Summary
התצהיר עמילואיד מהווה סימן היכר של מחלות שונות, פוגעת באיברים שונים רבים. מאמר זה מתאר את היישום של זריחה oligothiophene מצומדת זורח מכתים בשילוב עם טכניקות במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. שיטה זו מכתימים מייצגת כלי רב עוצמה עבור זיהוי וחקירה של אגרגטים חלבון ב setups קליניים ומדעיים.
Abstract
חלבונים להפקיד עמילואיד ברקמות בגוף יכולה להיות הגורם או התוצאה של מספר רב של מחלות. בין אלה אנו מוצאים מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון מתעצמת בעיקר על מערכת העצבים המרכזית, וכן עמילואידוזיס מערכתית היכן להפקיד סרום עמילואיד A, transthyretin ו- IgG שרשראות אור כמו עמילואיד בכבד, שורש כף היד המנהרה הטחול, כליות, לב, רקמות היקפיים אחרים. עמילואיד ידוע והוא למד במשך יותר ממאה, לעתים קרובות תוך שימוש עמילואיד צבעים ספציפיים כגון אדום קונגו, Thioflavin T (ThT) או Thioflavin (ThS). בנייר זה, אנו מציגים חומצה אצטית thiophene heptamer-formyl (hFTAA) כדוגמה שפותחו לאחרונה שישלימו את התמונה אלה צבעי בשם oligothiophenes מצומדת זורח (LCOs). hFTAA הוא קל לשימוש, והוא תואם עם צביעת משותפת ב- immunofluorescence או עם סמנים אחרים התאית. מחקר מקיף הוכיחה ש-hftaa הזה מזהה מגוון רחב יותר של מחלות הקשורות אגרגטים חלבון מאשר צבעי עמילואיד קונבנציונלי. בנוסף, ניתן להחיל hFTAA גם עבור הקצאה אופטי של morphotypes צבור ברורים כדי לאפשר מחקרים של פולימורפיזם עמילואיד fibril. בעוד המתודולוגיה הדמיה חלה היא אופציונלית, אנחנו כאן מדגימים הדמיה היפרספקטרליות לחישה מרחוק (שלו), לייזר סריקה מיקרוסקופיה קונפוקלית ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה (FLIM). דוגמאות אלה להראות חלק טכניקות הדימות שבו LCOs יכול לשמש ככלים כדי לקבל מידע מפורט יותר על היווצרות ומאפיינים מבניים של amyloids. מגבלה חשובה הטכניקה היא, באשר כל טכניקות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי, הדרישה לגודל מיקרוסקופי של אגרגטים כדי לאפשר זיהוי. יתר על כן, שסך כל צריך מהווים מבנה β-גיליון החוזרות על עצמן כדי לאפשר hFTAA מחייב. חשיפה מוגזמת קיבוע ו/או epitope המשנים את מבנה צבירה או קונפורמציה ניתן לעיבוד איגוד hFTAA המסכן, ומכאן להוות המגבלות דימות מדויק.
Introduction
בתצהיר של עמילואיד ברקמות מהווה סימן היכר פיפטות מספר מחלות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, עמילואידוזיס מערכתית ומחלות פריון. למרות השכיחות של מחלות הקשורות עמילואיד, ואת העובדה כי קרוב 40 חלבונים שונים לתאריך שסווגו כמודעות מבשרי עמילואיד האנושי1, מעט מאוד ידוע על הקשר בין התצהיר עמילואיד פנוטיפ המחלה. היסטולוגיה של דגימות מחולים האנושי עבר לשמש הן למטרות אבחון ומדעיים. מספר רב של מודלים בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את הקשר בין נטל עמילואיד, התנהגות, תוחלת החיים, לבין מספר אחר לקריאה פנוטיפי מגזרות של המחלה-התקדמות-2,-3. גם נעשים מאמצים גדולים גילוי תרופות ועיצוב לקרב כמה מחלות נרחבת המפחידים ביותר שלנו. עם זאת, הערכת הקשר בין גנוטיפ, פנוטיפ, טען פלאק עמילואיד, והתרופות אינו ישר קדימה. הכלים עבור צביעת והדמיה של עמילואיד ברקמות לעיתים בוטה, לספק מידע ברזולוציה נמוכה על היווצרות עמילואיד ומבנה.
קונגו אדום שבירה כפולה, ThT ו- ThS פלורסצנטיות הן דוגמאות קלאסיות שיטות זיהוי וניתוח עמילואיד נטל דגימות רקמה של ביופסיות החולה ופוסט מורטם דגימות, מודלים חייתיים של מחלות4. טכניקות אלה שימשו במשך כמה עשורים (קונגו האדום מאז שנות ה-20, ThT ונגזרות, מאז שנות ה-60), למרות מכשור שוכללה מאפשר ניתוח מפורט, ניתוח וקביעת נהלים מכתימים עדיין מבוצעות באותו אופן כמו כמעט לפני מאה שנה.
בנייר זה, אנו מתארים את הניצול של צבע רגישה מאוד עמילואיד הרומן, hFTAA5, המאפשר את איתור הפיקדונות חלבון לא בוגר קטן עם רמת דיוק גבוהה, וכן זיהוי של עמילואיד בוגרת. לעומת צבעים המקובלת, hFTAA הוכח כדי לזהות מגוון רחב יותר של מחלות הקשורות חלבון אגרגטים5,6,7. בנוסף, ניתן להחיל hFTAA גם עבור הקצאה אופטי של morphotypes צבור ברורים8. במסמך זה, אנו מתארים hFTAA מכתים וניתוח של רקמה מתוך ויצר מודלים חייתיים של מחלת פריאון ו עמילואיד-β קודמן חלבון (APP) העכברים הטרנסגניים שנועדו לחקות את התפתחות הפלאק אלצהיימר9,10 . אנו גם מראים ניתוח של האבחון, פוסט מורטם דגימות מחולים הסובלים עמילואידוזיס מערכתית. LCOs יש מאפיינים מהותיים מאפשר להם לדווח על הבדלים הסתגלותי בתוך רובד אחד; על ידי שילוב שתי LCOs עם מאפיינים שונים לגבי איגוד פלורסצנטיות, ההבדל בולטת אף יותר11. מיקרוסקופ epifluorescence מצויד זמן לעבור מסננים ומשמש ראש המצלמה היפרספקטרליות כדי לאפשר סיווג אובייקטיבי של תכונות ספקטרליות ורישום של micrographs עבור ניתוח ספקטרלי. מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה עם לייזר tunable כמקור עירור משמש כדי להעריך את מאפייני תלת-ממדי פלאק עמילואיד בפירוט רב יותר. הלייזר tunable מאפשרת איסוף של עירור ספקטרום, צעד פחות מבחר של אורכי גל פליטה על המיקרוסקופ מאפשר הדמיה שותף לקו פלורסצנטיות, immunofluorescence לקבוע שיתוף לוקליזציה של חלבונים היעד, עמילואיד. FLIM מציע חסרת תקדים רגישות להבדלים הסתגלותי המוטלות על LCOs, מגלה הבדלים זה אולי לא יזוהו על ספקטרום הפליטה זריחה.
המטרות העיקריות עם השיטה מכתימים שתואר הן כדי להקל על זיהוי רגיש של משקעי עמילואיד קטן כדי לאפיין פולימורפיזם הסתגלותי בתוך משקעי עמילואיד. ידע זה חשוב על ההבנה הבסיסית של החלבון צבירת מחלות.
Protocol
הערה: סינתזה לקו בוצע במעבדה במשך יותר מעשור. על-ידי החלת בעיקרו הפרוטוקולים עבור החלפת ארומטי electrophilic, פלדיום מזורז קרוס-מצמד, אמיד צימוד הידרוליזה אסתר, אנו לאכסון להתאים זונדי מטרות שונות 5 , 12. לאחר הסינתזה, אפיון, טיהור, הוא המוצר לקו lyophilized, בטמפרטורת החדר. חלק הגששים (ביניהם hFTAA) נמצאים כעת זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
1. לקו מכתים פתרון
הערה: אם hFTAA נרכש מספק מסחרי, נא בצע הספק ' s הוראות במקום סעיף 1-
- Resuspend lyophilized hFTAA של 2 מ מ להכין פתרון מניות של 1 מ"ג/מ"ל NaOH. לשמור את המניה בבקבוקון זכוכית ב 4 º C. ניתן לאחסן את המניה במשך שנה אחת.
- ביום מכתים, להכין הפתרון עובד על ידי דילול של 1:10,000 מניות בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
2. הכנת דגימות רקמה
הערה: סוגים רבים של רקמות יכול לדימות באמצעות hFTAA כמו סמן עמילואיד. לקבלת דוגמאות, ראה איור 1. hFTAA רגישה קונפורמציה צבירה. ההכתמה יש לכן רצוי לבצעו על אגרגטים undisrupted עם חשיפה epitope אין. איכות מיטבית ספקטרלי מושגת אם הקיבעון רקמות נשמרת למינימום. ומכאן טריים קפואים, גשמי בעדינות קבוע אתנול בזמנו של צביעת, היא עדיפה. עם זאת, ניתן לזהות גם משקעי עמילואיד ברקמות כי תוקנה עם למשל, פורמלין. hFTAA בדרך כלל חודר לרקמת היטב. בחירת עובי הדגימה התואמת המלצותיה הדמיה טכניקה.
- אם פורמלין קבוע, parafinembedded מקטעים משמשים, deparafinize ב קסילן במשך הלילה. טובלים בסעיפים אמבטיות רצופים של 99% אתנול, 70% אתנול, dH 2 O ו- PBS, 10 דקות כל אחד. לאפשר הסעיפים רקמות יבש בתנאים אמביינט.
התראה: קסילן תמיד מטופל בשכונה fume כימי. קסילן ממיסים אורגניים אחרים הם מזיקים.- Cryosections להפשיר בטמפרטורת החדר. את הסעיפים רקמות בפורמלין 10% בן לילה, נתרענן בטבילת אותם באמבטיות רצופים של 99% אתנול, 70% אתנול, dH 2 O ו- PBS, 10 דקות כל אחד. לאפשר הסעיפים רקמות יבש בתנאים אמביינט.
- להוסיף טיפות של הפתרון עובד hFTAA (כ- 200 µL) למקטעי רקמות כדי לכסות את זה. ה-droplet צריך להישאר במקום על ידי מתח. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר במשך צביעת.
- שטיפה ערפו את הפתרון מכתימים 500 PBS µL באמצעות פיפטה של, ואז לטבול את השקופית באמבטיה PBS במשך 10 דקות אפשר המקטע להתייבש בתנאי הסביבה-
- הר תוך שימוש באמצעי הרכבה זריחה. לאפשר הרכבה בינונית ליישב בין לילה.
הערה: hFTAA מכתים יכול להתבצע בשילוב עם שיטות אחרות מכתימים כגון immunofluorescence, סמני ספציפי תא - או אברון, וכו '. כדי לבצע שיתוף מכתים, להפעיל את הפרוטוקול מכתימים המלא של בחירה ולהוסיף hFTAA מכתים בסוף, החל משלב 2.2. ראה איור 2 דוגמאות. עבור immunofluorescence, רצוי לבחור נוגדנים משניים כי הוא נרגש ב-640 ננומטר או גבוה יותר. בטווח זה גל ', hFTAA אינו בולע ולכן לא יכול להיות נרגש, לא לזרוח. פעולה זו מבטיחה כי אין דימום-דרך נתפסת בין נוגדן hFTAA.
3. מיקרוסקופ
הערה: להשתמש מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד זמן לעבור מסננים. כל ההגדרות שלהלן שימשו כדי ליצור את התמונות באיור 4. התאמות עשוי חייבים להיעשות בהתאם הדגימה סוג ורקמות עמילואיד. למרות hFTAA קשור עמילואיד יציבה לעבר הלבנה, מומלץ לבטל את מקור האור כאשר הדגימה לא בדק או עם תמונה.
- שלו
הערה: הניסוי התבצע בעזרת מיקרוסקופ epifluorescence עם זמן לעבור פליטה מסננים וראש המצלמה שלו (ראו טבלה של חומרים).- שימוש מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה מצוידים זמן לעבור מסננים ומצלמה היפרספקטרליות לחישה מרחוק. לוודא כי המצלמה ספקטרלי מכויל.
- שם התוכנה, הפרויקט, בחר " התמונה ספקטרלי " ולהתחיל רכישת.
- בחר באובייקט של הריבית דרך העינים באמצעות מסנן עירור 436-nm, משמרת את נתיב האור למצלמה.
- ב התיק נתוני מנהל (CDM), בחר את סוג הדגימה הספקטרום, תווית המדגם, ולרכוש העיתונות. יפתח חלון רכישת.
- בחלון רכישת " הדמיה ספקטרלי ", פתח את תפריט הגדרות, בחר רכישת נכסים, ולהגדיר את טווח הספקטרום 460-700, את מהירות-מהירות מירבית ואיכות המדידה להקליד מסנני גז/לייזר/צר. סגור את תיבת הדו-שיח.
- בתפריט ' תמונה ', בחר לחיות מלא. בשורת הסמלים, כבה בשוליים. בחר או גודל אזור תמונה בעלת ערך זיכרון שיא מתחת 800 MB. הגדר את זמן החשיפה ערך זה נותן בהירות התמונה הכוללת בין 1,000 ל- 3,000. בשורת הסמלים, הקש את המצלמה בצבע. רכישת יתחיל. עם השלמת רכישת התמונה, לחץ על שמור ב " התמונה ספקטרלי ידרשו " בתיבת הדו-שיח ו " תא חדש " ', בתיבת הדו-שיח ' מנהל ' נתונים במקרה.
- מ ה CDM, פתחו את התמונה שנאספו באמצעות לחצן התחל ניתוח. יפתח חלון ניתוח נתונים. ניתן לאסוף מידע
- הספקטרום של כל פיקסל של התמונה על-ידי בחירת ROIs באמצעות תיבת הדו-שיח תצוגה ספקטרלי. בחר " להגדיר " ובחר ROIs מן האזורים הרלוונטיים של התמונה.
- לשמור את הנתונים ספקטרלי כקובץ טקסט באמצעות לחצן Lib. ניתן לייבא הקובץ. txt שנשמר בכל תוכנת ניתוח של בחירה. הקובץ .slb יכול לשמש לניתוח בתוך התוכנה ניתוח נתונים. הנתונים עבור הקוביה היפרספקטרליות מהתמונה כולה יכול גם להיות מיוצא כקובץ raw, כמו " שכבות כמו tif ", או כפי " שכבות בתבנית טקסט " עבור יישומי ניתוח נתונים של תמונות באמצעות תוכנה חיצוניים.
- קונפוקלית
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי הינו מצויד עם לייזר tunable כמקור עירור. לניסויים פליטת קרינה פלואורסצנטית, להגדיר את עוצמת הלייזר 0.2% (תואם לכוח ממוצע של 3 µW), את חריר ליחידה אוורירי 1, את גודל המסגרת עד 1,024 px x 1,024 px, מהירות סריקה כמו 7 וממוצע של מעל 16 סריקות, עומק הסיביות כמו 8 סיביות (ראה < s trong > טבלה של חומרים). הגדרות אלה צריכים להיות מותאמים עבור כל המערכת קונאפוקלית הפרט, לייזר מקור וסוג הדגימה.- על ספקטרום הפליטה, לאסוף נתונים באמצעות למדא ומצב של עירור באמצעות ארגון לייזר מוגדר כ- 488 ננומטר. לאסוף את פליטת בין באמצעות ערוצי 22 בתוך הגלאי התנשמות ערוץ 32 ננומטר 503, 687. הגדר את הרווח 755.
- כדי להשיג תמונות ערוץ אחד, שימוש חכם להגדיר אפשרות. עבור FITC (מסנן ירוק), הגדר את הרווח 750 ועבור אלקסה 535 (מסנן אדום) להגדיר את הרווח 845.
- כדי לאסוף את הספקטרום עירור עם הלייזר tunable, השתמש עירור בצעדים nm 1 בין nm 490, 545 תוך איסוף פליטה בין nm 551, 586. להגדיר את עוצמת הלייזר 2% (המקביל הספק ממוצע של 30 µW) ורווח כדי 774.
- לאסוף Z-מחסנית במצב ספקטרלי, יסרוק העומק של המקטע בשלבים של מיקרומטר 0.96. ההגדרות עירור של פליטה אותו כמו שלב 3.2.1 יכולה להיות בשימוש אלא להגדיר את הרווח 730.
- FLIM
הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם יחידת FLIM (ראה טבלה של חומרים).- להגדיר את הפרמטרים הבאים עבור מיקרוסקופ קונפוקלי: חריר, 20; עירור אורך גל, 490 nm; לייזר בעוצמה, 0.5% (המקביל הספק ממוצע של 7.5 µW). השתמש פעמו לייזרים במהירות 40 מגה-הרץ-
- תוכנה ב- FLIM, להגדיר פוטון לספור מעל 550 ננומטר. בחלון פרמטרים ' תצוגה ', בצע את הפוטון לספור עד מקס הוא 4,000 ספירות פוטון.
- לשמור את הקובץ, לייצא אותו כתמונת SPC.
- להתאים את הנתונים כדי דעיכה מעריכית 2-רכיב התוכנה FLIM. התאמה שנותן χ 2 < 2 הוא טוב. הערך על ציר ה-y הוא מספר ספירות למשך כל החיים נתון.
- בחר סף עבור סעיפים לכלול, למשל, 100. צבע קוד על-ידי T1 ובחר טווח בחיים. הריקבון הוא תלויים במבנה עמילואיד איפה hFTAA מאוגדת. קרינה פלואורסצנטית חיים של בין 300 ו- 1,000 ps נצפו. שמור את הקובץ.
- לייצא את הנתונים הגולמיים באמצעות אפשרויות ייצוא ולשמור את הנתונים הרצויים בתיקייה חדשה.
Representative Results
רגיש, סלקטיבי מכתים של משקעי עמילואיד ממספר גדול של חלבונים בסוגי רקמות שונות רבות של בני אדם חולים והן חיות ניסוי היא חיונית עבור אבחון קליני באותה מידה כמו מחקר מדעי. בנייר זה, נדגים איך זו יכולה להיות מושגת באמצעות LCOs, ומעוררות hFTAA, עבור צביעת והדימות עם מודאלים מרובים של עמילואיד מתוך מבחר של סוגי רקמות. מאז פרסום הראשון המבוסס על thiophene ליגנדים עמילואיד לפני למעלה מעשר שנים13, עמילואיד פיקדונות מורכבת של מגוון רחב של חלבונים במגוון רקמות יש כבר צילמו באמצעות LCOs6,7,11, 14,15,16 (איור 1). בשילוב עם נוגדנים או סמנים אחרים היסטולוגית, LCOs לספק כלי מעולה למטרות אבחון והן מדעית (איור 1a, איור 2). מבחר מתאים של סמני פלורסנט, fluorophores כמה אפשר לדימות על אותו סעיף (איור 1 א', hFTAA, דאפי, איור 2a hFTAA בהגדרת immunofluorescence). . זה גם ניתן להשתמש מקטעים רציפים עבור צביעת באמצעות brightfield וקרינה פלואורסצנטית (איור 2b, hFTAA ו- DAB נוגדן מכתים). לאחרונה, hFTAA הוכח להיות משלימים המבטיחים ביותר אדום קונגו מכתים אבחון קליני7,15 (איור 3).
פיתוח טכניקות הדמיה העשורים האחרונים גדל הצורך של צבעי עמילואיד אשר יכול להפלות בין דקה, אבל באותו זמן מעמיקה הבדלי משקעי עמילואיד בצורה כמותית. מערכת מצומדת בתוך לקו מספק עם יכולת ייחודית לדווח על וריאציה במצב של האיגוד. פיתול של המולקולה יכולה להוביל עיוות הזוויות מחייב מערכת מצומדת וזה לעכב העברת אלקטרונים (איור 4a). זה בתורו משקף על מאפייני לקו אורך הגל עירור, פליטה והן בגלגול פליטה פלורסנט. אנו משתמשים שלו במיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף מצויד זמן לעבור מסננים עבור פליטת. עירור, ספקטרום הפליטה מיקרוסקופיה קונפוקלית ו FLIM, אנו משתמשים של LSM780 עם לייזר פעמו. לצורך המחשה הטכניקות השונות, אנחנו עם תמונה אובייקט אחד (בטא עמילואיד (Aβ) הפלקיו עכבר הטרנסגניים APP) (איור 4b–e). ספקטרום קרינה פלואורסצנטית היפרספקטרליות (איור 4b) מאפשר הערכת משמרות ספקטרלי והגיוון בעוצמה בתוך אזורים שונים של הלוחית. עירור ספקטרום במיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 4 c) יכול לשמש כדי לקבוע את אורך הגל של עירור אופטימלית עבור ניסויים במורד הזרם, למשל, שילוב מכתים עם מספר fluorophores. שיטה זו גם יכול להוכיח שימושי עבור זיהוי ההבדלים הסתגלותי מצב מחייב לקו. ספקטרום פליטה במצב קונאפוקלית יכול לשמש כדי לקבוע את המאפיינים פליטת קרינה פלואורסצנטית hFTAA או שילוב של מספר fluorophores כדי להעריך colocalization בניסויים בשילוב עם מספר LCOs או לקו, immunofluorescence שילובים. קרינה פלואורסצנטית משך hFTAA מושפעת מאוד וריאציות קטנות במצב איגוד של hFTAA. ומכאן FLIM הוא כלי רב עוצמה של האפליה בין ההבדלים המוטלות על hFTAA על ידי המטרה מחייב (איור 4 d). זה יכול לשמש לדוגמה האפליה בין זנים שונים פריון8. קונאפוקלית הדמיה ועיבוד Z-במחסן לתמונות תלת מימד הוא כלי שימושי עבור חקר הצורה הכללית של צבירה עמילואיד (איור 4e). שוב, השימוש fluorophores נוספים יכול לסייע בהבנת ההרכב של פיקדון.
איור 1: שונים רקמות סוגים של חלבונים אגרגטים מציג ה-FTAA כתמים: () מלורי-ולסיים גופות המורכב אגרגטים קרטין כבד (counterstained עם דאפי), (b) r p62-חיוביות בקהילות סדיר הכללה-הגוף לומבגו (s-IBM) רקמת שריר, (ג) עמילואיד של איון מפוליפפטיד עמילואיד לבלב אנושי, המוח (d) שרשרת אור עמילואיד של אימונוגלובולינים במעי האדם, (e) הצאן scrapie (prions) עכבר, (נ ) כרוני מבזבז את המחלה (prions) במוח העכבר, הפלאק (g) Aβ במוח העכבר APP23, פתולוגיה (h) Aβ מוח העכבר APP/PS1 ולאחר ביופסיה (אני) שומן מכפיש מדגימות אבחון של עמילואיד transthyretin בחולים אנושיים מדורגות 1-4 על-פי הניקוד קונגו רגיל אדום (CR). האיזורים הצהובים מראים hFTAA צבעונית משקעי עמילואיד. כחול, זה autofluorescence של רקמת שומן. אורך סרגל קנה מידה צוין של כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמאות של צביעת במשותף עם נוגדנים. () שיתוף מכתים עם חלבון עמילואיד אנטי-סרום A (AA) immunofluorescence, hFTAA של האדם עמילואיד AA על אותו סעיף. השמאלית העליונה: AA נוגדן פליטה 640 ננומטר; העליונה hFTAA נכון-488 ננומטר; פאנל התחתונה כיסוי colocalization מראה התמונה בצהוב. (b) נוגדן פלורסצנטיות מכתים, hFTAA על קטעים רצופים. הדף פאנל: AA נוגדן DAB מכתים, החלונית התחתונה: hFTAA עם תמונה עם מסנן פליטה longpass. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השוואת זריחה עם מסננים מסירה קצרה על transthyretin עמילואיד בתוך הלב האנושי מוכתם hematoxylin/קונגו של מאייר אדום (–d) ו hematoxylin/hFTAA מאייר (e). התמונה () Brightfield, (b) Brightfield + זריחה, (ג) Brightfield polarizers מצטלבים, (ד) Brightfield + זריחה + polarizers מצטלבים, זריחה hFTAA (י) ב- 405nm + ננומטר 480 עירור (רצופים סעיפים כדי –d). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אותו עצם מוכתמים hFTAA, עם תמונה עם מספר טכניקות הוכח באמצעות לוח Aβ אחת העכבר APP23 בגילאי. () ידי קרינה פלואורסצנטית מאפייני hFTAA מוכתב על ידי למצבו הסתגלותי. מבנה של hFTAA במצב מישורי ומעוות מוצג. הדמיה (b) היפרספקטרליות להערכה של ספקטרום פליטה רציפה. ספקטרה בחלונית התחתונה הם צבע מקודד לפי אזורים מסגרת עניין בתמונה. (c) (i) Confocal הדמיה עבור עירור הדמיה ו- (ii ו- iii) ספקטרום והדמיה פליטה במצב מסנן או במצב ספקטרלי (iv). (d) זריחה שלמים הדמיה לצורך זיהוי ההבדלים הסתגלותי עמילואיד, משך חיים קצר יותר נמצאים בפריפריה של הלוחית Aβ ואיפה טיימס חיים ארוכות במרכז הפלאק. היסטוגרמה בחלונית התחתונה מציגה את ההפצה של החיים זמני של הפלקיו כולו. התמונה היא בצבע לקנה מתחת להיסטוגרמה. (e) Z קונאפוקלית-מחסנית אסף במצב מסנן כדי להציג את מבנה תלת ממדי של אובייקטים. אורך סרגל קנה מידה צוין של כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
בתצהיר של חלבונים aberrantly מקופל לתוך עמילואיד הוא אירוע מפתח של תהליכי מחלה רבים. חוץ-תאית פלאק עמילואיד המורכב Aβ פפטידים, תאיים קשרים neurofibrillary הנוצרת על-ידי hyperphosphorylated טאו נמצאים במוח של חולי אלצהיימר. מגוון של חלבונים שונים, למשל, transthyretin (TTR), סרום עמילואיד A רכיב (SAA), ו- IgG שרשרת אור misfold מניפסט כמו משקעי עמילואיד ברקמות מחוץ מערכת העצבים. למרות עמילואיד פיקדונות ידוע ולמד במשך יותר ממאה, עדיין חסר מידע מפורט על איך עמילואיד התצהיר מאותחלת ברמה המולקולרית, מה ניתן לעשות כדי למנוע את התהליך הזה. עבור מחלת אלצהיימר, זה הכרחי לאמת איך התהליך של עמילואידוזיס משויך הקשורים ניוון מוחיים. המסע מפתח אחד במשימה בעמילואידוזיס הוא לפתח רומן יסודי כלי לניטור חניכה עמילואיד, התקדמות, רגרסיה; ומכאן זיהוי עמילואיד יישוב הוא המפתח. בטווח הארוך, אבחון קליני יהנה להגדיל את הרגישות ואת סלקטיביות של עמילואיד מכתימים שיטות7,15. אתגרים עכשוויים בהקשר זה הן אדירות, והוא תחום מחקרי מאוד פעיל. בעיה אחת הראשי עבור הפיתוח הקליני של ניסויים הוא אבחון prognostic. מחלות אלו סביר להתחיל הרבה לפני הופעת התסמינים, אך להתחיל עם טיפול שם צריך להיות זיהוי של המחלה. במסמך זה, רגישות הוא היבט מרכזי עבור הרומן מתודולוגיות. יתר על כן, בנושא זה אפילו יותר מורכב, כי כמה אגרגטים חלבון רעיל, חלקם מגן, וחלקן נייטרלי. ומכאן היכולת לפקח ספציפי morphotypes צבור חיוני מאז קיומו של מינים צבורים ברורים הוצע להסביר את פנוטיפ הטרוגנית דיווח עבור מגוון של מחלות ניווניות חלבון צבירה. למשל, חלבון פריאון הוא דוגמה קלאסית של איך רצף ראשי זהה של חומצות אמינו יכול misfold לתוך morphotypes צבירה שונים, אשר להצמיח זנים מסוימים פריון. פולימורפיזם דומה גם דווח פפטיד, α-synuclein של טאו Aβ. בהקשר זה, LCOs הוכחו להיות יוצאת דופן כלי להקצאת אופטי morphotypes צבורים שונים. אגרגטים חלבון פריאון-זן-ספציפי, משקעי חלבון נמצאו מספר סוגים של עמילואידוזיס מערכתית, כמו גם Aβ רב שלבית, אגרגטים טאו כיבדתם עקב התופעה אופטי conformationally המושרה הבחינו מפני LCOs.
התצהיר עמילואיד הוא אירוע אשר מתרחש ברקמות שקשה לחדור עם שיטות ביוכימיות או ביופיזיקלי של דיוק מולקולרי. האפשרות לחקור את האירועים שמחוץ ויוו, במבחנה באמצעות מולקולות לקו אותו קובע את הבמה עבור unraveling אירועים שמתרחשים ויוו באמצעות טכניקות אפשריות רק להחיל על שמחוץ או חוץ גופית דוגמאות11,17. המודל המבני ברזולוציה גבוהה דיווחו לאחרונה מראה כי pentameric לקו הסכם הסחר החופשי (pFTAA) נקשר בתוך חלל הנוצרת על-ידי מיושר לצד רשתות במקביל לציר fibril המתפרסות על-פני 6 ברישום בטא-רצחניים18, להפגין שזה ניתן להשיג ברזולוציה אטומית ידע על הישויות של המטרה לקו. בעיקרו של דבר מחייב חלל ואיגוד המצב של pFTAA דומה קונגו אדום19, מוכתבת על ידי חריץ שלאורכו חוזרות חיובי טעונה Lys לצד רשתות. זיקתו של LCOs להופיע כדאי להשוות לאדום קונגו, ככל הנראה בגלל הגמישות שרשרת ואינטראקציות ואן דר Waals חזקה של אטומי גופרית שר הטבעות thiophene לעבר חלל הידרופובי. זיהוי מינים prefibrillar (לפני ThT מגיב)5,20 מופיע תלויים גליונות β החוזרות על עצמן, מורכב, את הרישום במקביל-בטא-גדילי, אשר עבור hFTAA להיות שתי יחידות thiophene יותר pFTAA היה span ההיצטלבות של תחנה של גדילי-ביתא עד 8.
פרוטוקול מכתימים דורש תשומת לב צרות הירי על השלבים הבאים: (i) קיבעון: קיבוע נרחב של דגימות רקמה יכול לשבש את מבנה עמילואיד ולהגביל את האפשרות לזהות וריאציה פלורסצנטיות spectra שנגזרות עיוות הסתגלותי של מולקולת hFTAA. קיבוע מתון של cryosections מחומר קפוא טרי הוא העדיף כדי להשיג רזולוציה מיטבית ספקטרלי. עם זאת, hFTAA כתם, לזרוח עמילואיד ברקמות קבוע אבל עם יעילות מופחתת ופחות וריאציה ספקטרלי. (ii) Epitope חשיפה: טיפול קדם של רקמות כדי להשיג חשיפה epitope עבור הנוגדן מחייב לעיתים עלול להפחית את היכולת של hFTAA לאגד בגלל שיבשו מבנה עמילואיד. אם בעיה זו קיימת חשיפה epitope היא שלב קריטי הנוגדן מכתים פרוטוקול, באמצעות מקטעים רציפים עבור נוגדן hFTAA, בהתאמה יכול להיחשב. (iii) overstaining: hFTAA רגיש ביותר. פתרונות עבודה יש לשמור על ריכוז נמוך ננומטר. להקטין את הריכוז של hFTAA אם רקע מכתימה את הבעיה. אם רכיבי איגוד hFTAA הם דלילים ברקמה, עודף של hFTAA ניתן לצבור, להצטבר המדיום הרכבה. זה מזוהה כמו זריחה שאינו במישור המוקד של הרקמה עצמה. אם זה מופיע, לטבול את השקופית נטען ב- PBS עד בתגית הכיסוי יכול להיות החליקה של המקטע, לשטוף עם PBS, טען מחדש עם הרכבה טריים בינונית, תגית כיסוי חדש. (iv) מסנן בהתבסס הדמיה: מאמר זה מתאר פלורסצנטיות בעיקר spectrally נפתרה הדמיה באמצעות זמן לעבור מסננים או איתור ערוצים מרובים. hFTAA יכול גם להיות במעקב שימוש במסננים מסירה קצרה. שימו לב כי זה להפחית את החדות, לבטל את האפשרויות כדי לזהות צבעים מרובים.
במהלך השנים האחרונות זה הפך ברור כמו מחקר כלים, פלורסנט LCOs בפרט hFTAA להציג מאפיינים מאוד מבטיח. תוצאות הוכחו למגוון העצום של חלבונים ועם מצבי מחלה, החל hFTAA זיהוי של אגרגטים בתוך תאים (טאו, לומבגו הכללה הגוף), עמילואיד מערכתית של עמילואיד סרום A, transthyretin, שרשראות אור אימונוגלובולינים (לקאפה ו למדא) seminogelin 1, פריון חלבון (כולל דוגמאות קליניות)21, איון מפוליפפטיד עמילואיד ואינסולין7,15. גורם מגביל את יישום hFTAA ככלי אבחוני היא שמיקרוסקופ פלורסצנטיות הזה לא משמש בהרחבה במעבדות פתולוגיה עמילואיד שגרתית. יתר על כן, שלו אינה זמינה במרפאה. עם זאת, מכתים עמילואיד hFTAA, פלורסצנטיות מיקרוסקופ שימשו במעבדות קליניות במיקרוסקופ מסנן קרינה פלואורסצנטית מבוסס, צריךלהיחשב כשיטת אבחון ללא תשלום. זה הודגם לאחרונה על מנהרת שורש כף היד ביופסיות עם עמילואידוזיס transthyretin באמצעות הגדרות בסיסיות עבור זריחה אופנה אוטומטיות22.
יתר על כן, בנוסף חלבונים שונים, זריחה hFTAA מזהה מגוון עצום של סוגי fibril, אגרגטים עמילואיד fibrillar מראש, למשל, מסלול fibrillar מינים יש כבר זוהה מאופיין. בפרסום זה, הראו לקו אחד בסוגים שונים של דגימה באמצעות שלוש טכניקות במיקרוסקופ. השימוש של סינתזה מבוקר גם איפשר לפיתוח LCOs רב-תכליתי גילוי של יעדים למערכות ביולוגיות, למשל, הקלטה של אינטראקציות על ידי משטח פלזמון תהודה (SPR)23 של radiolabeling עבור פליטת פוזיטרון פוזיטרונים (PET)24.
נכון להיום, מעל 25 LCOs שונים עם פורסמו. שימוש מוגבר של LCOs עבור הדמיה של משקעי עמילואיד יגדיל את הידע ואת ההבנה של איך אלה הקשורים למחלה להרכיב, לפרק, אגרגטים להפריע האיברים ויחידים שבו הם מתגוררים.
Disclosures
PH PN MB SN הם בעלי מניות קטנים ביוטק Ebba זה commercializes hFTAA תחת שם המותג Amytracker545.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות מיקאל לינדגרן, חנן Sluzny לקבלת ייעוץ אודות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, ולא אדריאנו Aguzzi, יוהן Bijzet, Bouke Hazenberg, פרנק Heppner, מתיאס Jucker, Klingstedt תרז, קארין מגנוסון, כריסטינה עורכת הדין, דניאל Sjölander, כריסטוף Röcken, Gunilla Westermark, Westermark לכל ו קורט Zatloukal לתרומת רקמה מקטעים או micrographs המוצגים בפרסום זה. האוסף של נתונים שהוצגו במסמך זה יש כבר במימון תרומות של המוח שבדי קרן (Hjärnfonden), איגוד האלצהיימר שבדי (Alzheimerfonden), שוודית המועצה למחקר (VR), האגודה גוראן Gustafsson, גאורג & אסטריד אולסון, האיחוד האירופי האיחוד FP7 בריאות פרויקט LUPAS, ואוניברסיטת Linköping.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
