Summary
Amyloid nedfall är ett kännetecken för olika sjukdomar och drabbar många olika organ. Detta dokument beskriver tillämpningen av självlysande konjugerade oligothiophene fluorescens färgning i kombination med fluorescence mikroskopi tekniker. Denna färgningsmetod representerar ett kraftfullt verktyg för upptäckt och utforskning av protein aggregat i både kliniska och vetenskapliga uppställningar.
Abstract
Proteiner som insättning som amyloid i vävnader i hela kroppen kan vara orsak eller följd av ett stort antal sjukdomar. Bland dessa finner vi neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom drabbar främst centrala nervsystemet, och systemisk amyloidos där serum amyloid A, transthyretin och IgG lätta kedjor deponera som amyloid i levern, framknä tunnel, mjälte, njure, hjärta och andra perifera vävnader. Amyloid har varit känd och studerade för mer än ett århundrade, ofta med hjälp av amyloid specifika färgämnen som kongorött och Tioflavin T (ThT) eller Tioflavin (ThS). I detta papper presentera vi heptamer-formyl tiopen ättiksyra (hFTAA) som ett exempel på nyligen utvecklade komplement till dessa färgämnen som kallas självlysande konjugerade oligothiophenes (LCOs). hFTAA är lätt att använda och är kompatibel med samtidig färgning i immunofluorescens eller andra cellulära markörer. Omfattande forskning har visat att hFTAA upptäcker ett större antal sjukdomsassocierade protein aggregat än konventionella amyloid färgämnen. Dessutom kan hFTAA också tillämpas för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes att tillåta studier av amyloid fibrill polymorfism. Medan den bildgivande metod som tillämpas är valfritt, vi här Visa Hyperspektrala imaging (HIS), laser scanning konfokalmikroskopi och fluorescens livstid imaging (FLIM). Dessa exempel visar några av de imaging teknikerna där LCOs kan användas som verktyg för att få mer detaljerad kunskap om bildandet och strukturella egenskaper av amyloid. En viktig begränsning till tekniken är, när det gäller alla konventionella optisk mikroskopi tekniker, kravet på mikroskopisk storlek av aggregat att möjliggöra upptäckt. Sammanlagt bör dessutom omfatta en repetitiva β-ark-struktur som möjliggör hFTAA bindande. Överdriven fixering och/eller epitop exponering som ändrar den sammanlagda struktur eller konformation kan återge fattiga hFTAA bindande och därmed utgöra begränsningar till korrekt imaging.
Introduction
Nedfall av amyloid i vävnad är en patologisk kännetecken i ett antal sjukdomar som Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, systemisk amyloidos och prionsjukdomar. Trots förekomsten av amyloid-relaterade sjukdomar, och det faktum att nära 40 olika proteiner hittills har klassificerats som amyloid prekursorer i mänskliga1, är lite känt om relationen mellan amyloid nedfall och sjukdom fenotyp. Histologi av prover från mänskliga patienter har varit används både för diagnostik och vetenskapliga syften. Ett stort antal djurmodeller har fastställts för att undersöka sambandet mellan amyloid börda och beteende, livslängd och ett antal andra fenotypiska Läs outs av sjukdomsprogression2,3. Stora satsningar görs också i läkemedelsutveckling och design att slåss några av våra mest fruktade utbredda sjukdomar. Utvärdering av sambandet mellan genotyp, fenotyp, amyloida plack belastning och drug administration är dock inte rakt fram. Verktyg för färgning och imaging av amyloid i vävnad är ofta trubbiga och med låg upplösning information om amyloid bildas och struktur.
Kongorött Dubbelbrytning, ThT och ThS fluorescens är exempel på klassiska metoder för att upptäcka och analysera amyloid börda i vävnadsprover från patientens biopsier och post mortem prover och djurmodeller av sjukdom4. Dessa tekniker har använts i flera årtionden (kongorött sedan 1920-talet och ThT och derivat sedan 1960-talet), och även om instrumentering har förfinats och möjliggör detaljerad analys, färgning förfaranden och analys fortfarande utförs på samma sätt som nästan ett sekel sedan.
I detta papper beskriver vi utnyttjandet av ett mycket känsliga roman amyloid färgämne, hFTAA5, som gör att de upptäckt av små omogna protein insättningar med hög noggrannhet, samt detektion av mogen amyloid. Jämfört med konventionella färgämnen, har hFTAA visat att upptäcka ett bredare utbud av sjukdomen associerade protein aggregat5,6,7. Dessutom kan hFTAA också tillämpas för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes8. Häri, beskriver vi hFTAA färgning och analys av vävnad från etablerade djurmodeller av prion sjukdom och β-Amyloid prekursor Protein (APP) transgena möss utformade för att efterlikna plack utveckling i Alzheimers sjukdom9,10 . Vi visar också analys av diagnostiska och post mortem prover från patienter som lider av systemisk amyloidos. LCOs har inneboende egenskaper som gör det möjligt för dem att rapportera om konfirmerande skillnader inom en plakett; och genom att kombinera två LCOs med olika egenskaper när det gäller bindande och fluorescens, skillnaden är ännu mer uttalad11. Ett epifluorescensmikroskop utrustade med långa pass filter och ett Hyperspektrala kamerahuvud används för att aktivera objektiva klassificering av spektrala egenskaper och inspelning av micrographs för spektralanalys. Confocal fluorescensmikroskopi med avstämbara laser som magnetisering källa används för att utvärdera en amyloidplack i större detalj tredimensionella egenskaper. Avstämbara lasern möjliggör insamling av magnetiseringen spektrum och ett steg mindre urval av utsläpp våglängder på mikroskopet möjliggör samtidig avbildning av LCO fluorescens och immunofluorescens att bestämma samtidig lokalisering av målprotein och amyloid. FLIM erbjuder oöverträffad känslighet för konfirmerande skillnader ålagts LCOs och avslöjar skillnader som inte kanske upptäcks på fluorescens utsläpp spektra.
De viktigaste målen med den beskrivna färgningsmetod är att underlätta känslig detektion av små amyloid insättningar och karakterisera conformational polymorphism inom amyloid insättningar. Denna kunskap är viktig för den grundläggande förståelsen av protein aggregering sjukdomar.
Protocol
Obs: LCO syntes har utförts i våra labb för mer än ett decennium. Genom att i huvudsak använda protokoll för elektrofil aromatisk ersättning, palladium katalyseras cross-koppling, amide koppling och ester hydrolys, anpassa vi syntetiskt sonder för olika ändamål 5 , 12. efter syntes, karakterisering och rening, LCO produkten är frystorkade och förvaras i rumstemperatur. Några av sonderna (bland dem hFTAA) finns nu kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material).
1. LCO färgning lösning
Obs: om hFTAA är köpt från en kommersiell leverantör, följ leverantören ' anvisningar i stället för avsnitt 1.
- Omsuspendera den frystorkade hFTAA i 2 mM NaOH att förbereda en stamlösning av 1 mg/mL. Hålla beståndet i en injektionsflaska av glas vid 4 ° C. Beståndet kan lagras i ett år.
- På dagen för färgning, förbereda en fungerande lösning genom att späda ut den lager 1:10,000 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
2. Beredning av vävnadsprover
Obs: många vävnadstyper kan avbildas med hjälp av hFTAA som en amyloid markör. Se figur 1 för exempel. hFTAA är känslig för sammanlagda konformation. Färgningen bör därför företrädesvis utföras på störningsfri aggregat utan epitop exponering. Optimal spektrala kvalitet uppnås om vävnad fixering hålls till ett minimum. Färsk fryst material, försiktigt fast i etanol vid tidpunkten för färgning, är därför att föredra. Det är dock möjligt att upptäcka amyloid insättningar också i vävnad som har varit fast med t ex formalin. hFTAA allmänhet penetrerar vävnaden väl. Välj en specimen tjocklek som är kompatibel med den avsedda bildteknik.
- Om formalin fast, parafinembedded sektioner används, deparafinize i xylen över natten. Doppa i avsnitt i i rad bad av 99% etanol, 70% etanol, dH 2 O och PBS, 10 min i varje. Tillåta de vävnadssnitt torka under omgivningsförhållanden.
Försiktighet: Xylen är alltid hanteras i dragskåp kemiska. Xylen och andra organiska lösningsmedel är skadligt.- Tina kryosnitt i rumstemperatur. Fixa avsnitten vävnad i 10% formalin över natten och rehydrera genom att doppa dem i på varandra följande bad av 99% etanol, 70% etanol, dH 2 O och PBS, 10 min i varje. Tillåta de vävnadssnitt torka under omgivningsförhållanden.
- Lägga till droppar hFTAA arbetslösning (ca 200 µL) vävnad avsnitt för att täcka den. Droplet-programmet bör bo på plats av ytspänning. Inkubera i 30 min i rumstemperatur för färgning.
- Skölj av färglösningen med 500 µL PBS med pipett och sedan fördjupa bilden i PBS badet för 10 min. Tillåt i avsnittet torka under omgivningsförhållanden.
- Montera med hjälp av fluorescens monteringsmedium. Tillåta monteringsmedium sedimentera övernattning.
Obs: hFTAA färgning kan utföras i kombination med andra färgning metoder såsom immunofluorescens, cell- eller organell specifika markörer, etc. För att utföra samtidig färgning, köra din kompletta färgning protokoll av val och lägga till hFTAA färgning i slutet, start från steg 2.2. Se figur 2 för exempel. För immunofluorescens, helst välja en sekundär antikropp som är upphetsad på 640 nm eller högre. I denna våglängdsområdet, hFTAA absorberar inte och därför inte kan vara glada och kommer fluorescerar inte. Detta säkerställer att ingen genomlysningseffekten ses mellan hFTAA och antikropp.
3. Mikroskopi
Obs: Använd fluorescens Mikroskop utrustade med långa pass filter. Alla inställningar nedan användes för att generera bilder i figur 4. Justeringar behöva göras beroende på amyloid typ och vävnad provet. Även om hFTAA bunden till amyloid är stabil mot blekning, är det tillrådligt att inaktivera ljuskällan när preparatet inte är granskade eller avbildas.
- Hans
Obs: experimentet utfördes med hjälp av ett epifluorescensmikroskop med långa pass utsläpp filter och ett kamerahuvud för hans (se Tabell för material).- Användning standard fluorescens Mikroskop utrustat med långa pass filter och en Hyperspektrala kamera. Kontrollera att kamerans spektrala är kalibrerad.
- i programvaran, namn projektet, Välj " spektrala bild " och börja förvärv.
- Välj objekt av intresse genom den okulära med filtret 436-nm excitation och skifta ljusstrålen till kameran.
- i the fall Data Manager (CDM), Välj provtypen Spectral, etikett provet, och tryck på förvärva. Fönstret förvärv öppnas.
- i fönstret förvärv " Spectral imaging ", öppna inställningsmenyn, Välj förvärv egenskaper och ange spektralområdet till 460-700, hastighet kvalitet med maximal hastighet och mätningen skriver på gas/laser/smala filter. Stäng dialogrutan.
- i bildmenyn, välj live full. I baren ikoner, inaktivera fransar. Välj eller storlek en region till bild som har minne toppvärdet nedanför 800 MB. Ange ett värde som ger en total bildens ljusstyrka mellan 1.000 och 3.000 exponeringstiden. I baren ikoner, trycker du färgade. Förvärvet kommer att börja. När bild förvärv är klar, tryck på Spara i det " förvärva spektrala bild " dialogrutan och " nya cellen " i de fall data manager dialogrutan.
- Från the CDM, öppna insamlade bilden med knappen start analys. Öppnar fönstret data analys.
- Spectral information kan samlas in från varje pixel i bilden genom att välja ROIs med dialogrutan spektrala display. Välja " definiera " och välj ROIs från relevanta områden i bilden.
- Spara den spektrala data som en textfil med knappen Lib. Sparade txt-filen kan importeras till någon analys programvara av val. Filen .slb kan användas för analys i programmet data analys. Hyperspektrala kubdata från hela bilden kan också exporteras som en raw-fil, som " lager som tif ", eller som " lager i textformat " för data och bild analys program som använder extern programvara.
- Konfokalmikroskopi
Obs: confocal mikroskopet är utrustad med en avstämbara laser som magnetisering källa. För alla fluorescens utsläpp experiment, ställa in laser intensitet till 0,2% (motsvarande en genomsnittlig effekt av 3 µW), pinhole till 1 luftiga enhet, ramens storlek till 1 024 px x 1,024 px, spolningshastighet som 7 och genomsnitt över 16 skanningar och bitdjup som 8 bit (se < s Trong > tabell för material). Dessa inställningar måste anpassas för varje enskild confocal systemet, laserkälla och Provtyp.- För emissionsspektrum, samla in data med hjälp av lambda-läge och magnetiseringen använder argon laser set till 488 nm. Samla utsläpp mellan 503 och 687 nm med 22 kanaler i 32 kanal GASP detektorn. Ställa in förstärkningen till 755.
- Att uppnå enda kanal bilder, använda smart Ställ in alternativet. För FITC (grönt filter), ställa in förstärkningen till 750 och Alexa 535 (rött filter) ställa in förstärkningen till 845.
- Att samla excitation spektrumet med avstämbara laser, använda excitation med 1 nm steg mellan 490 och 545 nm samtidigt samla utsläpp mellan 551 och 586 nm. Ställ in laser intensitet till 2% (vilket motsvarar en genomsnittlig effekt av 30 µW) och vinsten för 774.
- Att samla in Z-stack i spektral-läget skanna igenom djupet av avsnittet i steg i 0,96 µm. Samma excitation och utsläpp inställningar som i steg 3.2.1 kan användas men ställa in förstärkningen till 730.
- FLIM
Obs: confocal mikroskopet är utrustad med en FLIM enhet (se Tabell för material).- Ställa in följande parametrar för mikroskopet confocal: hål, 20; excitation våglängd, 490 nm; laser intensitet, 0,5% (motsvarande en genomsnittlig effekt av 7,5 µW). Använda pulsade lasrar på 40 MHz.
- i the FLIM programvara, ställa in fotonen räkna över 550 nm. I fönstret Visa parametrar följer fotonen räkna tills den Max räkningen är cirka 4000 photon räknas.
- Spara filen och exportera den som SPC bild.
- Passar data till en 2-komponent exponentiell förruttnelse i programvaran FLIM. En passform som ger en χ 2 < 2 är bra. Värdet på y-axeln är antalet räknas för viss livstid.
- Välj ett tröskelvärde för räknas att inkludera, t.ex., 100. Färgkod av T1 och välj livstid utbud. Förfalla är beroende av amyloid strukturen där hFTAA är bunden. Fluorescens livstider mellan 300 och 1000 ps har observerats. Spara filen.
- Exportera raw-data med hjälp av exportalternativ och spara önskade data i en ny mapp.
Representative Results
Känslig och selektiv färgning av amyloid insättningar från ett stort antal proteiner i många olika vävnadstyper från både människor och försöksdjur är avgörande för klinisk diagnostik såväl som i vetenskaplig forskning. I detta papper, vi visar hur detta kan uppnås med hjälp av LCOs, exemplifieras av hFTAA, för färgning och multimodal avbildning av amyloid från ett urval av vävnadstyper. Sedan den första publiceringen av tiopen-baserade amyloid ligands över tio år sedan13, amyloid insättningar består av ett brett utbud av proteiner i en mängd olika vävnader har varit avbildad med LCOs6,7,11, 14,15,16 (figur 1). I kombination med antikroppar eller andra histologiska markörer ger LCOs utmärkta verktyg för både diagnostik och vetenskapliga ändamål (figur 1a, figur 2). Med ett lämpligt urval av fluorescerande markörer, kan flera fluorophores avbildas på samma avsnitt (figur 1a, hFTAA och DAPI, figur 2a hFTAA i immunofluorescens setup). Det är också möjligt att använda raka sektioner för färgning med brightfield och fluorescens (figur 2b, hFTAA och DAB antikropp färgning). HFTAA har nyligen visat sig vara ett mycket lovande komplement till kongorött färgning i klinisk diagnostik7,15 (figur 3).
Utveckling av avbildningstekniker under de senaste årtiondena har ökat behovet av amyloid färgämnen som kan diskriminera mellan minut, men på samma gång djupgående skillnader i amyloid insättningar på ett kvantitativt sätt. Det konjugera systemet inom LCO ger en unik förmåga att rapportera om variation i sitt läge av bindande. Vridning av molekylen kan leda till snedvridning i bindande vinklar i konjugerade systemet och hindrar transport av elektroner (figur 4a). Detta återspeglar i sin tur på LCO både excitation och utsläpp våglängd och utsläpp livstid fluorescerande egenskaper. Vi använder hans i en upprätt fluorescens Mikroskop utrustade med långa pass filter för utsläpp. För magnetisering och utsläpp spectra i konfokalmikroskopi och FLIM använder vi en LSM780 med pulsad laser. För att exemplifiera olika tekniker, vi avbildas ett objekt (beta-amyloid (Aβ) plack i en APP transgena möss) (figur 4b–e). Hyperspektrala fluorescens spectra (figur 4b) möjliggör utvärdering av spektral Skift och intensitet variation inom olika regioner av plack. Magnetiseringen spektrum i konfokalmikroskopi (figur 4 c) kan användas för att bestämma den optimala excitation våglängden för nedströms experiment, t.ex., kombination färgning med flera fluorophores. Denna metod kan också visa sig användbart för detektion av konfirmerande skillnader i bindande för LCO. Emissionsspektrum i confocal läge kan användas för att bestämma egenskaperna fluorescens utsläpp från hFTAA eller från en kombination av flera fluorophores att utvärdera colocalization i kombination experiment med flera LCOs eller LCO och immunofluorescens kombinationer. Fluorescens livslängden på hFTAA är mycket influerat av små variationer i bindande för hFTAA. Därför är FLIM ett kraftfullt verktyg i diskriminera skillnaderna åläggs hFTAA genom det bindande målet (figur 4 d). Detta kan användas till exempel i diskrimineringen mellan olika prion stammar8. Confocal imaging och bearbetning Z-stackar till tredimensionella bilder är ett användbart verktyg för att utforska den övergripande formen av en amyloid sammanvägning (figur 4e). Igen, kan användningen av ytterligare fluorophores stöd i förstå sammansättningen av en deposition.
Figur 1: olika vävnad typer och proteiner aggregat visar h-FTAA färgning av: (en) Mallory-Denk organ bestående av keratin aggregat i en lever (counterstained med DAPI), (b) p62-positiv r införanden i sporadiska inkludering-body myosit (s-IBM) muskelvävnad, (c), Amyloid av holme amyloid polypeptid i mänskliga bukspottkörteln, (d), Amyloid av immunglobulin Ljusslinga i mänskliga tarmen, (e), fåren skrapie (Pachyptila) i musen hjärnan, (f ) Kronisk slösa sjukdom (Pachyptila) i mus hjärna, (g), Aβ plack i APP23 mus hjärnan, (h), Aβ patologi i APP/PS1 mus hjärnan och (jag) fett biopsi utstryk från diagnostiska prov av transthyretin amyloid hos patienter graderas 1-4 enligt standard kongorött (CR) scoring. Gula områden visar hFTAA målat amyloid insättningar och blå är autofluorescens från fettvävnad. Skala bar längd anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på Co färgning med antikroppar. (en) Co färgning med anti serum amyloid protein A (AA) immunofluorescens och hFTAA av mänskliga AA amyloid på samma avsnitt. Övre vänster: AA antikropp utsläpp 640 nm. övre högra hFTAA på 488 nm. bottenpanelen överlagra bilden visar colocalization i gult. (b) antikropp färgning och hFTAA fluorescens på varandra följande delar. Övre panelen: AA antikropp DAB färgning, nedre panelen: hFTAA avbildas med en longpass utsläpp filter. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämföra fluorescens med korta pass filter på transthyretin amyloid i mänskliga hjärtat målat med Mayers hematoxylin/Kongo röd (en–d) och Mayers hematoxylin/hFTAA (e). (en) Brightfield bild, (b), Brightfield, fluorescens, (c), Brightfield + korsade polarisatorer, (d), Brightfield + fluorescens + korsade polarisatorer, (e) hFTAA fluorescens i 405nm + 480 nm excitation (raka sektioner till en–d). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: samma objekt målat med hFTAA och avbildas med flera tekniker demonstreras med en Aβ plack i en år APP23 mus. (en) fluorescensen egenskaper av hFTAA styrs av dess konfirmerande tillstånd. Strukturera av hFTAA i plana och tvinnade tillstånd visas. (b), Hyperspektrala imaging för utvärdering av kontinuerlig emissionsspektrum. Spectra i den undre panelen är färgkodade enligt boxed regioner av intresse i bilden. (c) (i) Confocal imaging för magnetisering imaging och (ii och iii) spektrum och utsläpp imaging i filtret eller (iv) spektral läge. (d), fluorescens livstid imaging för detektion av konfirmerande skillnader i den amyloid, där kortare livstid finns i peripheryen av Aβ plack och tidens liv är längre i mitten av plack. Histogrammet i den undre panelen visar fördelningen av liv gånger för hela plack. Bilden är färgad enligt skalan under histogrammet. (e), Confocal Z-stack samlas i filterläge att visa tredimensionella struktur av objekt. Skala bar längd anges i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Nedfall av aberrantly vikta proteiner till amyloid är en viktig händelse i många sjukdomsprocesser. Extracellulära amyloida plack består av Aβ peptider och intracellulära neurofibrillära tovor bildas av hyperphosphorylated tau återfinns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. En rad olika proteiner, t.ex., transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA), och IgG ljusslinga misfold och manifest som amyloid insättningar i vävnader utanför CNS. Även om amyloid insättningar har varit känd och studerade för mer än ett århundrade, vi fortfarande saknar detaljerad kunskap om hur amyloid initieras nedfall på molekylär nivå och vad kan göras för att hindra denna process. För Alzheimers sjukdom är det nödvändigt att bekräfta hur processen för amyloidos är associerade med neurodegeneration. En viktig strävan på uppdraget att behandla amyloidos är att utveckla roman finjusteras verktyg för övervakning av amyloid initiering och progression regression; Därför är riktade amyloid upptäckt nyckeln. I det långa loppet, nytta klinisk diagnostik öka känslighet och selektivitet av amyloid färgning metoder7,15. Aktuella utmaningar i detta avseende är enorm och är ett mycket aktivt forskningsområde. En huvudfråga för klinisk utveckling och prövningar är prognostiska diagnos. Dessa sjukdomar sannolikt börja väl innan symptom uppstår, men att börja med behandling där behöver vara identifikation av sjukdomen. Häri, är känsligheten en viktig aspekt för nya metoder. Dessutom är problemet ännu mer komplicerad eftersom vissa protein aggregat är giftiga, några är skyddande och några är neutral. Därmed är möjlighet att övervaka specifika aggregerade morphotypes viktigt eftersom förekomsten av skilda aggregerade arter har föreslagits för att förklara den heterogena fenotypen rapporterade för en mångfald av neurodegenerativa protein aggregering. Exempelvis är prionproteinet ett klassiskt exempel på hur en identiska primära sekvens av aminosyror kan misfold in i distinkta sammanlagda morphotypes, som ger upphov till specifika prion stammar. Liknande polymorfism har också rapporterats för Aβ peptid, α-synuclein och tau. I detta avseende har LCOs visat sig vara enastående verktyg för optisk tilldelning av distinkta aggregerade morphotypes. Prion-stam-specifika protein aggregat, protein insättningar finns i flera typer av systemisk amyloidos, liksom polymorfa Aβ och tau aggregat har varit framstående på grund av den conformationally inducerade optiska fenomen observeras från LCOs.
Amyloid nedfall är ett evenemang som äger rum i vävnader som är svåra att penetrera med biokemiska eller biofysikaliska metoder för molekylär precision. Möjligheten att söka evenemang ex vivo, vivooch in vitro- använder samma LCO molekyler sätter scenen för reda ut händelser som inträffar i vivo med tekniker som är endast möjliga att tillämpa på ex vivo eller i vitro prover11,17. En nyligen rapporterade hög upplösning strukturella modellen visar att det LCO pentameriskt FTAA (pFTAA) binder i en hålighet som bildas av justerad sida kedjor parallellt med fibrill axeln spanning 6 i-register parallella beta-strängar18, visar att det är möjligt att få atomär upplösning kunskap om organen i målet LCO. I huvudsak liknar bindande hålighet och bindande funktionsläget av pFTAA kongorött19, dikteras av en groove fodrad med repetitiva positivt laddade Lys sidokedjor. Frändskapet av LCOs verkar vara bättre jämfört med kongorött sannolikt på kedjan flexibilitet och starka van der Waals interaktioner av svavel atomer av tiopen ringer mot hydrofoba hålrummet. Påvisande av prefibrillar arter (före ThT svarar)5,20 visas beroende av repetitiva β ark, består av i-registrera parallell-beta-slingor, som för hFTAA är två tiopen enheter längre än pFTAA skulle span korsning av upp till 8 beta-strängar.
Färgning protokollet kräver att uppmärksamma felsökning på följande: (i) fixering: omfattande fixering av vävnadsprover kan störa amyloid struktur och begränsa möjligheten att upptäcka variationen i fluorescens spectra induceras av konfirmerande snedvridning av hFTAA molekylen. Mild fixering av kryosnitt av färskfryst material är att föredra att uppnå optimal spektral upplösning. Dock kommer hFTAA fläcken och fluorescerar amyloid i fasta vävnad men med reducerad effekt och mindre spektrala variation. (ii) epitop exponering: förbehandling av vävnad att uppnå epitop exponering för antikropp bindande kan ibland minska möjligheten för hFTAA att binda på grund av störd amyloid struktur. Om detta är en fråga och epitop exponering är ett avgörande steg i antikroppen färgning protokoll, med på varandra följande sektioner för antikroppar och hFTAA, kan respektive betraktas. (iii) overstaining: hFTAA är extremt känsliga. Fungerande lösningar bör hållas vid låg nM koncentration. Sänka koncentrationen av hFTAA om bakgrundsfärgning är ett problem. Om element som binder hFTAA är gles i vävnaden, kan ett överskott av hFTAA aggregera och ackumuleras i monteringsmedium. Detta är erkänd som fluorescens som inte är i fokus planet av vävnaden själv. Om detta visas, fördjupa den monterade bilden i PBS tills täckglaset kan skjutas av avsnittet, tvätta med PBS och montera med färska monteringsmedium och en ny täckglas. (iv) filter baserat imaging: denna uppsats beskriver mestadels spektralt löst fluorescens imaging med långa pass filter eller flera upptäckt kanaler. hFTAA kan också övervakas med hjälp av korta pass filter. Tänk dock på att detta kommer att minska kontrasten och avskaffa möjligheterna att upptäcka flera färger.
De senaste åren har det blivit uppenbart att som forskningsverktyg, fluorescerande LCOs och i synnerhet hFTAA visar mycket lovande egenskaper. Resultat har visats för en mängd olika proteiner och sjukdomstillstånd, alltifrån hFTAA upptäckt av aggregat inne i celler (tau, inkludering kroppen myosit), systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, immunglobulin lätta kedjor (kappa och lambda) seminogelin 1, prion protein (inklusive kliniska prover)21, holme amyloid polypeptid och insulin7,15. En begränsande faktor för genomförandet av hFTAA som ett diagnostiskt verktyg är att fluorescensmikroskopi inte används i stor utsträckning i rutinmässiga amyloid patologi labs. Dessutom är hans inte lätt tillgängliga i kliniken. Dock hFTAA amyloid färgning och fluorescensmikroskopi har använts i kliniska laboratorier i ett filter baserade fluorescens Mikroskop och börbetraktas som en kostnadsfri diagnostisk metod. Detta visades nyligen på karpaltunneln biopsier med transtyretinamyloidos med grundläggande inställningar för fluorescens i ett automatiserat sätt22.
Dessutom utöver olika proteiner, hFTAA fluorescens erkänner ett stort utbud av fibrillcellulosa typer och pre fibrillar amyloid aggregat, t.ex., väg fibrillar arter har upptäckts och karakteriseras. I den här publikationen har vi visat en LCO på olika typer av prov med tre mikroskopi tekniker. Användning av kontrollerade syntes har också möjliggjort utvecklingen av LCOs för mångsidig detektion av Biomolekylär mål, t.ex., inspelning av interaktioner av ytan plasmon resonans (SPR)23 och radiolabeling för positron emission tomografi (PET)24.
Hittills har har över 25 olika LCOs med publicerats. En ökad användning av LCOs för avbildning av amyloid insättningar kommer att öka kunskapen och förståelsen av hur dessa sjukdomsassocierade aggregat montera, demontera och störa de organ och individer där de är bosatta.
Disclosures
PH PN MB SN är mindre aktieägare i Ebba Biotech som kommersialiserar hFTAA under namnet Amytracker545.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Mikael Lindgren och Chanan Sluzny för råd om fluorescensmikroskopi, och Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias juckar, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark och Kurt Zatloukal för bidragande vävnadssnitt eller micrographs som visas i denna publikation. Insamling av presenterade uppgifter häri har finansierats med bidrag från stiftelsen hjärnan (Hjärnfonden), föreningen Svenska Alzheimers (Alzheimerfonden), Vetenskapsrådet (VR), föreningen Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, EU FP7 hälsa projektet LUPAS och Linköpings universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
