Summary
O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.
Abstract
Em nossos esforços para determinar os padrões de expressão e Localização subcellular da drosófila RNAs em uma base de todo o genoma e em uma variedade de tecidos, temos desenvolvido inúmeras modificações e melhorias para nossa original fluorescente in situ protocolo de hibridação (peixe). Para facilitar a taxa de transferência e custo eficácia, todas as etapas, desde a geração da sonda de detecção do sinal, são executadas usando placas de 96 poços da microplaca exon. Digoxygenin (escavação)-rotulados antisentido RNA sondas são produzidas usando clones de cDNA ou DNA genômico como modelos. Após a fixação de tecidos e permeabilização, sondas são hibridizadas para transcrições de interesse e então detectado usar uma sucessão de antianticorpo escavação conjugado com biotina, estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e conjugado fluorescente tyramide, que, na presença de HRP, produz um intermediário altamente reativo que vincula à regiões densa de elétron de proteínas imediatamente adjacentes. Estas etapas de amplificação e localização produzem um sinal robusto e altamente localizado que facilita a localização ambos transcrição celular e subcellular. Os protocolos fornecidos foram otimizados para produzir sinais altamente específicos em uma variedade de tecidos e estádios de desenvolvimento. As referências também são fornecidas para variações adicionais que permitem a detecção simultânea de várias transcrições, ou transcritos e proteínas, ao mesmo tempo.
Introduction
Novos métodos de deteção de RNA de todo o genoma como RNA-seq expandiram enormemente nosso conhecimento de quando e onde os genes são expressos, e em que os níveis1. No entanto, estes fornecem relativamente pobre resolução temporal e espacial. RNA hibridação in situ permite a distribuição espacial de transcrições para ser observada visualmente em tecidos fixos, revelando os detalhes da localização celular e subcellular2. Usar hibridização fluorescente in situ (FISH) permite a resolução espacial ainda mais, pois permite o uso de técnicas de microscopia poderoso, como o de microscopia confocal e leve folha3. Marcadores fluorescentes como DAPI também podem ser usados para estabelecer relacionamentos subcellular4. PEIXES também facilita a observação de vários RNAs e proteínas simultaneamente com indicações claras de sobreposição a nível subcelular. Os reagentes originais e etapas necessárias para a dupla-rotulagem podem ser encontradas no seguinte referências3,5.
Os procedimentos descritos aqui utilizam placas de 96 poços da microplaca para todas as etapas, incluindo a produção de modelo de cDNA (PCR de Colônia), produção de sonda RNA (usando a transcrição de escoamento dependente do polymerase T7, T3 ou SP6), hibridização in situ , e desenvolvimento do sinal fluorescente. Um número suficiente de embriões ou tecidos é adicionado a cada bem da placa de 96 poços para permitir a avaliação da consistência e variabilidade. Bem, então, cada um recebe uma sonda diferente. Após o desenvolvimento do sinal, embriões ou tecidos de cada poço são dispostos em corrediças do microscópio individuais para análise microscópica.
O uso de amplificação de sinal tyramide (TSA) para a deteção de sonda produz sinais robustos com excepcional resolução subcellular 5,6,7,8. A Localização subcellular de RNAs é um importante mecanismo regulatório 9 que parece ocorrer com praticamente todos os RNAs 4,10,11. Essas análises também mostraram que muitas transcrições não são detectados pelo RNA-seq são prontamente detectadas pelo peixe 8. A adaptação de hibridação in situ RNA para placas de 96 poços permite a análise de até 96 genes de interesse numa altura (placas mais se adicionais são usadas), possibilitando a análise de grandes conjuntos de dados. Cortando as placas em seções menores, o método é também facilmente adaptado para apenas algumas amostras. O protocolo fornecido é adequado para a análise das distribuições de RNA na maioria dos tipos de tecidos. Embora não mostrado, é adaptável aos não - tecidos deDrosophila também.
Protocol
1. amplificação por PCR de modelos de cDNA do plasmídeo
Nota: Use o plasmídeo de alta qualidade ou modelos gerados pelo PCR DNA para o RNA síntese da ponta de prova. As bibliotecas de Drosophila Gene coleção (DGC) geradas pelo projeto genoma Berkeley Drosophila fornece cobertura da maioria dos genes codificação encontrados no genoma de Drosophila (ver quadro 1a). Estas também permitem o uso de primers universais para a amplificação de qualquer inserção de cDNA. Estas amplificações do PCR são realizadas no plasmídeo DNAs presentes nos lysates do plasmídeo contendo culturas bacterianas. Os produtos do DNA são usados como modelos para a transcrição em vitro para gerar antisentidas sondas de RNA (ver tabela 1b).
- Projetar primers para amplificar uma região específica do exon de um gene de interesse por PCR (ex. de DNA genômico), de preferência com o site de reconhecimento do polymerase T7 na extremidade antisentido.
- Para experimentos com menos de 96 amostras, cortar partes desnecessárias de placas de 96 poços. Cobrir as placas com selagem de fita (ver materiais) para armazenamento e incubação do todo. Se forem utilizados tubos microcentrifuga, ajustar volumes conformemente.
Nota: placas de 96 poços permitem o uso de pipetas multicanais para maior throughput, bem como os volumes menores para a economia de custo.
| tabela 1a | ||||
vetor | Antibiótico trabalhando concentração 1: 1000 |
Primers | RNA polimerase para antisentido | RNA polimerase. para senso |
| CLLP-eu | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Cloro e álcalis | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | cloro e | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tabela 1b | ||||
| Primer | sequência | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) inverter | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
tabela 1: A) informações de clone geral DGC para amplificação do cDNA insere em plasmídeos. B) sequências de Primers Universal para plasmídeos DGC.
- crescer 250 µ l de plasmídeo contendo cultura bacteriana em placas de 96 poços cultura adicionando 240 µ l de LB mídia por alvéolo com seleção adequada de antibióticos (diluição 1: 1000 de um estoque de antibiótico 1000 X) e 10 µ l do original plasmídeo contendo bactérias (a partir de um estoque de glicerol). Selo com fita de vedação.
- Incubar agitando a 215 rpm a 37 ° C durante a noite (O/N).
Nota: Faça uma cópia nova do estoque de clone de plasmídeo bacteriano glicerol cDNA para substituir o original. Não volte a congelar original estoque bacteriana, como isso pode matar as bactérias. - Para produzir os modelos PCR, diluir 10 µ l da cultura bacteriana O/N em 90 µ l ddH autoclavado 2 O em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços. Desnature o DNA por 5 min a 95 ° C em thermocycler. Imediatamente, coloque a placa no gelo pelo menos 5 min.
- Reações de PCR preparar utilizando primers universais apropriados conforme tabela 2.
| reagentes | reação de 50 μl amostra | 96 misture bem (112 x reação) | concentração Final |
| 2 X PCR polymerase Mix | 25 μl | 2800 μl | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/μl) | 0,5 μl | 5 6 μl | pmol/μl 0.25 |
| Primer_Rev (25 pmol/μl) | 0,5 μl | μl 56 | 0,25 pmol/μl |
| ddH2O | μl 22 | μl 2464 | < /TR > |
| total | 48 μl | μl 5376 |
tabela 2: PCR Master Mix.
- utilizando uma pipeta, alíquota µ l 48 da mistura mestre PCR em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços. Adicionar 2 µ l de cada modelo de DNA de plasmídeo desnaturado por alvéolo.
Nota: Uso entre 1 picograma (pg) para 1 nanograma (ng) do ADN do plasmídeo. Modelo de DNA excessivo reduz o rendimento do PCR e especificidade. - a máquina PCR de 96 poços conforme tabela 3 do programa e executar a amplificação.
Nota: O tempo de extensão a 72° C é determinado pelo tamanho do produto da PCR (45 s para ≤ 2,0 kb, 1,5 min para ≤ 3,0 kb, 3 min para ≤ kb 4,0 e 3,5 min para 4.0-5.0 kb). A temperatura do recozimento (Tm) é determinada pela sequência de primers. Quando um primer é igual ou maior do que 20 nt, o Tm é calculada como:
Tm (° C) = (4 X número de CG) + (2 X número de AT) -4.
| passo | temperatura | tempo | ciclos |
| Desnaturação inicial | 95 ° C | 3 min | 1 ciclo |
| amplificação desnaturação, recozimento e extensão | 95 ° C | 45 seg | < linha td span = "3" > 30 ciclos|
| 54-58 ° C | 45 seg | ||
| 72 ° C | min 45 seg-3,5 | ||
| Extensão Final | 72 ° C | 7 min | 1 ciclo |
| Armazenamento | 4 ° C | segurar |
tabela 3: programa de PCR recomendado.
- acetato de
- precipitação de produto PCR com etanol (EtOH) e sódio (NaOAC) (ver quadro 4).
Nota: Se o volume de reação de PCR é menos de 50 µ l, encher a 50 µ l com DDQ 2 O.- Para precipitar o DNA, misturar os componentes da tabela 4 e armazenamento de amostras O/N a-20 ° C, ou por 30 min em °C.Centrifuge-80 a placa de 96 poços para 45-60 min a 2.250 x g a 4 ° c. uso um 8-canal colector pipeta para carefully remova o sobrenadante. Lave uma vez com 160 µ l de frio 70% EtOH (RNase-livre) por 30 min a 2.250 x g a 4 ° C.
Nota: O precipitado de DNA pode ser visto no fundo dos poços. Produtos PCR mais curtos exigem mais tempo centrifugações. - Inverter suavemente a placa de 96 poços sobre papel absorvente para remover as últimas gotas de líquido em cada poço (tanto quanto possível). Ar seca pelota do ADN por 1h à temperatura ambiente (RT). Ressuspender o precipitado de DNA em 25 µ l RNase livre água.
Nota: O ar 1h seco permitirá que todos os vestígios de EtOH evaporar. No entanto, um pequeno volume de líquido (cerca de 1 µ l) deve permanecer em cada poço para evitar que a pelota do ADN sequem completamente. Use 25 µ l para uma reação de PCR de 50 µ l. Não utilize água tratada DEPC nesta fase para evitar interferência com transcrição em vitro nas etapas a seguir.
- Para precipitar o DNA, misturar os componentes da tabela 4 e armazenamento de amostras O/N a-20 ° C, ou por 30 min em °C.Centrifuge-80 a placa de 96 poços para 45-60 min a 2.250 x g a 4 ° c. uso um 8-canal colector pipeta para carefully remova o sobrenadante. Lave uma vez com 160 µ l de frio 70% EtOH (RNase-livre) por 30 min a 2.250 x g a 4 ° C.
| componente | Volume | parte |
| PCR | 50 μl | |
| 100% etanol | 125 μl | 2.5 vol. X de PCR |
| 3 NaOAc M (pH = 5,2, RNase livre) | 5 μl | 10% Vol. de PCR |
| Total | 180 μl |
tabela 4: exemplo de uma reação de PCR de 50 µ l.
- verificar o tamanho e o rendimento dos produtos PCR executando 5 µ l da solução de DNA ressuspensa em um gel de agarose 1% em 1 tampão TAE X.
Nota: Um total de 250-500 ng do modelo de DNA é necessário para a reação de 15 µ l em vitro transcrição. Amostras com rendimentos mais elevados podem ser ainda mais diluídas. O rendimento do RNA também depende da sequência e comprimento do modelo de DNA. De acordo com o guia geral para a rotulagem de escavação-RNA com T7 RNA polimerase, aproximadamente 10 µ g de RNA escavar-etiquetadas é produzido a partir de modelo linear de 1 µ g.
2. Transcrição in vitro para gerar sondas antisentidas.
Nota: é fundamental trabalhar em um ambiente livre de RNase. Todos os reagentes e utensílios do laboratório devem ser RNase livre (como certificados DNase/RNase plástico ware livre).
| componente | concentração de estoque | Volume | Concentração final |
| ATP | mM 100 | μl 7 | 10mm |
| CTP | mM 100 | μl 7 | 10mm |
| GTP | 100mm | 7 & # 956; l | 10mm |
| UTP | mM 100 | μl 4,5 | 6,5 mM |
| Dig-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3,5 mM |
| água livre de RNase | < /td > | 19,5 μl | |
| Total | 70 μl |
tabela 5: preparação de mistura de escavação-NTP.
< tabela border = "1" fo:keep-together.within-página = "1" fo:keep-com-next.within-página = "sempre" >(112 x reação)
tabela 6:2 X transcrição Master Mix.
Mistura de- preparar o escavação-NTP, conforme tabela 5.
Nota: Para evitar erros, sempre alinhar a placa tal que A1 está no canto superior esquerdo da placa. - Adicionar componentes descritos na tabela 6, a cada poço em uma nova placa PCR de 96 poços (placa de sonda). Adicione 7,5 µ l de produto PCR (modelo de DNA) para cada uma correspondendo bem, usando uma pipeta multicanal. Cubra o prato com fita de vedação.
Nota: A quantidade ideal de produto PCR adicionado por reação de transcrição deve ser entre 0.5 e 1 µ g. Se bandas no gel são significativamente mais fraco ou mais intensa, o volume de DNA adicionado para a reação pode ser ajustado em conformidade. A quantidade exata não é crítica. - Incubar a 37 ° C, a placa de sonda para 3,5-4 h. Mix 15 µ l de sonda sintetizada com 35 µ l de DEPC tratada ddH 2 O, 125 µ l de 100% EtOH e 5 µ l de 3 M de NaOAC (pH = 5,2, RNase livre). Armazenar a-80 ° C durante pelo menos 30 min. centrifugar e lavar conforme descrito nas etapas 1.10.2 e 1.10.3.
- Ressuspender a precipitado sonda em 25 µ l de DEPC tratada ddH 2 O. executar 5 µ l em um gel de agarose 1% (tempo de execução < 20 min) para verificar a integridade e o rendimento da sonda ( Figura 2).
Nota: O gel de agarose deve ser feito com O DEPC tratada ddH 2 e tampão TAE. Aparelhos de eletroforese de gel devem ser atribuídos para o RNA trabalhar só. Mais gel de tempo de execução a baixa velocidade pode levar à degradação de RNA durante a eletroforese. - Misturar os restantes 20 µ l da sonda sintetizada com 100 µ l da hibridação solução (tabela 7) e loja a-80 ° C até ser necessário.
Nota: A concentração de sonda pode ser diluída mais se bandas são particularmente robusta (ver Figura 2 para exemplos). Solução de hibridação é muito eficaz na prevenção de contaminação de RNase. Imediatamente adicione solução de hibridização da sonda ressuspensão para evitar a degradação do RNA. Solução de hibridização deve ser filtrado através de um filtro de 0,2 µm. Para amostras de tecido, aumentar a concentração de detergente na solução de hibridização, adicionando o Triton X-100 para uma concentração final de 0,3%.
| Volume | docomponente | concentração Final |
| DEPC tratada ddH2O | ml 11,85% | 23,7% |
| 20 X SSC | 12,5 ml | 25% (5 X) |
| 25 ml | deformamida | 50% |
| Heparina (50 mg/ml) | ml 0,1 | 0. 2% (0,1 mg/ml) |
| 0,5 ml | deesperma de salmão único ADN encalhado | 1,0% |
| Tween-20 | 0,05 ml | 0,1% |
| Total | de50,00 ml | de100% |
3. coleção de tecido de criação e embrião, larva e adulto de drosófila.
Nota: para tanto em pequena escala (garrafas) e massa (caixas) voar criação, usar protocolos padrão laboratório voar sobre os alimentos à base de farinha de milho em 25 ° C. Mantenha larval e adulto densidade adequada e fornecer o pó de fermento ativo adicional sobre os alimentos superfícies.
- Coletar embriões seguindo protocolos padrão. As principais etapas de colheita de embriões são ilustradas na Figura 3.
Nota: Após enxaguar embriões devitillinized em metanol, os embriões fixos podem ser armazenados a-20 ° C por até um ano. Permeabilização do embrião e pós-fixação são realizados no dia 1 do protocolo peixe. - Preparar fresco PFA estoque solução a 40%.
- Prepare um recém-feitos solução stock de 40% paraformaldeído (PFA), misturando-se 10 mL de DEPC tratada ddH 2 O a 3,68 g de PFA e 70 µ l de KOH 2N em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL contendo um pequeno rebuliço bar
Atenção: O PFA é altamente tóxico com potenciais efeitos agudos e crônicos de saúde. MSDS (Material Safety Data Sheets) de ler e usar com a proteção apropriada para os olhos, pele e trato respiratório. - Em uma coifa, aqueça e agite o frasco para 3-5 min em uma placa de aquecimento a 200 ° C até o PFA é totalmente dissolvido. Retire a solução estoque de PFA do fogo assim que o PFA é dissolvido (não sobreaquecer).
- Cool dissolvido 40% PFA solução-mãe no gelo por 5 min e filtrar com uma seringa de filtro e 10 mL de 0,2 µm.
- Prepare um recém-feitos solução stock de 40% paraformaldeído (PFA), misturando-se 10 mL de DEPC tratada ddH 2 O a 3,68 g de PFA e 70 µ l de KOH 2N em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL contendo um pequeno rebuliço bar
- Terceiro estádio as larvas (L3) ou fixação de tecidos adultos, têmpera e permeabilização
Nota: Este protocolo deve ser concluído em um dia. Que inclui o tecido dissecação, fixação, têmpera de HRP endógena, permeabilização e pós-fixação.- Preparar soluções de fixação (Fix-I e II-Fix) conforme tabela 8.
Nota: o ácido pícrico é usado como um fixador adicional quando o tecido tem uma estrutura delicada que deve ser preservada. Não é um bom fixador quando ultraestrutura de tecido deve ser preservada para a microscopia de elétron (EM).
Aviso: o ácido pícrico é instável e tem a capacidade de reagir com outros materiais e criar compostos explosivos. Usar e armazenar, de acordo com as diretrizes de segurança. - Lugar de larvas ou adultos de moscas em um tubo de plástico de 50 mL contendo 10 mL de frio 1X PBS e 100 µ l de correção-eu solução. Calma no gelo por 2 min reduzir a motilidade mosca larvas ou adulta.
- Corte fora a ponta de uma ponta de plástico de 1 mL para criar uma abertura de 2-3 mm. Transferência de 10-30 larvas ou adulto voa com a ponta de 1 mL em uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) com uma camada superficial de 1X PBS do tubo de 50 mL (passo 3.3.2). Adicionando um pouco de PBTT pode diminuir a tensão superficial. Dissecar cuidadosamente larval (aberto do anterior e aperte os tecidos de posterior para anterior) ou tecidos adultos de interesse com um par de Pinças afiadas sob um escopo dissecar.
Nota: Cerca de 200-300 de larvas ou adultos testículos podem ser dissecados e fixo em um dia por pessoas experientes. - Transferência dissecado tecidos com uma pipeta de 200 µ l (com a ponta cortada para criar uma abertura de 2 mm de diâmetro) em um tubo de 1,5 mL e loja no gelo. Completar cada rodada de dissecação dentro de 10-15 min antes de avançar para o próximo passo.
Nota: Continue com rodadas adicionais (dentro de uma janela de tempo de 2 h) conforme necessário para gerar suficiente material. - Tecidos de correção com 800 µ l de correção-eu solução por 30 min em um misturador de bancada superior. Limitar a tecidos lave uma vez com 800 µ l 1 X PBTT e manter os tubos em gelo para um máximo de 2,5 h. devido a 30 min, isso precisa ser executada batch-wise até tecido suficiente tenha sido coletado.
- Pool todos os tecidos dissecados e fixos em um tubo de plástico único 15 mL contendo malha da tampa (veja a Figura 4 para o projeto do tubo). Aspire o excesso de líquido através da malha da tampa do tubo. Lave 3 X 5 min cada com 10 mL de 1 X PBTT. Lave duas vezes com 10 mL de 1X PBS para remover o detergente. Isso impede que as bolhas em excesso na próxima etapa.
Nota: Se os tecidos dissecados afundam até o fundo do tubo, etapas podem ser executadas em placas de microtitulação regular ou 0.5-1.5 tubos de microcentrifuga mL (volume de 300-800 µ l pelo tubo). - Mais uma vez saciar a atividade endógena de HRP com 5 mL de 0.3% H 2 O 2 em PBS por 15 min no RT. Repeat. Manter a tampa aberta durante esta etapa sem misturar. Lave duas vezes com 10 mL de 1 X PBTT. Lave duas vezes por 5 min com 10 mL de 1 X PBTT.
- Permeabilize tecidos com 10 mL de acetona 80% (-20 ° C, pré-refrigerados) a-20 ° C durante 10 min. inverter o tubo duas vezes durante o período de incubação. Lave duas vezes por 10 min com 10 mL de 1 X PBTT para Re-hidratar os tecidos.
- Lavar com 10 mL de uma mistura de hibridação de PBTT, mais 5 ml 5 ml de solução (1:1). mistura de descartar e substituir com 10 ml de solução de hibridação. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até ser necessário. Para melhores resultados, não armazenar as amostras durante mais de uma semana.
- Preparar soluções de fixação (Fix-I e II-Fix) conforme tabela 8.
| componente | eu (10 ml) resolver | corrigir II (10ml) |
| Estoque PFA 40% | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | ml 8,99 | 9 ml |
| solução de ácido pícrico | 10 μl | – |
4. hibridação in situ
Nota: esta parte do protocolo exige um mínimo de 2 dias, com a preparação da amostra, pré-hibridização e hibridação tomando lugar no dia 1 e sonda da deteção em dia 2. Se o número de amostras é relativamente alto, se não estão familiarizados com o protocolo, ou um dia inteiro, não é possível, o protocolo deve ser realizado em 3 dias com as etapas de amplificação de deteção e sinal de sonda dividido em 2 dias. Grande número de embriões ou amostras de tecido dissecado também pode exigir dias adicionais para processar. Para amostras de tecido dissecado, substitua 1 X PBT 1 X PBTT em todas as etapas, salvo indicação em contrário. O detergente extra é necessário para a penetração dos tecidos muitas larvas e adultos, como o cérebro e o testículo. Embora não testada, 1 X PBTT também pode ser usado para embriões. Use 100 µ l por alvéolo para placas de 96 poços e 800 µ l para tubos de 1,5 mL.
- Pré-hibridização e hibridação
Nota: 4.1.1-4.1.6.2 passos são para hibridação de embrião in situ. Para tecido de larvas ou adultos em situ hibridação, pule etapas.- Remover a 2 mL de embriões fixos (armazenados em metanol a-20 ° C) para um novo tubo de 15 mL. Lave os embriões duas vezes para 7 min com 10 mL de metanol em cada lavagem. WASoares embriões para 7 min com 10 mL de uma mistura de metanol e 1 X PBTT (1:1). Lave os embriões duas vezes por 7 min com 10 mL de 1 X PBTT para Re-hidratar.
- Para a permeabilização do embrião, preparar uma solução intermediária proteinase K (40 µ l/mL) por diluição 1: 500 de solução (20 mg/mL). Loja a -20 ° C. fazer uma solução de proteinase K trabalho diluindo a solução intermediária proteinase K 1/15 em 1 PBTT de X para uma concentração final de trabalho de 2.667 ug/mL.
- Permeabilize embriões com 10 mL de solução de proteinase K (uso menos para um número menor de embriões) de trabalho. Incube o tubo em RT para 13 min. inverta suavemente o tubo 4 vezes durante a incubação. Incubar as amostras em solução de proteinase K no gelo por 1h sem misturar.
Nota: Esta incubação relativamente longa com diluído proteinase K garante permeabilização reproducibly uniforme e coloração subsequentes. - Enquanto permeabilize embriões, faça um 2 mg/mL solução de glicina do estoque de X 10 (20 mg/mL) em 1 X PBTT, para um volume total de 30 mL. Solução de
- remover proteinase K, lavar com 10 mL de solução de glicina (2 mg/mL) e lavar duas vezes por 2 min cada. Lavar três vezes com 10 mL de 1 X PBTT para remover a glicina.
- Pós-fixação dos embriões.
- Prepare-se 10 mL de 4% PFA (1 mL de 40% PFA em 9 mL de PBTT, filtrado através de filtro de 0,45 µm).
- Incubar as amostras em 4% PFA de 20 min. lavar 3 X por 2 min cada com PBTT.
- Para preparar a solução de hibridação desnaturado, ferver a solução de hibridização por 5 min. Para uma placa de 96 poços completo, use três tubos de 12 mL. Legal no gelo imediatamente por 5 min. Embriões de
- lave uma vez com 10 mL de 1 X PBTT: solução de hibridação (1:1). Lave duas vezes com 5 mL de solução de hibridação. Alíquota µ l ~ 20 por alvéolo de resolvidos embriões (30-40 embriões) ou tecidos reparados em uma placa PCR de 96 poços no gelo. Remover a solução de hibridação de tecidos ou embriões utilizando uma pipeta de colector de 8 canais ( Figura 1 / vídeo).
Nota: A pipeta colector tem um ‘ para ’ que impede que as dicas de ir para o fundo dos poços e remoção de amostra. Para experimentos usando tecidos que flutuam, remover o líquido cuidadosamente com uma pipeta de 100 µ l de cima.
- Adicione 100 µ l da solução de hibridação desnaturado a cada poço. Pre-cruzar os embriões por um período mínimo de 2,5-3 h a 56 ° C, usando uma unidade de aquecimento de banho seco que contém contas de metal (ver materiais e Figura 1). Sonda
- desnaturar 100 µ l do preparado em um prato PCR de 96 poços usando um thermocycler por 5 min a 80 ° C. imediatamente cool no gelo por 5 min. Remova a solução pré-hibridização de embriões ou tecidos. Adicionar desnaturadas sondas gene-específico para cada amostra, cubram com fita de vedação e cruzam a 56 ° C por 16-18 h O/N, sob contas de metal em banho seco, unidade de aquecimento
5. Deteção da ponta de prova
- pré-aquecer as soluções no quadro 9, na unidade de aquecimento a 56 ° C. Remova a placa sondas.
Nota: As sondas podem ser reutilizadas entre 2 - 3 vezes, se armazenado a-80 ° C (nunca loja qualquer RNA amostras em-20 ° C). Após a hibridização, o RNA encalhado dobro é mais estável que um único filamento RNA e é menos suscetível à degradação causada por contaminação de RNase.
Se utilizar um sistema de filtragem de vácuo de placa multi bem para tecidos, um prato de coleção deve ser incluído sob a placa do filtro para recolher as pontas de prova (Veja o vídeo para detalhes de montagem). Tecidos hibridizados precisará ser transferida da chapa de regular da microplaca de 96 poços usada para hibridação com 1,2 µm poro tamanho PVDF as membranas no fundo de cada poço.
| etapa | pré aquecido solução (56 ° C) | tempo | Volume por bem |
| 1 | Solução de hibridização: PBTT (3:1) | 15 min | 100 μl |
| 15min | deHibridização solução: PBTT (3:1) | 2 | 100 μl |
| 3 | Solução de hibridização: PBTT (1:1) | 15 min | 100 μl |
| 4 | Solução de hibridização: PBTT (1:3) | 15 min | 100 μl | 5 | PBTT 3 lava | 5 min | 100 μl |
tabela 9: lavar sondas após hibridação.
- se usando placas normais, lavagem de amostras conforme tabela 9 em uma unidade de aquecimento a 56 ° C. se usando o sistema colector de aspiração, usar soluções aquecidas com sistema de vácuo no banco e remover soluções imediatamente abaixo por vaccuum. Após a lavagem 3 com 1 X PBTT, a placa normal pode ser removida do aquecimento unidade
- Anticorpos de preparar.
- Preparar 11 mL de solução de anticorpo primário (2,5 µ g/mL) do estoque (1 mg/mL), diluindo o anticorpo monoclonal de antiratinho escavação conjugada com biotina (veja a lista de material) em PBTTB (1: 400). Se processando amostras menos, ajustar volumes conformemente.
- Preparar 11 mL de solução de streptavidin HRP (1 µ g/mL) do estoque (1 mg/mL) por diluição 1: 1000 streptavidin-HRP conjugado (veja a lista de material) em PBTTB. Se usando amostras menos, ajustar volumes conformemente.
- Bloquear de embriões ou tecidos com PBTTB (leite desnatado de 1% em 1 X PBTT) por 20 min em um misturador de bancada superior no RT.
Nota: O filtro PBTTB usando papel de filtro (grau 3, 6 µm) antes de usá-lo em placas de 96 poços filtro para evitar o entupimento dos filtros. Em vez de PBTB, PBTTB (PBTB com adicional 0,3% Triton X-100) é usado para todos os tecidos durante o protocolo de. - Incubar embriões ou tecidos em solução de anticorpo (100 µ l/poço) por 2 h no misturador de bancada amostra. Lave duas vezes com 1 x PBTTB. Lavar 3 X por 5 min e 5 X por 10 min com PBTTB. Incube os embriões ou tecidos com solução streptavidin HRP (100 µ l/poço) para 1,5 h, usando um misturador de bancada amostra. Lave 2 X por 5 min com PBTTB. Manter amostras no escuro deste ponto.
Nota: durante todas as lavagens de anticorpo, se o tecido está sendo perdido devido a opacidade produzida pelo leite, tente lavar sem o leite (PBTT em vez de PBTTB). - Preparar uma solução DAPI diluição 100 X DAPI em PBTTB (1: 100).
- Incubar embriões ou tecidos com solução DAPI (100 µ l/poço) por 15 min em um misturador de bancada amostra. Lave 4 X por 10 min com PBTT. Guarde a placa de 96 poços com amostras O/N a 4 ° C ou prosseguir para a próxima etapa.
Nota: O procedimento pode ser pausado aqui.
6. Pesquisa de anticorpos usando tyramide (ver Figura 5)
Nota: aqui caseiro cianina 3-conjugados tyramide foi usado, que foi preparado de acordo com o protocolo descrito em 12 . Se realizando muitas experiências ou testes muitas amostras, isso economiza uma quantidade significativa de dinheiro e é eficaz em comparação com reagentes comerciais (de experiência). Para poucas experiências e amostras, pode ser usado comercialmente disponível cianina 3-tyramide (ver materiais).
- Amostra de lavagem placas de 1 X PBTT 3 X por 5 min.
- Preparar tyramide ativação buffer (buffer de ativação) que contém a 0,006% de H 2 O 2 em PBTT (diluir 30% (w/w) H 2 O 2 ações 1:5000). < lEu > enxaguar as placas com o buffer de ativação.
- Solução de 3-tyramide de cianina Prepare diluindo-o no buffer de ativação em um tubo de 15 mL.
- Para embriões, usar 1:80 diluição (137 µ l de cianina 3-tyramide em 11 mL de tampão de ativação). Para tecidos larvais, use 1:150 diluição (73 µ l de cianina 3-tyramide em 11 mL de tampão de ativação). Para testículos adultos, utilize diluição 1: 200 (55 µ l de cianina 3-tyramide em 11 mL de tampão de ativação). Para adultos ovários, usar a diluição de 1: 300 (36 µ l de cianina 3-tyramide em 11 mL de tampão de ativação).
- Incubar amostras com solução de cianina 3-tyramide para 2 h no misturador de bancada amostra. Enxágue quatro vezes com PBTT. Lave 6 X por 10 min com PBTT. Lavar 3 X por 5 min com PBS para remover o detergente.
- Adicionar 150 µ l/poço de antidesvanece-se meios de montagem. Manter amostras O/N a 4 ° C, para permitir que os tecidos ou embriões para afundar até o fundo do tubo. Montar as amostras em corrediças do microscópio (sob dissecando o escopo para os tecidos) e cobrir com lamínula. Selar as bordas da lamela com esmalte transparente.
- Imagem usando um microscópio de fluorescência.
Nota: analisar controle negativo primeiro para ter uma ideia de ‘ específico ’ fundo.
Representative Results
A Figura 6 mostra exemplos de resultados obtidos usando este procedimento. Os top 3 painéis mostram exemplos dos primeiros embriões da drosófila (Figura 6, painéis A C), a próxima 3 painéis mostram exemplos de tarde embriões da drosófila com sinais em tecidos diferentes (amnioserosa, músculos e sistema nervoso central, respectivamente (Figura 6, painéis D-F). Em seguida são exemplos de 3º ínstar larvas tecidos (Figura 6, painéis G-J). Painéis, K e L mostram imagens representativas de adultas gônadas (ovário e testículo, respectivamente). Centenas de imagens foram carregadas e anotadas no nosso pesquisável 'fluorescente em situ mosca de fruta database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Figura 1. Contorno da fluorescente em situ hybridization (FISH) protocolo chave equipamentos e. (A) amplificação por PCR do cDNA. (B) em vitro transcrição para gerar gene-específico antisentido DIG - rotulado de sondas de RNA em uma placa de 96 poços (foto da placa mostrada na b). (C) e (D): adultos (feminino: relação masculino 2:1. 300-400 moscas/bottle) moscas são permitidas para acasalar por 3-4 dias. Embriões de uma coleção durante a noite na comida de fubá padrão a 25 ° C são transferidos para uma caixa de plástico bem ventilada (1L de alimentos farinha de milho em um recipiente de tamanho: 8 "X 8" X 3" LWH) ou a novas garrafas, mantendo uma adequada densidade larval. Para coleta de tecido, o pó de fermento ativo deve ser polvilhado sobre o alimento às 24, 48 h após a postura (AEL) de ovos. (E de H): Fluorescente em situ as experiências de hibridação realizada por 3 dias consecutivos. Para embriões ou tecidos que não flutuam, use um prato PCR de 96 poços, como mostrado na foto b com aspirador de 8 canais (foto c). Para tecidos que flutuam, como a maioria dos tecidos larvais, use um prato com fundo de filtro (fotografia em d) e remover o líquido da parte inferior com um aspirador colector usando a baixa pressão (fotografia em mi). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Determinação do rendimento de sonda de RNA. Recém sintetizado sondas antisentido RNA observadas em um gel de agarose 1% (5 µ l/pista). O rendimento pode ser categorizado (com base na intensidade da banda) como 'baixo rendimento nas faixas 3 e 10, «rendimento típico' nas faixas 1, 4, 5, 6 e 8 ou 'high yield' nas pistas, 2, 7, 9, 11 e 12. Para amostras com 'rendimentos típicos', use 10-15 µ l de sonda diluída em 100 µ l de solução de hibridização para cada experimento em situ . Dilua as amostras com 'rendimentos elevados' da sonda com solução de hibridização adicional de acordo com a intensidade da banda em relação a uma intensidade de 'sonda típico'. Objetivo a apresentar uma concentração de sonda final aproximadamente igual em cada poço. A seta aponta para uma das sondas RNA' ', a banda mais elevada em cada lane é o modelo original de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Principais etapas para uma colheita de embriões em larga escala e a fixação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Tubo caseiro para a remoção de líquido dos tecidos larvais ou flutuantes. Alguns tecidos adultos e larvas flutuam na solução durante a fixação. Esta ferramenta simples é composto por uma malha de nylon, realizada por um 200 µ l cortar a ponta, seguida por uma ponta de 1 mL, como um adaptador para ligar a um aspirador. Líquido pode ser removido com segurança, sem perder qualquer tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Amplificação do sinal de Tyramide. (1) escavar-etiquetadas sonda de RNA antisenso se com sentido endógeno do RNA. (2) ligação imuno-afinidade entre anticorpo primário conjugado biotina e DIG-UTP. (3) HRP conjugado streptavidin vincula biotina. (4) HRP catalisa a reação de cianina 3-tyramide e peróxido de hidrogênio para formar radicais de curta duração cianina 3-tyramide. (5) radicais de 3-tyramide cianina vincular a resíduos de tirosina nas proteínas nas proximidades. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Representante em situ imagens de hibridização. Cada painel mostra um exemplo de um RNA diferente (mostrado em ciano) e núcleos corados com DAPI (mostrado em vermelho). (A-C) Exemplos dos primeiros embriões da drosófila . (D, F) Exemplos de tarde embriões da drosófila . (G-J) Exemplos de 3º ínstar larvas tecidos drosófila (túbulos malphigian, intestino, glândulas salivares e músculo respectivamente). (K) ovário adulto. (L) testículo adulto. Cada painel exibe o nome do gene que a sonda é cruzamento de. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito fornece um método altamente reprodutível, sensível e econômico para a detecção da maioria dos RNAs em embriões da drosófila fixo ou de tecidos. Embora um pouco mais complicado do que o mais tradicionalmente utilizado método de fosfatase alcalina da deteção de sonda, a resolução obtida por peixe é muito maior e a sensibilidade é comparável ou melhor 7,8. Usando placas de microtitulação total ou parcial, os protocolos podem ser usados para análises em larga escala ou limitadas de genes de interesse. Deve-se notar que as sondas geradas podem detectar todos ou tala de transcrição múltiplos formulários a menos que sondas destinam-se mais especificamente (ou seja, único exões). Embora nós testamos sondas tão pequenas quanto 200 nucleotídeos com razoável sucesso, sondas menores tendem a ser menos eficaz e podem ser menos específicas. Claramente, este protocolo não é apropriado para a detecção de pequenas intrões, exões, ou processado microRNAs.
Embora esta abordagem usa um passo enzimático para aumentar a força dos sinais, intensidade de sinal parece ser proporcional à expressão do gene alvo em uma escala relativamente ampla e linear dos níveis de expressão. A maior ampliação, o sinal é visto como partitura ou speckles dentro de células e tecidos. Para transcrições relativamente raras são vistos apenas alguns pequenos partitura. Como aumenta a abundância de transcrição, estes crescem em número e tamanho. Assim como única molécula peixe (smFISH), única pequena partitura também pode corresponder ao único RNAs e deve também ser facilmente quantificada usando software de imagem e informática. Comparações de imagens publicadas obtidas usando smFISH com imagens que nós temos com curadoria para os mesmos objectivos de sugerem que a geral, a sensibilidade e a resolução dos dois métodos são relativamente semelhantes, embora isto deve ser testado pelo comparações mais rigorosas. Tendo em conta a despesa muito maior de smFISH, o método fornecido aqui deve dar resultados semelhantes em uma fração do custo. No entanto, se o objetivo é detectar pequenas transcrições, ou partes distintas de transcrições, smFISH é recomendado.
Devido ao tamanho menor de algumas sondas de peixe, este método também pode ser melhor em tecidos penetrantes que são grandes ou têm barreiras significativas. No entanto, nosso uso de níveis mais elevados de detergente e ajustes de fixação e permeabilização do tecido parecem ter resolvido este problema. Finalmente, embora desenvolvido para tecidos de Drosophila , os buffers de detergente altos descritos aqui para tecidos dissecados devem funcionar também para os tecidos, bem como a maioria dos outros organismos e embriões da drosófila .
Disclosures
Autores têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Apoio para este projeto de financiamento foi fornecido por uma concessão para HMK pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder 133473 MOP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
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- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
