Summary
Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.
Abstract
In onze inspanningen om de patronen van meningsuiting en subcellular localisatie van Drosophila RNAs op basis van de genoom-brede en in een verscheidenheid van weefsels, hebben we talloze aanpassingen en verbeteringen aan onze oorspronkelijke TL in situ protocol van hybridisatie (FISH). Ter vergemakkelijking van doorvoer en kosteneffectiviteit, zijn alle stappen, van sonde generatie op signaal detectie, uitgevoerd met behulp van de exon 96-wells microtiterplaat platen. Digoxygenin (DIG)-gelabelde antisense RNA sondes worden geproduceerd met behulp van cDNA klonen of genomic DNA als sjablonen. Na weefsel fixatie en permeabilization, sondes worden gekruist om afschriften van belang en vervolgens gevonden met behulp van een opeenvolging van anti-DIG antilichaam geconjugeerd met biotine, daar geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) en fluorescently geconjugeerd tyramide, die in het bijzijn van HRP, produceert een zeer reactief intermediair dat zich bindt aan elektron dichte regio's van de onmiddellijk aangrenzende eiwitten. Versterking en localisatie volgt produceren een robuust en sterk gelokaliseerde signaal dat beide transcript van cellulaire en subcellular localisatie wordt vergemakkelijkt. De protocollen die zijn geoptimaliseerd voor de productie van zeer specifieke signalen in een verscheidenheid van weefsels en ontwikkelingsstadia. Verwijzingen zijn ook voorzien van extra variaties waarmee de simultane detectie van meerdere afschriften, of afschriften en eiwitten, op hetzelfde moment.
Introduction
Nieuwe genoom-brede RNA detectiemethoden zoals RNA-seq hebben onze kennis van wanneer en waar de genen worden uitgedrukt, en op welke niveaus1sterk uitgebreid. Deze bieden echter relatief lage temporele en ruimtelijke resolutie. RNA in situ hybridisatie kunt de ruimtelijke spreiding van afschriften worden visueel waargenomen in vaste weefsels, aldus onthullen de details van cellulaire en subcellular localisatie2. Gebruikt Fluorescente kruising in situ (vissen), kunt zelfs meer ruimtelijke resolutie als daarmee het gebruik van krachtige microscopie technieken, zoals confocale en lichte blad microscopie3. Fluorescente markeringen zoals DAPI kunnen ook worden gebruikt om vast te stellen subcellular relaties4. VIS vergemakkelijkt ook de observatie van meerdere RNAs en eiwitten gelijktijdig met duidelijke aanwijzingen van overlap op het subcellular niveau. Unieke reagentia en stappen die nodig zijn voor het labelen van dubbele kunnen worden gevonden in de volgende verwijzingen3,5.
De hier beschreven procedures gebruiken 96-wells microtiterplaat platen voor alle maatregelen, met inbegrip van cDNA sjabloon productie (PCR van de kolonie), RNA sonde productie (met T7, T3 of SP6 polymerase-afhankelijke run-off transcriptie), in situ hybridisatie, en fluorescent signaal ontwikkeling. Voldoende aantal embryo's of weefsels worden toegevoegd aan elk van de 96-wells-plaat om evaluatie van de consistentie en veranderlijkheid. Nou dan ontvangt elk een verschillende sonde. Na signaal ontwikkeling, zijn embryo's of weefsels van elk putje gekleed op individuele Microscoop dia's voor microscopische analyse.
Het gebruik van tyramide signaal versterking (TSA) voor de detectie van de sonde produceert robuuste signalen met uitzonderlijke subcellular resolutie 5,,6,,7,8. De subcellular localisatie van RNAs is een belangrijke regelgevende mechanisme 9 die verschijnt optreden bij vrijwel alle RNAs 4,10,11. Deze analyses hebben ook aangetoond dat veel afschriften die niet worden gedetecteerd door RNA-seq gemakkelijk worden gedetecteerd door vis 8. De aanpassing van RNA in situ hybridisatie aan 96-wells-platen kunt analyse van maximaal 96 genen van belang op een moment (meer als extra platen worden gebruikt), analyse van grote datasets mogelijk te maken. Door het snijden van de platen in kleinere delen, is de methode ook gemakkelijk aangepast aan een paar monsters. Het protocol geboden is geschikt voor analyse van RNA distributies in de meeste soorten weefsels. Hoewel niet wordt weergegeven, is het aan te passen aan niet -Drosophila weefsels zo goed.
Protocol
1. PCR versterking van cDNA sjablonen van plasmiden
Opmerking: gebruik van hoge kwaliteit plasmide of DNA PCR gegenereerde sjablonen voor RNA sonde synthese. De Drosophila Gene collectie (DGC) bibliotheken gegenereerd door de Berkeley Drosophila genoomproject biedt dekking voor de meeste codering genen gevonden in het genoom van Drosophila (zie tabel 1a). Deze kunnen ook het gebruik van universele inleidingen voor de versterking van een cDNA invoegen. Deze PCR amplifications worden op plasmide ANI's aanwezig in de lysates van plasmide-bevattende bacteriële culturen uitgevoerd. De DNA-producten worden vervolgens gebruikt als sjablonen voor in vitro transcriptie voor het genereren van antisense RNA sondes (zie tabel 1b).
- Om te vullen een specifieke exon-regio van een gen van belang door PCR inleidingen ontwerpen (bv. van genomic DNA), bij voorkeur met de T7 polymerase erkenning site op het einde antisense.
- Voor experimenten met minder dan 96 monsters, afgesneden van onnodige gedeelten van 96-wells-platen. Dekking van de platen met afdichting tape (Zie materiaal) voor alle incubations en opslag. Als microcentrifuge buizen worden gebruikt, aangepast volumes.
Opmerking: 96-wells-platen staan het gebruik van meerkanaals pipetten voor grotere gegevensdoorvoer, evenals kleinere volumes voor kostenbesparing.
| tabel 1a | ||||
Vector | Antibiotica werken concentratie 1:1000 |
Primers | RNA polymerase voor antisense | RNA polymerase. voor zin |
| pFLC-ik | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | ,T3 |
| pOT2 | Elektrolyse | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tabel 1b | ||||
| Primer | reeks | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Reverse | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
tabel 1: A) algemene DGC kloon informatie voor het sturen van cDNA wordt ingevoegd in de plasmiden. B) sequenties van universele inleidingen voor DGC plasmiden.
- 250 groeien µL van het plasmide-bevattende bacteriecultuur in 96-Wells cultuur platen door toevoeging van 240 µL van LB-media per putje met de juiste antibiotica keuze (1:1000 verdunning van een antibioticum voorraad van 1000 X), en 10 µL van het origineel plasmide-bevattende bacteriën (uit de voorraad van een glycerol). Zegel met tape afdichten.
- Incubate door schudden bij 215 t/min bij 37 ° C's nachts (O/N).
Opmerking: Maak een nieuwe kopie van bacteriële glycerol cDNA plasmide kloon materieel ter vervanging van het origineel. Niet originele bacteriële voorraad, doen refreeze, als dit de bacteriën kan doden. - Voor de productie van de PCR-sjablonen, Verdun 10 µL van de O/N bacteriecultuur in 90 µL gesteriliseerde met autoclaaf ddH 2 O in ieder putje van een nieuwe PCR 96-wells-plaat. Het DNA voor 5 min bij 95 ° C in thermocycler denatureren. Onmiddellijk plaats van de plaat op ijs voor ten minste 5 min.
- Bereiden PCR reacties met behulp van passende universele inleidingen volgens tabel 2.
| reagentia | 50 µl monster reactie | 96 goed mengen (112 x reactie) | eindconcentratie |
| 2 X PCR polymerase Mix | 25 μl | 2800 μl | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/l) | 0,5 μl | 5 6 μl | 0,25 pmol/l |
| Primer_Rev (25 pmol/l) | 0,5 μl | 56 μl | 0,25 pmol/l |
| ddH2O | 22 μl | 2464 μl | < /TR > |
| totaal | 48 µl | 5376 μl |
tabel 2: PCR Master Mix.
- met behulp van een precisiepipet, aliquoot 48 µL van de master mix van PCR in ieder putje van een nieuwe PCR 96-wells-plaat. Voeg 2 µL van elke sjabloon DNA gedenatureerd plasmide per putje.
NB: Gebruik tussen 1 picogram (pg) aan 1 nanogramgebied (ng) van plasmide DNA. Buitensporige DNA sjabloon vermindert PCR opbrengst en specificiteit. - Programma van de 96-Wells PCR machine volgens tabel 3 en uitvoeren van de amplificatie.
Opmerking: De tijd van de uitbreiding bij 72° C wordt bepaald door de grootte van het PCR-product (45 s voor ≤ 2.0 kb, 1.5 min voor ≤ 3.0 kb, 3 min voor ≤ 4.0 kb en 3,5 min voor 4.0-5.0 kb). De onthardende temperatuur (Tm) wordt bepaald door een opeenvolging van inleidingen. Wanneer een primer is gelijk of meer dan 20 nt, het VG wordt als volgt berekend:
Tm (° C) = (4 X aantal CG) + (2 X aantal AT) -4.
| stap | temperatuur | tijd | uitlaatgasnabehandelingssysteem |
| Eerste denaturatie | 95 ° C | 3 min | 1 cyclus |
| versterking denaturatie, gloeien en uitbreiding | 95 ° C | 45 sec | < td rij span = "3" > 30 cycli|
| 54-58 ° C | 45 sec | ||
| 72 ° C | 45 sec-3,5 min | ||
| Laatste uitbreiding | 72 ° C | 7 min | 1 cyclus |
| Opslag | 4 ° C | houden |
tabel 3: aanbevolen PCR programma.
- PCR product precipitatie met Ethanol (EtOH) en natrium acetaat (NaOAC) (zie tabel 4).
Opmerking: Als het PCR reactie volume minder dan 50 µL is, vullen naar 50 µL met ddH 2 O.- Neerslaan van het DNA te mengen van de componenten uit tabel 4 en winkel monsters O/N bij-20 ° C of gedurende 30 minuten op-80 °C.Centrifuge de 96-wells-plaat voor 45-60 min bij 2250 x g bij 4 ° C. gebruik een 8-kanaals spruitstuk Pipetteer tot carefully Verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen met 160 µL van koude 70% EtOH (RNase-vrij) gedurende 30 minuten bij 2250 x g bij 4 ° C.
Opmerking: De geprecipiteerde DNA kan worden gezien op de bodem van putten. Kortere PCR producten vereist langere centrifugations. - Voorzichtig omkeren de 96-wells-plaat op een papieren handdoek te verwijderen van de laatste druppels van vloeistof in elk putje (zoveel mogelijk). Lucht drogen DNA pellet gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Resuspendeer de geprecipiteerde DNA in 25 µL RNase gratis water.
Nota: De droge lucht van 1 h zal toestaan alle sporen van EtOH te verdampen. Een zeer kleine hoeveelheid vloeistof (ongeveer 1 µL) moet echter blijven in elk putje om te voorkomen dat de DNA-pellet volledig drogen. Gebruik 25 µL voor een 50 µL PCR reactie. Gebruik geen DEPC behandeld water in dit stadium om storing met in vitro transcriptie in de volgende stappen te voorkomen.
- Neerslaan van het DNA te mengen van de componenten uit tabel 4 en winkel monsters O/N bij-20 ° C of gedurende 30 minuten op-80 °C.Centrifuge de 96-wells-plaat voor 45-60 min bij 2250 x g bij 4 ° C. gebruik een 8-kanaals spruitstuk Pipetteer tot carefully Verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen met 160 µL van koude 70% EtOH (RNase-vrij) gedurende 30 minuten bij 2250 x g bij 4 ° C.
| component | Volume | deel |
| PCR | 50 µl | |
| 100% ethanol | 125 μl | 2.5 X vol. van PCR |
| 3 M NaOAc (pH = 5.2, RNase gratis) | 5 µl | 10% vol van PCR |
| totale | 180 μl |
tabel 4: voorbeeld van een PCR-reactie van 50 µL.
- Controleer de grootte en de opbrengst van PCR producten door 5 µL van de geresuspendeerde DNA-oplossing uit te voeren op een 1% agarose gel in 1 X TAE-buffer.
Opmerking: Een totaal van 250-500 ng van DNA sjabloon is vereist voor de 15 µL in vitro transcriptie reactie. Monsters met een hogere opbrengst kunnen verder worden verdund. De RNA-opbrengst hangt ook af van de volgorde en de lengte van de DNA-sjabloon. Volgens de algemene gids voor DIG-RNA labelen met T7 RNA polymerase, ongeveer 10 µg DIG-geëtiketteerden RNA wordt geproduceerd uit 1 µg gelineariseerde sjabloon.
2. In vitro transcriptie voor het genereren van antisense sondes.
Opmerking: het is van cruciaal belang om te werken in een RNase-vrije omgeving. Alle reagentia en lab-ware moeten worden RNase gratis (zoals gecertificeerde DNase/RNase gratis plastic ware).
| component | voorraad concentratie | Volume | De definitieve concentratie van |
| ATP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| GTP | 100 mM | 7 & # 956; l | 10 mM |
| UTP | 100 mM | 4,5 μl | 6.5 mM |
| Dig-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3.5 mM |
| RNase gratis water | < /td > | 19,5 μl | |
| totaal | 70 μl |
tabel 5: DIG-NTP Mix voorbereiding.
< tabel Border = "1" fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-met-next.within-pagina = "always" >(112 x reactie)
tabel 6:2 X transcriptie Master Mix.
- Voorbereiden de DIG-NTP mix volgens tabel 5.
Opmerking: Om fouten te voorkomen, altijd uitlijnen de plaat zodanig dat A1 op de linker bovenhoek van de plaat. - Toevoegen-componenten beschreven in tabel 6 aan elk putje in een nieuwe PCR 96-wells-plaat (sonde plaat). Voeg 7,5 µL van het PCR-product (DNA sjabloon) toe aan elk goed overeenkomt, met behulp van een meerkanaalspipet. De afdekplaat met tape afdichten.
Opmerking: De optimale hoeveelheid PCR product toegevoegd per transcriptie reactie moet tussen 0,5 en 1 µg. Als bands op de gel aanzienlijk zwakker of intenser zijn, kan de hoeveelheid DNA toegevoegd aan de reactie dienovereenkomstig worden aangepast. Het exacte bedrag is niet kritisch. - Broeden de plaat van de sonde bij 37 ° C voor 3.5-4 h. Mix 15 µL van gesynthetiseerde sonde met 35 µL van DEPC behandeld ddH 2 O, 125 µL van 100% EtOH en 5 µL van 3 M NaOAC (pH = 5.2, RNase gratis). Opslaan bij-80 ° C gedurende ten minste 30 min. Centrifuge en wassen zoals beschreven in stappen 1.10.2 en 1.10.3.
- Resuspendeer de geprecipiteerde sonde in 25 µL van DEPC ddH 2 O. Run 5 µL behandeld op een 1% agarose gel (speelduur < 20 min) om te controleren van de integriteit en de opbrengst van de sonde ( Figuur 2).
Nota: De agarose gel moet worden gemaakt met DEPC behandeld ddH 2 O en TAE-buffer. Gel elektroforese apparaat moeten worden toegewezen voor RNA werken alleen. Langere gel speelduur bij lage snelheid kan leiden tot aantasting van het RNA tijdens elektroforese. - Meng de resterende 20 µL van de gesynthetiseerde sonde met 100 µL hybridisatie oplossing (tabel 7) en winkel bij-80 ° C totdat nodig.
Opmerking: De concentratie van de sonde kan worden verdund meer als bands zijn bijzonder robuust (Zie Figuur 2 voor voorbeelden). Hybridisatie oplossing is zeer effectief in het voorkomen van RNase besmetting. Onmiddellijk toevoegen hybridisatie oplossing aan de geresuspendeerde sonde om te voorkomen dat de aantasting van het RNA. Hybridisatie oplossing moet worden gefilterd door een 0,2 µm filter. Voor weefselsteekproeven, het wasmiddel concentratie in de oplossing van de kruising te verhogen door toevoeging van Triton-X-100 aan een eindconcentratie van 0,3%.
| component | Volume | eindconcentratie |
| DEPC behandeld ddH2O | 11.85 ml | 23.7% |
| 20 X SSC | 12,5 ml | 25% (5 X) |
| Formamide | 25 ml | 50% |
| Heparine (50 mg/ml) | 0,1 ml | 0. 2% (0,1 mg/ml) |
| Zalm sperma één gestrande DNA | 0,5 ml | 1,0% |
| Tween-20 | 0,05 ml | 0,1% |
| Totale | 50.00 ml | 100% |
3. drosophila fokken en embryo, larve en volwassen weefsel collectie.
Opmerking: voor zowel kleinschalige (flessen) en massa (dozen) fokken vliegen, standaard vliegen lab protocollen op maïsmeel gebaseerd voedsel bij 25 ° C. Houd goede volwassen en larvale dichtheid gebruiken en extra actieve gist poeder voor de menselijke voeding bieden oppervlakken.
- Collect embryo's na standaardprotocollen. De hoofdstappen van het embryo worden geïllustreerd in Figuur 3.
Opmerking: Na het spoelen devitillinized embryo's in methanol, de vaste embryo's kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende maximaal één jaar. Embryo permeabilization en na fixatie worden uitgevoerd op dag 1 van het protocol van de vis. - Voorbereiden vers 40% PFA stamoplossing.
- Voorbereiden een versgemaakte stockoplossing van 40% paraformaldehyde (PFA) door het mengen van 10 mL DEPC behandeld ddH 2 O 3.68 g PFA en 70 µL van 2N KOH in een 20 mL glas Scintillatie flesje met een klein roer bar.
Let op: PFA is zeer giftig met potentiële acute en chronische gezondheidseffecten. MSDS (Veiligheidskaarten materiaal) te lezen en te gebruiken met goede bescherming voor de ogen, huid en luchtwegen. - In een zuurkast, warmte en roer de flacon voor 3-5 min op een verwarmingsplaat bij 200 ° C tot de PFA is volledig opgelost. De stockoplossing PFA Haal van het vuur zodra de PFA wordt ontbonden (doen niet oververhit).
- De opgeloste 40% PFA stockoplossing op ijs gedurende 5 minuten afkoelen, en filteren met een 0,2 µm filter en 10 mL spuit.
- Voorbereiden een versgemaakte stockoplossing van 40% paraformaldehyde (PFA) door het mengen van 10 mL DEPC behandeld ddH 2 O 3.68 g PFA en 70 µL van 2N KOH in een 20 mL glas Scintillatie flesje met een klein roer bar.
- Derde instar larven (L3) of volwassen weefsel fixatie, blussen en permeabilization
Opmerking: dit protocol moet worden afgewerkt in een dag. Het omvat weefsel dissectie, fixatie, blussen van endogene HRP, permeabilization en na fixatie.- Voorbereiden fixing oplossingen (Fix-I en Fix-II) volgens tabel 8.
Opmerking: pikrinezuur wordt gebruikt als een extra fixeerspray als weefsel heeft een fijne structuur dat moet worden behouden. Het is niet een goed fixatief als weefsel ultrastructuur moet worden bewaard voor elektronenmicroscopie (EM).
Waarschuwing: pikrinezuur is onstabiel en heeft de mogelijkheid om te reageren met andere stoffen en ontplofbare verbindingen maken. Gebruik en sla volgens veiligheidsrichtlijnen. - Plaats larven of volwassen vliegen in een plastic buis van 50 mL, met 10 mL koude 1 X PBS en 100 µL van Fix-ik oplossing. Chill op het ijs gedurende 2 minuten om larvale of volwassen vliegen motiliteit.
- Knippen uit het topje van een plastic tip van 1 mL maken een opening van 2-3 mm. Overdracht van 10-30 larven of volwassene vliegt met de tip 1 mL in een petrischaal (diameter 9 cm) met een ondiepe laag van 1 X PBS van de tube van 50 mL (stap 3.3.2). Het toevoegen van een beetje PBTT kan verminderen oppervlaktespanning. Zorgvuldig ontleden larvale (openen vanuit anterior en knijp weefsels van posterieure aan anterior) of volwassen weefsels van belang met een paar scherpe pincet onder een ontleden.
Opmerking: Ongeveer 200-300 larven of volwassen testes kunnen worden ontleed en in één dag opgelost door ervaren personen. - Overdracht ontleed weefsels met een 200 µL Pipet (met het puntje afgesneden maken een 2 mm diameter openen) in een tube 1,5 mL en winkel op ijs. Elke ronde van dissectie binnen 10-15 min voordat vooruit naar de volgende stap voltooien.
Opmerking: Ga verder met extra rondes (binnen een venster van tijd van 2 h) zoals vereist voor het genereren van voldoende materiaal. - Fix weefsels met 800 µL van Fix-ik oplossing voor 30 min op een bankje top mixer. Spoelen weefsels zodra met 800 µL 1 X PBTT en houden van buizen op ijs voor een maximum van 2,5 h. vanwege de 30 min beperken, dit moet batchgewijs worden uitgevoerd totdat voldoende weefsel is geïnd.
- Bundelen alle ontleed en vaste weefsels in een enkele 15 mL kunststof buis met gaas in het deksel (Zie Figuur 4 voor buis ontwerp). Gecombineerd overtollige vocht via de mazen in het deksel van de buis. Wassen van 3 X 5 minuten elk met 10 mL van de 1 X PBTT. Spoel tweemaal met 10 mL 1 X PBS afwasmiddel te verwijderen. Hiermee voorkomt u dat overtollige luchtbellen in de volgende stap.
Opmerking: Als ontleed weefsels naar de bodem van de buis zinken, kunnen de stappen worden uitgevoerd in normale microtiterplaat platen of 0,5-1,5 mL microcentrifuge buizen (300-800 µL volume per buis). - Quench endogene HRP activiteit met 5 mL 0,3% H 2 O 2 in PBS voor 15 min op RT. Herhaal nogmaals. Houd het deksel open tijdens deze stap zonder mengen. Spoel tweemaal met 10 mL 1 X PBTT. Wassen tweemaal voor 5 min met 10 mL van de 1 X PBTT.
- Permeabilize weefsels met 10 mL van 80% aceton (-20 ° C, vooraf gekoeld) op-20 ° C gedurende 10 minuten omkeren de buis tweemaal tijdens de incubatieperiode. Wassen tweemaal voor 10 min met 10 mL van de 1 X PBTT naar de weefsels hydrateren.
- Spoelen met 10 mL van een mengsel van 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisatie oplossing (1:1). negeren mix en vervangen met 10 ml hybridisatie. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C totdat het nodig is. Voor de beste resultaten, Sla geen monsters voor meer dan een week.
- Voorbereiden fixing oplossingen (Fix-I en Fix-II) volgens tabel 8.
| component | Fix ik (10 ml) | Fix II (10 ml) |
| 40% PFA voorraad | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8,99 ml | 9 ml |
| pikrinezuur oplossing | 10 μl | - |
4. in situ hybridisatie
Opmerking: dit gedeelte van het protocol vereist een minimum van 2 dagen, met de bereiding van de monsters, pre kruising en kruising nemen plaats op dag 1 en sonde detectie op dag 2. Als het aantal monsters is relatief hoog, als niet vertrouwd zijn met het protocol, of een volledige dag niet mogelijk is, moet het protocol worden uitgevoerd in 3 dagen met de stappen van de sonde opsporen en signaal versterking in 2 dagen verdeeld. Grote aantallen embryo's of ontleed weefselsteekproeven mogelijk ook extra dagen te verwerken. Voor ontleed weefselsteekproeven, vervangen door 1 X PBT 1 X PBTT in alle stappen, tenzij anders aangegeven. Het extra wasmiddel is vereist voor de penetratie van vele larvale en volwassen weefsel, zoals de hersenen en de testis. Hoewel nog niet getest, 1 kan X PBTT ook worden gebruikt voor embryo's. Gebruik 100 µL per putje voor 96-wells-platen en 800 µL voor 1,5 mL tubes.
- Pre kruising en kruising
Opmerking: stappen 4.1.1-4.1.6.2 zijn voor embryo in situ hybridisatie. Voor larvale of volwassen weefsel in situ kruisingen, moet u deze stappen overslaan.- Verwijderen 2 mL van vaste embryo's (opgeslagen in methanol bij-20 ° C) om een nieuwe tube van 15 mL. Wassen embryo's tweemaal voor 7 min met 10 mL van methanol in elke wasbeurt. WAsh embryo's voor 7 min met 10 mL van het mengsel van methanol en 1 X PBTT (1:1). Wassen van embryo's tweemaal voor 7 min met 10 mL van de 1 X PBTT te rehydrateren.
- Voor embryo permeabilization, bereid een tussenliggende proteïnase K-oplossing (40 µL/mL) door verdunning van de 1:500 van de stockoplossing (20 mg/mL). Opslag bij -20 ° C. Maak een werkoplossing proteïnase K door verdunning van de tussenliggende proteïnase K-oplossing 1/15 in 1 X PBTT voor een eindconcentratie van de werken van 2.667 mg/mL.
- Permeabilize embryo's met 10 mL van de werkoplossing proteïnase K (gebruik minder voor kleinere aantallen embryo's). Incubeer de buis op RT voor 13 min. omkeren de tube zachtjes 4 keer tijdens de incubatie. Incubeer de monsters in de oplossing van het proteïnase K op ijs voor 1 h zonder mengen.
Opmerking: Deze relatief lange incubatie met verdunde proteïnase K zorgt voor reproducibly uniforme permeabilization en latere kleuring. - Terwijl embryo's permeabilize, maak een 2 mg/mL glycine oplossing uit 10 X voorraad (20 mg/mL) in 1 X PBTT voor een totaal volume van 30 mL.
- Verwijderen proteïnase K-oplossing, met 10 mL van oplossing (2 mg/mL) van de glycine afspoelen en wassen tweemaal voor elke 2 min. Spoel driemaal met 10 mL 1 X PBTT te verwijderen van de glycine.
- Na fixatie van embryo's.
- 10 mL 4% bereiden PFA (1 mL van 40% PFA in 9 mL PBTT, gefilterd door 0,45 µm filter).
- Broeden de monsters in 4% PFA voor 20 min. Wash 3 X voor elke 2 min met PBTT.
- Te bereiden gedenatureerde hybridisatie oplossing, kook de kruising oplossing voor 5 min. Gebruik voor een volledige 96-wells-plaat, de drie tubes van 12 mL. Cool op ijs onmiddellijk voor 5 min.
- Rinse embryo's keer met 10 mL 1 X PBTT: kruising oplossing (1:1). Spoel tweemaal met 5 mL van de oplossing van de kruising. Aliquot ~ 20 µL per putje van geregeld embryo's (30-40 embryo's) of vaste weefsels in een 96-Wells PCR plaat op ijs. Hybridisatie oplossing verwijderen uit weefsels of embryo's met behulp van een 8-kanaals spruitstuk precisiepipet ( Figuur 1 / video).
Opmerking: De spruitstuk pipet heeft een ‘ stoppen ’ die voorkomt dat de tips gaan naar de onderkant van de putten en verwijderen van monster. Voor experimenten met behulp van weefsels die zweven, verwijderen vloeistof zorgvuldig met een pipet 100 µL van bovenaf.
- Voeg 100 µL van de gedenatureerde hybridisatie oplossing aan elk putje. Vooraf het vermengen van embryo's voor een minimum van 2,5-3 h bij 56 ° C met behulp van een droge bad Verwarming eenheid bevattende metalen bolletjes (Zie materialen en Figuur 1).
- Denatureren 100 µL van de voorbereide sonde in een 96-Wells PCR plaat met behulp van een thermocycler voor 5 min op 80 ° C. onmiddellijk koel op ijs gedurende 5 minuten. Pre kruising oplossing verwijderen van embryo's of weefsels. Gedenatureerde gen-specifieke sondes aan elk monster, dek af met tape afdichten en kruisen op 56 ° C gedurende 16-18 h, O/N, onder metalen kralen in droge bad Verwarming apparaat toevoegen
5. Sonde detectie
- vooraf de oplossingen in tabel 9 in de eenheid van de verwarming 56 ° C warm. Sondes uit de plaat verwijderen.
Opmerking: Sondes opnieuw kunnen worden gebruikt tussen 2 - 3 keer als opgeslagen bij-80 ° C (nooit winkel een RNA samples in-20 ° C). Na de kruising, de dubbele gestrande RNA is stabieler dan enkele streng RNA, en is minder gevoelig voor aantasting veroorzaakt door RNase besmetting.
Als met behulp van een een multi goed vacuüm filtratie-plaatsysteem voor weefsels, een collectie plaat onder de plaat van de filter voor het verzamelen van de sondes (zie video voor details van de vergadering) moet worden opgenomen. Gehybridiseerde weefsels zal moeten worden overgedragen van de regelmatige 96-wells microtiterplaat plaat gebruikt voor hybridisatie aan één met 1,2 µm porie grootte PVDF membranen op de bodem van elk putje.
| stap | vooraf opgewarmd oplossing (56 ° C) | tijd | Volume per putje |
| 1 | Kruising oplossing: PBTT (3:1) | 15 min | 100 µl |
| 2 | Hybridisatie oplossing: PBTT (3:1) | 15 min | 100 µl |
| 3 | Hybridisatie oplossing: PBTT (1:1) | 15 min | 100 µl |
| 4 | Hybridisatie oplossing: PBTT (1:3) | 15 min | 100 µl | 5 | PBTT 3 wast | 5 min | 100 µl |
tabel 9: het wassen van sondes na hybridisatie.
- als normale platen, wassen monsters per tabel 9 in een verwarming unit van 56 ° C. als met behulp van het spruitstuk vacuümsysteem, gebruiken verwarmde oplossingen met vacuümsysteem op Bank en oplossingen onmiddellijk uit hieronder door vaccuum verwijderen. Na de 3e wash met 1 X PBTT, de normale plaat kan worden verwijderd uit de verwarming apparaat
- Voorbereiden antilichamen.
- Bereiden 11 mL primair antilichaam-oplossing (2,5 µg/mL) uit voorraad (1 mg/mL) door verder verdunnen van biotine-geconjugeerde muis monoklonaal anti-DIG antilichaam (Zie materiële lijst) in PBTTB (1:400). Als de verwerking minder monsters, dienovereenkomstig aan te passen volumes.
- Bereiden 11 mL streptavidine-HRP-oplossing (1 µg/mL) uit voorraad (1 mg/mL) door verder verdunnen van 1:1000 daar-HRP conjugaat (Zie materiële lijst) in PBTTB. Als u minder monsters, dienovereenkomstig aan te passen volumes.
- Blokkeren van embryo's of weefsels met PBTTB (1% magere melk in 1 X PBTT) gedurende 20 minuten op een bankje top mixer op RT.
Opmerking: Filter PBTTB met filtreerpapier (grade 3, 6 µm) alvorens het te gebruiken op filter van de 96-wells-platen om verstopping van de filters. In plaats van PBTB, PBTTB (PBTB met extra 0,3% Triton-X-100) wordt gebruikt voor alle weefsels tijdens het protocol. - Incubate embryo's of weefsels in antilichaam oplossing (100 µL per putje) voor 2 h op Bank-top monster mixer. Spoel tweemaal met 1 x PBTTB. Wassen van 3 X 5 minuten en 5 X voor 10 min met PBTTB. Incubeer embryo's of weefsels met daar-HRP-oplossing (100 µL per putje) voor 1,5 h met gebruikmaking van een bank-top monster mixer. Wassen 2 X voor 5 min met PBTTB. Monsters in het donker te houden vanaf dit punt op.
Opmerking: tijdens alle antilichaam wast, als weefsel verloren als gevolg van de dekking die geproduceerd door de melk gaat is, probeer wassen zonder de melk (PBTT in plaats van PBTTB). - Bereid een DAPI oplossing door verdunnen 100 X DAPI in PBTTB (1:100).
- Incubate embryo's of weefsels met DAPI oplossing (100 µL per putje) gedurende 15 minuten op een bank-top monster mixer. Wassen van 4 X voor 10 min met PBTT. Opslaan van de 96-wells-plaat met steekproeven O/N bij 4 ° C of ga naar de volgende stap.
Opmerking: De procedure kan hier worden gepauzeerd.
6. Opsporing van antilichamen met behulp van tyramide (Zie Figuur 5)
Opmerking: hier zelfgemaakte cyanine 3-geconjugeerde tyramide werd gebruikt, die is opgesteld volgens het protocol beschreven 12 . Als vele experimenten uitvoeren of het testen van vele monsters, dit een aanzienlijke hoeveelheid geld bespaart en effectief met commerciële reagentia (uit ervaring vergeleken is). Voor minder experimenten en voorbeelden, commercieel verkrijgbare cyanine 3-tyramide kan worden gebruikt (Zie materiaal).
- Wash monster platen 3 X voor 5 min met 1 X PBTT.
- Voorbereiden tyramide activering buffer (activering buffer) met 0.006% van H 2 O 2 in PBTT (verdund 30% (w/w) H 2 O 2 voorraad 1:5000). < lIk > spoel de platen met de activering buffer.
- Voorbereiden cyanine 3-tyramide oplossing door verdunning van het in activering buffer in een tube van 15 mL.
- Voor embryo's, gebruiken 1:80 verdunning (137 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Gebruik voor larvale weefsels, 1:150 verdunning (73 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Voor volwassen testes, gebruikt u 1:200 verdunning (55 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Voor volwassen eierstokken, gebruiken 1:300 verdunning (36 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer).
- Broeden van monsters met cyanine 3-tyramide oplossing voor 2 h op Bank-top monster mixer. Viermaal spoelen met PBTT. Wassen van 6 X voor 10 min met PBTT. Wassen 3 X voor 5 min met PBS te verwijderen van het wasmiddel.
- Toevoegen 150 µL per putje van anti-fade montage media. Houd de monsters O/N bij 4 ° C om weefsels of embryo's te zinken naar de bodem van de buis. Monsters op Microscoop dia's (onder de ontrafeling van ruimte voor weefsels) monteren en dek af met een dekglaasje aan. Zegel van de randen van het dekglaasje aan met doorzichtige nagellak.
- Beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop.
Opmerking: analyseren negatieve controle eerst krijgt u een indruk van ‘ niet-specifieke ’ achtergrond.
Representative Results
Figuur 6 ziet u voorbeelden van de resultaten verkregen met behulp van deze procedure. De top 3 panelen tonen voorbeelden van vroege Drosophila embryo's (Figuur 6, panelen A-C), de volgende 3 panelen voorbeelden van late Drosophila embryo's met signalen in verschillende weefsels (amnioserosa, spieren en centrale zenuwstelsel, respectievelijk (Figuur 6, panelen D-F). Volgende zijn voorbeelden van 3de instar larvale weefsels (Figuur 6, panelen G-J). Panelen K en L Toon representatieve beelden uit volwassen gonaden (eierstokken en testis, respectievelijk). Honderden foto's zijn geüpload en geannoteerde in onze doorzoekbaar 'fluorescent in situ fruitvlieg database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Figuur 1. Overzicht van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocol en sleutel apparatuur. (A) PCR versterking van cDNA. (B) In vitro transcriptie voor het genereren van gen-specifieke antisense DIG - label RNA sondes in een 96-wells-plaat (foto van de plaat weergegeven in b). (C) en (D): volwassenen (vrouwelijke: mannelijke verhouding 2:1. 300-400 vliegen/fles) vliegen zijn toegestaan om te paren voor 3-4 dagen. Embryo's uit een overnachting collectie op standaard maïsmeel voedsel bij 25 ° C worden overgebracht naar een goed geventileerde plastic doos (1 L voor Maïsmeel food in een container formaat: 8 "X 8" X 3" LWH) of om nieuwe flessen houden van een goede larvale dichtheid. Voor weefsel collectie, moet actieve gist poeder worden bestrooid op de top van het voedsel op 24, 48 h na ei leggen (AEL). (E tot H): Fluorescent in situ hybridisatie experimenten uitgevoerd meer dan 3 opeenvolgende dagen. Voor embryo's of weefsels die doen niet zweven, door een 96-Wells PCR plaat te gebruiken zoals in de foto b met 8-kanaals aspirator (foto c). Voor weefsels die, zoals de meeste larvale weefsels zweven, gebruik van een filter-bodem plaat (foto in d) en vloeistof afzuigen van bodem met een spruitstuk aspirator met behulp van lage druk (foto in e). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Bepaling van RNA sonde opbrengst. Nieuw gesynthetiseerd antisense RNA sondes waargenomen op een 1% agarose gel (5 µL/lane). De opbrengst kan worden gecategoriseerd (gebaseerd op de intensiteit van de band) als "laag rendement' in stegen 3 en 10, 'typische opbrengst' in rijstroken 1, 4, 5, 6 en 8 of 'high yield' in rijstroken 2, 7, 9, 11 en 12. Voor monsters met een 'typische opbrengst', gebruik 10-15 µL van sonde verdund in 100 µL van hybridisatie oplossing voor elk experiment in situ . Verdun monsters met 'hoge opbrengsten' van sonde met extra hybridisatie oplossing volgens de intensiteit van de band ten opzichte van een 'typische sonde' intensiteit. Willen hebben min of meer gelijk definitieve sonde concentraties in elk putje. De pijl wijst naar één van de sondes van RNA, de hogere band op elke baan is de oorspronkelijke DNA-sjabloon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Belangrijke stappen voor een grootschalige embryo's worden verzameld en fixatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Zelfgemaakte buis voor het verwijderen van de vloeistof uit de larvale of zwevende weefsels. Sommige larven en de volwassen weefsels zweven in oplossing tijdens fixatie. Deze eenvoudige tool bestaat uit een nylon gaas gehouden door een 200 µL wenk, gevolgd door een 1 mL tip als een adapter om verbinding met een aspirator te knippen. Vloeistof kan veilig worden verwijderd zonder het verliezen van een weefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Tyramide signaal amplificatie. (1) antisense RNA-sonde DIG-label hybridizes met endogene gevoel RNA. (2) Immuno-affiniteit binding tussen Biotine-geconjugeerde primair antilichaam en DIG-UTP. (3) HRP geconjugeerd streptavidine bindt biotine. (4) HRP katalyseert de cyanine 3-tyramide en waterstofperoxide reactie tot kortstondige cyanine 3-tyramide radicalen. (5) cyanine 3-tyramide radicalen binden aan tyrosine residuen op nabijgelegen eiwitten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Vertegenwoordiger in situ hybridisatie beelden. Elk deelvenster ziet u een voorbeeld van een verschillende RNA (getoond in cyaan) en kernen gekleurd met DAPI (afgebeeld in het rood). (A-C) Voorbeelden van vroege Drosophila embryo's. (D, F) Voorbeelden van late Drosophila embryo's. (G-J) Voorbeelden van 3e instar Drosophila larvale weefsels (malphigian tubuli, middendarm, speekselklier en spier respectievelijk). (K) volwassen eierstok. (L) volwassen testis. Elk paneel bevat de naam van het gen dat de sonde is kwekers aan. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het beschreven protocol biedt een zeer reproduceerbaar, gevoelige en economische methode voor de detectie van de meeste RNAs in vaste Drosophila embryo's of weefsels. Hoewel iets ingewikkelder dan de meer traditioneel alkalische fosfatase methode voor de detectie van de sonde gebruikt, de resolutie verkregen door vis is veel groter en de gevoeligheid is vergelijkbare of betere 7,8. Met behulp van gehele of gedeeltelijke microtiterplaat platen, kunnen de protocollen worden gebruikt voor grootschalige of beperkte analyses van genen van belang. Opgemerkt moet worden dat de sondes gegenereerd kunnen alle gedetecteerd of meerdere transcript splice vormt tenzij sondes zijn meer specifiek ontworpen (dat wil zeggen, één exons). Hoewel we hebben getest sondes zo klein als 200 nucleotiden met redelijk succes, kleinere sondes zijn meestal minder effectief en kunnen wel minder specifiek zijn. Duidelijk, is dit protocol is niet geschikt voor het opsporen van kleine introns, exons, of microRNAs verwerkt.
Hoewel deze aanpak een enzymatische stap gebruikt voor het stimuleren van de sterkte van de signalen, lijkt signaalsterkte te zijn in verhouding tot doel genexpressie in een relatief lineaire en brede waaier van expressie niveaus. Op hogere vergroting, het signaal wordt gezien als puncta of spikkels binnen cellen en weefsels. Alleen een paar kleine puncta zijn relatief zeldzaam afschriften beschouwd. Zoals transcript overvloed toeneemt, groeien deze in aantal en de grootte. Zoals met enkel molecuul vis (smFISH), enkele kleine puncta mogelijk ook overeen met één RNAs en moet ook worden gemakkelijk gekwantificeerd aan de hand beeldvorming en informatica software. Vergelijkingen van gepubliceerde beelden verkregen met behulp van smFISH met beelden die we hebben samengesteld voor dezelfde doelstellingen suggereren dat de overall, de gevoeligheid en de resolutie van de twee methoden relatief vergelijkbaar, zijn maar dit moet worden getest door strengere vergelijkingen. Gezien de veel hogere kosten van smFISH, moet de methode die hier geven vergelijkbare resultaten tegen een fractie van de kosten. Maar als het doel is om het detecteren van kleine afschriften of afzonderlijke delen van afschriften, wordt smFISH aangeraden.
Vanwege de kleinere omvang van sommige vis sondes, kan deze methode ook worden beter op indringende weefsels die zijn grote of belangrijke belemmeringen. Echter, het gebruik van hogere niveaus van wasmiddel en weefsel fixatie en permeabilization tweaks lijken te hebben dit probleem opgelost. Tot slot, hoewel ontwikkeld voor Drosophila weefsels, de hoge wasmiddel buffers hier beschreven voor ontleed weefsels zou ook moeten werken voor Drosophila embryo's, evenals de meeste andere organismen en weefsels.
Disclosures
Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door een subsidie aan HMK door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen MOP 133473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
