Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

doi: 10.3791/56281 Published: October 19, 2017

Summary

الجيش الملكي النيبالي هو موضح في الموقع البروتوكول التهجين يسمح الكشف عن الحمض النووي الريبي في أسرة المورفولوجية أجنة أو أنسجة تشريح. استخدام لوحات microtiter 96-جيدا وتضخيم إشارة تيراميدي، يمكن اكتشاف النصوص في عالية الدقة والحساسية، والإنتاجية، وتكلفة منخفضة نسبيا.

Abstract

في جهودنا الرامية إلى تحديد أنماط التعبير والتعريب سوبسيلولار من المورفولوجية الكشف على نطاق الجينوم، وفي مجموعة متنوعة من الأنسجة، قمنا بتطوير العديد من التعديلات والتحسينات على موقعنا الأصلي فلوري في الموقع البروتوكول التهجين (الأسماك). لتسهيل الإنتاجية وفعالية التكاليف، جميع الخطوات، من جيل التحقيق للكشف عن إشارة، يتم تنفيذها باستخدام لوحات microtiter 96-جيدا إكسون. ديجوكسيجينين (حفر)-تحقيقات المسمى antisense الحمض النووي الريبي يتم إنتاجها باستخدام الحيوانات المستنسخة كدنا أو الحمض النووي كقوالب. بعد تثبيت الأنسجة وبيرميبيليزيشن، هي تهجين المسابير للمحاضر الحرفية للفائدة وتم الكشف عنها باستخدام سلسلة الأجسام المضادة حفر مترافق ثم إلى البيوتين، streptavidin مترافق بالفجل البيروكسيديز (HRP) وفلوريسسينتلي مترافق تيراميدي، التي تنتج متوسط شدة رد الفعل الذي يربط بين المناطق الكثيفة إلكترون من البروتينات متاخم حضور برنامج الصحة الإنجابية،. تنتج هذه الخطوات التضخيم والتعريب إشارة قوية وعالية مترجمة يسهل الترجمة نسخة الخلوية وسوبسيلولار على حد سواء. لقد تم تحسين البروتوكولات المقدمة لإنتاج إشارات محددة للغاية في مجموعة متنوعة من الأنسجة ومراحل النمو. كما تتوفر المراجع للتغيرات الإضافية التي تسمح للكشف عن العديد من النصوص، أو النصوص والبروتينات، متزامنة في نفس الوقت.

Introduction

أساليب الكشف عن الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم جديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي توسعت إلى حد كبير معرفتنا متى وأين يتم التعبير عن الجينات، وإزاء ما مستويات1. ومع ذلك، توفر هذه القرار الزماني والمكاني فقيرة نسبيا. الجيش الملكي النيبالي في التهجين الموقع يسمح التوزيع المكاني للنصوص التي سيحتفل بها بصريا في الأنسجة الثابتة، مما يكشف عن تفاصيل التعريب الخلوية وسوبسيلولار2. يسمح القرار المكانية أكثر كما أنه يسمح باستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية، مثل ورقة [كنفوكل] والخفيفة الميكروسكوب3باستخدام التهجين في الموقع نيون (الأسماك). يمكن أيضا استخدام علامات مضيئة مثل DAPI إقامة علاقات سوبسيلولار4. الأسماك يسهل أيضا الملاحظة للكشف والبروتينات متعددة في وقت واحد مع مؤشرات واضحة للتداخل على مستوى سوبسيلولار. ويمكن الاطلاع على الكواشف فريدة من نوعها والخطوات اللازمة لوضع العلامات المزدوجة في المراجع التالية3،5.

تعمل الإجراءات الموضحة هنا تستخدم لوحات microtiter 96-جيدا لجميع الخطوات، بما في ذلك إنتاج قالب كدنا (مستعمرة PCR)، إنتاج مسبار الحمض النووي الريبي (باستخدام النسخ بوليميريز-تعتمد على الجريان السطحي T7, T3 أو SP6)، التهجين في الموقع ، و وضع إشارة الفلورسنت. يتم إضافة عدد كاف من أجنة أو أنسجة لكل جيدا لصفيحة 96-جيدا للسماح بتقييم الاتساق وتقلبه. ويتلقى كل جيدا ثم تحقيق مختلفة. بعد وضع إشارة، هي صفت أجنة أو أنسجة من كل بئر على شرائح المجهر الفردية للتحليل المجهري.

استخدام التضخيم إشارة تيراميدي (TSA) لكشف المسبار تنتج إشارات قوية مع قرار استثنائي سوبسيلولار 5،6،،من78. تعريب سوبسيلولار للكشف هو إليه تنظيمية هامة 9 التي يبدو أن يحدث مع تقريبا جميع الكشف 4،،من1011. وأظهرت هذه التحليلات أيضا أن العديد من النصوص التي لم يتم الكشف عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي هي سهولة الكشف عن الأسماك 8. تكييف الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين إلى لوحات 96-جيدا يسمح تحليل الجينات تصل إلى 96 من الفائدة في كل مرة (وتستخدم لوحات أكثر إذا إضافية)، مما يجعل من الممكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة. قطع اللوحات إلى مقاطع أصغر، تتكيف الأسلوب أيضا بسهولة عينات قليلة فقط. وينص البروتوكول المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي لتوزيع في معظم أنواع الأنسجة. على الرغم من أن لا يظهر، أنها قابلة للتكيف لغير-المورفولوجية الأنسجة، وكذلك.

Protocol

1. [بكر] تضخيم قوالب كدنا من البلازميدات

ملاحظة: استخدام بلازميد عالية الجودة أو قوالب المولدة بواسطة PCR الحمض النووي للحمض النووي الريبي التحقيق التوليف. مكتبات مجموعة الجينات (DGC) المورفولوجية المتولدة عن مشروع الجينوم البشري بيركلي المورفولوجية يوفر تغطية لمعظم الجينات الترميز الموجودة في الجينوم المورفولوجية (انظر الجدول 1 (أ)). كما تسمح هذه استخدام كبسولة تفجير عالمي للتضخيم من أي إدراج كدنا. وتجري هذه إيضاحات مسهبة بكر على بلازميد المعينة الموجودة في ليساتيس الثقافات البكتيرية المحتوية على بلازميد. ثم يتم استخدام منتجات الحمض النووي كقوالب للنسخ في المختبر لتوليد العقاقير تحقيقات الجيش الملكي النيبالي (انظر الجدول 1 باء)-

  1. تصميم كبسولة تفجير لتضخيم منطقة إكسون محددة من جينات اهتمام ببكر (على سبيل المثال. من الحمض النووي)، يفضل أن يكون ذلك مع موقع الاعتراف بوليميريز T7 في نهاية العقاقير.
  2. للتجارب مع العينات أقل من 96، قطع الأجزاء غير المرغوب فيها من لوحات 96-جيدا. تغطي لوحات مع ختم الشريط (انظر المواد) لجميع إينكوبيشنز والتخزين. إذا كان يتم استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي، ضبط حجم وفقا لذلك.
    ملاحظة: 96-جيدا لوحات تسمح باستخدام الممصات متعددة القنوات لزيادة الإنتاجية، فضلا عن أحجام أصغر للتوفير في التكاليف-
الجدول 1a

ناقل
المضادات الحيوية
العمل تركيز 1: 1000

كبسولة تفجير
رنا بوليميراز
عن
أنتيسينسي
رنا بوليميراز.
ل
الشعور
فلك--أنا أمبير pBst_SK (-) _F/R T3 T7
pBSt(-) T7 T3 أمبير pBSt_SK(-)
pOT2 الكلور pOT2_F/R SP6 T7
pOTB7 الكلور pOT2_F/R T7 SP6
الجدول 1 باء
التمهيدي التسلسل
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
_Forward pBst_SK (-) 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
_Reverse pBst_SK (-) 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

الجدول 1: A) إدراج DGC العامة استنساخ المعلومات لتضخيم كدنا في والبلازميدات. ب) متواليات من "الإشعال العالمي" ل DGC والبلازميدات.

    الثقافة
  1. تنمو 250 ميليلتر المحتوية على بلازميد البكتيرية في لوحات الثقافة 96-جيدا بإضافة 240 ميليلتر لوسائل الإعلام رطل كل جيدا مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة (تخفيف 1: 1000 من 1000 X مخزون المضادات الحيوية)، و 10 ميليلتر من الأصل المحتوية على بلازميد البكتيريا (من مخزون والغليسيرول). الختم بختم الشريط.
  2. إينكوباتي بالهز 215 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O/N)-
    ملاحظة: إجراء نسخة جديدة من والغليسيرول البكتيرية كدنا بلازميد استنساخ الأوراق المالية ليحل محل النص الأصلي. عدم إعادة تجميد الأسهم البكتيرية الأصلية، كهذا قد يقتل البكتريا.
  3. لإنتاج قوالب بكر، تمييع 10 ميليلتر O/N ثقافة البكتيرية في 90 ميليلتر ddH يعقم 2 س في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة. تؤذي الحمض النووي لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية في ثيرموسيكلير. فورا بوضع اللوحة على الجليد لمالا يقل عن 5 دقيقة
  4. "بكر إعداد" ردود الفعل باستخدام كبسولة تفجير العالمية المناسبة وفقا للجدول 2-
< /tr >
الكواشف 50 ميكروليتر عينة رد فعل 96 مزيج جيد
(112 x رد فعل)
التركيز النهائي
1 X 2 X PCR بوليميريز ميكس 25 ميكروليتر ميكروليتر 2800
Primer_For (25 pmol/ميكروليتر) ميكروليتر 0.5 5 6 ميكروليتر 0.25 pmol/ميكروليتر
Primer_Rev (25 pmol/ميكروليتر) ميكروليتر 0.5 ميكروليتر 56 0.25 pmol/ميكروليتر
ddH2O ميكروليتر 22 ميكروليتر 2464
إجمالي 48 ميكروليتر ميكروليتر 5376

الجدول 2: ميكس ماجستير PCR.

  1. ماصة، الكوة ميليلتر 48 من مزيج PCR الرئيسي في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة باستخدام. إضافة 2 ميليلتر لكل قالب الحمض النووي بلازميد التشويه والتحريف كل بئر-
    ملاحظة: استخدم بين حلول 1 (س) إلى 1 نانوجرام (الحرس الوطني) من بلازميد الحمض النووي. قالب الحمض النووي المفرط يقلل PCR الغلة وخصوصية.
  2. برنامج الجهاز بكر 96-جيدا وفقا للجدول 3 وتؤدي التضخيم.
    ملاحظة: يتم تحديد الوقت التمديد في 72 درجة مئوية بحجم المنتج بكر (45 s ل ≤ 2.0 كيلو بايت, 1.5 دقيقة ل ≤ 3.0 كيلو بايت، 3 دقيقة ل ≤ كيلوبايت 4.0 و 3.5 دقيقة ل 4.0 5.0 كيلو بايت). درجة حرارة انلينغ (Tm) يتحدد بتسلسل الإشعال. عندما تمهيدي تساوي أو تزيد عن 20 nt، يحسب Tm ك:
    Tm (درجة مئوية) = (4 X عدد CG) + (2 X عدد AT)-4-
< الصف td تمتد = "3" > دورات 30
الخطوة درجة الحرارة وقت Cycle(s)
تمسخ الأولى 95 ° ج 3 دقيقة 1 دورة
التضخيم
تمسخ، الصلب وتمديد
95 ° ج 45 ثانية
ج 54-58 ° 45 ثانية
72 درجة مئوية ثانية 45-3.5 دقيقة
التمديد النهائي 72 درجة مئوية دقيقة 7 1 دورة
تخزين 4 درجات مئوية عقد

الجدول 3: أوصى البرنامج PCR.

    اسيتات
  1. بكر المنتج هطول الأمطار مع الإيثانول (EtOH) والصوديوم (نواك) (انظر الجدول 4).
    ملاحظة: إذا كان حجم تفاعل PCR أقل من 50 ميليلتر، ملء إلى 50 ميليلتر مع ddH 2 o.
    1. أن يعجل بالحمض النووي، وخلط المكونات من الجدول 4 وتخزين العينات س/ن في-20 درجة مئوية، أو لمدة 30 دقيقة في °C.Centrifuge-80 لوحة 96-جيدا لمدة 45-60 دقيقة في 2,250 س ز في 4 ° C. استخدام قناة 8 ماصة متعددة إلى جأريفولي إزالة المادة طافية. أغسل مرة واحدة مع 160 ميليلتر من البرد 70% EtOH (رناسي الحرة) لمدة 30 دقيقة في 2,250 س ز في 4 ° C.
      ملاحظة: يمكن رؤية الحمض النووي سرع في الجزء السفلي من الآبار. تتطلب منتجات PCR أقصر أطول سينتريفوجيشنز.
    2. برفق عكس لوحة 96-جيدا على منشفة ورقية لإزالة آخر قطرات من السائل في كل بئر (قدر الإمكان). الهواء الجاف بيليه الحمض النووي ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT). ريسوسبيند الحمض النووي سرع في 25 ميليلتر رناسي المياه مجاناً-
      ملاحظة: ح 1 الهواء الجاف تسمح كل آثار EtOH تتبخر. ومع ذلك، ينبغي أن تظل كمية صغيرة جداً من السائل (حوالي 1 ميليلتر) في كل بئر لمنع بيليه الحمض النووي من التجفيف تماما. استخدام 25 ميليلتر لفعل PCR 50 ميليلتر. لا تستخدم الماء ديبك تعامل في هذه المرحلة لتجنب التداخل مع النسخ في المختبر في الخطوات التالية-
مكون تخزين جزء
بكر 50 ميكروليتر
100% الإيثانول ميكروليتر 125 المجلد X 2.5 من بكر
3 م نواك (pH = 5.2، رناسي مجاناً) ميكروليتر 5% 10% المجلد بكر
المجموع 180 ميكروليتر

الجدول 4: مثال على رد فعل PCR 50 ميليلتر.

  1. التحقق من الحجم والعائد من منتجات PCR بتشغيل 5 ميليلتر من الحل الحمض النووي ريسوسبينديد 1% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت "تاي س" 1-
    ملاحظة: مطلوب إجمالي 250-500 نانوغرام من قالب الحمض النووي 15 ميليلتر في المختبر رد فعل النسخ. يمكن أن تضعف العينات بمردود أعلى كذلك. العائد الحمض النووي الريبي يعتمد أيضا على التسلسل وطول قالب الحمض النووي. وفقا للدليل العام لحفر-الجيش الملكي النيبالي وسم مع بوليميريز الحمض النووي الريبي T7، تنتج حوالي 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المسمى حفر من 1 ميكروغرام خطية القالب.

2. النسخ في المختبر لتوليد المسابير العقاقير.

ملاحظة: من الأهمية بمكان للعمل في بيئة خالية من رناسي. يجب أن تكون جميع الكواشف ومختبر وير رناسي الحرة (مثل شهادة الدناز/رناسي الحرة البلاستيك وير)-

مكون المخزون تركيز وحدة التخزين التركيز النهائي
ATP مم 100 ميكروليتر 7 10 ملم
CTP مم 100 ميكروليتر 7 10 مم
أنشئ 100 مم 7 آند # 956؛ ول 10 مم
UTP 100 مم ميكروليتر 4.5 مم 6.5
حفر-11-UTP 10 ملم 25 ميكروليتر 3.5 مم
المياه مجاناً رناسي ميكروليتر 19.5
مجموع ميكروليتر 70

الجدول 5: إعداد "مزيج" حفر NTP.

< الجدول الحدود = fo:keep "1"-together.within-الصفحة = fo:keep "1"-مع-next.within-صفحة = "دائماً" > مكون 15 ميكروليتر رد فعل 96 مزيج جيد
(112 س رد فعل)
الأسفلت النهائي 1 x X 5 النسخ الاحتياطي ميكروليتر 3.00 3.00 ميكروليتر NTP حفر مزيج (10 ملم) ميكروليتر 0.75 0.75 ميكروليتر 0.5 مم المانع رناسي ميكروليتر 0.25 ميكروليتر 0.25 0.67 يو/ميكروليتر رنا بوليميراز (T7 أو T3 أو SP6) ميكروليتر 2.00 2.00 ميكروليتر 2.67 يو/ميكروليتر المياه مجاناً رناسي ميكروليتر 1.50 1.50 ميكروليتر مجموع ميكروليتر 7.50 7.50 ميكروليتر

النسخ الجدول 6:2 X ميكس ماجستير.

مزيج
  1. تحضير الحفر-NTP حسب الجدول 5-
    ملاحظة: لتجنب الأخطاء، دائماً محاذاة اللوحة تكون A1 في الزاوية اليسرى العليا اللوحة.
  2. المكونات الإضافية المبينة في الجدول 6 لكل بئر في صفيحة بكر 96-بئر جديدة (لوحة التحقيق). إضافة ميليلتر 7.5 من منتج PCR (قالب الحمض النووي) إلى كل المقابلة أيضا، باستخدام ماصة الأقنية. وتغطي اللوحة بختم الشريط.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون المبلغ الأمثل لمنتج PCR إضافة كل رد فعل النسخ بين 0.5 و 1 ميكروغرام. إذا كانت العصابات على الهلام أضعف بشكل كبير أو أكثر كثافة، يمكن ضبط حجم الحمض النووي إضافة إلى رد الفعل تبعاً لذلك. المبلغ المحدد ليس حاسما.
  3. احتضان لوحة المسبار في 37 درجة مئوية لتعامل ميليلتر h. 3.5-4 15 ميكس المركبة المسبار مع 35 ميليلتر من ديبك ddH 2 س، ميليلتر 125 100% EtOH، و 5 ميليلتر من 3 م نواك (pH = 5.2، رناسي مجاناً). تخزين في-80 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة للطرد المركزي وتغسل كما هو موضح في الخطوات 1.10.2 و 1.10.3-
  4. معاملة
  5. ريسوسبيند المسبار سرع في 25 ميليلتر من ديبك ddH 2 سين تشغيل 5 ميليلتر على 1% [اغروس] هلام (إدارة الوقت < 20 دقيقة) للتحقق من سلامة والعائد للتحقيق ( الشكل 2).
    ملاحظة: يجب بذل [اغروس] هلام مع ديبك معاملة ddH 2 س وتاي المخزن المؤقت. يجب أن يتم تعيين جهاز التفريد جل للحمض النووي الريبي العمل فقط. هلام أطول مدة على سرعة منخفضة يمكن أن يؤدي إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي خلال التفريد.
  6. مزيج
  7. ميليلتر 20 المتبقية المركبة المسبار مع 100 ميليلتر التهجين الحل (الجدول 7) ومخزن في-80 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
    ملاحظة: أن تركيز التحقيق يمكن أن تضعف أكثر إذا كانت العصابات قويا على وجه الخصوص (انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة). التهجين والحل فعالة جداً في منع التلوث رناسي. فورا إضافة حل التهجين لمسبار ريسوسبينديد لتجنب تدهور الجيش الملكي النيبالي. وقد حل التهجين لتتم تصفيته من خلال فلتر 0.2 ميكرون. لعينات الأنسجة، وزيادة تركيز المنظفات في الحل التهجين بإضافة تريتون-X-100 إلى تركيز نهائي من 0.3%-
المكون لحجم تركيز نهائي
ديبك معاملة ddH2O مل 11.85% 23.7%
20 X SSC 12.5 مل 25% (5 س)
ميثلامين مل 25% 50%
الهيبارين (50 ملغم/مل) 0.1 مل 0. % 2 (0.1 مغ/مل)
الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مل 0.5% 1.0%
توين-20 مل 0.05 0.1%
مجموع مل 50.00% 100%
< الفئة p = "jove_content fo:keep-together.within-صفحة = "1" > الجدول 7: حل التهجين.

3-المورفولوجية تربية والجنين ويرقان والكبار جمع الأنسجة.

ملاحظة: صغيرة الحجم (زجاجات) وكتلة (خانات) يطير تربية، تستخدم بروتوكولات قياسية مختبر ذبابة على طعام دقيق الذرة على أساس عند 25 درجة مئوية. إبقاء السليم الكبار واليرقات كثافة وأن توفر مسحوق الخميرة النشطة إضافية على الأغذية الأسطح.

  1. جمع الأجنة بعد البروتوكولات القياسية. الخطوات الرئيسية لجمع الجنين موضحة في الشكل 3-
    ملاحظة: بعد الشطف ديفيتيلينيزيد الأجنة في الميثانول، الأجنة ثابتة يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. بيرميبيليزيشن الجنين وبعد انتهاء التثبيت تتم في يوم 1 من البروتوكول الأسماك-
  2. تحضير الطازجة 40% PFA الأسهم الحل. حل بارافورمالدهيد 40% (PFA) بخلط 10 مل ديبك الأسهم
    1. تحضير تقدم طازجة معاملة ddH 2 س إلى 3.68 g لمنهاج عمل بيجين وميليلتر 70 من كوه 2N في زجاج 20 مل التﻷلؤ قنينة تحتوي على شريط صغير إثارة
      تنبيه: منهاج عمل بيجين شديد السمية مع الآثار الصحية الحادة والمزمنة. قراءة العظمية (صحائف بيانات السلامة المادية) وتستخدم مع توفير الحماية المناسبة للعيون والجلد والجهاز التنفسي.
    2. في غطاء دخان، الحرارة ويقلب القنينة لمدة 3-5 دقيقة على لوحة تدفئة في 200 درجة مئوية حتى يذوب تماما منهاج عمل بيجين. إزالة الحل الأسهم الأرجنتينية من الحرارة حالما يتم حل منهاج عمل بيجين (لا أسخن).
    3. باردة منهاج العمل 40% تم حله الحل الأسهم على الجليد لمدة 5 دقائق وتصفية مع حقنه 10 مل وتصفية 0.2 ميكرون.
  3. الثالث instar اليرقات (L3) أو تثبيت أنسجة البالغين، وتبريد وبيرميبيليزيشن
    ملاحظة: يجب الانتهاء من هذا البروتوكول في يوم واحد. ويشمل الأنسجة التشريح، والتثبيت، تبريد الذاتية برنامج الصحة الإنجابية، وبيرميبيليزيشن وبعد انتهاء التثبيت.
    1. تحضير تثبيت الحلول (إصلاح-الأول والثاني فيكس) وفقا للجدول 8-
      ملاحظة: يتم استخدام حمض البكريك كما مثبت إضافية عند الأنسجة لديها بنية حساسة التي يجب الحفاظ عليها. أنها ليست مثبت جيدا عندما يجب الحفاظ على الأنسجة أولتراستروكتوري الميكروسكوب الإلكتروني (م)-
      تحذير: حامض البكريك غير مستقر ولديه القدرة على التفاعل مع المواد الأخرى وإنشاء المركبات المتفجرة. استخدام وتخزين ووفقا للمبادئ التوجيهية للسلامة-
    2. مكان اليرقات أو الذباب الكبار في أنبوب 50 مل بلاستيكية التي تحتوي على 10 مل من البرد 1 × برنامج تلفزيوني و 100 ميليلتر من الإصلاح--أنا الحل. البرد على الجليد لمدة 2 دقيقة للحد من حركية يطير اليرقات أو الكبار-
    3. قص إيقاف غيض من تلميح 1 مل البلاستيك لإنشاء افتتاح 2-3 مم. نقل اليرقات 10-30 أو الذباب الكبار مع تلميح 1 مل إلى طبق بتري (قطرها 9 سم) مع طبقة سطحية من 1 X برنامج تلفزيوني من أنبوب 50 مل (الخطوة 3.3.2). يمكن إضافة قليلاً من ببتت إلى انخفاض التوتر السطحي. عناية تشريح اليرقات (فتح من الأمامي والضغط على الأنسجة من الخلفي إلى الأمامي) أو أنسجة البالغين من الاهتمام مع زوج من الملقط حادة تحت نطاق تشريح.
      ملاحظة: حوالي 200-300 اليرقات أو الخصيتين الكبار يمكن تشريح وإصلاحها في يوم واحد من الأفراد ذوي الخبرة.
    4. نقل تشريح الأنسجة مع 200 ميليلتر ماصة (مع تلميح قطع لإنشاء قطرها 2 مم فتح) إلى أنبوب 1.5 مل ومخزن على الجليد. إكمال كل جولة من تشريح داخل 10-15 دقيقة قبل التقدم إلى الخطوة التالية-
      ملاحظة: تستمر مع جولات إضافية (في غضون إطار زمني ح 2) كما هو مطلوب لإنشاء مادة كافية.
    5. إصلاح الأنسجة مع 800 ميليلتر من الإصلاح--أنا الحل لمدة 30 دقيقة في خلاط أعلى مقاعد البدلاء. الحد من الأنسجة شطف مرة واحدة مع 800 ميليلتر 1 X ببتت وإبقاء أنابيب على الجليد لمدة أقصاها 2.5 حاء بسبب 30 دقيقة، هذه الاحتياجات التي يتعين القيام بها باتشويسي حتى تم جمعها كافية الأنسجة.
    6. تجمع جميع الأنسجة تشريح وثابت في أنبوب بلاستيك واحدة 15 مل يحتوي على شبكة في الغطاء (انظر الشكل 4 لتصميم أنبوب). نضح السائل الفائض من خلال الشبكة في غطاء الأنبوبة. أغسل 3 X 5 دقيقة كل مع 10 مل من 1 X ببتت. شطف مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني X 1 إزالة المنظفات. وهذا ما يمنع فقاعات الزائدة في الخطوة التالية-
      ملاحظة: إذا كان تشريح الأنسجة بالوعة إلى الجزء السفلي من الأنبوب، يمكن تنفيذ الخطوات في لوحات microtiter العادية أو 0.5-1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب (300-800 ميليلتر حجم كل أنبوب)-
    7. إخماد النشاط HRP الذاتية مع 5 مل من 0.3% H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في تكرار الرايت مرة أخرى. الحفاظ على الغطاء مفتوحاً أثناء هذه الخطوة دون خلط. شطف مرتين باستخدام 10 مل من 1 X ببتت. أغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع 10 مل من 1 X ببتت.
    8. بيرميبيليزي
    9. الأنسجة مع 10 مل الأسيتون 80% (-20 درجة مئوية، مبردة مسبقاً) في-20 درجة مئوية للحد الأدنى 10 عكس الأنبوب مرتين خلال فترة الحضانة. أغسل مرتين عن 10 دقيقة مع 10 مل من 1 X ببتت ترطيب الأنسجة.
    10. شطف خليط 10 مل من التهجين ببتت زائد 5 مل 5 مل مع الحل (1:1)-تجاهل ميكس واستبدال مع 10 مل التهجين الحل. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة. للحصول على أفضل النتائج، لا تقم بتخزين العينات لأكثر من أسبوع.
عنصر إصلاح أنا (10 مل) حل ثانيا (10 مل)
الأسهم منهاج العمل 40% 1 مل 1 مل
ببتت 8.99 مل مل 9
حل حامض البكريك 10 ميكروليتر
< الفئة p = "jove_conte fo:keep nt "--together.within--صفحة =" 1 "> الجدول 8:" تحديد الحلول "للأنسجة.

4-التهجين في الموقع

ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول يتطلب حدا أدنى من 2 أيام، مع إعداد عينة، وقبل التهجين والتهجين أخذ مكان في يوم 1 والتحقيق للكشف عن على يوم 2. إذا كان عدد العينات مرتفع نسبيا، إذا كان غير مألوف مع البروتوكول، أو يوم كامل من غير الممكن، ينبغي إجراء البروتوكول في 3 أيام مع خطوات التحقيق الكشف وإشارة التضخيم مقسمة إلى 2 يوما. قد يتطلب أعدادا كبيرة من الأجنة أو عينات الأنسجة تشريح يوما إضافيا عملية. لعينات الأنسجة تشريح، استبدال 1 X PBT مع ببتت س 1 في جميع الخطوات، ما لم يبين خلاف ذلك. المنظفات إضافي مطلوب لاختراق العديد من الأنسجة اليرقات والكبار، مثل الدماغ والخصية. على الرغم من أن 1 ليس اختبارها، كما يمكن استخدام X PBTT للأجنة. استخدام 100 ميليلتر كل بئر للوحات 96-جيدا و 800 ميليلتر لأنابيب 1.5 مل.

  1. قبل التهجين والتهجين
    ملاحظة: الخطوات 4.1.1-4.1.6.2 للجنين في الموقع التهجين. للأنسجة اليرقات أو الكبار في الموقع هيبريديزيشنز، تخطي الخطوات التالية.
    1. مل 2 إزالة الأجنة ثابتة (المخزنة في الميثانول في-20 درجة مئوية) إلى أنبوب 15 مل جديدة. تغسل الأجنة مرتين لمدة 7 دقائق مع 10 مل من الميثانول في كل غسل. واش الأجنة لمدة دقيقة 7 مع الخليط 10 مل من الميثانول و 1 X ببتت (1:1). تغسل الأجنة مرتين لمدة دقيقة 7 مع 10 مل من 1 X ببتت ترطيب.
    2. للجنين بيرميبيليزيشن، تعد حلاً وسيطة بروتيناز ك (40 ميكروليتر/mL) بتمييع 1: 500 من حل الأسهم (20 ملغ/مل). مخزن في-20 ° جيم جعل حل بروتيناز ك عامل بتمييع الحل الوسيطة بروتيناز ك 1/15 في 1 X ببتت لتركيز عمل نهائي ل 2.667 ميكروغرام/ملليلتر-
    3. الأجنة بيرميبيليزي مع 10 مل من العمل الحل بروتيناز ك (استخدام أقل لعدد أقل من الأجنة). احتضان الأنبوب في RT ل 13 دقيقة برفق عكس الأنبوب 4 مرات أثناء الاحتضان. احتضان هذه العينات في حل بروتيناز ك على الجليد ح 1 دون خلط.
      ملاحظة: هذا الاحتضان طويلة نسبيا مع تمييع بروتيناز ك يضمن permeabilization تكاثر موحدة وتلطيخ اللاحقة-
    4. حين بيرميبيليزي الأجنة، جعل 2 مغ/مل الحل جليكاين من المخزون X 10 (20 ملغ/مل) في 1 X ببتت لإجمالي حجم 30 مل-
    5. الحل
    6. إزالة بروتيناز ك، شطف مع 10 مل من محلول جليكاين (2 مغ/مل) وتغسل مرتين لكل 2 دقيقة. شطف ثلاث مرات مع 10 مل من 1 X ببتت لإزالة جليكاين-
    7. بعد التثبيت للأجنة.
      1. مل 10% 4 إعداد منهاج عمل بيجين (منهاج عمل بيجين في 9 مل ببتت, 1 مل من 40% تصفيتها عن طريق 0.45 ميكرومتر تصفية).
      2. احتضان هذه العينات في 4% منهاج العمل عن 20 دقيقة أغسل 3 X لكل 2 دقيقة مع ببتت.
      3. لإعداد حل التهجين التشويه والتحريف، وغلى الحل التهجين لمدة 5 دقائق. لوحة كاملة 96-جيدا، استخدام أنابيب ثلاثة من 12 مل. بارد على الجليد فورا للحد الأدنى 5
      4. شطف الأجنة مرة واحدة مع 10 مل من 1 X ببتت: الحل التهجين (1:1). شطف مرتين مع 5 مل من محلول التهجين. اليكووت ~ 20 ميليلتر كل بئر استقر الأجنة (30-40 الأجنة) أو إصلاح الأنسجة في لوحة بكر 96-جيدا على الجليد. إزالة الحل التهجين من الأنسجة أو الأجنة باستخدام ماصة 8 قنوات متعددة ( الشكل 1 /فيديو).
        ملاحظة: ماصة متعددة له ‘ وقف ’ أن يمنع النصائح من الذهاب إلى الجزء السفلي من الآبار وإزالة عينة. لإجراء تجارب باستخدام الأنسجة التي تطفو، إزالة السائل بعناية مع ماصة 100 ميليلتر من الأعلى-
    8. إضافة 100 ميليلتر من الحل التهجين التشويه والتحريف لكل بئر. قبل هجن أجنة للحد ني ح 2.5-3 في 56 درجة مئوية باستخدام وحدة تدفئة حمام جافة التي تحتوي على معدن الخرز (انظر المواد و الشكل 1).
    9. تؤذي 100 ميليلتر من الذي أعد التحقيق في صفيحة بكر 96-جيدا باستخدام ثيرموسيكلير لمدة 5 دقائق في 80 درجة "جيم فورا" باردة على الجليد لمدة 5 دقائق. إزالة الحل قبل التهجين من أجنة أو أنسجة. إضافة التشويه والتحريف المجسات الخاصة بالجينات لكل عينة، وتغطي مع ختم الشريط وهجن في 56 درجة مئوية ح 16-18 س/ن، تحت حبات معدنية في حمام الجافة تدفئة unit.

5. التحقيق كشف

  1. الحارة قبل الحلول في الجدول 9 في وحدة تدفئة 56 درجة مئوية. إزالة المجسات من اللوحة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام المسابير بين 2-3 مرات إذا كانت مخزنة في-80 درجة مئوية (ابدأ تخزين عينات الحمض النووي الريبي أي في-20 درجة مئوية). بعد التهجين، الجيش الملكي النيبالي الذين تقطعت بهم السبل مزدوج هو أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي جديلة واحدة، وهو أقل عرضه للتدهور الناجم عن تلوث رناسي.
    في حالة استخدام نظام ترشيح فراغ لوحة متعددة جيدا للأنسجة، ينبغي إدراج لوحة جمع تحت صفيحة تصفية لجمع المسابر (انظر الفيديو لتفاصيل التجميع). سوف تحتاج الأنسجة المهجن ستنقل من لوحة ميكروتيتير 96-البئر العادية المستخدمة التهجين لواحد مع حجم المسام ميكرومتر 1.2 PVDF الأغشية في الجزء السفلي من كل بئر.
< t r >
خطوة استعد الحل (56 درجة مئوية) قبل وقت وحدة التخزين في بئر
1 التهجين الحل: ببتت (3:1) 15 دقيقة 100 ميكروليتر
2 التهجين الحل: ببتت (3:1) 15 دقيقة 100 ميكروليتر
3 التهجين الحل: ببتت (1:1) 15 دقيقة 100 ميكروليتر
4 التهجين الحل: ببتت (1:3) 15 دقيقة 100 ميكروليتر
5 5 دقائق يغسل 3 ببتت 100 ميكروليتر

9 الجدول: الغسيل تحقيقات بعد التهجين.

  1. في حالة استخدام لوحات طبيعية، وعينات المياه والصرف الصحي وفقا للجدول 9 في وحدة تدفئة في 56 ° جيم إذا كان استخدام نظام فراغ المتشعبة، استخدام الحلول ساخنة مع نظام الشفط على مقاعد البدلاء وإزالة الحلول فورا من دون من فراغ. بعد الغسيل 3 مع 1 X ببتت، يمكن إزالة لوحة طبيعية من التدفئة unit.
  2. تحضير الأجسام المضادة.
    1. إعداد 11 مل من محلول جسم الأولية (2.5 ميكروغرام/ملليلتر) من المخزون (1 ملغ/مل) بتمييع مترافق البيوتين الماوس [مونوكلونل] حفر المضادة الأجسام المضادة (انظر قائمة المواد) في ببتب (1: 400). إذا كان تجهيز العينات أقل، ضبط أحجام تبعاً لذلك.
    2. متزاوجة
    3. إعداد 11 مل من محلول ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية (1 ميكروغرام/ملليلتر) من المخزون (1 ملغ/مل) بتمييع 1: 1000 ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية (انظر قائمة المواد) في ببتب. في حالة استخدام عينات أقل، ضبط أحجام تبعاً لذلك.
  3. كتلة أجنة أو أنسجة مع ببتب (اللبن المقشود 1% في 1 X ببتت) لمدة 20 دقيقة في خلاط أعلى هيئة في الرايت
    ملاحظة: عامل تصفية ببتب باستخدام ورق الترشيح (الصف 3، 6 ميكرومتر) قبل استخدامه في لوحات تصفية 96-جيدا لتجنب انسداد المرشحات. بدلاً من ببتب، ببتب (ببتب مع إضافية 0.3% تريتون-X-100) يستخدم لجميع الأنسجة خلال البروتوكول.
  4. إينكوباتي الأجنة أو الأنسجة في جسم الحل (100 ميليلتر في البئر) ح 2 في خلاط نموذج أعلى مقاعد البدلاء. شطف مرتين مع 1 x PBTTB. أغسل 3 X 5 دقيقة و 5 X ل 10 دقيقة مع ببتب. احتضان أجنة أو أنسجة مع الحل ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية (100 ميليلتر في البئر) ل 1.5 ح استخدام خلاط نموذج أعلى مقاعد البدلاء. يغسل 2 X لمدة 5 دقائق مع ببتب. الاحتفاظ بعينات في الظلام من هذه النقطة.
    ملاحظة: خلال كل جسم يغسل، إذا هو الضياع الأنسجة بسبب التعتيم إنتاج الحليب، حاول الغسيل دون الحليب (ببتت بدلاً من ببتب).
  5. تعد حلاً DAPI 100 تمييع X DAPI في ببتب (1: 100)-
  6. إينكوباتي الأجنة أو الأنسجة مع الحل DAPI (100 ميليلتر في البئر) لمدة 15 دقيقة في خلاط نموذج أعلى مقاعد البدلاء. أغسل 4 X ل 10 دقيقة مع ببتت. تخزين لوحة 96-جيدا مع عينات س/ن في 4 درجات مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية-
    ملاحظة: هذا الإجراء يمكن أن يكون مؤقتاً هنا.

6. الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام تيراميدي (انظر الشكل 5)

ملاحظة: هنا استخدمت تيراميدي مترافق 3 سينين محلية الصنع، التي أعدت وفقا للبروتوكول، المذكورة في 12 . إذا كان أداء العديد من التجارب أو اختبار عينات كثيرة، وهذا يوفر قدرا كبيرا من المال، وهو مقارنة الكواشف تجارية فعالة (من تجربة). للحصول على عدد أقل من التجارب وعينات، يمكن استخدام cyanine المتاحة تجارياً 3-تيراميدي (انظر المواد)-

  1. عينة أغسل ألواح 3 X لمدة 5 دقائق مع 1 X ببتت.
  2. تيراميدي تحضير التنشيط مخزن (المخزن المؤقت للتنشيط) يحتوي على 0.006 ٪ ح 2 س 2 في ببتت (تمييع 30% (w/w) ح بينها 2 س 2 الأسهم)-
  3. < lأنا > شطف اللوحات مع المخزن المؤقت التنشيط.
  4. تحضير سينين 3-تيراميدي الحل باذابته في المخزن المؤقت للتنشيط في أنبوب 15 مل.
    1. للأجنة، استخدم 1:80 تمييع (137 ميليلتر من سيانيني 3-تيراميدي في 11 مل من المخزن المؤقت للتنشيط). للأنسجة اليرقات، استخدم 1:150 تمييع (73 ميليلتر من سينين 3-تيراميدي في 11 مل من المخزن المؤقت للتنشيط). للبالغين من الخصيتين، استخدام تمييع 1: 200 (55 ميليلتر من سينين 3-تيراميدي في 11 مل من المخزن المؤقت للتنشيط). المبايض الكبار، استخدام رافعة تمييع (36 ميليلتر من سينين 3-تيراميدي في 11 مل من المخزن المؤقت للتنشيط).
  5. احتضان عينات مع الحل 3-تيراميدي سينين ح 2 في خلاط نموذج أعلى مقاعد البدلاء. شطف أربع مرات مع ببتت. أغسل 6 X ل 10 دقيقة مع ببتت. أغسل X 3 لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني لإزالة مواد التنظيف-
  6. إضافة 150 ميليلتر/بئر تتلاشى المضادة تركيب وسائل الإعلام. الاحتفاظ بعينات س/ن في 4 درجات مئوية للسماح للأنسجة أو الأجنة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب. تحميل عينات على شرائح المجهر (ضمن تشريح مجالاً للأنسجة)، وتغطي مع ساترة. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر شفافة-
  7. الصورة باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: تحليل مراقبة سلبية أولاً للحصول على فكرة عن ‘ غير محددة ’ الخلفية.

Representative Results

ويبين الشكل 6 أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء. لوحات 3 الأعلى إظهار أمثلة المبكر المورفولوجية الأجنة (الشكل 6، لوحات أ-ج)، 3 المقبل لوحات أمثلة في وقت متأخر الأجنة المورفولوجية مع إشارات في أنسجة مختلفة (أمنيوسيروسا والعضلات والجهاز العصبي المركزي، على التوالي (الشكل 6، ألواح د-F). التالية هي أمثلة من الطور الثالث الأنسجة اليرقات (الشكل 6، ولوحات ز-ي). لوحات K و L تظهر الصور التمثيلية من الكبار الغدد التناسلية (المبيض والخصية، على التوالي). تم تحميله مئات الصور والمشروح في جهودنا للبحث 'الفلورسنت في الموقع ذبابة الفاكهة قاعدة البيانات' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

Figure 1
الشكل 1. الخطوط العريضة الفلورسنت في الموقع التهجين (الأسماك) البروتوكول ومفتاح المعدات. (أ) [بكر] تضخيم لكدنا. (ب) النسخ في المختبر لتوليد حفر العقاقير الخاصة بالجينات-المسمى تحقيقات الجيش الملكي النيبالي في صفيحة 96-جيدا (صورة للوحة سيظهر في ب). (ج) و (د): الكبار (الإناث: نسبة الذكور 2:1. 300-400 الذباب/زجاجة) الذباب ويسمح لزميله لمدة 3-4 أيام. يتم نقل الأجنة من مجموعة بين عشية وضحاها على معيار دقيق الذرة الغذاء عند 25 درجة مئوية إلى علبة بلاستيكية جيدة التهوية (1 لتر من دقيق الذرة الغذاء في حاوية الحجم: 8 "× 8" X 3 "LWH) أو في زجاجات جديدة الحفاظ على كثافة يرقات سليمة. لجمع الأنسجة، ويجب أن يرش مسحوق الخميرة النشطة على قمة الغذاء في 24، ح 48 بعد بيضة زرع (AEL). (E إلى H): فلوري في الموقع تجارب التهجين إجراء أكثر من 3 أيام متتالية. للأجنة أو الأنسجة التي لا تطفو، استخدام لوح بكر 96-جيدا كما هو موضح في الصورة ب مع 8 قنوات الشافطة (صورة ج). للأنسجة التي تطفو، مثل معظم أنسجة اليرقات، استخدام لوحة تصفية القاع (الصورة في د) وإزالة السائل من الأسفل مع المضخة متعددة استخدام ضغط منخفض (الصورة في ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. تحديد العائد مسبار الحمض النووي الريبي. حديثا توليفها المسابير antisense الحمض النووي الريبي يحتفل في 1% [اغروس] هلام (5 ميليلتر في حارة). ويمكن تصنيف العائد (استناداً إلى كثافة الفرقة) 'منخفضة الغلة' في الممرات 3 و 10، 'عائد نموذجي' في الممرات 1، 4، 5، 6 و 8، أو 'عالية الغلة' في الممرات 2، 7، 9 و 11 و 12. لعينات مع 'غلة نموذجية'، استخدم 10-15 ميليلتر من مسبار المخفف في 100 ميليلتر من التهجين الحل لكل تجربة في الموقع . تمييع عينات مع 'غلة عالية' للتحقيق مع الحل التهجين إضافية وفقا لكثافة الفرقة بالنسبة كثافة 'تحقيق نموذجية'. وتهدف إلى أن تركيزات التحقيق النهائي متساوية تقريبا في كل بئر. يشير السهم إلى واحدة من 'تحقيقات الجيش الملكي النيبالي،' الفرقة أعلى في كل حارة هو قالب الحمض النووي الأصلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. الرئيسية خطوات لجمع الجنين على نطاق واسع والتثبيت- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. أنبوب محلية الصنع لإزالة السائل من أنسجة اليرقات أو عائم. تعويم بعض الأنسجة اليرقات والكبار في الحل أثناء التثبيت. هذه أداة بسيطة تتألف من شبكة النايلون عقدته 200 ميليلتر قطع الحافة، تليها تلميح 1 مل كمحول للاتصال المضخة. سائل يمكن إزالتها بأمان دون أن تفقد أي الأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. تضخيم الإشارات تيراميدي. (1) حفر المسمى مسبار الحمض النووي الريبي العقاقير هيبريديزيس مع الإحساس بالذاتية الجيش الملكي النيبالي. (2) المناعية-تقارب ملزم بين جسم الابتدائي مترافق البيوتين وحفر UTP. (3) برنامج الصحة الإنجابية مترافق streptavidin يربط البيوتين. (4) برنامج الصحة الإنجابية يحفز cyanine 3-تيراميدي، وفوق أكسيد الهيدروجين رد فعل لتشكيل الجذور 3-تيراميدي سيانيني لم تدم طويلاً. (5) سيانيني 3-تيراميدي الجذور ربط تيروزين المخلفات على البروتينات القريبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. الممثل في الموقع الصور التهجين. كل لوحة يظهر مثال الحمض النووي الريبي مختلفة (كما هو موضح في سماوي) ونوى ملطخة DAPI (يظهر باللون الأحمر). (أ-ج) أمثلة للأجنة المورفولوجية في وقت مبكر. (D, F) أمثلة من أواخر المورفولوجية الأجنة. (غ-ي) أمثلة من 3rd instar المورفولوجية اليرقات الأنسجة (مالفيجيان الأنابيب، الأمامي والغدة اللعابية وعضلة على التوالي). (ك) الكبار المبيض. (L) الخصية الكبار. تعرض كل لوحة اسم جين أن التحقيق هو التهجين إلى. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ينص البروتوكول على وصف أسلوب استنساخه عالية وحساسة، واقتصادا للكشف عن معظم الكشف في الأنسجة أو أجنة المورفولوجية الثابتة. على الرغم من أن قليلاً أكثر تعقيداً مما الأكثر تقليديا تستخدم الأسلوب الفوسفاتيز القلوية للكشف عن التحقيق، أن القرار تم الحصول عليها من الأسماك أكبر بكثير والحساسية قابلة للمقارنة أو تحسين 7،8. باستخدام لوحات microtiter كاملة أو جزئية، يمكن استخدام البروتوكولات لتحليلات واسعة النطاق أو محدودة للجينات للفائدة. تجدر الإشارة إلى أن المجسات التي تم إنشاؤها يمكن الكشف عن كافة أو لصق نسخة متعددة الأشكال ما لم تكن مصممة على وجه التحديد المسابر (أي، واحد exons). على الرغم من اختبرناها المسابير صغيرة النيوكليوتيدات 200 بنجاح معقولة، تميل إلى أن تكون أقل فعالية المسابير أصغر وقد يكون أقل تحديداً. ومن الواضح أن هذا البروتوكول غير مناسب للكشف عن الصغيرة introns، exons، أو معالجة ميكرورناس.

على الرغم من أن هذا النهج يستخدم خطوة الانزيمية لتعزيز قوة الإشارات، يظهر كثافة إشارة يكون متناسباً مع الهدف التعبير الجيني في نطاق مستويات التعبير الخطي وواسع نسبيا. في أعلى التكبير، يعتبر الإشارة بونكتا أو تلامس داخل الخلايا والأنسجة. وينظر للنصوص نادرة نسبيا سوى عدد قليل من بونكتا صغيرة. كما يزيد من وفرة نسخة، وهذه تنمو في عدد وحجم. كما هو الحال مع جزيء واحد الأسماك (سمفيش)، بونكتا صغيرة واحدة قد تقابل أيضا الكشف واحدة وينبغي أيضا سهولة كمياً باستخدام برمجيات التصوير والمعلوماتية. مقارنات بين الصور المنشورة الحصول عليها باستخدام سمفيش مع الصور التي كنا قد رعاية للأهداف نفسها التي تشير إلى أن عموما وحساسية وحلها بالطريقتين متشابهة نسبيا، على الرغم من أن هذا ينبغي أن يمكن اختباره بواسطة مقارنات أكثر صرامة. الأسلوب المقدمة هنا نظراً لنفقات أعلى كثيرا من سمفيش، ينبغي أن تعطي نتائج مماثلة في جزء صغير من التكلفة. ومع ذلك، إذا كان الهدف الكشف عن النصوص الصغيرة، أو أجزاء منفصلة من النصوص، ينصح سمفيش.

نظراً لحجم أصغر من بعض المسابير الأسماك، قد يكون هذا الأسلوب أيضا أفضل في اختراق الأنسجة التي تكون كبيرة أو عقبات كبيرة. ومع ذلك، تظهر استخدامنا لمستويات أعلى من المنظفات والأنسجة من التثبيت وبيرميبيليزيشن من القرص حل هذه المشكلة. أخيرا، على الرغم من أن البلدان المتقدمة النمو للأنسجة المورفولوجية ، ينبغي أيضا العمل مخازن المنظفات عالية الموصوفة هنا لتشريح الأنسجة للأجنة المورفولوجية ، فضلا عن معظم الكائنات الحية والأنسجة الأخرى.

Disclosures

وقد المؤلف لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

تمويل الدعم لهذا المشروع قدمت منحة إلى همك "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح باتاكا 133473).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
Agarose Bioshop AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide Bioshop FOR001.500
Glycerol Bioshop GLY002.4
Glycine Bioshop GLN001.500
Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
Name Company Catalog Number Comments
Solutions Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
عالية الدقة الفلورسنت <em>في الموقع</em> التهجين في <em>المورفولوجية</em> الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).More

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter