Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

Summary

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Abstract

Dans nos efforts pour déterminer les modes d’expression et la localisation sous-cellulaire des Drosophila RNAs l’échelle du génome et dans une variété de tissus, nous avons développé de nombreuses modifications et améliorations à notre origine fluorescentes in situ protocole d’hybridation (poisson). Pour faciliter le débit et la rentabilité, toutes les étapes, depuis la génération de la sonde de détection du signal, sont effectuées à l’aide de plaques de Microplaque 96 puits exon. Dioxygénine (DIG)-sondes marquées antisens RNA sont fabriqués à partir de clones d’ADNc ou ADN génomique en tant que modèles. Après fixation du tissu et la perméabilisation, sondes sont hybridées aux transcriptions d’intérêt et ensuite détectés à l’aide d’une succession d’anticorps anti-DIG conjugué à la biotine, streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) et conjugué fluorescent tyramide, qui, en présence de la HRP, produit un intermédiaire très réactif qui se lie aux régions denses d’électron des protéines juste à côté. Cette procédure d’amplification et de localisation produit un signal robuste et très localisé qui facilite les deux localisation cellulaire et subcellulaire transcription. Les protocoles fournis ont été optimisées pour produire des signaux très spécifiques dans une variété de tissus et de stades de développement. Les références sont également fournis pour des variations additionnelles qui permettent la détection simultanée de plusieurs transcriptions, ou les transcriptions et les protéines, en même temps.

Introduction

Nouvelles méthodes de détection de RNA pangénomique tels que RNA-seq ont considérablement élargi notre connaissance de quand et où les gènes sont exprimés, et à quels niveaux¹. Cependant, ceux-ci fournissent relativement faible résolution spatiale et temporelle. RNA hybridation in situ permet la distribution spatiale des transcriptions à observer visuellement en tissus fixés, révélant ainsi les détails de localisation cellulaire et subcellulaire². En utilisant l’hybridation in situ fluorescente (FISH) permet une résolution spatiale encore plus car il permet l’utilisation des techniques de microscopie puissant, comme la feuille confocale et lumière microscopie³. Des marqueurs fluorescents comme DAPI permet également d’établir des relations subcellulaire⁴. POISSON facilite également l’observation des multiples des ARN et des protéines en même temps que des indications claires des chevauchements au niveau subcellulaire. Réactifs uniques et les étapes requises pour le marquage double se trouvent dans les références suivantes^3,5.

Les procédures décrites ici utilisent microplaques 96 puits pour toutes les étapes, y compris la production de modèle de cDNA (PCR sur colonie), production de sonde d’ARN (à l’aide de la transcription de ruissellement dépendante polymérase T7, T3 ou SP6), hybridation in situ , et développement de signal fluorescent. Un nombre suffisant d’embryons ou de tissus est ajouté à chaque puits de la plaque à 96 puits pour permettre une évaluation de la cohérence et de la variabilité. Eh bien, chacun reçoit une sonde différente. Après le développement du signal, des embryons ou des tissus provenant de chaque puits sont rangés sur lames de microscope individuels pour analyse microscopique.

L’utilisation d’amplification de signal tyramide (TSA) pour la détection de la sonde produit des signaux robustes avec une résolution exceptionnelle subcellulaire ^5,6,7,8. La localisation subcellulaire des ARN est un mécanisme important de régulation ⁹ qui semble se produire avec pratiquement tous les ARN ^4,10,11. Ces analyses ont également montré que les nombreuses transcriptions qui ne sont pas détectées par RNA-seq sont facilement détectées par poisson ⁸. L’adaptation de l’hybridation in situ RNA pour plaques 96 puits permet l’analyse de jusqu'à 96 gènes d’intérêt à la fois (plaques plus si supplémentaires sont utilisées), permettant l’analyse des grands ensembles de données. En découpant les plaques en plus petites sections, la méthode est également facilement adaptée aux quelques échantillons. Le protocole fourni est approprié pour l’analyse des distributions de RNA dans la plupart des types de tissus. Bien que non représenté, il est adaptable aux non - tissus dedrosophile ainsi.

Protocol

1. amplification par PCR de modèles de cDNA de plasmides

Remarque : utilisez le plasmide de haute qualité ou templates générées par PCR ADN ARN sonde synthèse. Les bibliothèques de Gene Collection (DGC) de Drosophila générées par le projet de génome de Berkeley Drosophila offre une couverture de la plupart des gènes codage trouvé dans le génome de la drosophile (voir tableau 1 a). Ils permettent également l’utilisation des amorces universelles pour l’amplification de n’importe quelle insertion de l’ADNc. Ces amplifications PCR sont effectuées sur le plasmide DNAs présents dans les lysats de plasmide contenant des cultures bactériennes. Les produits de l’ADN sont ensuite utilisés comme modèles pour la transcription in vitro pour générer des sondes d’ARN antisens (voir tableau 1 b).

1. Concevoir des amorces pour amplifier une région de l’exon spécifique d’un gène d’intérêt par PCR (e.g. partir d’ADN génomique), de préférence avec le site de reconnaissance de polymérase T7 sur la fin antisens.
2. Pour les expériences moins de 96 échantillons, couper les parties inutiles des plaques à 96 puits. Couvercles avec joint de bande (voir documentation) pour tous les incubations et stockage. Si l'on utilise des tubes de microcentrifuge, ajuster le volume en conséquence.
   NOTE : plaques à 96 puits permettent l’utilisation des pipettes multicanaux pour augmenter la productivité, ainsi que des volumes plus petits pour des économies de coûts.

tableau 1 a
Vector	Antibiotique concentration 1/1000 de travail	Des amorces	ARN polymérase pour antisens	de l’ARN polymérase. pour sens
CPHV-j’ai	Amp	pBst_SK (-) _F/R	T3	T7
pBSt(-)	Amp	pBSt_SK(-)	T7	T3
pOT2	Chlor	pOT2_F/R	SP6	T7
pOTB7	Chlor	pOT2_F/R	T7	SP6
Tableau 1 b
Primer	séquence
pOT2_Forward	5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse	5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward	5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Reverse	5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

tableau 1 : A) information clone général DGC pour amplifier les ADNc insère dans les plasmides. B) les séquences des amorces universelles pour les plasmides de GCR.

3. grow 250 µL du plasmide contenant des cultures bactériennes dans des plaques de 96 puits de culture en ajoutant 240 µL des médias LB / puits avec sélection de l’antibiotique approprié (dilution 1/1000 d’un stock d’antibiotiques 1000 X) et 10 µL de l’original bactéries contenant des plasmides (provenant d’un stock de glycérol). Joint avec du ruban d’étanchéité.
4. Incuber en secouant à 215 tr/min à 37 ° C pendant la nuit (O/N).
   Remarque : Faire une nouvelle copie du stock de clone de plasmide bactérien glycérol cDNA pour remplacer l’original. Ne pas recongeler original stock bactérienne, comme cela peut tuer les bactéries.
5. Pour produire les modèles PCR, diluer 10 µL de la culture bactérienne O/N 90 µL ddH autoclavés ₂ O dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR 96 puits. Dénaturer l’ADN pendant 5 min à 95 ° C dans le thermocycleur. Placez immédiatement la plaque sur la glace pendant au moins 5 min.
6. Des réactions de PCR de préparer à l’aide des amorces universelles appropriées selon le tableau 2.

< /TR >

réactifs	réaction échantillon 50 μl	96 bien mélanger (112 x réaction)	concentration finale
2 X PCR polymérase Mix	25 μl	2800 μl	1 X
Primer_For (25 pmol/μl)	0,5 μl	5 6 μl	0,25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl)	0,5 μl	μl 56	pmol/μl 0,25
ddH2O	μl 22	μl 2464
total	48 μl	5376 μl

tableau 2 : PCR Master Mix.

7. aide d’une pipette, aliquote 48 µL du mélange maître PCR dans chaque cupule d’une nouvelle plaque PCR 96 puits. Ajouter 2 µL de chaque matrice d’ADN de plasmide dénaturé par puits.
   Remarque : L’utilisation entre 1 picogramme (pg) à 1 nanogramme (ng) de l’ADN de plasmide. Matrice d’ADN excessive réduit le rendement PCR et la spécificité.
8. La machine PCR 96 puits selon le tableau 3 du programme et effectuer l’amplification.
   Remarque : La prorogation de délai à 72° C est déterminée par la taille du produit PCR (45 s pour ≤ 2,0 Ko, 1,5 min pour ≤ 3,0 Ko, 3 min pour ≤ 4,0 Ko et 3,5 min pour 4.0-5.0 kb). La température de recuit (Tm) est déterminée par la séquence des amorces. Quand une couche d’apprêt est supérieur ou égal à 20 nt, le Tm est calculé comme :
   Tm (° C) = (4 X nombre de CG) + (2 × nombre d’AT) -4.

< ligne td span = « 3 » > 30 cycles

étape	température	temps	cycle d’enseignement
La dénaturation initiale	95 ° C	3 mn	1 cycle
Amplification dénaturation, recuit et extension	95ºC	45sec
	54-58 ° C	45 s
	72 ° C	45 sec-3,5 min
72 ° C	Extension finale	7 min	1 cycle
Stockage	4 ° C	tenir

tableau 3 : programme de PCR recommandé.

9. précipitations de produit PCR avec l’éthanol (EtOH) et Sodium acétate (NaOAC) (voir tableau 4).
   Remarque : Si le volume de réaction PCR est inférieure à 50 µL, compléter à 50 µL avec FD ₂ O.
   1. Pour précipiter l’ADN, de mélanger les composants provenant d’échantillons tableau 4 et magasin O/N à-20 ° C ou pendant 30 min à °C.Centrifuge-80 de la plaque à 96 puits pendant 45-60 min à 2 250 x g à 4 pipette collecteur c. utiliser un 8 voies de ° carefully enlever le surnageant. Laver une fois à 160 µL de froid 70 % EtOH (RNase-libre) pendant 30 min à 2 250 x g à 4 ° C.
      Remarque : L’ADN précipité peut être vu au fond du puits. Amplicons plus courtes nécessitent plues centrifugations.
   2. Inverser doucement la plaque 96 puits sur du papier absorbant pour enlever les dernières gouttes de liquide dans chaque puits (autant que possible). Sécher à l’air granule d’ADN pendant 1 h à température ambiante (RT). Remettre en suspension l’ADN précipité dans 25 µL RNase free eau.
      NOTE : Le séchage à l’air 1 h permettra toute trace d’EtOH à s’évaporer. Un très petit volume de liquide (environ 1 µL) devrait toutefois demeurer dans chaque puits pour empêcher le granule d’ADN de sécher complètement. Utiliser 25 µL d’une réaction de PCR 50 µL. Ne pas utiliser l’eau traitée par DEPC à ce stade pour éviter toute interférence avec in vitro la transcription dans les étapes suivantes.

,

composant	Volume	partie
PCR	50 μl
100 % éthanol	125 μl	2,5 X vol. de PCR
3 M NaOAc (pH = 5,2, RNase librement)	5 μl	10 % de vol. de PCR
Total	180 μl

tableau 4 : exemple d’une réaction de PCR 50 µL.

10. Vérifier la taille et le rendement des produits PCR en exécutant 5 µL de la solution d’ADN remises en suspension sur un gel d’agarose de 1 % dans un tampon TAE X 1.
    Remarque : Un total de 250 à 500 ng de la matrice d’ADN est nécessaire pour la réaction 15 µL in vitro de transcription. Échantillons avec des rendements supérieurs peuvent être plus dilués. Le rendement de RNA dépend également de la séquence et la longueur de la matrice d’ADN. Selon le guide général DIG-RNA marquage avec l’ARN polymérase T7, environ 10 µg d’ARN creuser-étiquetée est produite à partir de 1 µg de modèle linéarisé.

2. In vitro de transcription pour générer des sondes antisens.

Remarque : il est essentiel de travailler dans un environnement exempt de RNase. Tous les réactifs et lab-ware doivent être RNase librement (par exemple, certifié ware de plastique gratuit DNase/RNase).

composant	concentration Stock	Volume	Concentration finale
ATP	mM 100	μl 7	mM 10
CTP	mM 100	μl 7	10 mM
GTP	100 mM	7 & # 956 ; l	10 mM
UTP	100 mM	4,5 μl	6,5 mM
Dig-11-UTP	10 mM	25 μl	3,5 mM
l’eau libre de RNase	< /td >	μl 19,5
Total		70 μl

tableau 5 : préparation de Mix DIG-NTP.

< table Border = « 1 » fo:keep-together.within-page = « 1 » fo:keep-avec-next.within-page = « always » > composant μl 15 réaction 96 bien mélanger
(réaction de 112 x) Finale conc. Tampon de Transcription X 5 μl 3,00 3,00 μl 1 x Dig-NTP mix (10 mM) μl 0.75 0.75 μl 0,5 mM inhibiteur de RNase 0,25 μl 0,25 μl 0,67 U / µl De l’ARN polymérase (T7 ou T3 ou SP6) μl 2.00 2.00 μl 2,67 U / µl L’eau libre de RNase μl 1,50 1,50 μl Total μl 7.50 7.50 μl

tableau 6:2 X transcription Master Mix.

1. Prepare le DIG-NTP mélange selon le tableau 5.
   Remarque : Pour éviter les erreurs, toujours aligner la plaque telle que A1 est dans le coin supérieur gauche de la plaque.
2. Ajouter composants décrits dans le tableau 6 dans chaque puits en une nouvelle plaque PCR 96 puits (plaque de sonde). Ajouter 7,5 µL du produit PCR (matrice d’ADN) à chacun correspond bien, à l’aide d’une pipette multicanaux. Couvrir la plaque avec du ruban d’étanchéité.
   Remarque : La quantité optimale de produit PCR ajoutée par réaction de transcription doit être entre 0,5 et 1 µg. Si les bandes sur le gel sont sensiblement plus faibles ou plus intense, le volume de l’ADN a ajouté à la réaction peut être ajusté en conséquence. Le montant exact n’est pas critique.
3. Incuber la plaque de sonde à 37 ° C pendant 3,5 à 4 h. Mix 15 µL de sonde synthétisée avec 35 µL de DEPC traités ddH ₂ O, 125 µL de 100 % EtOH et 5 µL de 3 M AcONa (pH = 5,2, RNase librement). Conserver à-80 ° C pendant au moins 30 min. centrifugeuse et laver comme indiqué aux paragraphes 1.10.2 et 1.10.3.
4. Remettre la sonde précipitée dans 25 µL de DEPC traités ddH ₂ O. exécuter 5 µL sur un gel d’agarose à 1 % (temps de marche < 20 min) pour vérifier l’intégrité et le rendement de la sonde ( Figure 2).
   Remarque : Le gel d’agarose doit être effectué à traitée par DEPC ddH ₂ O et tampon TAE. Appareil d’électrophorèse de gel doit être attribuée à la RNA travailler seuls. Gel de plus longue durée de fonctionnement à basse vitesse peut conduire à la dégradation de l’ARN au cours de l’électrophorèse.
5. Mélanger le restant de 20 µL de la sonde synthétisée avec 100 µL de solution de l’hybridation (tableau 7) et les conserver à-80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
   Remarque : La concentration de la sonde peut être diluée plus si les bandes sont particulièrement robuste (voir la Figure 2 par exemple). Solution d’hybridation est très efficace pour prévenir la contamination de RNase. Ajouter immédiatement la solution d’hybridation de la sonde remises en suspension afin d’éviter la dégradation de l’ARN. Solution d’hybridation doit être filtré par un filtre de 0,2 µm. Pour des échantillons de tissus, augmenter la concentration du détergent dans la solution d’hybridation en ajoutant Triton-X-100 à une concentration finale de 0,3 %.

composant	Volume	concentration finale
DEPC traités ddH2O	ml 11,85	23,7 %
20 X SSC	12,5 ml	25 % (5 X)
Formamide	25 ml	50 %
D’héparine (50 mg/ml)	0,1 ml	0. 2 % (0,1 mg/ml)
ADN bicaténaire seul saumon sperme	0,5 ml	1,0 %
Tween-20	ml 0,05	0,1 %
Total	50,00 ml	100 %

< classe p = jove_conten «t » fo:keep-together.within-page = « 1 » > tableau 7 : solution d’hybridation.

3. collection de tissus d’élevage et embryon, larve et adulte drosophila.

Remarque : fois à petite échelle (bouteilles) et masse (boîtes) voler élevage, utilisent des protocoles de laboratoire volant standard sur la nourriture de base de semoule de maïs à 25 ° C. garder adultes et larvaires densité appropriée et fournir poudre de levure active supplémentaire sur les denrées alimentaires surfaces.

1. Collecte des embryons suite de protocoles standard. Les principales étapes de la collecte des embryons sont illustrées à la Figure 3.
   Remarque : Après avoir rincé les embryons de devitillinized dans le méthanol, les embryons fixes peuvent être stockés à-20 ° C jusqu'à un an. Perméabilisation de l’embryon et après fixation sont effectuées le jour 1 du protocole poisson.
2. Solution-mère préparer frais 40 % PFA. Solution mère
   1. Prepare un fraîchement préparé de 40 % de paraformaldéhyde (PFA) en mélangeant 10 mL de DEPC traités ddH ₂ O à 3,68 g de PFA et 70 µL de 2N KOH dans un flacon de scintillation de verre de 20 mL contenant une barre de remuer petit
      ATTENTION : PFA est hautement toxique ayant des effets potentiels de santé aigus et chroniques. Lire MSDS (Material Safety Data Sheets) et les utiliser avec une protection appropriée pour les yeux, la peau et des voies respiratoires.
   2. Sous une hotte, faire chauffer et remuer le flacon pendant 3-5 min sur une plaque chauffante à 200 ° C jusqu'à ce que la PFA est entièrement dissous. Retirer la solution mère de PFA du feu dès que la PFA est dissous (ne pas trop chauffer).
   3. Refroidir la solution mère dissoute 40 % PFA sur la glace pendant 5 min, puis filtrer avec une seringue de 10 mL et de filtre de 0,2 µm.
3. Troisième stade larvaire (L3) ou la fixation de tissu adulte, la trempe et la perméabilisation
   Remarque : ce protocole devrait être achevée en une seule journée. Il comprend le tissu dissection, fixation, trempe d’endogène HRP, perméabilisation et après fixation. Solutions de fixation
   1. Prepare (Difficulté-I et II-Fix) selon le tableau 8.
      Remarque : l’acide picrique est utilisé comme un fixatif supplémentaire lorsque le tissu a une structure délicate qui doit être préservée. Il n’est pas un bon fixateur lorsque l’ultrastructure tissu doit être préservé pour la microscopie électronique (EM).
      ATTENTION : l’acide picrique est instable et a la capacité de réagir avec d’autres matériaux et créer des composés explosifs. Utiliser et stocker selon les consignes de sécurité.
   2. Place des larves ou des mouches adultes dans un tube en plastique de 50 mL contenant 10 mL de froid 1 X PBS et 100 µL de solution-j’ai solution. Refroidissement éolien sur glace pendant 2 min afin de réduire la motilité mouche adulte ou larvaire.
   3. Couper l’extrémité d’une pointe en plastique de 1 mL pour créer une ouverture de 2 à 3 mm. 10-30 larves de transfert ou adulte vole avec la pointe de 1 mL dans une boîte de Pétri (9 cm de diamètre) avec une mince couche de solution 1 PBS X du tube de 50 mL (étape 3.3.2). Ajouter un peu de PBTT peut diminuer la tension superficielle. Décortiquer soigneusement larvaire (ouvert d’antérieure et presser les tissus de postérieur à antérieur) ou de tissus adultes d’intérêt avec une paire de pinces pointus sous une dissection étendue.
      NOTE : Environ 200-300 larves ou adultes testicules peuvent être disséqués et fixés en une seule journée par des personnes expérimentées.
   4. Transfert disséqué les tissus avec une pipette µL 200 (avec le bout coupé pour créer une ouverture de 2 mm de diamètre) dans un tube de 1,5 mL et le magasin sur la glace. Terminer chaque tour de dissection dans 10-15 min avant de passer à l’étape suivante.
      NOTE : Continuer avec des tours supplémentaires (dans une fenêtre de temps de 2 h) tel que requis pour générer suffisamment de matière.
   5. Tissus de fix avec 800 µL de solution-j’ai la solution pendant 30 min sur une table de mixage haut de banc. Limiter les tissus rincez une fois avec 800 µL 1 X PBTT et garder les tubes sur la glace pour un maximum de 2,5 h. en raison des 30 minutes, doit être effectuée batch-wise jusqu'à ce que le tissu suffisant ont été recueilli.
   6. Centraliser tous les tissus disséqués et fixes dans un tube de plastique unique 15 mL contenant de maille dans le couvercle (voir la Figure 4 pour la conception du tube). Aspirer l’excès de liquide à travers les mailles du couvercle du tube. Laver 3 X 5 min chacun avec 10 mL de 1 X PBTT. Rincer deux fois avec 10 mL de solution de 1 PBS X pour enlever le détergent. Cela empêche les bulles d’excès dans la prochaine étape.
      Remarque : Si les tissus disséqués coulent au fond du tube, étapes peuvent être réalisées dans les microplaques ordinaire ou de 0,5 à 1,5 tubes de microcentrifuge de mL (volume µL 300-800 par tube).
   7. Étancher activité endogène de HRP avec 5 mL de 0,3 % H ₂ O ₂ dans du PBS pendant 15 min à RT. répéter une fois de plus. Laisser le couvercle ouvert pendant cette étape sans mélange. Rincer deux fois à l’aide de 10 mL de 1 X PBTT. Laver deux fois pendant 5 min avec 10 mL de 1 X PBTT.
   8. Permeabilize tissus avec 10 mL d’acétone 80 % (-20 ° C, préalablement réfrigérées) à-20 ° C pendant 10 min. inverser le tube deux fois au cours de la période d’incubation. Laver deux fois pendant 10 min avec 10 mL de 1 X PBTT pour réhydrater les tissus.
   9. Rincer avec 10 mL d’un mélange d’hybridation PBTT et 5 ml de 5 ml de solution (1:1). jeter mix et le remplacer avec 10 ml de solution d’hybridation. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Pour de meilleurs résultats, ne pas stocker les échantillons pendant plus d’une semaine.

de de

composant	Difficulté j’ai (10 ml)	Difficulté II (10 ml)
Stock PFA 40 %	1 ml	1 ml
PBTT	8,99 ml	9 ml
solution d’acide picrique	10 μl	–

< classe p = jove_conte « NT » fo:keep-together.within-page = « 1 » > tableau 8 : Solutions de fixation pour tissus.

4. hybridation in situ

Remarque : cette partie du protocole exige un minimum de 2 jours, avec préparation de l’échantillon, avant l’hybridation et l’hybridation prenant placent sur le jour 1 et sonde de détection sur jour 2. Si le nombre d’échantillons est relativement élevé, si peu familier avec le protocole, ou une journée entière n’est pas possible, le protocole doit être effectué dans 3 jours avec les étapes de la sonde de détection et signal amplification divisé en 2 jours. Un grand nombre d’embryons ou d’échantillons de tissus disséqués peut également exiger des jours supplémentaires pour traiter. Pour les échantillons de tissus disséqués, remplacer 1 X PBT avec 1 X PBTT dans toutes les étapes, sauf indication contraire. Le détergent supplémentaire est requis pour une pénétration de nombreux tissus larvaires et adultes, comme le cerveau et les testicules. Bien que non testés, 1 X PBTT peut également être utilisé pour les embryons. Utilisez 100 µL / puits pour plaques 96 puits et 800 µL pour tubes de 1,5 mL.

1. Pré-hybridation et hybridation
   Remarque : mesures 4.1.1-4.1.6.2 sont pour l’hybridation, embryon in situ. Pour tissus larvaires ou adultes en situ hybridations, ignorez ces étapes.
   1. Enlever 2 mL d’embryons fixes (stocké dans le méthanol à-20 ° C) dans un nouveau tube de 15 mL. Laver les embryons deux fois à 7 min avec 10 mL de méthanol à chaque lavage. WaSH embryons pendant 7 min avec 10 mL d’un mélange de méthanol et 1 X PBTT (1:1). Lavez les embryons deux fois à 7 min avec 10 mL de 1 X PBTT à réhydrater.
   2. Pour la perméabilisation de l’embryon, préparer une solution intermédiaire protéinase K (40 µL/mL) en diluant 1/500 de la solution mère (20 mg/mL). Conserver à -20 ° C. faire une solution de protéinase K travail en diluant la solution intermédiaire protéinase K 1/15 à 1 X PBTT pour une concentration finale de travail de 2.667 ug/mL.
   3. Permeabilize embryons avec 10 mL de solution de protéinase K (utilisation de moins pour les plus petits nombres d’embryons) de travail. Incuber le tube à ta pendant 13 min. retourner doucement le tube 4 fois au cours de l’incubation. Incuber les échantillons en solution de protéinase K sur la glace pendant 1 h sans mélange.
      NOTE : Cette incubation relativement longue avec diluée de protéinase K assure la perméabilisation de façon reproductible uniforme et coloration ultérieure.
   4. Alors que les embryons permeabilize, faites un 2 mg/mL solution de glycine du stock de X 10 (20 mg/mL) à 1 X PBTT pour un volume total de 30 mL.
   5. Supprimer protéinase K solution, rincer avec 10 mL de solution de glycine (2 mg/mL) et laver deux fois pendant 2 min chacun. Rincer trois fois avec 10 mL de 1 X PBTT pour enlever le glycine.
   6. Après fixation des embryons.
      1. Préparer 10 mL de 4 % PFA (1 mL de 40 % PFA dans 9 mL de PBTT, filtrée par le filtre de 0,45 µm).
      2. Incuber les échantillons à 4 % PFA pendant 20 min. Laver 3 X 2 mn chaque avec PBTT.
      3. Pour préparer la solution d’hybridation dénaturé, faire bouillir la solution d’hybridation pendant 5 min. Pour une plaque à 96 puits complet, utilisez trois tubes de 12 mL. Cool sur glace immédiatement pendant 5 min.
      Des embryons de
      4. rinçage une fois avec 10 mL de 1 X PBTT : solution d’hybridation (1:1). Rincer deux fois avec 5 mL de solution d’hybridation. Aliquote ~ 20 µL / puits de réglé les embryons (30-40 embryons) ou tissu fixé sur une plaque à 96 puits PCR sur la glace. Supprimer la solution d’hybridation des tissus ou des embryons à l’aide d’une pipette à 8 canaux multiple ( Figure 1 / vidéo).
         Remarque : La pipette collecteur a une ‘ arrêter ’ qui empêche les conseils d’aller au fond des puits et enlever l’échantillon. Pour les expériences utilisant des tissus qui flottent, évacuer le liquide soigneusement avec une pipette 100 µL de haut.
   7. Ajouter 100 µL de solution d’hybridation dénaturé dans chaque puits. Hybrider les embryons pour un minimum de 2,5 à 3 h à 56 ° C à l’aide d’un appareil de chauffage bain sec contenant des perles en métal (voir matériaux et Figure 1).
   Sonde
   8. dénaturer 100 µL de la préparé dans une plaque à 96 puits PCR utilisant un thermocycleur pendant 5 min à 80 ° C. immédiatement refroidir sur glace pendant 5 min. Solution d’hybridation pre prélever sur embryons ou tissus. Ajouter dénaturés sondes de gène-spécifique à chaque échantillon, couvrent avec du ruban d’étanchéité et s’hybrident à 56 ° C pendant 16-18 h O/N, en vertu de la perle de bain sec unité de chauffage

5. Sonde de détection

1. préchauffer les solutions dans le tableau 9 de l’unité de chauffage de 56 ° C. Retirer les sondes de la plaque.
   Remarque : Les sondes peuvent être réutilisés entre 2 - 3 fois si stocké à-80 ° C (jamais magasin toute RNA échantillons à-20 ° C). Après hybridation, l’ARN double brin est plus stable que l’ARN simple brin et est moins sensible à la dégradation causée par la contamination de la RNase.
   Si vous utilisez un un système de filtration sous vide plaque multipuits pour tissus, une plaque de collection doit être insérée sous la plaque de filtre pour recueillir les sondes (voir la vidéo pour plus de détails de montage). Hybridée tissus devront être transférées de la plaque ordinaire Microplaque 96 puits utilisée pour l’hybridation à un cas de 1,2 µm pore taille PVDF la membrane sur le fond de chaque puits.

de < t r >

étape	préchauffée solution (56 ° C)	temps	Volume / puits
1	Solution d’hybridation : PBTT (3:1)	15 min	100 μl
2	Hybridation Solution : PBTT (3:1)	15 min	100 μl
15 min	100 μl	l’Hybridation Solution : PBTT (1:1)	3
4	Solution d’hybridation : PBTT (1:3)	15 min	100 μl
5	PBTT 3 lave	5 min	100 μl

tableau 9 : sondes de lavage après hybridation.

2. si vous utilisez des plaques normales, des échantillons de lavage selon tableau 9 dans un appareil de chauffage à 56 ° C. Si, en utilisant le système collecteur d’aspiration, utiliser les solutions chauffées avec système de vide sur le banc et supprimer des solutions immédiatement au-dessous de vaccuum. Après le 3ème lavage avec 1 X PBTT, la plaque normale peut être retirée de la chauffage unité
3. Préparation des anticorps.
   1. Préparer 11 mL de solution d’anticorps primaire (2,5 µg/mL) du stock (1 mg/mL) en diluant les anticorps d’anti-DIG monoclonal de souris de conjugué Biotine (voir la liste de matériel) en PBTTB (1 : 400). Si le traitement moins d’échantillons, ajuster les volumes en conséquence.
   2. Préparer 11 mL de la solution (1 µg/mL) de streptavidine-HRP du stock (1 mg/mL) en diluant 1/1000 streptavidine-HRP conjugué (voir la liste de matériel) en PBTTB. Si vous utilisez moins d’échantillons, ajuster les volumes en conséquence.
4. Bloquer des embryons ou des tissus avec PBTTB (lait écrémé 1 % dans 1 X PBTT) pendant 20 min sur une table de mixage haut de banc à température ambiante.
   Remarque : Filtre PBTTB à l’aide de papier filtre (3e année, 6 µm) avant de l’utiliser sur des plaques de 96 puits filtre pour éviter le colmatage des filtres. Au lieu de PBTB, PBTTB (PBTB supplémentaires 0,3 % Triton-X-100) est utilisé pour tous les tissus au cours du protocole.
5. Incuber des embryons ou des tissus dans la solution d’anticorps (100 µL/puits) pendant 2 h sur paillasse mélangeur. Rincer deux fois à 1 x PBTTB. Laver 3 X pour 5 min et 5 X pour 10 min avec PBTTB. Incuber les embryons ou les tissus avec la solution de streptavidine-HRP (100 µL/puits) pour 1,5 h en utilisant un mélangeur paillasse. Laver 2 X pendant 5 min avec PBTTB. Conserver les échantillons dans l’obscurité de ce point.
   Remarque : au cours de tous les anticorps produits de lavage, si le tissu est perdu en raison de l’opacité produite par le lait, essayez lavage sans le lait (PBTT au lieu de PBTTB).
6. Préparer une solution DAPI en diluant 100 X DAPI en PBTTB (1/100).
Embryons
7. incuber ou tissus avec solution DAPI (100 µL/puits) pendant 15 min sur un paillasse mélangeur. Lavez 4 X pendant 10 min avec PBTT. Stocker la plaque 96 puits avec échantillons O/N à 4 ° C ou de passer à l’étape suivante.
   Remarque : La procédure peut être suspendue ici.

6. Détection des anticorps à l’aide de tyramide (voir Figure 5)

Remarque : maison cyanine 3 conjugué tyramide fut empruntée, qui a été préparé selon le protocole décrit dans ¹² . Si effectuer beaucoup d’expériences ou essais de nombreux échantillons, cela permet d’économiser une somme importante d’argent et est efficace par rapport aux réactifs commerciaux (par expérience). Pour moins d’expériences et des exemples, disponibles dans le commerce de cyanine 3-tyramide peut être utilisé (voir documentation).

1. Échantillon de lavage plaques 3 X pendant 5 min avec 1 X PBTT.
2. Préparer le tampon tyramide activation (activation tampon) contenant 0,006 % H ₂ O ₂ dans PBTT (diluer 30 % (p/p) H ₂ O ₂ stock 1 : 5000).
< lJ’ai > rincer les plaques avec le tampon de l’activation.
3. Solution de 3-tyramide de cyanine Prepare en diluant il dans un tampon d’activation dans un tube de 15 mL.
   1. Pour les embryons, utiliser la dilution 1 : 80 (137 µL de cyanine 3-tyramide en 11 mL de tampon d’activation). Pour les tissus larvaires, utiliser la dilution 1 : 150 (73 µL de cyanine 3-tyramide en 11 mL de tampon d’activation). Pour testicules adultes, utiliser la dilution 1 : 200 (55 µL de cyanine 3-tyramide en 11 mL de tampon d’activation). Ovaires adultes, utiliser la dilution 1 : 300 (36 µL de cyanine 3-tyramide en 11 mL de tampon d’activation).
4. Incuber les échantillons avec la solution 3-tyramide cyanine pendant 2 h sur paillasse mélangeur. Rincez quatre fois avec PBTT. Lavez 6 X pendant 10 min avec PBTT. Laver 3 X pendant 5 min avec du PBS pour enlever le détergent.
5. Ajouter 150 µL/puits de anti-fade supports de montage. Conserver les échantillons O/N à 4 ° C pour permettre des tissus ou des embryons à couler au fond du tube. Monter des échantillons sur lames de microscope (en vertu de la dissection étendue pour les tissus) et recouvrir d’une lamelle couvre-objet. Sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent.
6. Image à l’aide d’un microscope à fluorescence.
   Remarque : analyser un contrôle négatif tout d’abord pour avoir une idée de ‘ non spécifique ’ fond.
   

Representative Results

La figure 6 montre des exemples des résultats obtenus à l’aide de cette procédure. Les top 3 panneaux montrent des exemples de jeunes embryons de drosophile (Figure 6, panneaux A-C), les 3 prochaines panneaux montrent des exemples de la fin des embryons de drosophile avec des signaux dans différents tissus (amnioserosa, muscles et du système nerveux central, respectivement (Figure 6, panneaux D-F). Ensuite sont des exemples de 3e instar des tissus larvaires (Figure 6, panneaux G-J). Panneaux K et L montrent des images représentant des adultes gonades (ovaires et les testicules, respectivement). Des centaines d’images ont été téléchargées et annotés dans notre consultable « fluorescent in situ drosophile database » (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

La figure 1. Contour de Fluorescent in situ hybridation (poisson) protocole clé matériel et. (A) amplification par PCR de l’ADNc. (B) In vitro la transcription pour générer DIG antisens gène-spécifique - étiqueté des sondes d’ARN dans une plaque à 96 puits (photo de la plaque figure b). (C) et (D) : adultes (femelles : ratio mâles 2:1. 300-400 mouches/bottle) mouches sont autorisés à s’accoupler pendant 3-4 jours. Embryons provenant d’une collection au jour le jour sur la nourriture de la semoule de maïs standard à 25 ° C sont transférés dans une boîte en plastique bien ventilée (1 L de nourriture de la semoule de maïs dans un récipient de taille : 8 "X 8" X 3" LWH) ou de nouvelles bouteilles en gardant une bonne densité larvaire. Pour la collection de tissus, poudre de levure active devrait être saupoudré sur le dessus de la nourriture à 24, 48 h après la ponte (AEL). (E à H) : Expériences d’hybridation fluorescente in situ effectuées sur 3 jours consécutifs. Pour les tissus qui ne pas flotter ou embryons, utilisez une plaque à 96 puits PCR comme sur la photo b avec dispositif d’aspiration 8 canaux (photo c). Pour les tissus qui flottent, comme la plupart des tissus larvaires, utilisez une plaque de fond de filtre (photo d) et évacuer le liquide de fond avec un aspirateur collecteur à l’aide de basse pression (photographie en e). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Calcul du rendement de sonde de RNA. Nouvellement synthétisé sondes antisens RNA observées sur un gel d’agarose de 1 % (5 µL/lane). Le rendement peut être catégorisé (basé sur l’intensité de la bande) comme « faible rendement » dans les couloirs 3 et 10, « rendement typique » dans les couloirs 1, 4, 5, 6 et 8 ou « high yield » dans les couloirs, 2, 7, 9, 11 et 12. Pour les échantillons avec des « rendements typiques », utiliser 10-15 µL de sonde dilué dans 100 µL de solution d’hybridation pour chaque expérience in situ . Diluer les échantillons avec « des rendements élevés » de sonde avec la solution d’hybridation supplémentaires selon l’intensité de la bande par rapport à une intensité de « sonde typique ». But est d’avoir des concentrations plus ou moins égale de la sonde dans chaque puits. La flèche pointe vers un des « sondes d’ARN », la bande supérieure sur chaque voie est la matrice d’ADN initiale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Principales étapes pour la collecte des embryons à grande échelle et fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Maison tube pour enlever le liquide des tissus larvaires ou flottantes. Certains tissus larvaires et adultes flottent dans la solution pendant la fixation. Cet outil simple se compose d’une maille en nylon qui s’est tenue par un 200 µL, couper la pointe, suivie d’une pointe de 1 mL comme un adaptateur pour raccordement à un aspirateur. Liquide peut être retiré en toute sécurité sans perdre n’importe quel tissu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5. Amplification du Signal de Tyramide. (1) creuser-étiqueté de sonde d’ARN antisens s’hybride avec sens endogène RNA. (2) Immuno-affinité entre anticorps primaire conjugué Biotine et DIG-UTP. (3) HRP conjugué streptavidine biotine de lie. (4) HRP catalyse la réaction de cyanine 3-tyramide et peroxyde d’hydrogène pour former des radicaux éphémère cyanine 3-tyramide. (5) radicaux de cyanine 3-tyramide lient à des résidus de tyrosine des protéines à proximité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 6. Des images représentant in situ hybridation. Chaque panneau présente un exemple d’un ARN différent (montré en Cyan) et noyaux colorés au DAPI (indiqué en rouge). (A-C) Exemples de jeunes embryons de drosophile . (D, F) Exemples d’embryons de drosophile tardive. (G-J) Exemples de 3ème stade larvaire des tissus larvaires de drosophile (tubules malphigian, intestin, glandes salivaires et muscle respectivement). (K) ovaire adulte. (L) testicule adulte. Chaque panneau affiche le nom du gène qui la sonde est hybridant à. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit fournit une méthode hautement reproductible, sensible et économique pour la détection d’ARN la plupart dans des embryons de drosophile fixe ou les tissus. Bien qu’un peu plus compliqué que plus traditionnellement utilisé de méthode de phosphatase alcaline de détection de la sonde, la résolution obtenue par les poissons est beaucoup plus grande et la sensibilité est comparable ou meilleure ^7,8. En utilisant tout ou partie des microplaques, les protocoles peuvent être utilisés pour des analyses à grande échelle ou limités de gènes d’intérêt. Il est à noter que les sondes générées peuvent détecter tous ou plusieurs épissure de transcription fait à moins que les sondes sont conçus plus spécifiquement (c'est-à-dire, seul exons). Bien que nous avons testé aussi petits que 200 nucléotides avec un succès raisonnable des sondes, sondes plus petites ont tendance à être moins efficace et peuvent être moins précis. De toute évidence, ce protocole n’est pas approprié pour la détection de petits introns, exons, ni transformées microARN.

Bien que cette approche utilise une étape enzymatique pour booster la force des signaux, intensité du signal semble être proportionnel à l’expression des gènes cible dans une gamme relativement large et linéaire des niveaux d’expression. Un grossissement plus élevé, le signal est considéré comme punctums ou mouchetures dans les cellules et les tissus. Relativement rares transcriptions seulement quelques examen minuscules sont considérés. Comme transcription abondance augmente, celles-ci croissent en nombre et en taille. Comme avec molécules simples poissons (smFISH), seul petit examen peut également correspondre à RNAs unique et doit également être facilement quantifiée à l’aide de logiciels d’imagerie et d’informatique. Comparaisons d’images publiées obtenues à l’aide de smFISH avec les images que nous avons organisée pour les mêmes objectifs suggèrent que la globalement, la sensibilité et la résolution des deux méthodes sont relativement similaires, même si cela doit être testé par des comparaisons plus rigoureuses. Compte tenu de la dépense beaucoup plus élevée de smFISH, la méthode proposée ici devrait donner des résultats similaires à une fraction du coût. Toutefois, si l’objectif est de détecter les petites transcriptions, ou des parties distinctes de transcriptions, smFISH est recommandé.

En raison de la petite taille de certaines sondes FISH, cette méthode peut également être meilleure en pénétrant les tissus qui sont grandes ou présentent des obstacles importants. Cependant, notre utilisation des niveaux plus élevés de détergent et tissus fixation et perméabilisation des réglages semblent avoir résolu ce problème. Enfin, bien que mis au point pour des tissus de drosophile , les tampons de détergent hautes décrites ici pour tissus disséqués devraient aussi fonctionner pour les tissus ainsi que plupart des autres organismes et des embryons de drosophile .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes	Frogga Bio	TB15-500	Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)	Biomart (Canada)	141106-1K	Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes	Frogga Bio	TB50-500	Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane	EMD MILLIPORE	MSBVS1210	Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl)	Denville	C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u)	PALL	PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u)	PALL	PN4614
Agarose	Bioshop	AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates	UltiDent Scientific	24-P96-450V-C	To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals	UltiDent Scientific	24-PCR-AS-200	To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)	UltiDent Scientific	24-T205-WB-C	To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin	Jackson ImmunoResearch Lab	200062156	Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable)	BrandTech Scientific Inc.	704526	To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol	Sigma-aldrich	C1919	Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)	Home made		Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)	Sigma-aldrich	D2522	Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate	Roche	11-209-256-910
Embryo collection cage	Home made	N/A	Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804	Eppendorf	Model 5804	Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide	Bioshop	FOR001.500
Glycerol	Bioshop	GLY002.4
Glycine	Bioshop	GLN001.500
Heparin	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads	DiaMed	LAA42370-001	Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer	Fisher Scientific	50-998-347	Sample mixing
Mesh - 100 micons	FlyStuff	57-103	For collecting embryos
Mesh - 800 microns	SEFAR - Nytex	06-780/53	For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses	VWR	48366-067	Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd	VWR	48312-003	Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold	Pall Corporation	P/N 5017	Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA)	Bioshop	PAR070.500	Fixation
PCR machine	Bio-Rad	Model: DNA Engine PTC-200	96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution	Sigma-aldrich	80456	For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL)	Bioshop	POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case	UltiDent Scientific	24-P-LID-PP	Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)	UltiDent Scientific	825-1-50-5S	Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil	UltiDent Scientific	87-CFILM-AL	Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K	Sigma-aldrich	P2308- 5MG	Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set	Roche	11277057001	RNA probe sythesis
RNase free water	GIBCO	10977015-500ml	RNA probe sythesis
RNaseZap	Ambion	AM9780	Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma-aldrich	D9156	For hybridization solution
Skim milk (non fat power)	Bioshop	SKI400.500	Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)	Bioshop	SAA333	Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0131	20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath	VWR	13259-274.	To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source	Leica	Model: MZ6	Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate	Molecular Probes	S911	Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0101	20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0111	20 Unit/ul
Tip station (10 ul)	Axygen	T-300-STK-S	Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul)	Sorbio	27770T	Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml)	Sorbio	10200	Certified DNase and RNase free
TRITON X-100	Bioshop	TRX506	Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20	Bioshop	TWN510	Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3	Sigma-aldrich	WHA1003917
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions			Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media			DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L)			1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L)			1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L)			1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L)			1 % Skim milk in 1 X PBTT