Summary
Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.
Abstract
Nei nostri sforzi per determinare i modelli di espressione e localizzazione subcellulare di Drosophila RNAs su una base del genoma e in una varietà di tessuti, abbiamo sviluppato numerose modifiche e miglioramenti al nostro originale fluorescente in situ protocollo di ibridazione (pesce). Per facilitare la velocità effettiva e convenienza, tutte le fasi, dalla generazione di sonda per il rilevamento del segnale, vengono eseguite utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti esone. Digoxygenin (DIG)-etichettati antisenso RNA sonde sono prodotte utilizzando DNA genomico o cDNA cloni come modelli. Dopo il fissaggio del tessuto e permeabilizzazione, sonde sono ibridate al trascrizioni di interesse e quindi rilevato utilizzando una successione di anticorpo anti-DIG coniugato con biotina, streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e coniugato fluorescente tyramide, che in presenza di HRP, produce un intermedio altamente reattivo che si lega alle regioni densi dell'elettrone di proteine immediatamente adiacente. Questi passaggi di amplificazione e localizzazione producono un segnale robusto e altamente localizzato che facilita la localizzazione sia trascrizione cellulare e subcellulare. I protocolli forniti sono stati ottimizzati per produrre segnali altamente specifici in una varietà di tessuti e stadi di sviluppo. Inoltre vengono forniti riferimenti per variazioni aggiuntive che consentono la rilevazione simultanea di più trascrizioni, o trascrizioni e proteine, allo stesso tempo.
Introduction
Nuovi metodi di rilevamento RNA genoma come RNA-seq hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di dove e quando i geni sono espressi, e a quali livelli di1. Tuttavia, questi forniscono relativamente scarsa risoluzione spaziale e temporale. Ibridazione in situ RNA permette la distribuzione spaziale delle trascrizioni da osservare visivamente in tessuti fissi, rivelando così i dettagli di localizzazione cellulare e subcellulare2. Usando l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette maggiore risoluzione spaziale come consente l'utilizzo di tecniche di microscopia potente, come di microscopia confocale e leggero foglio3. Marcatori fluorescenti come DAPI è utilizzabile anche per stabilire relazioni sottocellulare4. PESCE, inoltre, facilita l'osservazione di più di RNA e proteine contemporaneamente con chiare indicazioni di sovrapposizione a livello subcellulare. Reagenti unici e passaggi necessari per doppia marcatura possono essere trovati nei seguenti riferimenti3,5.
Le procedure descritte qui utilizzano 96 piatti di microtitolo per tutti i passaggi, tra cui produzione di modello di cDNA (PCR della Colonia), produzione di sonda RNA (mediante trascrizione della polimerasi dipendente dal dilavamento T7, T3 o SP6), ibridazione in situ , e sviluppo del segnale fluorescente. Un numero sufficiente di embrioni o tessuti vengono aggiunti a ogni bene della piastra 96 pozzetti per consentire la valutazione della coerenza e della variabilità. Bene, allora ognuno riceve una sonda diversa. Dopo lo sviluppo di segnale, embrioni o tessuti da ogni pozzetto sono schierati su vetrini da microscopio individuali per l'analisi al microscopio.
L'uso di amplificazione del segnale di microarray (TSA) per sonda rilevazione produce segnali robusti con una risoluzione eccezionale subcellulare 5,6,7,8. La localizzazione subcellulare di RNA è un importante meccanismo di regolazione 9 che sembra accadere con praticamente tutti gli RNA 4,10,11. Queste analisi hanno inoltre dimostrato che molte trascrizioni che non vengono rilevate da RNA-seq vengono prontamente rilevate da pesce 8. L'adattamento di RNA in situ ibridazione per piastre da 96 pozzetti permette l'analisi di fino a 96 geni di interesse in un momento (più se ulteriori piastre vengono utilizzati), rendere possibile l'analisi di DataSet di grandi dimensioni. Tagliando le piastre in sezioni più piccole, il metodo è anche facilmente adattato a pochi campioni. Il protocollo fornito è appropriato per l'analisi delle distribuzioni di RNA nella maggior parte dei tipi di tessuti. Anche se non indicato, è adattabile ai non - tessutidella drosofila pure.
Protocol
1. amplificazione di PCR del cDNA modelli da plasmidi
Nota: utilizzare il plasmide di alta qualità o modelli di DNA PCR-generato per RNA sintesi della sonda. Le librerie di Gene collezione (DGC) Drosophila generate dal Berkeley Drosophila genome project fornisce una copertura della maggior parte dei geni codificanti trovato nel genoma di Drosophila (Vedi tabella 1a). Inoltre, consentono l'utilizzo di universal primer per l'amplificazione del cDNA insert. Il plasmide DNAs presenti nei lisati di plasmide contenente le colture batteriche vengono eseguite queste amplificazioni di PCR. I prodotti del DNA vengono quindi utilizzati come modelli per la trascrizione in vitro per generare le sonde del RNA antisense (Vedi tabella 1b).
- Disegnare primers per amplificare una regione specifica dell'esone di un gene di interesse mediante PCR (ad es. da DNA genomic), preferibilmente con il sito di riconoscimento della polimerasi di T7 in fine antisenso.
- Per esperimenti con meno di 96 campioni, tagliare parti inutili di piastre da 96 pozzetti. Coprire le piastre con guarnizione a nastro (Vedi materiali) per tutte le incubazioni e deposito. Se vengono utilizzati per microcentrifuga, regolare i volumi conseguenza.
Nota: piastre da 96 pozzetti consentono l'uso di pipette multicanale per aumentare la velocità effettiva, come pure i volumi più piccoli per il risparmio di costo.
| tabella 1a | ||||
Vector | Antibiotico lavorando concentrazione 1: 1000 |
Primer | RNA polimerasi per antisenso | RNA polimerasi. per senso |
| CLLP-io | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | ,T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Chlor | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tabella 1b | ||||
| Primer | sequenza | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) Inverti | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
tabella 1: A) informazioni clone DGC generale per l'amplificazione del cDNA inserisce in plasmidi. B) sequenze dei primer universale per plasmidi DGC.
- crescere 250 µ l di plasmide contenente coltura batterica in piastre a 96 pozzetti cultura aggiungendo 240 µ l di LB media per pozzetto con selezione antibiotica adeguata (diluizione 1: 1000 di uno stock di 1000 X antibiotico) e 10 µ l di originale plasmide contenente batteri (da uno stock di glicerolo). Guarnizione con nastro sigillante.
- Incubare agitando a 215 giri/min a 37 ° C durante la notte (O/N).
Nota: Creare una nuova copia di stock di clone di glicerolo batterica cDNA plasmide da sostituire all'originale. Non ricongelare originale azione batterica, come questo può uccidere i batteri. - Per produrre i modelli di PCR, diluire 10 µ l della coltura batterica O/N in 90 µ l in autoclave ddH 2 O in ciascun pozzetto di una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Denaturare il DNA per 5 min a 95 ° C nel termociclatore. Posizionare immediatamente la piastra sul ghiaccio per almeno 5 min
- Reazioni di PCR preparare utilizzando appositi primer universale secondo la tabella 2.
| reagenti | reazione di 50 μl del campione | 96 ben mescolare (112 x reazione) | concentrazione finale |
| 2 X PCR polimerasi Mix | 25 μl | μl 2800 | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/μl) | 0,5 μl | 5 6 μl | 0,25 pmol/μl |
| Primer_Rev (25 pmol/μl) | 0,5 μl | μl 56 | pmol/μl 0.25 |
| ddH2O | 22 μl | μl 2464 | < /TR > |
| totale | 48 μl | μl 5376 |
tabella 2: PCR Master Mix.
- utilizzando una pipetta, aliquotare 48 µ l della miscela PCR master in ciascun pozzetto di una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 2 µ l di ogni modello di DNA del plasmide denaturato per pozzetto.
Nota: Uso tra 1 picogrammo (pg) a 1 nanogrammo (ng) di DNA plasmidico. Modello di DNA eccessivo riduce resa PCR e specificità. - Programmare la macchina PCR 96 pozzetti secondo tabella 3 ed effettuare l'amplificazione.
Nota: Il tempo di estensione a 72° C è determinato dalla dimensione del prodotto della PCR (45 s per ≤ 2,0 kb, 1,5 min per ≤ 3,0 kb, 3 min per ≤ 4,0 kb e 3,5 min per 4.0-5.0 kb). La temperatura di annealing (Tm) è determinata dalla sequenza degli iniettori. Quando un primer è uguale o più lungo di 20 nt, la Tm è calcolato come:
Tm (° C) = (4 X numero di CG) + (2 X numero di AT) -4.
| passo | temperatura | tempo | dei cicli |
| Denaturazione iniziale | 95 ° C | 3 min | 1 ciclo |
| amplificazione denaturazione, ricottura ed estensione | 95 ° C | 45 sec | < riga td span = "3" > 30 cicli|
| 54-58 ° C | 45 sec | ||
| 72 ° C | 45 sec-3,5 min | ||
| Estensione finale | 72 ° C | 7 min | 1 ciclo |
| Deposito | 4 ° C | tenere |
tabella 3: consigliato programma PCR.
- PCR prodotto precipitazione con etanolo (EtOH) e sodio acetato (NaOAC) (cfr. tabella 4).
Nota: Se il volume di reazione di PCR è inferiore a 50 µ l, riempire a 50 µ l con ddH 2 O.- a far precipitare il DNA, mescolare i componenti da tabella 4 e archivio di campioni O/N a-20 ° C o a-80 °C.Centrifuge per 30 minuti la piastra a 96 pozzetti per 45-60 min a 2.250 x g a 4 ° c. uso un 8-canale collettore pipetta ccaute e rimuovere il surnatante. Lavare una volta con 160 µ l di freddo 70% EtOH (RNAsi-libera) per 30 min a 2.250 x g a 4 ° C.
Nota: Il DNA precipitato può essere visto nella parte inferiore dei pozzi. Prodotti di PCR più brevi richiedono più tempo centrifugazioni. - Capovolgere delicatamente la piastra a 96 pozzetti su carta assorbente per rimuovere le ultime gocce di liquido in ogni pozzetto (per quanto possibile). Pellet di DNA per 1 h a temperatura ambiente (TA) asciugare all'aria. Risospendere il precipitato DNA in acqua libera RNAsi di 25 µ l.
Nota: L'aria di 1h asciutto permetterà tutte le tracce di EtOH ad evaporare. Tuttavia, dovrebbe rimanere un piccolo volume di liquido (circa 1 µ l) in ciascun pozzetto per evitare che il pellet di DNA completamente secchi. Utilizzare 25 µ l per una reazione di PCR di 50 µ l. Non utilizzare acqua trattata DEPC in questa fase per evitare interferenze con trascrizione in vitro nei passaggi seguenti.
- a far precipitare il DNA, mescolare i componenti da tabella 4 e archivio di campioni O/N a-20 ° C o a-80 °C.Centrifuge per 30 minuti la piastra a 96 pozzetti per 45-60 min a 2.250 x g a 4 ° c. uso un 8-canale collettore pipetta ccaute e rimuovere il surnatante. Lavare una volta con 160 µ l di freddo 70% EtOH (RNAsi-libera) per 30 min a 2.250 x g a 4 ° C.
| componente | Volume | parte |
| PCR | 50 µ l | |
| 100% etanolo | 125 μl | 2,5 X Vol. di PCR |
| 3 M NaOAc (pH = 5.2, RNAsi liberamente) | 5 μl | 10% vol di PCR |
| totale | 180 μl |
tabella 4: esempio di una reazione di PCR di 50 µ l.
- controllare la dimensione e la resa dei prodotti di PCR eseguendo 5 µ l di sedimento soluzione di DNA su gel di agarosio 1% in 1x tampone TAE.
Nota: Un totale di 250-500 ng della mascherina del DNA è necessario per la reazione di trascrizione in vitro 15 µ l. Campioni con rendimenti più alti possono essere ulteriormente diluiti. Il rendimento di RNA dipende anche la sequenza e la lunghezza del modello del DNA. Secondo la guida generale per l'etichettatura di DIG-RNA con T7 RNA polimerasi, circa 10 µ g di RNA scavare-contrassegnato è prodotto da 1 µ g modello linearizzato.
2. Trascrizione in vitro per generare sonde antisenso.
Nota: è fondamentale per lavorare in un ambiente privo di RNAsi. Tutti i reagenti e laboratorio-ware deve essere RNAsi liberamente (come ad esempio certificati articoli plastica liberi di DNasi/RNasi).
| componente | concentrazione Stock | Volume | Concentrazione finale |
| ATP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| GTP | 100mm | 7 & n. 956; l | 10mm |
| UTP | mM 100 | μl 4,5 | 6,5 mM |
| Dig-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3,5 mM |
| acqua gratuita RNasi | < /td > | μl 19,5 | |
| totale | 70 μl |
tabella 5: preparazione di Mix di DIG-NTP.
< tabella border = "1" fo:keep-together.within-pagina = "1" fo:keep-con-next.within-pagina = "sempre" >(112 x reazione)
tabella 6:2 X trascrizione Master Mix.
- Preparare il DIG-NTP mix secondo la tabella 5.
Nota: Per evitare errori, sempre allineare la piastra tale che A1 è l'angolo superiore sinistro della piastra. - Aggiungi componenti descritti nella tabella 6 per ciascun pozzetto in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti (sonda piastra). Aggiungere 7,5 µ l di prodotto di PCR (modello DNA) a ogni corrispondente bene, usando una pipetta multicanale. Coprire la piastra con il nastro di sigillamento.
Nota: La quantità ottimale di prodotto di PCR aggiunto per reazione di trascrizione deve essere compresa tra 0,5 e 1 µ g. Se le bande sul gel sono significativamente più debole o più intenso, il volume di DNA aggiunto alla reazione può essere regolato di conseguenza. L'importo esatto non è critico. - Incubare la piastra di sonda a 37 ° C per 3,5-4 h. Mix 15 µ l di sonda sintetizzato con 35 µ l di DEPC trattata ddH 2 O, 125 µ l di 100% EtOH e 5 µ l di 3 M NaOAC (pH = 5.2, RNAsi libera). Conservare a-80 ° C per almeno 30 min centrifuga e lavare come descritto nei passaggi 1.10.2 e 1.10.3.
- Risospendere la sonda precipitata in 25 µ l di DEPC trattata ddH 2 O. eseguire 5 µ l su gel di agarosio 1% (tempo di esecuzione < 20 min) per verificare l'integrità e la resa della sonda ( Figura 2).
Nota: Il gel di agarosio deve essere fatta con DEPC trattata ddH 2 O e tampone TAE. Apparecchi di elettroforesi del gel devono essere assegnato per RNA lavorare solo. Gel di più lunga durata a bassa velocità può portare a degradazione del RNA durante l'elettroforesi. - Mescolare il rimanente 20 µ l di sonda sintetizzata con 100 µ l di soluzione di ibridazione (tabella 7) e conservare a-80 ° C fino a quando necessario.
Nota: La concentrazione di sonda può essere diluita più se le bande sono particolarmente robusto (Vedi Figura 2 per esempi). Soluzione di ibridazione è molto efficace nel prevenire la contaminazione RNasi. Immediatamente aggiungere soluzione di ibridazione per la sonda di sedimento per evitare la degradazione del RNA. Soluzione di ibridazione deve essere filtrato attraverso un filtro da 0,2 µm. Per campioni di tessuto, aumentare la concentrazione di detergente nella soluzione di ibridazione aggiungendo Triton-X-100 ad una concentrazione finale di 0.3%.
| componente | Volume | concentrazione finale |
| DEPC trattata ddH2O | 11,85 ml | 23,7% |
| 20 X SSC | 12,5 ml | 25% (5 X) |
| Formammide | 25 ml | 50% |
| Eparina (50 mg/ml) | 0,1 ml | 0. 2% (0,1 mg/ml) |
| Sperma di salmone singolo DNA incagliato | 0,5 ml | 1,0% |
| Tween-20 | 0,05 ml | 0,1% |
| Totale | 50,00 ml | 100% |
3. collezione di tessuto di allevamento ed embrione, larva e adulto drosophila.
Nota: per sia su piccola scala (bottiglie) e massa (scatole) volare allevamento, utilizzare protocolli di laboratorio standard volare sul cibo a base di farina di mais a 25 ° C. Keep corretta adulto e larvale densità e forniscono ulteriori attivo lievito in polvere sul cibo superfici.
- Raccolta embrioni seguendo protocolli standard. I passaggi principali di raccolta di embrioni sono illustrati nella Figura 3.
Nota: Dopo il risciacquo devitillinized embrioni in metanolo, gli embrioni fissi possono essere conservati a-20 ° C fino ad un anno. Permeabilizzazione di embrione e la post-fissazione vengono eseguiti il giorno 1 del protocollo pesce. - Soluzione stock di preparare fresca 40% PFA.
- Preparare una preparata soluzione stock di 40% paraformaldeide (PFA) mescolando 10 mL di DEPC trattata ddH 2 O a 3,68 g di PFA e 70 µ l di KOH 2N in un flaconcino di scintillazione di vetro da 20 mL contenente un piccolo stir bar
Attenzione: PFA è altamente tossico con potenziali effetti sulla salute acuti e cronici. MSDS (Material Safety Data Sheets) di leggere e utilizzare con un'adeguata protezione per gli occhi, pelle e delle vie respiratorie. - In una cappa, riscaldare e mescolare il flaconcino per 3-5 min su una piastra riscaldante a 200 ° C finchè la PFA sia completamente dissolto. Rimuovere la soluzione di riserva di PFA dal fuoco non appena il PFA è dissolto (non surriscaldare).
- Raffreddare la soluzione stock di disciolto 40% PFA in ghiaccio per 5 minuti e filtrare con una siringa di filtro e 10 mL di 0,2 µm.
- Preparare una preparata soluzione stock di 40% paraformaldeide (PFA) mescolando 10 mL di DEPC trattata ddH 2 O a 3,68 g di PFA e 70 µ l di KOH 2N in un flaconcino di scintillazione di vetro da 20 mL contenente un piccolo stir bar
- Terzo instar larve (L3) o fissazione del tessuto adulto, tempra e permeabilizzazione
Nota: questo protocollo dovrebbe essere finito in un giorno. Esso comprende tessuto dissezione, fissazione, tempra di endogeno HRP, permeabilizzazione e post-fissazione.- Preparare soluzioni di fissaggio (Difficoltà-I e Fix-II) secondo la tabella 8.
Nota: l'acido picrico viene utilizzato come un fissativo aggiuntivo quando il tessuto ha una struttura delicata che deve essere preservata. Non si tratta di un buon fissativo quando ultrastruttura del tessuto deve essere conservato per la microscopia elettronica (EM).
Attenzione: l'acido picrico è instabile e ha la capacità di reagire con altri materiali e creare composti esplosivi. Utilizzare e conservare secondo linee guida sicurezza.
Larve di - posto o mosche adulte in un tubo di plastica di 50 mL contenente 10 mL di freddo 1X PBS e 100 µ l di correzione-ho soluzione. Chill sul ghiaccio per 2 min per ridurre la motilità volare larvale o adulta.
- Taglio largo della punta di una punta in plastica da 1 mL per creare un'apertura di 2-3 mm. Trasferire 10-30 larve o adulto Vola con la punta di 1 mL in una capsula Petri (diametro 9 cm) con uno strato superficiale di 1X PBS dal tubo 50 mL (punto 3.3.2). Aggiunta di un po' di Crediutuel può diminuire la tensione superficiale. Accuratamente sezionare larvale (aperto da anteriore e spremere i tessuti da posteriore ad anteriore) o tessuti dell'adulto di interesse con un paio di pinze taglienti in un ambito dissezione.
Nota: Circa 200-300 larve o adulti testicoli possono essere sezionati e corretti in un giorno da persone con esperienza. - Trasferimento dissecato tessuti con una pipetta di 200 µ l (con la punta tagliata per creare un diametro di 2 mm di apertura) in una provetta da 1,5 mL e conservare il ghiaccio. Completare ogni turno della dissezione entro 10-15 min prima di passare al passaggio successivo.
Nota: Continuare con turni aggiuntivi (all'interno di una finestra di tempo di 2 h) come richiesto per generare sufficiente materiale. - Fix tessuti con 800 µ l di correzione-ho soluzione per 30 min in un miscelatore top panchina. Tessuti di sciacquare una volta con 800 µ l 1 X Crediutuel e mantenere i tubi sul ghiaccio per un massimo di 2,5 h. dovuto il 30 min limitare, questo deve essere eseguita per singoli batch fino a quando è stato raccolto sufficiente tessuto.
- Piscina tutti i tessuti dissecati e fissi in una provetta di plastica singolo 15 mL contenente maglia nel coperchio (Vedi Figura 4 per design con tubo). Aspirare il liquido in eccesso attraverso la maglia nel coperchio del tubo. Lavare 3 X 5 minuti ciascuno con 10 mL di 1 X Crediutuel. Sciacquare due volte con 10 mL di 1X PBS per rimuovere il detergente. Questo previene le bolle in eccesso nel passaggio successivo.
Nota: Se tessuti dissecati affondano sul fondo del tubo, procedura può essere eseguita in piastre microtiter regolari o 0.5-1.5 microcentrifuga mL (300-800 µ l per provetta). - Quench attività endogena di HRP con 5 mL di 0,3% H 2 O 2 in PBS per 15 min a RT. ripetere ancora una volta. Tenere il coperchio aperto durante questo passaggio senza mescolare. Sciacquare due volte con 10 mL di 1 X Crediutuel. Lavare due volte per 5 min con 10 mL di 1 X Crediutuel.
- Permeabilize tessuti con 10 mL di acetone 80% (-20 ° C, pre-raffreddato) a-20 ° C per 10 min. Inverti il tubo due volte durante il periodo di incubazione. Lavare due volte per 10 min con 10 mL di 1 X Crediutuel per reidratare i tessuti.
- Risciacquo con 10 mL di miscela di ibridazione Crediutuel plus 5ml 5ml soluzione (1:1). mix di scartare e sostituire con 10 ml di soluzione di ibridazione. I campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a quando necessario. Per risultati ottimali, non conservare campioni per più di una settimana.
- Preparare soluzioni di fissaggio (Difficoltà-I e Fix-II) secondo la tabella 8.
| componente | Difficoltà I (10 ml) | Difficoltà II (10 ml) |
| 40% delle scorte PFA | 1 ml | 1 ml |
| Crediutuel | 8,99 ml | 9 ml |
| soluzione di acido picrico | μl 10 | – |
4. ibridazione in situ
Nota: questa parte del protocollo richiede un minimo di 2 giorni, con preparazione del campione, pre-ibridazione e ibridazione prendendo luogo il giorno 1 e sonda di rilevamento su 2 ° giorno. Se il numero di campioni è relativamente alto, se non hanno familiarità con il protocollo, o una giornata intera non è possibile, il protocollo dovrebbe essere effettuato in 3 giorni con i passi di amplificazione di rilevamento e segnale di sonda diviso in 2 giorni. Gran numero di embrioni o campioni di tessuto dissecato può anche richiedere ulteriori giorni per elaborare. Per campioni di tessuto dissecato, sostituire 1 X PBT con 1 X Crediutuel in tutte le fasi, se non diversamente indicato. Il detersivo supplementare è necessario per la penetrazione di molti tessuti larvale e adulti, come il cervello e il testicolo. Anche se non testato, 1 X PBTT possono anche essere utilizzati per gli embrioni. Utilizzare 100 µ l per pozzetto per piastre da 96 pozzetti e 800 µ l per provette da 1,5 mL.
- Pre-ibridazione e ibridazione
Nota: passaggi 4.1.1-4.1.6.2 sono per ibridazione in situ degli embrioni. Per tessuto larvale o adulto in situ ibridazioni, ignorare questi passaggi.- Rimuovere 2 mL di embrioni fissi (memorizzati in metanolo a-20 ° C) ad un nuovo tubo da 15 mL. Lavare gli embrioni due volte per 7 min con 10 mL di metanolo in ogni lavaggio. WASH embrioni per 7 min con 10 mL di una miscela di metanolo e 1 X Crediutuel (1:1). Lavare gli embrioni due volte per 7 min con 10 mL di 1 X Crediutuel reidratare.
- Per permeabilizzazione embrione, preparare una soluzione intermedia proteinasi K (40 µ l/mL) diluendo 1: 500 dalla soluzione madre (20 mg/mL). Conservare a -20 ° C. assicurarsi una soluzione di proteinasi K lavoro diluendo la soluzione intermedia proteinasi K 1/15 a 1 X Crediutuel per una concentrazione finale del lavoro di 2.667 ug/mL.
- Permeabilize embrioni con 10 mL di soluzione di proteinasi K (uso di meno per i più piccoli numeri di embrioni) di lavoro. Incubare la provetta al RT per 13 min. Capovolgere delicatamente la provetta 4 volte durante l'incubazione. Incubare i campioni in soluzione di proteinasi K su ghiaccio per 1h senza miscelazione.
Nota: al termine dell'incubazione relativamente lungo con diluito proteinasi K assicura permeabilizzazione riproducibile uniforme e successiva colorazione. - Mentre gli embrioni permeabilize, fare un 2 mg/mL soluzione di glicina da 10 X stock (20 mg/mL) in 1 X Crediutuel per un volume totale di 30 mL. Soluzione
- Rimuovi proteinasi K, sciacquare con 10 mL di soluzione di glicina (2 mg/mL) e lavare due volte per 2 minuti ciascuno. Lavare tre volte con 10 mL di 1 X Crediutuel per rimuovere la glicina.
- Post-fissazione degli embrioni.
- Preparare 10 mL di 4% PFA (1 mL di 40% PFA in 9 mL di Crediutuel, filtrata attraverso 0,45 µm).
- Incubare i campioni nel 4% PFA per lavare 3 X 20 min. per 2 minuti ciascuno, con Crediutuel.
- Per preparare la soluzione di ibridazione denaturato, far bollire la soluzione di ibridazione per 5 min. Per una piastra a 96 pozzetti completo, utilizzare tre tubi da 12 mL. Fresco su ghiaccio immediatamente per 5 min. Gli embrioni
- Sciacquare una volta con 10 mL di 1 X Crediutuel: soluzione di ibridazione (1:1). Sciacquare due volte con 5 mL di soluzione di ibridazione. Aliquotare ~ 20 µ l di liquidazione di embrioni (30-40 embrioni) o tessuti fissi in una piastra PCR a 96 pozzetti sul ghiaccio. Rimuovere la soluzione di ibridazione da tessuti o embrioni usando una pipetta di collettore 8 canali ( Figura 1 / video).
Nota: La pipetta collettore ha un ‘ smettere di ’ che previene le punte da andare al fondo dei pozzi e la rimozione del campione. Per gli esperimenti usando i tessuti che galleggiano, rimuovere il liquido accuratamente con una pipetta 100 µ l dalla cima.
- Aggiungere 100 µ l della soluzione di ibridazione denaturato in ciascun pozzetto. Pre-ibridare embrioni per un minimo di 2,5-3 h a 56 ° C, utilizzando un'unità di riscaldamento bagno secco contenente perle di metallo (Vedi materiali e Figura 1). Sonda
- denaturare 100 µ l del preparato in una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando un termociclatore per 5 min a cool 80 ° C. immediatamente in ghiaccio per 5 min. Rimuovere pre-l'ibridazione soluzione da embrioni o tessuti. Aggiungere denaturati gene-specifiche sonde a ciascun campione, coprono con nastro di sigillamento e ibridano a 56 ° C per 16-18 h O/N, sotto perline di metallo nel bagno secco riscaldamento unità.
5. Sonda rilevamento
- pre-riscaldare le soluzioni nella tabella 9 nell'unità di riscaldamento di 56 ° C. Rimuovere le sonde dalla piastra.
Nota: Sonde possono essere riutilizzati tra 2 - 3 volte se conservati a-80 ° C (mai negozio qualsiasi RNA campioni a-20 ° C). Dopo l'ibridazione, il RNA incagliato doppio è più stabile del RNA a singolo filamento ed è meno suscettibile di degradazione causati dalla contaminazione RNasi.
Se si utilizza un sistema di filtrazione sotto vuoto una piastra multi-pozzetto per tessuti, un piatto di raccolta dovrebbe essere incluso sotto la piastrina filtro per raccogliere le sonde (Vedi video per dettagli di montaggio). Ibridati tessuti dovranno essere trasferite dalla piastra regolare micropiastra a 96 pozzetti utilizzata per l'ibridazione ad uno con 1,2 µm membrane di PVDF di dimensione dei pori sul fondo di ciascun pozzetto.
| passo | pre-riscaldati soluzione (56 ° C) | tempo | Volume per pozzetto |
| 1 | Soluzione di ibridazione: Crediutuel (3:1) | 15 min | 100 μl |
| 2 | Soluzione di ibridazione: Crediutuel (3:1) | 15 min | 100 μl |
| 3 | Soluzione di ibridazione: Crediutuel (1:1) | 15 min | 100 μl |
| 4 | Soluzione di ibridazione: Crediutuel (1:3) | 15 min | 100 μl | 5 | Crediutuel 3 lava | 5min | 100 μl |
tabella 9: sonde di lavaggio dopo l'ibridazione.
- se utilizza normali piastre, campioni di lavaggio come da tabella 9 in un impianto di riscaldamento a 56 ° C. se utilizzando il sistema collettore sottovuoto, utilizzare soluzioni riscaldate con sistema di vuoto sul banco e soluzioni immediatamente da qui sotto per rimuovere vaccuum. Dopo il 3 ° lavaggio con 1 X Crediutuel, la piastra normale può essere rimosso dal riscaldamento unità
- Preparare gli anticorpi.
- Preparare 11 mL di soluzione di anticorpo primario (2,5 µ g/mL) da magazzino (1 mg/mL) diluendo un anticorpo monoclonale anti-DIG mouse coniugato con biotina (Vedi lista dei materiali) in PBTTB (1: 400). Se l'elaborazione meno campioni, regolare i volumi conseguenza.
- Preparare 11 mL di soluzione di streptavidina-HRP (1 µ g/mL) da magazzino (1 mg/mL) diluendo 1: 1000 streptavidina-HRP coniugato (Vedi lista dei materiali) in PBTTB. Se si utilizza meno campioni, regolare i volumi conseguenza.
- Bloccare gli embrioni o tessuti con PBTTB (latte scremato di 1% in 1 X Crediutuel) per 20 minuti su un mixer top panchina a RT.
Nota: Filtro PBTTB utilizzando carta da filtro (grado 3, 6 µm) prima di utilizzarlo su piastre a 96 pozzetti filtro per evitare di bloccare i filtri. Invece di PBTB, PBTTB (PBTB con ulteriori 0,3% Triton X-100) viene utilizzato per tutti i tessuti durante il protocollo. - Incubare embrioni o tessuti in soluzione di anticorpo (100 µ l/pozzetto) per 2 h mixer banco campione. Sciacquare due volte con 1 x PBTTB. Lavare 3 X per 5 min e 5 X per 10 min con PBTTB. Incubare gli embrioni o tessuti con soluzione di streptavidina-HRP (100 µ l/pozzetto) per 1,5 h utilizzando un campione di banco mixer. Lavare 2 X 5 min con PBTTB. Mantenere i campioni al buio da questo punto.
Nota: durante tutti i lavaggi di anticorpi, se il tessuto è essere persi a causa dell'opacità prodotta da latte, prova lavaggio senza il latte (Crediutuel anziché PBTTB). - Preparare una soluzione DAPI per diluire 100 X DAPI in PBTTB (1: 100).
- Incubare embrioni o tessuti con soluzione DAPI (100 µ l/pozzetto) per 15 minuti su un mixer di banco campione. Lavare 4 X per 10 min con Crediutuel. Conservare la piastra a 96 pozzetti con campioni O/N a 4 ° C o procedere al passaggio successivo.
Nota: La procedura può essere messo in pausa qui.
6. Rilevazione dell'anticorpo utilizzando microarray (Vedi Figura 5)
Nota: qui è stata usata in casa cianina 3-coniugato microarray, che è stata predisposta secondo il protocollo descritto in 12 . Se molti esperimenti o test molti campioni, ciò consente di risparmiare una notevole quantità di denaro ed è efficace rispetto ai reagenti commerciali (per esperienza). Per un minor numero di esperimenti ed esempi, può essere utilizzato commercialmente disponibili cianina 3-microarray (Vedi materiali).
- Campione di lavaggio piastre 3 volte per 5 min con 1 X Crediutuel.
- Preparare microarray attivazione buffer (buffer di attivazione) contenente 0.006% di H 2 O 2 in Crediutuel (diluire 30% (w/w) H 2 O 2 stock 1: 5000). < lho > sciacquare le piastre con il buffer di attivazione.
- Soluzione di Prepare cianina 3-microarray di diluirla nel buffer di attivazione in una provetta da 15 mL.
- Per gli embrioni, utilizzare diluizione 1: 80 (137 µ l di cianina 3-microarray in 11 mL di tampone di attivazione). Per i tessuti larvali, utilizzare diluizione di 1: 150 (73 µ l di cianina 3-microarray in 11 mL di tampone di attivazione). Per adulto testes, utilizzare diluizione 1: 200 (55 µ l di cianina 3-microarray in 11 mL di tampone di attivazione). Per adulte ovaie, utilizzare diluizione di 1: 300 (36 µ l di cianina 3-microarray in 11 mL di tampone di attivazione).
- Incubare i campioni con soluzione di cianina 3-microarray per 2 h mixer banco campione. Lavare 4 volte con Crediutuel. Lavare 6 X per 10 min con Crediutuel. Lavare 3 X per 5 minuti con PBS per rimuovere il detersivo. Mezzi di montaggio
- aggiungere 150 µ l/pozzetto di antislittamento. Mantenere i campioni O/N a 4 ° C per consentire tessuti o embrioni ad affondare verso il basso del tubo. Montare i campioni su vetrini da microscopio (sotto ambito per tessuti di dissezione) e coprire con vetrino coprioggetto. Sigillare i bordi del coprivetrino con smalto trasparente.
- Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Nota: analizzare controllo negativo prima di ottenere un'idea di ‘ non specifico ’ sfondo.
Representative Results
Figura 6 Mostra esempi di risultati ottenuti con questa procedura. Il top 3 pannelli mostrano esempi di primi embrioni della drosofila (Figura 6, pannelli A-C), il successivo 3 pannelli mostrano esempi di ritardo embrioni della drosofila con segnali in tessuti differenti (amnioserosa, muscoli e sistema nervoso centrale, rispettivamente (Figura 6, pannelli D-F). Poi ci sono esempi da 3rd instar larvali tessuti (Figura 6, pannelli G-J). Pannelli K e L Visualizza immagini rappresentative da adulti gonadi (ovaie e testicoli, rispettivamente). Centinaia di immagini è state caricate e annotata nel nostro ricercabili 'fluorescente in situ moscerino della frutta database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Figura 1. Contorno di fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) protocollo chiave attrezzature e. (A) l'amplificazione di PCR del cDNA. (B) trascrizione In vitro per generare gene-specifico antisenso DIG - sonde di RNA in una piastra a 96 pozzetti (foto della piastra mostrata in b). (C) e (D): adulti (femminile: rapporto maschio 2:1. 300-400 mosche/bottiglia) mosche sono permesso di accoppiarsi per 3-4 giorni. Embrioni da una raccolta durante la notte il cibo di farina di mais standard a 25 ° C a una scatola di plastica ben ventilata (1 L di cibo di farina in un contenitore di dimensioni: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuove bottiglie mantenendo una corretta densità larvale. Per la raccolta di tessuto, polvere di lievito attivo dovrebbe essere spruzzata sulla sommità del cibo a 24, 48 ore dopo (AEL) la deposizione delle uova. (E-H): Gli esperimenti di ibridazione fluorescente in situ effettuate oltre 3 giorni consecutivi. Per gli embrioni o tessuti che non galleggiano, utilizzare una piastra PCR a 96 pozzetti, come mostrato in fotografia b con aspiratore 8 canali (foto c). Per i tessuti che galleggiano, come la maggior parte dei tessuti larvale, utilizzare un filtro con il fondo piatto (fotografia in d) e rimuovere il liquido dal basso con un aspiratore collettore utilizzando bassa pressione (foto e). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Determinazione del rendimento sonda RNA. Recentemente sintetizzato sonde antisenso RNA osservate su un gel di agarosio 1% (5 µ l/lane). Il rendimento può essere categorizzato (basato sull'intensità della band) come 'bassa resa' in vicoli 3 e 10, 'rendimento tipico' nelle corsie 1, 4, 5, 6 e 8 o 'ad alto rendimento' nelle corsie 2, 7, 9, 11 e 12. Per campioni con 'rendimenti tipici', utilizzare 10-15 µ l di sonda diluito in 100 µ l di soluzione di ibridazione per ogni esperimento in situ . Diluire i campioni con alti rendimenti della sonda con la soluzione di ibridazione aggiuntiva secondo l'intensità di banda rispetto a un'intensità 'tipico sonda'. Mirare ad avere concentrazioni di sonda finale approssimativamente uguale in ciascun pozzetto. La freccia punta verso una delle sonde' RNA', la banda superiore su ogni corsia è il modello di DNA originale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Principali passaggi per una raccolta di embrioni su larga scala e fissazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. In casa tube per rimuovere il liquido dai tessuti larvali o galleggianti. Alcuni tessuti larvali e adulti galleggiano in soluzione durante la fissazione. Questo semplice strumento è costituito da una rete di nylon, tenuta da un 200 µ l taglio punta, seguita da una mancia di 1 mL come un adattatore per collegare a un aspiratore. Liquido può essere tranquillamente rimosso senza perdere qualsiasi tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Amplificazione del segnale di tyramide. (1) scavare-contrassegnata sonda RNA antisenso ibridizza con senso endogeno RNA. (2) Immuno-affinità che lega tra anticorpo primario coniugato con biotina e DIG-UTP. (3) HRP coniugato streptavidina biotina si lega. (4) HRP catalizza la reazione di cianina 3-microarray e perossido di idrogeno per formare i radicali di breve durata cianina 3-microarray. (5) i radicali cianina 3-microarray associare ai residui della tirosina di proteine nelle vicinanze. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Rappresentante in situ immagini ibridazione. Ogni pannello viene illustrato un esempio di un RNA diverso (mostrato in ciano) e nuclei macchiati con DAPI (mostrato in rosso). (A-C) Esempi di primi embrioni della drosofila . (D, F) Esempi di tardi embrioni della drosofila . (G-J) Esempi di 3rd instar larvale tessuti della drosofila (tubuli malphigian, muscolo, della ghiandola salivaria e del midgut rispettivamente). (K) adulto dell'ovaia. (L) testicolo adulto. Ogni pannello viene visualizzato il nome del gene che la sonda è ibridazione a. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo descritto fornisce un metodo altamente riproducibile, sensibile ed economico per la rilevazione della maggior parte RNAs in fissa embrioni della drosofila o tessuti. Anche se leggermente più complessa rispetto più tradizionalmente utilizzato metodo di fosfatasi alcalina di sonda rilevazione, la risoluzione ottenuta da pesce è molto più grande e la sensibilità è paragonabile o migliore 7,8. Utilizzando piastre microtiter intero o parziale, dei protocolli possono essere utilizzati per analisi su larga scala o limitati di geni di interesse. Dovrebbe essere notato che le sonde generate potrebbero rilevare tutti o multiple della giuntura di trascrizione forma a meno che le sonde sono più specificamente progettati (cioè, singoli esoni). Anche se abbiamo testato sonde piccole come 200 nucleotidi con discreto successo, sonde più piccole tendono ad essere meno efficaci e possono essere meno specifici. Chiaramente, questo protocollo non è appropriato per la rilevazione di piccoli introni, esoni, o elaborati microRNA.
Sebbene questo approccio utilizza un passaggio enzimatico per aumentare la forza del segnale, intensità del segnale sembra essere proporzionale all'espressione genica in una relativamente lineare e ampia gamma di livelli di espressione. A maggiore ingrandimento, il segnale è visto come puncta o macchioline all'interno di cellule e tessuti. Per le trascrizioni relativamente rare sono visti solo pochi piccoli puncta. Abbondanza di trascrizione aumenta, questi si sviluppano in numero e dimensioni. Come con la singola molecola pesce (smFISH), singola puncta piccolo può anche corrispondere a singolo RNAs e inoltre dovrebbe essere facilmente quantificato utilizzando il software di imaging e informatica. Confronti di immagini pubblicate ottenute mediante smFISH con le immagini che abbiamo abbiamo curato per i medesimi obiettivi suggeriscono che il complessivo, la sensibilità e la risoluzione dei due metodi sono relativamente simili, anche se questo dovrebbe essere testato tramite i confronti più rigorosi. Dato il costo molto più elevato di smFISH, il metodo fornito qui dovrebbe dare risultati simili a una frazione del costo. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di rilevare piccole trascrizioni o parti distinte di trascrizioni, smFISH è raccomandato.
A causa delle dimensioni più piccole di alcune sonde FISH, questo metodo può anche essere meglio a tessuti penetranti che sono grandi o con barriere significative. Tuttavia, il nostro uso di livelli più elevati di detersivo e tweaks di fissazione e permeabilizzazione tessuto sembrano hanno risolto questo problema. Infine, sebbene sviluppato per tessuti di Drosophila , il buffer di detergente alta descritto qui per tessuti dissecati dovrebbe funzionare anche per tessuti, nonché la maggior parte altri organismi ed embrioni della drosofila .
Disclosures
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Finanziamento per questo progetto ha fornito una sovvenzione alla HMK dal canadese istituti di salute ricerca (concedere 133473 MOP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
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- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
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- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
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