Clustal 오메가 웹 기능 (그림 3)를 사용 하 여 수행 되었다. 결과 정렬 파일에서 모든 일치 하지 않는 아미노산 잔류물이 확인 되었다 (그림 4) 얻은 (기증자의 잔류물은 강조 표시). 다음, 우리는 서식 시퀀스 (밑줄) 충분히 그의 일치 하지 않는 모든 잔류물을 커버 하 긴 했다 기증자의 표시. 기반으로이 서식 파일 시퀀스 "걷는" 디자인에 따라 펩 티 드의 3 시리즈 위에서 설명한 각 15 길이에 aa HLA DQB1 위해 파생 되었다. 이 과정은 기증자의 HLA-A, B, C의, DQA1, DRB1 대립 유전자의 나머지에 반복 되었다 (DRA1와 DP 관련 임상 기록의 불가능 때문에 제외 되었다) 그의 수신자의 해당 대립 유전자에 비해. 끝에, 202 펩 티 드의 총 PTN # 4의 이식 후 혈 청을 조사를 위해 특별히 배열 (워크시트 그림 5에서와 그림 6에서 배열 그림에서 펩 티 드 순서)를 만들기 위한 참여 했다 하 고 결과를 비교 그는 그의 사전 이식 혈 청 (그림 7)의 후속 reprobing에서 얻은. 202 펩 티 드에서 총 10 보였다 항 체 신호 관련 된 (받는 사람에서 일치 하지 않는) 어떤 기증자 특정 잔류물의 포스트 이식 견본 E87, I306, W243 및 K197의 HLA-B * 52:01, B * 52:01,-C * 03시 04분와-DQA1 * 05시 01분 될 듯 항 체 반응 (붉은 글자 그림7에서에 표시 된 잔류물) 선동에 참여.

또한, 전통적인 SAB 테스트에 비해 배열 방법의 주요 장점 중 하나는 그 epitope 정보는 쉽게 얻을 수 있습니다, 그림 7에서 같이. 우리 ( 류 외 에 별도 배열 결과에서 모든 다섯 환자에서 HLA DQA1와 DQB1 항 체 반응 epitopes를 비교 17) 함으로써 DQA1와 DQB1 heterodimer (그림 8)의 공동 결정 구조를 모든 모델. 격려, β1 스트랜드로 알려진 구조의 저명한 세그먼트 "핫스팟" 5 대 일대에는 훨씬 더 높은 기회가 (3/5에 환자 2,3,5) 이식 과목 중 alloantibodies에 의해 타겟이 될 했다 이다.

Figure 1
그림 1 . 기관 수령인에 안티 기증자 HLA alloantibodies을 탐지 하기 위한 항 원 HLA 기반 배열 방법의 전체 체계. (적응 및 수정에서 리 우 외. 17) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 데이터 저장소 웹사이트
HLA 시퀀스 검색, 다음 웹사이트를 방문 하십시오: http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 여러 단백질 시퀀스 Clustal 오메가 웹 기반 도구를 사용 하 여 받는 사람 HLA DQB1 대립 대는 기증자의 정렬.
복사 및 붙여넣기 시퀀스 환자 # 4(PTN#4)의 DQB1 * 0201와 03:01, 그리고 기증자의 DQB1 * 04시 02분, 05:01 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/로 FASTA 형태로 (DQB1 이해를 돕기 위해 * PTN # 4와 DQB1 05시 01분 * 03:01 기증자의 입력된 상자에 표시 됩니다) . 출력 형식에 대 한 "2"에서 "숫자 승 Clustal" 옵션을 선택 하 고 맞춤을 실행 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 비교환자/받는 사람 HLA DQB1 및 펩 티 드 합성에 대 한 서식 파일 시퀀스의 선택 대 기증자.
기증자의 시퀀스에는 굵게, 빨간색 글꼴로 기증자 전용 불일치 또한 블랙 박스와 함께 강조 표시 됩니다. (밑줄) 펩 티 드를 파생 하기 위한 템플릿을 시퀀스 이러한 기증자 특정 잔류물을 포함 합니다. (이 그림은 적응 하 고 Liuet 알에서 수정. 17) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 기증자의 HLA 펩 티 드의 스프레드시트에서 마스터 워크시트의 설명 예.
펩 티 드 위치 배열에 열 좌표 대 행으로 표시 됩니다. 펩 티 드 순서는 합성 로봇 자리 합성기를 사용 하 여 프로그래밍 하는 데 사용 됩니다. 기증자 전용 잔류물 (받는 사람의 해당 대립에서 일치 하지 않는) 굵게 강조 표시 되며 밑줄. 전체 길이 HLA DQB1 시퀀스에 해당 하는 펩 티 드의 시작 및 끝 위치 표시도 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 . 이미지 배열 섹션의 스테인드 Ponceau s
모든 자리 지역 중 펩 티 드 농도 같은 색상 강도 중 펩 티 드, 아미노산 구성에 차이 때문에 격차를 note. (이미지 설명 예, 하나도이 실제 연구에서입니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 . 기증자 특정 HLA A, B, C, DQ, PTN # 4에 일치 하지 않는 epitopes의 박사 배열 연구.
직렬 펩 티 드 일치 하지 않는 잔류물 (DQB1 그림4에서의 예)를 커버 하는 기증자의 시퀀스에서 파생 되었다. 배열 포스트 이식 혈 청을 조사 하는 데 사용 되었다 (낮은 오: 게시물-TX) 이후에 사전 이식 혈 청 (위 오 점: pre-TX) 동일한 환자에서. 포스트 이식 프로 빙에서 강한 관광 명소의 4 세트 (낮은 오 점)에 빨간 선으로 표시 된만 연관 된 두 개의 중간 강도 관광 명소 미리 이식 하는 동안 혈 청 (위 오 점)에서 파란색 선으로 표시 됩니다. 아래쪽 테이블에는 해당 펩 티 드 순서 및 그들의 반응성 포스트 이식 혈 청을 보여 줍니다. 기증자 전용 (일치) 잔류물 E87, I306, W243 및 그들의 각각 대립 유전자의 K197 빨간 편지에 있고 펩 티 드 강한 항 체 반응을 보여주는 대담한 글꼴에 있다. 이 그림은 적응 하 고 리 에서 수정 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8 . HLA DQ epitopes의 구조적 위치입니다.
HLA DQ8의 공동 결정 구조는 템플릿으로 사용 되었다. 구조 항 원 펩 티 드 (A)와 DQB1 소 단위는 DQA1 구성 했다. Α 나선 그리고 β 물가의 단백질 이차 구조 (B)패널에 표시 됩니다. DQA1와 DQB1 펩 티 드 중 하나 5 혈 청으로 반작용 하는 공동 결정 구조에 있는 ( AB: 파란색에서 음영). 3 β 물가, β1, β6 및 β12 b에서(진한 파란색), 여러 개의 펩 티 드 (짧은 레드 라인 DQA1의 선형 aa 위치에 해당)을 나타내는 각 여러 환자 샘플 (원래 결과 류 에 반응 17). β1 "핫스팟" 세그먼트에 위치 하 고 모든 6 DQB1 펩 티 드 (굵은 글꼴)에 환자 #2, #3, #5 항 체 반응 ( b에서: 빨간색 화살표 여). 이 수치는 리 우 외. 에서 적응 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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여기서 설명 하는 자리 배열의 디자인은 이식 한 장기 기증자의 HLA 항 원에 대 한 alloantibody 특이성의 실험 연구입니다. 기존 SAB 클리닉에서 광범위 하 게 사용 분석 결과, 달리 항 배열 메서드는 개별 기증자의 진정한 HLA 시퀀스를 수용할 수 있는 유연한 디자인에 주요 이점이 있다. 곧 모호성16,27 없이 정확한 HLA 유전자 시퀀스 판독을 생산할 수 있을 것입니다 빠르게 전진 DNA 시퀀싱 기술의 잠재력 및 지정 된 데이터베이스의 잠재력을 악용 하는 새로운 플랫폼 저장소에 대 한 HLA15 세계 인구에서 시퀀스. 우리의 현재 배열 검사 프로토콜 이식 세라의 여러 파일럿 연구의 성공에 따라 개발 되었다. 여기 우리는이 단계에서 우리의 프로토 타입 배열 건설 하지 임상 연습에서 진단 응용 프로그램에 대 한 연구 사용에 대해서만 강조 해야 한다.

또 다른 주목할 만한 구별 SAB와 우리의 항은 후자는 alloantigenicity18에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있는 HLA 시퀀스의 15 aa 세그먼트 내의 잠재적인 항 원 epitopes를 구별 하는 더 높은 해상도 . 그러나, SAB 전체 단백질 항 원 그들의 접힌된 구조를 적응을 선물, 달리 항 배열만 통합 짧은 펩 티 드는 구조적 폴딩에 대 한 정보를 제외 합니다. 따라서, 배열 구조적 epitopes만 인식 하는 항 체를 검색할 수 없습니다는 어떤 항 체 중재 거부28,29관련 모든 기능 epitopes의 대부분을 구성 생각. 아직도, 다른 상황에서 그에 짧은 펩 티 드, 등 선형 epitopes에 대 한 항 체 작업 바이러스 성 항 원 응답에서 악용 되 고 있습니다 하 고 백신 디자인30,31. 우리 또한 주의 해야, 환자 샘플 테스트의 제한 된 수에 우리의 배열의 검출 감도 성능 SAB의 초과17 의 임상 진행 중 빨리 기증자 특정 항 체의 검출을 허용 항 체 중재 거절입니다. 이것은 SAB.에 비해 배열에 현지 항 원 펩 티 드의 높은 어 금 니 농도 이 기능은 우리가 보여준 이전17항 체 중재 거절의 임상 및 병리학 적 증거, 명백한 동안 SAB 아무 반응이 감지 될 때 경우에 특히 유용 했다. 그러나,이 개인된 테스트는 표준 SAB 테스트 보다 더 많은 시간이 소요 되는 것을 중요 하다. 배열 검사 항 원 펩 티 드의 디자인을 시작 하기 전에 장기 기증자의 고 (제안된) 받는 사람의 HLA 시퀀스를 취득 해야 합니다. 그것은 다음 몇 일 배열 및 항 체 결과를 얻는 또 다른 7-8 시간 걸립니다. 따라서, 긴 절차에 적합 하지 않습니다 고 인된 기증자 이식, 항 체 검사의 주요 목적은 다음 이식, 기증자-특정 항 체의 출현을 결정 하기 위한 보다 사전 이식 평가 하지 않는 기존 항 체.

배열 방법 검출 하는 항 원 epitopes에서 기존 SAB 테스트에서 주요 개선을 했다. 또한, 우리 5 이식 환자에서 반응성 epitopes HLA DQ, 우리 다섯 환자17에서 3에서 발생 하는 β1 스트랜드에 적어도 1 개의 저명한 "핫스팟" epitope를 언급의 템플릿 구조에 매핑하는 시도 했다. 글, HLA DQA1와 DQB1 β1 가닥의 항 원-프레 젠 테이 션 오목 (그림 8), 이식 거부32의 맥락에서 항 원 것으로 알려진 위치 홈에 있습니다. 따라서, 우리는 우리의 맞춤된 항 배열 방법 확장된 이식 코 호트 연구에서의 미래의 탐사 HLA 분자에 항 원 핫스팟에 귀중 한 통찰력을 얻을 것입니다 예상. 이러한 식별된 핫스팟, 높게 정확한 DNA 시퀀싱 입력 잠재 기증자와 받는 사람, 사이 HLA 유전자와 함께에서 고려의 카탈로그 궁극적으로 불일치를 허용 프로그램을 통해 사전 이식 결정 도움이 될 것입니다. 33, 보다 효과적으로 분류 핫스팟에 부근에서 특정 불일치를 방지 하기 위한 것.

요약 하자면, 특정 안티-HLA alloantibodies의 검출을 위한 항 배열 맞춤된 디자인을 탐험에 우리의 원래 연구17 그것의 종류의 첫번째 이었다. 연구의 초점 배열 설계 및 구현, 잠재적인 미래 기술에 대 한 프로토 타입으로의 타당성에 했다. 우리의 파일럿 연구 장려 임상 견본에서 결과 생성 뿐만 아니라 전반적인 비용 및 시험의 속도 추정 수 있었습니다. 우리의 현재 실험실 속 한 개인 배열의 생산 비용은 배열 reprobing 사이클의 성능 손실 없이 최대 20 라운드에서 시간이 지남에 따라 사용할 수 있습니다 때문에 1 회 비용 달러 1000 달러, 미만입니다. 그것은 가능한 이식 주제의 광범위 한 코 호트와 배열 프로토콜의 추가 테스트 1 일 임상 연습에서 사용할 수 있는 방법을 간소화 추가 됩니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

우리 박사 숀 리를 감사 하 고 자리와 그들의 친절 한 도움에 대 한 캐나다의 웨스턴 대학교의 싱 리 생산 배열. 우리는 샘플 서비스를 제공 하기 위한 조직 적합성 코어와 포괄적인 이식 센터의 노스웨스턴 대학 직원에 감사. 이 작품 보조 보드 노스웨스턴 메모리얼 병원, 그리고 노스웨스턴 대학에서 제공 하는 제이를 교수 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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References

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장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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