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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Drosophila भ्रूण और Tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर ऊतकों में सीटू संकरण में उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56281
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

सीटू संकरण प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए पूरे Drosophila भ्रूण या विच्छेदित ऊतकों में आरएनए का पता लगाने की अनुमति देता है । ९६-अच्छी तरह से microtiter प्लेटों और tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग करना, टेप उच्च संकल्प, संवेदनशीलता, और प्रवाह में पता लगाया जा सकता है, और एक अपेक्षाकृत कम कीमत पर ।

Abstract

हमारे प्रयासों में एक जीनोम-व्यापक आधार पर अभिव्यक्ति और Drosophila RNAs के सेलुलर स्थानीयकरण के पैटर्न का निर्धारण करने के लिए, और ऊतकों की एक किस्म में, हम कई संशोधनों और सीटू में हमारे मूल फ्लोरोसेंट में सुधार विकसित किया है संकरण (मछली) प्रोटोकॉल । प्रवाह और लागत प्रभावशीलता की सुविधा के लिए, जांच पीढ़ी से सभी कदम, संकेत पता लगाने के लिए, एक्सॉन ९६-well microtiter प्लेट्स का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । Digoxygenin (डीआईजी)-बला antisense आरएनए जांच टेम्पलेट्स के रूप में या तो सीडीएनए क्लोन या जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं । ऊतक निर्धारण और permeabilization के बाद, जांच हित के टेप करने के लिए संकरे है और फिर विरोधी की एक उत्तराधिकार का उपयोग कर पाया-खोदो एंटीबॉडी संयुग्मित करने के लिए बायोटिन, streptavidin संयुग्मित को सहिजन peroxidase (एचआरपी) और फ्लोरोसेंट संयुग्मित tyramide, जो एचआरपी की उपस्थिति में, एक उच्च प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती है कि तुरंत आसंन प्रोटीन के इलेक्ट्रॉन घने क्षेत्रों को बांधने का उत्पादन । ये प्रवर्धन और स्थानीयकरण कदम एक मजबूत और उच्च स्थानीयकृत संकेत है कि दोनों सेलुलर और सेलुलर प्रतिलिपि स्थानीयकरण की सुविधा का उत्पादन । प्रदान की गई प्रोटोकॉल के ऊतकों और विकास के चरणों की एक किस्म में अत्यधिक विशिष्ट संकेतों का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया गया है । संदर्भ भी अतिरिक्त बदलाव है कि एकाधिक टेप, या टेप और प्रोटीन, एक ही समय में एक साथ पता लगाने की अनुमति के लिए प्रदान की जाती हैं ।

Introduction

आरएनए-seq जैसे नए जीनोम-वाइड आरएनए डिटेक्शन तरीकों ने हमारे ज्ञान को कब और कहाँ जीन व्यक्त किया है, और किस स्तर पर1का विस्तार किया है । हालांकि, इन अपेक्षाकृत गरीब लौकिक और स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं । सीटू संकरण में आरएनए के स्थानिक वितरण की अनुमति देता नेत्रहीन निश्चित ऊतकों में मनाया जा करने के लिए, इस प्रकार सेलुलर और उपसेलुलर स्थानीयकरण के विवरण का खुलासा2. सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट का प्रयोग भी अधिक स्थानिक संकल्प की अनुमति देता है क्योंकि यह इस तरह के फोकल और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के रूप में शक्तिशाली माइक्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग की अनुमति देता है3. ऐसे DAPI के रूप में फ्लोरोसेंट मार्कर भी सेलुलर संबंध4स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मछली भी कई RNAs और प्रोटीन के अवलोकन के साथ ही उपसेलुलर स्तर पर ओवरलैप के स्पष्ट संकेत के साथ की सुविधा । अद्वितीय रिएजेंट और दोहरे लेबलिंग के लिए आवश्यक चरणों को निंन संदर्भ में3,5में ढूंढा जा सकता है ।

यहां वर्णित प्रक्रियाओं ९६-सीडीएनए टेम्पलेट उत्पादन (कॉलोनी पीसीआर) सहित सभी चरणों के लिए अच्छी तरह से microtiter प्लेटों का उपयोग, आरएनए जांच उत्पादन (T7, T3 या SP6 पोलीमरेज़-निर्भर रन-ऑफ प्रतिलेखन का उपयोग करते हुए), सीटू संकरण में , और फ्लोरोसेंट संकेत विकास । भ्रूण या ऊतकों की पर्याप्त संख्या ९६ की एक अच्छी तरह से थाली में जोड़ रहे है के लिए स्थिरता और परिवर्तनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं । एक अच्छी तरह से तो एक अलग जांच प्राप्त करता है । संकेत विकास के बाद, भ्रूण या ऊतकों को एक अच्छी तरह से सूक्ष्म विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सरणी रहे हैं ।

जांच का पता लगाने के लिए tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) का उपयोग असाधारण उपसेलुलर संकल्प के साथ मजबूत संकेतों का उत्पादन 5,6,7,8. RNAs का उपसेलुलर स्थानीयकरण एक महत्वपूर्ण विनियामक तंत्र 9 है जो लगभग सभी RNAs 4,10,11के साथ घटित होता प्रतीत होता है । इन विश्लेषणों से यह भी पता चला है कि आरएनए-seq द्वारा पहचाने नहीं गए कई टेप मछली 8से आसानी से पाए जाते हैं । सीटू में संकरण के लिए ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में आरएनए के अनुकूलन एक समय में ब्याज की ९६ जीन के विश्लेषण की अनुमति देता है (अधिक यदि अतिरिक्त प्लेट का उपयोग किया जाता है), बड़े डेटासेट का विश्लेषण संभव बनाना. छोटे वर्गों में प्लेटें काटने से, विधि भी आसानी से बस कुछ ही नमूनों के लिए अनुकूलित है । प्रदान की गई प्रोटोकॉल के ऊतकों के अधिकांश प्रकार में आरएनए वितरण के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । हालांकि नहीं दिखाया गया है, यह गैर के रूप में अच्छी तरह सेDrosophila ऊतकों के लिए अनुकूल है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. पीसीआर प्रवर्धन सीडीएनए टेम्पलेट्स से plasmids

< p class = "jove_content" > नोट: आरएनए जांच संश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड या पीसीआर जनित डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करें । Drosophila जीन संग्रह (क्लब) बर्कले Drosophila जीनोम परियोजना द्वारा उत्पंन पुस्तकालयों सबसे कोडन Drosophila जीनोम में पाया जीन की कवरेज प्रदान करता है (1a तालिका देखें) । ये भी किसी भी सीडीएनए डालने के प्रवर्धन के लिए यूनिवर्सल प्राइमरों के उपयोग की अनुमति देते हैं । ये पीसीआर प्रवर्धन प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरियल संस्कृतियों के lysates में मौजूद प्लाज्मिड DNAs पर प्रदर्शन कर रहे हैं । डीएनए उत्पादों तो के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में antisense आरएनए जांच उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट्स के रूप में उपयोग किया जाता है (तालिका 1b देखें).

  1. डिजाइन प्राइमरों के लिए पीसीआर द्वारा ब्याज की एक जीन की एक विशिष्ट एक्सॉन क्षेत्र बढ़ाना ( उदाहरण डीएनए से जीनोमिक), अधिमानतः T7 समाप्ति पर पोलीमरेज़ antisense मांयता साइट के साथ ।
  2. से कम ९६ नमूनों के साथ प्रयोगों के लिए, ९६-अच्छी तरह से प्लेटों की जरूरत से ज्यादा भागों में कटौती । सील टेप के साथ प्लेटें कवर (सामग्री देखें) सभी की मशीन और भंडारण के लिए । यदि microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, तदनुसार मात्रा समायोजित करें ।
    नोट: ९६-अच्छी तरह से प्लेटें वृद्धि हुई प्रवाह के लिए मल्टीचैनल पिपेट के उपयोग की अनुमति, साथ ही लागत की बचत के लिए छोटे संस्करणों ।
< तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > table 1a
वेक्टर एंटीबायोटिक
कार्य एकाग्रता 1:1000
प्राइमरी आरएनए पोलीमरेज़
फॉर
antisense आरएनए पोलीमरेज़.
त्यात
सेन्स pFLC-I amp pBst_SK (-) _F/R T3 T7 pBst (-) Amp pBst_SK (-) T7 T3 pOT2 Chlor pOT2_F/आर SP6 T7 pOTB7 Chlor pOT2_F/R T7 SP6 Table 1b प्राइमरी अनुक्रम pOT2_Forward < td colspan = "4" > 5 & #39;-AAT-जीसीए-GGT-ताा-CCT-GGC-TTA-TCG-3 & #39; pOT2_Reverse < td colspan = "4" > 5 & #39;-AAC-GCG-GCT-ऐका-ATT-AAT-ऐका-ताा-CC-3 & #39; pBst_SK (-) _Forward < टीडी colspan = "4" > 5 & #39;-गाा-ऐका-GCT-ATG-एसीसी-ATG-ATT-ACG-CC-3 & #39; pBst_SK (-) _Reverse < td colspan = "4" > 5 & #39;-CGG-सीसीए-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 & #39; < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 1: A) सीडीएनए में plasmids आवेषण बढ़ाना के लिए सामान्य क्लब क्लोन जानकारी. ख) क्लब plasmids के लिए यूनिवर्सल प्राइमरों का जुगाड़.

< राजभाषा प्रारंभ = "3" >
  • बढे २५० & #181; ९६ में प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरियल संस्कृति के एल-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों जोड़कर २४० & #181; एल पौंड मीडिया की अच्छी तरह से उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ (1:1000 एक १००० एक्स एंटीबायोटिक स्टॉक के कमजोर पड़ने), और 10 & #181; l के मूल प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरिया (एक ग्लिसरॉल स्टॉक से) । सील टेप के साथ मुहर.
  • २१५ आरपीएम पर ३७ & #176 पर झटकों से मशीन; सी रातोंरात (O/
    नोट: मूल की जगह के लिए बैक्टीरियल ग्लिसरॉल सीडीएनए प्लाज्मिड क्लोन शेयर की एक नई प्रतिलिपि बनाओ । इस बैक्टीरिया को मार सकता है के रूप में मूल बैक्टीरियल स्टॉक reफ्रीज़ न करें ।
  • का निर्माण करने के लिए पीसीआर टेम्पलेट्स, पतला 10 & #181; l में O/N बैक्टीरियल संस्कृति के ९० & #181; l autoclaved ddH 2 ओ एक नई ९६-खैर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में । thermocycler में ९५ & #176; C पर 5 मिनट के लिए डीएनए को विकृत करना । तुरंत बर्फ पर थाली कम से 5 मिनट के लिए जगह
  • तालिका 2.
    • के अनुसार उपयुक्त यूनिवर्सल प्राइमरों का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > रिएजेंट्स ५० & #956; l sample reaction ९६ वेल मिक्स
    (112x reaction)     अंतिम एकाग्रता 2 x पीसीआर पोलीमरेज़ मिक्स 25 & #956; l २८०० & #956; l 1 X Primer_For (25 pmol/& #956; l) ०.५ & #956; l 5 6 & #956; l ०.२५ pmol/& #956; l Primer_Rev (25 pmol/& #956; l) ०.५ & #956; l ५६ & #956; l ०.२५ pmol/& #956; l ddH2O 22 & #956; l २४६४ & #956; l < /tr > कुल ४८ & #956; l ५३७६ & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 2: पीसीआर मास्टर मिक्स ।

    < राजभाषा प्रारंभ = "7" >
  • का उपयोग कर एक पिपेट, aliquot ४८ & #181; एक नया ९६-खैर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में पीसीआर मास्टर मिश्रण के एल । Add 2 & #181; L प्रत्येक विकृत प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट प्रति well.
    नोट: 1 picogram (pg) से 1 नैनोग्राम (एनजी) प्लाज्मिड डीएनए के बीच का उपयोग करें । अत्यधिक डीएनए टेम्पलेट पीसीआर यील्ड और विशिष्टता को कम करता है ।
  • प्रोग्राम ९६-well पीसीआर मशीन के अनुसार तालिका 3 और प्रवर्धन प्रदर्शन ।
    नोट: एक्सटेंशन टाइम पर ७२ & #176; C पीसीआर उत्पाद के आकार से निर्धारित होता है (४५ s for & #8804; २.० kb, & #8804 के लिए १.५ min; ३.० kb, & #8804 के लिए 3 min; ४.० kb और ३.५ मिनट के लिए 4.0-5.0 kb). एनीलिंग तापमान (Tm) प्राइमरों के अनुक्रम से निर्धारित होता है । जब एक प्राइमर बराबर है या 20 से अधिक nt, tm के रूप में गणना की है:
    tm (& #176; C) = (4 सीजी के एक्स संख्या) + (2 एक्स संख्या एटी)-4.
    • < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ-अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > पाइला तापमान Time सायकल (s) पहायला विकार ९५ & #176; ग 3 मिन 1 सायकल < टीडी rowspan = "3" > प्रवर्धन
    विकार, एनीलिंग व विस्तार ९५ & #176; ग ४५ sec < टीडी पंक्ति स्पैन = "3" > 30 चक्र 54-58 & #176; ग ४५ सेक ७२ & #176; ग ४५ sec-३.५ min अंतिम विस्तार ७२ & #176; ग 7 मिन 1 सायकल हण 4 & #176; ग पकड़ < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 3: अनुशंसित पीसीआर प्रोग्राम ।

    < राजभाषा प्रारंभ = "9" >
  • पीसीआर इथेनॉल (ेतोः) और सोडियम एसीटेट (NaOAC) के साथ उत्पाद वर्षा (तालिका 4 देखें).
    नोट: यदि पीसीआर रिएक्शन की मात्रा ५० & #181 से कम है; l, भरण करने के लिए ५० & #181; l साथ ddH 2 हे.
    1. डीएनए को हाला, अवयवों को टेबल 4 से मिलाएं और स्टोर के नमूने हे/N at-20 & #176; c या के लिए 30 min at-८० & #176; c. ९६-खैर प्लेट के लिए 45-60 मिनट पर २,२५० x g पर 4 & #176; c. एक 8 चैनल का उपयोग कई गुना पिपेट सीarefully निकाल supernatant । १६० & #181 के साथ एक बार धो लें; L शीत ७०% ेतोः (RNase-फ्री) के लिए 30 मिनट में २,२५० x g पर 4 & #176; C.
      नोट: उपजी डीएनए कुओं के नीचे देखा जा सकता है । कम पीसीआर उत्पादों अब केंद्रापसारक की आवश्यकता है ।
    2. धीरे एक कागज तौलिया पर ९६-अच्छी तरह से प्लेट उलटा एक अच्छी तरह से (जितना संभव हो) में तरल की पिछले बूंदों को दूर करने के लिए । एयर शुष्क डीएनए गोली 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर (आरटी) । RNase में हाला डीएनए को फिर से सस्पेंड किया गया & #181; L नि जल.
      नोट: 1 एच हवा सूखी ेतोः के सभी निशान को लुप्त होने की अनुमति देगा । हालांकि, तरल की एक बहुत छोटी मात्रा (लगभग 1 & #181; L) को पूरी तरह से सूखने से डीएनए गोली को रोकने के लिए प्रत्येक कुआं में रहना चाहिए । उपयोग 25 & #181; l के लिए एक ५० & #181; l पीसीआर रिएक्शन. इन विट्रो प्रतिलेखन में निम्नलिखित चरणों में के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए इस स्तर पर इलाज DEPC पानी का उपयोग न करें.
    • < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ-अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > घटक मात्रा भाग पीसीआर ५० & #956; l १००% इथेनॉल १२५ & #956; l २.५ X vol. of पीसीआर 3m NaOAc (pH = 5.2, RNase free) 5 & #956; l 10% of vol. of पीसीआर कुल १८० & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 4:५० & #181 का उदाहरण; L पीसीआर रिएक्शन.

    < राजभाषा प्रारंभ = "10" >
  • द्वारा पीसीआर उत्पादों के साइज व उपज की जांच कर 5 & #181; L 1 X ताे बफर में 1% agarose जेल पर पुनर्निलंबित डीएनए समाधान के एल.
    नोट: DNA टें पलेट के 250-500 एनजी के कुल 15 & #181 के लिए आवश् यक है; L इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया । अधिक पैदावार वाले नमूनों को आगे पतला किया जा सकता है । आरएनए उपज भी डीएनए टेम्पलेट के अनुक्रम और लंबाई पर निर्भर करता है । T7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ डीआईजी-आरएनए लेबलिंग के लिए सामान्य गाइड के अनुसार, लगभग 10 & #181; डीआईजी के जी-लेबल आरएनए 1 & #181 से निर्मित है; जी रेखीय टेम्पलेट.
    • < p class = "jove_title" > 2. इन विट्रो प्रतिलेखना antisense जांच उत्पन्न.

    < p class = "jove_content" > नोट: यह एक RNase-मुक्त वातावरण में काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । सभी रिएजेंट और लैब-वेयर को RNase फ्री (जैसे सर्टिफाइड DNase/RNase फ्री प्लास्टिक वेयर) होना जरूरी है ।

    < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" फो: रखने के साथ-अगले । भीतर पृष्ठ = "हमेशा" > घटक स्टोक एकाग्रता मात्रा अंतिम एकाग्रता एटीपी १०० mm 7 & #956; l 10 mm CTP १०० mm 7 & #956; l 10 mm GTP १०० mm 7 & # 956; l 10 mm UTP १०० mm ४.५ & #956; l ६.५ mm डीआईजी-11-UTP 10 mM 25 & #956; l ३.५ mM RNase फ्री वॉटर १९.५ & #956; l कुल ७० & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 5: डीआईजी-NTP मिक्स वडा.

    < table सीमा = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" फो: रखने के साथ-बगल में । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > घटक १५ & #956; l प्रतिक्रिया ९६ वेल मिक्स
    (112x reaction)     अंतिमं 5x प्रतिलेखन बफर ३.०० & #956; l ३.०० & #956; l 1 x डीआईजी-NTP mix (10 mM) ०.७५ & #956; l ०.७५ & #956; l ०.५ mM RNase अवरोधक ०.२५ & #956; l ०.२५ & #956; l ०.६७ U/& #956; l आरएनए पोलीमरेज़ (T7 या T3 या SP6) २.०० & #956; l २.०० & #956; l २.६७ U/& #956; l RNase इव जल १.५० & #956; l १.५० & #956; l कुल ७.५० & #956; l ७.५० & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 6:2x प्रतिलेखन मास्टर मिक्स ।

    1. तालिका 5.
      के अनुसार डीआईजी-NTP मिश्रण तैयार करें नोट: गलतियों से बचने के लिए, हमेशा प्लेट को ऐसे संरेखित करें कि A1 प्लेट के शीर्ष बाएं कोने पर है ।
    2. तालिका 6 में एक नए ९६-well पीसीआर प्लेट (जांच प्लेट) में एक अच्छी तरह से वर्णित घटक जोड़ें । Add ७.५ & #181; पीसीआर उत्पाद (डीएनए टेंपलेट) के एल प्रत्येक संगत अच्छी तरह से, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । सील टेप के साथ प्लेट कवर ।
      नोट: पीसीआर उत्पाद की इष्टतम राशि प्रति प्रतिलिपि प्रतिक्रिया जोड़ा ०.५ और 1 के बीच होना चाहिए & #181; जी. यदि जेल पर बैंड काफी कमजोर या अधिक तीव्र कर रहे हैं, डीएनए की मात्रा प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा तदनुसार समायोजित किया जा सकता है । सटीक मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है ।
    3. मशीन पर जांच प्लेट ३७ & #176; ग के लिए 3.5-4 एच. मिश्रण 15 & #181; संश्लेषित जांच के साथ ३५ & #181; l के DEPC स्वास्थ्यकर्मी ddH 2 O, १२५ & #181; l का १००% ेतोः, व 5 & #181; l का 3 एम NaOAC (pH = 5.2, RNase free). Store at-८० & #176; C के लिए ंयूनतम 30 min. केंद्रापसारक और धोने के रूप में चरणों में वर्णित 1.10.2 और 1.10.3.
    4. 25 & #181 में हुई हाला जांच को पुनर्स्थगित; l च्या DEPC स्वास्थ्यकर्मी ddH 2 O. ्न 5 & #181; l पर 1% agarose जेल (चल समय & #60; 20 min) की अखंडता और उपज की जांच के लिए जांच (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
      नोट: agarose जेल DEPC इलाज ddH 2 O और ताे बफर के साथ बनाया जाना चाहिए । जेल ट्रो तंत्र आरएनए काम के लिए ही सौंपा जाना चाहिए । अब जेल कम गति पर चलने समय ट्रो के दौरान आरएनए क्षरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    5. मिश्रण १०० & #181 के साथ संश्लेषित जांच के शेष 20 & #181; l संकरण समाधान (तालिका 7) और स्टोर at-८० & #176; C जब तक आवश्यक हो.
      नोट: जांच एकाग्रता अधिक पतला किया जा सकता है अगर बैंड विशेष रूप से मजबूत कर रहे है (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 उदाहरण के लिए ). संकरण समाधान RNase संदूषण को रोकने में बहुत प्रभावी है । आरएनए क्षरण से बचने के लिए तुरंत पुनर्निलंबित जांच के लिए संकरण समाधान जोड़ें । संकरण समाधान एक ०.२ & #181; मी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना है । ऊतक के नमूनों के लिए, संकरण समाधान में डिटर्जेंट एकाग्रता में वृद्धि ट्राइटन-X-१०० ०.३% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़कर.
    < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > घटक मात्रा अंतिम एकाग्रता DEPC स्वास्थ्यकर्मी ddH2O ११.८५ मिलि २३.७% 20 x SSC १२.५ मिलि 25% (5 x) Formamide 25 मिलि ५०% हेपरिन (५० मिलीग्राम/एमएल) ०.१ मिलि 0.2% (०.१ मिलीग्राम/एमएल) सामन शुक्राणु एकल असहाय डीएनए ०.५ मिलि १.०% के बीच-20 ०.०५ मिलि ०.१% कुल ५०.०० मिलि १००% < p class = "jove_contenटी "फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ =" 1 "> तालिका 7: संकरण समाधान.

    < p class = "jove_title" > 3. Drosophila पाहिजे और भ्रूण, लार्वा और वयस्क ऊतक संग्रह ।

    < p class = "jove_content" > नोट: दोनों छोटे स्केल (बोतलें) और मास (बक्से) के लिए मक्खी पालन, cornmeal आधारित भोजन पर स्टैंडर्ड फ्लाई लैब प्रोटोकॉल का उपयोग 25 & #176; C. उचित वयस्क और लार्वा घनत्व रखें और भोजन पर अतिरिक्त सक्रिय खमीर पाउडर प्रदान सतहों.

    1. मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित भ्रूण इकट्ठा । भ्रूण संग्रह के प्रमुख कदमों में सचित्र हैं < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ .
      नोट: मेथनॉल में devitillinized भ्रूण को धोने के बाद, नियत भ्रूण को एक वर्ष तक के लिए-20 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है । भ्रूण permeabilization और पद निर्धारण मछली प्रोटोकॉल के दिन 1 पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
    2. ताजा ४०% पीएफए शेयर समाधान तैयार करते हैं ।
      1. तैयार ४०% paraformaldehyde (पीएफए) के एक नए सिरे से बनाया स्टॉक समाधान 10 मिलीलीटर का मिश्रण करके DEPC इलाज ddH 2 O से ३.६८ g के पीएफए और ७० & #181; एल के 2N कोह एक 20 मिलीलीटर ग्लास में एक छोटी सी हलचल पट्टी युक्त शीशी ।
        चेतावनी: पीएफए अत्यधिक संभावित तीव्र और जीर्ण स्वास्थ्य प्रभाव के साथ विषाक्त है । पढ़ें MSDS (सामग्री सुरक्षा डेटा शीट) और आंखों, त्वचा, और श्वसन तंत्र के लिए उचित संरक्षण के साथ प्रयोग करें ।
        2. एक धुएं के हुड में
      2. , गर्मी और 3-5 मिनट के लिए शीशी में एक हीटिंग प्लेट पर २०० & #176; C जब तक पीएफए पूरी तरह से भंग है । गर्मी से पीएफए स्टॉक समाधान निकालें जैसे ही पीएफए भंग है (ज़्यादा गरम नहीं) ।
      3. ठंडा 5 मिनट के लिए बर्फ पर भंग ४०% पीएफए स्टॉक समाधान, और एक ०.२ & #181 के साथ फिल्टर, एम फिल्टर और 10 मिलीलीटर सिरिंज.
    3. थर्ड instar लार्वा (L3) या वयस्क ऊतक निर्धारण, शमन और permeabilization
      नोट: यह प्रोटोकॉल एक दिन में समाप्त किया जाना चाहिए । इसमें ऊतक विच्छेदन, निर्धारण, अंतर्जात एचआरपी की शमन, permeabilization और पद-निर्धारण शामिल हैं.
      1. फिक्सिंग समाधान तैयार (फिक्स-मैं और फिक्स-II) तालिका के अनुसार 8.
        नोट: Picric एसिड एक अतिरिक्त निर्धारण के रूप में प्रयोग किया जाता है जब ऊतक एक नाजुक संरचना है कि संरक्षित किया जाना चाहिए है । यह एक अच्छा निर्धारण नहीं है जब ऊतक ultrastructure इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए ।
        चेतावनी: Picric एसिड अस्थिर है और अंय सामग्री के साथ प्रतिक्रिया और विस्फोटक यौगिकों बनाने की क्षमता है । का प्रयोग करें और सुरक्षा के दिशा निर्देशों के अनुसार स्टोर ।
        2. एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में
      2. जगह लार्वा या वयस्क मक्खियों से 10 मिलीलीटर ठंड 1 X पंजाबियों और १०० & #181; L ठीक-I समाधान के. लार्वा या वयस्क मक्खी गतिशीलता.
        3. को कम करने के लिए 2 मिनट के लिए बर्फ पर चिल
      3. एक 2-3 मिमी खोलने बनाने के लिए एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप की नोक काट । ५० एमएल ट्यूब (स्टेप 3.3.2) से 1 X पंजाबियों के उथले परत के साथ एक पेट्री डिश (9 सेमी व्यास) में 1 मिलीलीटर टिप के साथ 10-30 लार्वा या वयस्क मक्खियों का स्थानांतरण । PBTT के एक बिट जोड़ने सतह तनाव कम कर सकते हैं । ध्यान से टुकड़े लार्वा (पूर्वकाल के पीछे से पूर्वकाल और निचोड़ ऊतकों से खुला) या एक विदारक गुंजाइश के तहत तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ ब्याज की वयस्क ऊतकों ।
        नोट: लगभग 200-300 लार्वा या वयस्क tests को एक दिन में अनुभवी व्यक्तियों द्वारा विच्छेदित और नियत किया जा सकता है ।
      4. स्थानांतरण एक २०० & #181 के साथ विच्छेदित ऊतकों; एल पिपेट (टिप के साथ काट एक 2 मिमी व्यास खोलने बनाने के लिए) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और बर्फ पर दुकान में । अगले चरण में प्रगति करने से पहले 10-15 मिनट के भीतर विच्छेदन के प्रत्येक दौर को पूरा करें ।
        नोट: के रूप में पर्याप्त सामग्री उत्पंन करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त राउंड (एक 2 एच समय विंडो के भीतर) के साथ जारी रखें ।
      5. ८०० & #181 के साथ ऊतकों को ठीक करें; एक बेंच टॉप मिक्सर पर 30 मिनट के लिए ठीक-मैं समाधान के एल । कुल्ला ऊतक ८०० के साथ एक बार & #181; एल 1 एक्स PBTT और २.५ एच की एक अधिकतम के लिए बर्फ पर ट्यूबों रखें । 30 मिनट की सीमा के कारण, यह बैच वार प्रदर्शन करने की जरूरत है जब तक पर्याप्त ऊतक एकत्र किया गया है ।
      6. पूल एक एकल 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब ढक्कन में जाल युक्त में सभी विच्छेदित और तय ऊतकों (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 ट्यूब डिजाइन के लिए ) । ट्यूब ढक्कन में जाल के माध्यम से अतिरिक्त तरल महाप्राण । 1 x PBTT के 10 मिलीलीटर के साथ 3 x 5 मिनट प्रत्येक धो लें । 1 एक्स पंजाबियों के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला डिटर्जेंट हटाने के लिए । यह अगले चरण में अतिरिक्त बुलबुले रोकता है ।
        नोट: यदि विच्छेदित ऊतकों ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक, कदम नियमित microtiter प्लेटों या 0.5-1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में प्रदर्शन किया जा सकता है (300-800 & #181; एल मात्रा प्रति ट्यूब).
      7. बुझाने अंतर्जात एचआरपी गतिविधि के 5 मिलीलीटर के साथ ०.३% एच 2 ओ 2 में 15 मिनट के लिए पंजाब में एक बार फिर दोहराएं । मिश्रण के बिना इस कदम के दौरान ढक्कन खुला रखें । दो बार 1 एक्स PBTT के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर कुल्ला । 1 X PBTT.
        8. के 10 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धो
      8. Permeabilize ऊतकों को 10 मिलीलीटर के साथ ८०% एसीटोन (-20 & #176; c, pre-द्रुतशीतन) at-20 & #176; सी के लिए 10 min. the ट्यूब दो बार के लिए मशीनिंग अवधि के दौरान पलटना । 10 मिनट के लिए 1 एक्स PBTT की 10 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने के लिए ऊतक निर्जलीकरण ।
      9. 10 मिलीलीटर मिश्रण के साथ कुल्ला 5 मिलीलीटर PBTT प्लस 5 मिलीलीटर संकरण समाधान (1:1). & #160;D छोड़ें मिश्रण और 10 मिलीलीटर संकरण समाधान के साथ बदलें । नमूनों की आवश्यकता होने तक & #160;-20 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, नमूनों को एक सप्ताह से अधिक समय तक स्टोर न करें.
    < सारणी सीमा = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । के भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > घटक फिक्स I (10 मिलि) फिक्स II (10 ml) ४०% पीएफए स्टोक 1 मिलि 1 मिलि PBTT ८.९९ मिलि 9 मिलि Picric अम्ल हल 10 & #956; l - < p class = "jove_conte nt "फो: रखें-एक साथ । भीतर-पृष्ठ =" 1 "> तालिका 8: ऊतकों के लिए समाधान फिक्सिंग.

    < p class = "jove_title" > 4. में सीटू संकरण

    < p class = "jove_content" > नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग में नमूना तैयारी के साथ न्यूनतम 2 दिनों की आवश्यकता होती है, पूर्व-संकरण और संकरण दिन 1 पर जगह ले रही है और जांच का पता लगाने पर day 2. यदि नमूनों की संख्या अपेक्षाकृत अधिक है, अगर प्रोटोकॉल के साथ अपरिचित, या एक पूरा दिन संभव नहीं है, प्रोटोकॉल जांच का पता लगाने और संकेत प्रवर्धन 2 दिनों में विभाजित के चरणों के साथ 3 दिनों में किया जाना चाहिए । भ्रूण या विच्छेदित ऊतक नमूनों की बड़ी संख्या भी प्रक्रिया के लिए अतिरिक्त दिनों की आवश्यकता हो सकती है । विच्छेदित ऊतक नमूनों के लिए, 1 x PBT & #160; सभी चरणों में 1 x PBTT के साथ बदलें, जब तक अंयथा इंगित न हो । अतिरिक्त डिटर्जेंट मस्तिष्क और वृषण के रूप में कई लार्वा और वयस्क ऊतकों, के प्रवेश के लिए आवश्यक है । हालांकि परीक्षण नहीं, 1 एक्स PBTT भी भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रयोग १०० & #181; l प्रति चहेतों के लिए ९६-वेल प्लेट्स और ८०० & #181; l के लिए १.५ mL ट्यूबों.

    1. प्री-संकरण और संकरण
      नोट: कदम शुू-4.1.6.2 में सीटू में भ्रूण संकरण के लिए हैं । सीटू       hybridizations में लार्वा या एडल्ट टिशू के लिए इन स्टेप्स को छोड़ें ।
      1. 2 मिलीलीटर फिक्स्ड भ्रूण को निकालें (मेथनॉल में संग्रहित-20 & #176; C) को एक नया 15 एमएल ट्यूब । एक धोने में मेथनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ 7 मिनट के लिए दो बार भ्रूण धो लें । वामेथनॉल और 1 X PBTT (1:1) के 10 मिलीलीटर मिश्रण के साथ 7 मिनट के लिए श भ्रूण । 1 एक्स PBTT के 10 मिलीलीटर के साथ 7 मिनट के लिए दो बार भ्रूण धोने के लिए ।
        2. भ्रूण permeabilization के लिए
      2. , एक मध्यवर्ती proteinase K समाधान तैयार करें (४० & #181; L/एमएल) द्वारा कमजोर 1:500 से स्टॉक समाधान (20 मिलीग्राम/एमएल) । Store at-20 & #176; C. एक कार्यशील proteinase k समाधान कमजोर द्वारा मध्यवर्ती proteinase k समाधान 1/15 1 X PBTT में २.६६७ यूजी/एमएल.
        3. के अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए करें काम proteinase कश्मीर समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ
      3. Permeabilize भ्रूण (भ्रूण की छोटी संख्या के लिए कम का उपयोग करें) । 13 मिनट के लिए आर टी पर ट्यूब की मशीन धीरे ट्यूब पलटना 4 बार मशीन के दौरान । मिश्रण के बिना 1 एच के लिए बर्फ पर proteinase कश्मीर समाधान में नमूनों की मशीन ।
        नोट: पतला proteinase K के साथ यह अपेक्षाकृत लंबे समय से मशीन reproducibly वर्दी permeabilization और बाद में धुंधला सुनिश्चित करता है ।
      4. जबकि भ्रूण permeabilize, एक 2 मिलीग्राम/एमएल glycine 10 एक्स स्टॉक (20 मिलीग्राम/एमएल) से 1 x PBTT में कुल मात्रा के लिए 30 मिलीलीटर
      5. निकालें proteinase कश्मीर समाधान, glycine समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ कुल्ला (2 मिलीग्राम/एमएल) और 2 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लो । कुल्ला करने के लिए glycine को दूर करने के लिए 1 X PBTT के 10 मिलीलीटर के साथ तीन बार ।
      6. के पश्चात् भ्रूण का निर्धारण.
        1. तैयार 4% पीएफए की 10 मिलीलीटर (1 मिलीलीटर की ४०% पीएफए 9 मिलीलीटर में PBTT, ०.४५ के माध्यम से फ़िल्टर किया गया & #181; m फ़िल्टर) ।
        2. PBTT.
          3. के साथ 2 मिनट प्रत्येक के लिए 20 मिनट धो 3 एक्स के लिए 4% पीएफए में नमूने की मशीन
        3. विकृत संकरण समाधान तैयार करने के लिए, 5 मिनट के लिए संकरण समाधान फोड़ा । एक पूर्ण ९६ के लिए अच्छी तरह से थाली, 12 मिलीलीटर की तीन ट्यूबों का उपयोग करें । 5 min.
          4. के लिए तुरंत बर्फ पर ठंडा
        4. कुल्ला भ्रूण & #160; एक बार के साथ 10 मिलीलीटर की 1 X PBTT: संकरण समाधान (1:1) । संकरण समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला । Aliquot ~ 20 & #181; बस बर्फ पर एक ९६-खैर पीसीआर प्लेट में बसे भ्रूण (30-40 भ्रूण) या निर्धारित ऊतकों के प्रति अच्छी तरह से एल. एक 8-चैनल कई गुना का उपयोग कर ऊतकों या भ्रूण से संकरण समाधान निकालें पिपेट (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ /video ).
          नोट: कई गुना पिपेट ने एक & #8216; stop & #8217; जो सुझावों को कुएँ के नीचे तक जाने से रोकता है और नमूना निकालता है. ऊतकों कि फ्लोट का उपयोग प्रयोगों के लिए, एक १०० & #181 के साथ तरल सावधानी से निकालें; L पिपेट ऊपर से.
      7. Add १०० & #181; हर कुआं को विकृत संकरण समाधान के ल. प्री-संकरण भ्रूण के लिए कम से कम 2.5-3 ज पर ५६ & #176; ग एक शुष्क स्नान हीटिंग धातु मोती युक्त इकाई का उपयोग कर (सामग्री देखें और < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
      8. स्वभाव १०० & #181; तैयार जांच के एल एक ९६-well पीसीआर प्लेट में 5 मिनट के लिए एक thermocycler का उपयोग कर ८० & #176; C. तुरंत 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा । भ्रूण या ऊतकों से पूर्व संकरण समाधान निकालें । प्रत्येक नमूने के लिए विकृत जीन विशिष्ट जांच जोड़ें, सील टेप और संकरण पर ५६ & #176 के साथ कवर, 16-18 एच ओ/एन के लिए सी, शुष्क स्नान हीटिंग इकाई में धातु मोतियों के नीचे ।
    < p class = "jove_title" > 5. जांच पड़ताल

    1. ५६ & #176; C ताप इकाई में तालिका 9 में समाधानों को पूर्व-उष्ण करना । थाली से जांच निकालेगी ।
      नोट: जांच 2-3 समय के बीच पुनः उपयोग किया जा सकता है अगर पर संग्रहित-८० & #176; c (कभी भी आरएनए के नमूनों को-20 & #176; c) में संग्रहीत न करें । संकरण के बाद, डबल असहाय आरएनए एकल कतरा आरएनए की तुलना में अधिक स्थिर है, और RNase संदूषण की वजह से क्षरण के लिए कम अतिसंवेदनशील है ।
      यदि ऊतकों के लिए एक एक बहु अच्छी तरह से प्लेट वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर, एक संग्रह प्लेट जांच इकट्ठा करने के लिए फिल्टर प्लेट के तहत शामिल किया जाना चाहिए (विधानसभा विवरण के लिए वीडियो देखें) । संकरित ऊतकों को नियमित ९६ से स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी-अच्छी तरह से microtiter प्लेट १.२ & #181 के साथ एक को संकरण के लिए इस्तेमाल किया; मीटर ताकना आकार PVDF झिल्ली प्रत्येक कुआं के तल पर ।
    < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" फो: रखने के साथ-बगल में । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > पाइला पूर्व उष्ण समाधान (५६ & #176; C) समय मात्रा प्रति कुआं 1 संकरण हल: PBTT (3:1) 15 min १०० & #956; l 2 संकरण हल: PBTT (3:1) 15 min १०० & #956; l 3 संकरण हल: PBTT (1:1) 15 min १०० & #956; l 4 संकरण हल: PBTT (1:3) 15 min १०० & #956; l < t r > 5 PBTT 3 बहाकर 5 min १०० & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 9: संकरण के बाद वाशिंग जांच.

    < राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • यदि सामान्य प्लेटों का उपयोग करते हुए, ५६ पर एक ताप इकाई में 9 तालिका के अनुसार नमूनों को धो & #176; C. & #160; यदि निर्वात कई गुना प्रणाली का उपयोग कर, पीठ पर वैक्यूम प्रणाली के साथ गरम समाधान का उपयोग करें और vaccuum द्वारा नीचे से तुरंत समाधान निकालें । 1 एक्स PBTT के साथ 3 धोने के बाद, सामांय थाली हीटिंग इकाई से हटाया जा सकता है ।
  • तैयार एंटीबॉडी ।
    1. तैयार 11 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (२.५ & #181; जी/एमएल) से स्टॉक (1 मिलीग्राम/एमएल) से कमजोर बायोटिन-संयुग्मित माउस मोनोक्लोनल विरोधी खोदो एंटीबॉडी (देखें सामग्री सूची) में PBTTB (1:400) । कम नमूनों को संसाधित करते हैं, तो वॉल्यूम तदनुसार समायोजित करें ।
    2. तैयार 11 मिलीलीटर के streptavidin-एचआरपी समाधान (1 & #181; g/ml) से स्टॉक (1 mg/एमएल) से कमजोर 1:1000 streptavidin-एचआरपी संयुग्म (देखें सामग्री सूची) में PBTTB । कम नमूनों का उपयोग करते हैं, तो तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें ।
  • ब्लॉक भ्रूण या PBTTB के साथ ऊतकों (1% 1 एक्स PBTT में स्किम दूध) आरटी पर एक बेंच शीर्ष मिक्सर पर 20 मिनट के लिए
    नोट: फिल्टर पेपर का उपयोग कर फ़िल्टर PBTTB (ग्रेड 3, 6 & #181; m) ९६-अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटों पर यह प्रयोग करने से पहले कॉलेस्ट्रॉल फिल्टर से बचने के लिए । PBTB के बजाय, PBTTB (अतिरिक्त ०.३% ट्राइटन-X-१०० के साथ PBTB) प्रोटोकॉल के दौरान सभी ऊतकों के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  • मशीन भ्रूण या ऊतकों एंटीबॉडी समाधान में (१०० & #181; एल/अच्छी तरह से) बेंच-टॉप नमूना मिक्सर पर 2 एच के लिए । 1x PBTTB के साथ दो बार कुल्ला । धो 3 5 मिनट और 5 PBTTB के साथ 10 मिनट के लिए एक्स के लिए एक्स । streptavidin-एचआरपी समाधान (१०० & #181; एल/अच्छी तरह से) के लिए १.५ एच एक बेंच टॉप नमूना मिक्सर का उपयोग कर के साथ गर्मी भ्रूण या ऊतकों । धो 2 PBTTB के साथ 5 मिनट के लिए एक्स । इस बिंदु से अंधेरे में नमूने रखें.
    नोट: सभी एंटीबॉडी धोने के दौरान, यदि ऊतक दूध द्वारा उत्पादित अस्पष्टता के कारण खो दिया जा रहा है, दूध के बिना धोने की कोशिश (PBTT के बजाय PBTTB).
  • PBTTB (1:100) में कमजोर १०० X DAPI द्वारा एक DAPI समाधान तैयार करें ।
  • मशीन भ्रूण या ऊतकों DAPI समाधान के साथ (१०० & #181; एल/अच्छी तरह से) एक बेंच टॉप नमूना मिक्सर पर 15 मिनट के लिए । धो 4 PBTT के साथ 10 मिनट के लिए एक्स । ९६-वेल प्लेट को नमूनों के साथ स्टोर करें O/N पर 4 & #176; C या अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
    नोट: कार्यविधि को यहां रोका जा सकता है ।
    • < p class = "jove_title" > 6. एंटीबॉडी डिटेक्शन का प्रयोग tyramide (see < सुदृढ class = "xfig" > फिगर 5 )

    < p class = "jove_content" > NOTE: यहां क्लीक cyanine 3-संयुग्मित tyramide का इस्तेमाल किया गया, जो < सुप क्लास = "xref" > 12 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार हुआ था . कई प्रयोगों प्रदर्शन या कई नमूनों का परीक्षण करते हैं, तो यह पैसे की एक महत्वपूर्ण राशि बचाता है और (अनुभव से) वाणिज्यिक रिएजेंट की तुलना में प्रभावी है. कम प्रयोगों और नमूनों के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cyanine 3-tyramide का उपयोग किया जा सकता है (सामग्री देखें).

    1. धो नमूना प्लेटें 3 एक्स 1 एक्स PBTT.
      2. के साथ 5 मिनट के लिए
    2. तैयार tyramide सक्रियकरण बफर (सक्रियकरण बफर) युक्त ०.००६% की एच 2 ओ 2 में PBTT (पतला 30% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) एच 2 ओ 2 शेयर 1:5000) ।
      3. < lमैं > सक्रियण बफ़र के साथ प्लेट्स कुल्ला.
    3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सक्रियण बफर में कमजोर द्वारा cyanine 3-tyramide समाधान तैयार करते हैं । भ्रूण के लिए
      1. , प्रयोग 1:80 कमजोर पड़ने (१३७ & #181; L के cyanine 3-tyramide में 11 मिलीलीटर सक्रियण बफ़र) । लार्वा ऊतकों के लिए, 1:150 कमजोर पड़ने का उपयोग करें (७३ & #181; L के cyanine 3-tyramide में 11 मिलीलीटर सक्रियण बफ़र) । वयस्क परीक्षण के लिए, का उपयोग 1:200 कमजोर पड़ने (५५ & #181; L के cyanine 3-tyramide के 11 मिलीलीटर में सक्रियण बफ़र) । वयस्क अंडाशय के लिए, उपयोग 1:300 कमजोर पड़ने (३६ & #181; L के cyanine 3-tyramide के 11 मिलीलीटर में सक्रियण बफ़र).
    4. पीठ टॉप नमूना मिक्सर पर 2 ज के लिए cyanine 3-tyramide समाधान के साथ मशीन नमूने । PBTT के साथ चार बार कुल्ला । धो 6 PBTT के साथ 10 मिनट के लिए एक्स । धो 3 पंजाब के साथ 5 मिनट के लिए एक्स डिटर्जेंट को दूर करने के लिए
    5. Add १५० & #181; विरोधी क्षीण बढ़ते मीडिया के ठीक/ 4 & #176; C पर नमूने की अनुमति के लिए ऊतकों या भ्रूण को ट्यूब के नीचे सिंक करने के लिए रखें । खुर्दबीन स्लाइड पर नमूने माउंट (ऊतकों के लिए विदारक गुंजाइश के तहत) और coverslip के साथ कवर । पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील ।
    6. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि.
      नोट: पहले नकारात्मक नियंत्रण का विश्लेषण करें & #8216 का एक विचार पाने के लिए; गैर-विशिष्ट & #8217; पृष्ठभूमि.
      & #160;

    Representative Results

    आरेख 6 इस कार्यविधि का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के उदाहरण दिखाता है । शीर्ष 3 पैनलों जल्दी Drosophila भ्रूण (चित्रा 6, पैनलों एक-सी), अगले 3 पैनलों विभिंन ऊतकों (amnioserosa, मांसपेशियों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में संकेतों के साथ देर Drosophila भ्रूण के उदाहरण दिखाने के उदाहरण दिखाने के लिए, क्रमशः (चित्रा 6, पैनलों डी-एफ) । अगला 3 instar लार्वा ऊतकों (चित्रा 6, पैनलों G-J) से उदाहरण हैं । पैनलों K और L वयस्क gonads (अंडाशय और वृषण, क्रमशः) से प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं । सैकड़ों छवियों को अपलोड किया गया है और ' सीटू फ्रूट फ्लाई डेटाबेस ' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)) में हमारे खोजा ' फ्लोरोसेंट में व्याख्या की गई है ।

    Figure 1
    चित्र 1. सीटू संकरण (मछली) प्रोटोकॉल और प्रमुख उपकरणों में फ्लोरोसेंट की रूपरेखा । (क) सीडीएनए का पीसीआर प्रवर्धन. (ख) इन विट्रो प्रतिलेखन में जीन विशेष antisense खुदाई-लेबल आरएनए जांच एक ९६-अच्छी तरह से थाली (बी में दिखाई थाली की तस्वीर) । (ग) और (घ): वयस्कों (महिला: पुरुष अनुपात 2:1.300-400 मक्खियों/मक्खियों को 3-4 दिनों के लिए मेट की अनुमति दी जाती है । 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक cornmeal भोजन पर एक रात संग्रह से भ्रूण एक अच्छी तरह हवादार प्लास्टिक बॉक्स (एक कंटेनर आकार में cornmeal भोजन के 1 एल को हस्तांतरित कर रहे हैं: 8 "x 8" x 3 "LWH) या नई बोतलों के लिए एक उचित लार्वा घनत्व रखने । ऊतक संग्रह के लिए, सक्रिय खमीर पाउडर अंडे बिछाने (AEL) के बाद 24, ४८ ज पर भोजन के शीर्ष पर छिड़का जाना चाहिए । (E to H): सीटू संकरण प्रयोगों में फ्लोरोसेंट लगातार 3 दिनों से अधिक प्रदर्शन किया । भ्रूण या ऊतकों कि नाव नहीं है के लिए, एक ९६-well पीसीआर प्लेट का उपयोग के रूप में 8 के साथ फोटो बी में दिखाया चैनल aspirator (फोटो सी) । ऊतकों है कि सबसे लार्वा ऊतकों की तरह, फ्लोट के लिए, एक फिल्टर-तली हुई प्लेट (डी में तस्वीर) का उपयोग करें और नीचे से एक कई गुना aspirator कम दबाव (ई में तस्वीर) का उपयोग कर के साथ तरल निकालें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2. आरएनए जांच उपज का निर्धारण । नव संश्लेषित antisense आरएनए जांच एक 1% agarose जेल (5 µ एल/ उपज को वर्गीकृत किया जा सकता है (बैंड की तीव्रता के आधार पर) ' के रूप में कम उपज ' गलियों में 3 और 10, ' ठेठ ' गलियों में उपज 1, 4, 5, 6 और 8, या ' उच्च ' गलियों में उपज 2, 7, 9, 11, और 12 । ' ठेठ पैदावार ' के साथ नमूनों के लिए, जांच के 10-15 µ एल का उपयोग करें १०० µ एल में संकरण समाधान के प्रत्येक के लिए सीटू प्रयोग में पतला । ' एक ठेठ जांच ' तीव्रता के सापेक्ष बैंड तीव्रता के अनुसार अतिरिक्त संकरण समाधान के साथ जांच की ' उच्च पैदावार ' के साथ नमूने पतला । प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग बराबर अंतिम जांच सांद्रता है उद्देश्य । तीर एक ' आरएनए जांच ' के लिए अंक, प्रत्येक लेन पर उच्च बैंड मूल डीएनए टेम्पलेट है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3. बड़े पैमाने पर भ्रूण संग्रह और निर्धारण के लिए प्रमुख कदम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4. लार्वा या अस्थायी ऊतकों से तरल को हटाने के लिए घर का बना ट्यूब । कुछ लार्वा और वयस्क ऊतकों को निर्धारण के दौरान समाधान में तैरने लगते हैं । यह सरल उपकरण एक नायलॉन एक २०० µ एल कट टिप द्वारा आयोजित जाल के होते हैं, एक अनुकूलक एक aspirator से कनेक्ट करने के लिए के रूप में एक 1 मिलीलीटर टिप द्वारा पीछा किया । तरल किसी भी ऊतक को खोने के बिना सुरक्षित रूप से हटाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5. Tyramide संकेत प्रवर्धन. (१) डीआईजी-त्यसपछि antisense आरएनए जाँच अंतर्जात भाव आरएनए के साथ hybridizes. (२) bliss-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी और डीआईजी-UTP के बीच संबंध बंधनकारक. (३) एचआरपी संयुग्मित streptavidin बाँधे बायोटिन. (4) एचआरपी catalyzes cyanine 3-tyramide और हाइड्रोजन पेरोक्साइड की प्रतिक्रिया लघु रूप में रहते थे cyanine 3-tyramide कण । (५) Cyanine ३-tyramide कण पास के प्रोटीन पर tyrosine अवशेषों को बाँध देते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6. सीटू में प्रतिनिधि संकरण छवियां । प्रत्येक पैनल एक अलग आरएनए का एक उदाहरण दिखाता है (सियान में दिखाया गया है) और DAPI के साथ सना हुआ नाभिक (लाल रंग में दिखाया गया है). (A-C) जल्दी Drosophila भ्रूण के उदाहरण । (डी, एफ) देर से Drosophila भ्रूण के उदाहरण । (G-J) 3 instar Drosophila लार्वा ऊतकों (malphigian नलिकाओं, midgut, लार ग्रंथि और मांसपेशियों क्रमशः) के उदाहरण । (K) वयस्क अंडाशय. (ठ) प्रौढ वृषण. प्रत्येक पैनल जीन का नाम है कि जांच करने के लिए hybridizing है प्रदर्शित करता है । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Discussion

    वर्णित प्रोटोकॉल निश्चित Drosophila भ्रूण या ऊतकों में सबसे RNAs का पता लगाने के लिए एक उच्च प्रतिलिपि, संवेदनशील, और किफायती तरीका प्रदान करता है । हालांकि जांच का पता लगाने के अधिक परंपरागत रूप से इस्तेमाल alkaline फॉस्फेट विधि से थोड़ा अधिक जटिल है, मछली द्वारा प्राप्त संकल्प कहीं अधिक से अधिक है और संवेदनशीलता तुलनीय है या सुधार 7,8। पूरी या आंशिक microtiter प्लेटों का उपयोग करके, प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर या ब्याज की जीन के सीमित विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जांच उत्पंन सभी या एकाधिक प्रतिलिपि ब्याह रूपों का पता लगाने जब तक जांच और अधिक विशेष रूप से डिजाइन (यानी, एक exons) हो सकता है । हालांकि हम परीक्षण किया है जांच के रूप में छोटे के रूप में २०० न्यूक्लियोटाइड उचित सफलता के साथ, छोटे जांच कम प्रभावी हो जाते है और कम विशिष्ट हो सकता है । जाहिर है, इस प्रोटोकॉल छोटे introns, exons, या संसाधित microRNAs का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है ।

    हालांकि इस दृष्टिकोण संकेतों की ताकत को बढ़ावा देने के लिए एक एंजाइमी कदम का उपयोग करता है, संकेत तीव्रता अभिव्यक्ति के स्तर की एक अपेक्षाकृत रैखिक और व्यापक रेंज में जीन अभिव्यक्ति को लक्षित करने के लिए आनुपातिक प्रतीत होता है । उच्च आवर्धन पर, संकेत puncta या कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर speckles के रूप में देखा जाता है । अपेक्षाकृत दुर्लभ टेप के लिए केवल कुछ छोटे puncta देखा जाता है । के रूप में प्रतिलिपि बहुतायत बढ़ जाती है, इन संख्या और आकार में वृद्धि । एकल अणु मछली (smFISH) के साथ के रूप में, एकल छोटे puncta भी एकल RNAs के अनुरूप हो सकता है और भी आसानी से मात्रा इमेजिंग और सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाना चाहिए । प्रकाशित छवियों की तुलना छवियों है कि हम एक ही लक्ष्य के लिए उपचारात्मक है के साथ smFISH का उपयोग कर प्राप्त सुझाव है कि समग्र, संवेदनशीलता और दो तरीकों के समाधान अपेक्षाकृत समान हैं, हालांकि यह अधिक कठोर तुलना द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए । smFISH के बहुत अधिक खर्च को देखते हुए, यहां प्रदान की विधि लागत के एक अंश पर इसी तरह के परिणाम देना चाहिए । हालांकि, अगर लक्ष्य के लिए छोटे टेप, या टेप के विशिष्ट भागों का पता लगाने के लिए है, smFISH की सिफारिश की है ।

    कुछ मछली जांच के छोटे आकार के कारण, इस विधि भी ऊतकों कि बड़े है या महत्वपूर्ण बाधाओं है मर्मज्ञ में बेहतर हो सकता है । हालांकि, हमारे उच्च डिटर्जेंट स्तर और ऊतक निर्धारण और permeabilization tweaks के उपयोग के लिए इस समस्या का हल दिखाई देते हैं । अंत में, हालांकि Drosophila ऊतकों के लिए विकसित, उच्च डिटर्जेंट, विच्छेदित ऊतकों के लिए यहां वर्णित बफ़र्स भी Drosophila भ्रूण के लिए काम करना चाहिए और साथ ही अधिकांश अंय जीवों और ऊतकों ।

    Disclosures

    लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

    Acknowledgments

    इस परियोजना के लिए अनुदान सहायता HMK को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों द्वारा प्रदान की गई थी (अनुदान १३३४७३) ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
    2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
    50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
    96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
    96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
    Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
    Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
    Agarose Bioshop AGA002.500
    AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
    AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
    AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
    Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
    BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
    Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
    Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
    DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
    Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
    Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
    Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
    Formamide Bioshop FOR001.500
    Glycerol Bioshop GLY002.4
    Glycine Bioshop GLN001.500
    Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
    Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
    Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
    Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
    Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
    Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
    Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
    Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
    Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
    PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
    Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
    Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
    PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
    Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
    Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
    Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
    RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
    Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
    RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
    RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
    Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
    Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
    Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
    SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
    Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
    Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
    Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
    T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
    T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
    Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
    Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
    Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
    TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
    Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
    Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
    Name Company Catalog Number Comments
    Solutions Preparation
    DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
    1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
    1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
    1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
    1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

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    References

    1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
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    3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
    4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
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    12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

    Tags

    आनुवंशिकी मुद्दा १२८ आरएनए उपसेलुलर स्थानीयकरण सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट मछली Drosophila उच्च प्रवाह tyramide संकेत प्रवर्धन भ्रूण ऊतकों.
    <em>Drosophila</em> भ्रूण और Tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर ऊतकों में <em>सीटू संकरण में</em> उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट
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    Jandura, A., Hu, J., Wilk, R.,… More

    Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

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