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Genetics

高分辨率荧光原位杂交在果蝇胚胎和组织中使用 Tyramide 信号放大

doi: 10.3791/56281 Published: October 19, 2017

Summary

所描述的 rna原位杂交协议允许检测整个果蝇胚胎或解剖组织中的 rna。使用96井孔板和 tyramide 信号放大, 记录可以检测高分辨率, 灵敏度和吞吐量, 并以较低的成本。

Abstract

在我们的努力, 以确定的表达模式和亚细胞定位的果蝇rna 在全基因组的基础上, 并在各种组织, 我们已经开发了许多修改和改进, 我们原来的荧光原位杂交 (鱼) 协议。为了方便吞吐量和成本效益, 所有步骤, 从探头生成到信号检测, 都是使用外显子 96-孔板。Digoxygenin (挖掘)-标签反义 RNA 探针的生产使用的是 cDNA 克隆或基因组 DNA 作为模板。在组织固定和性后, 探针杂交到感兴趣的抄本, 然后用一系列抗性的抗体结合生物素, 亲和共轭辣根过氧化物酶 (HRP) 和荧光共轭tyramide, 在 HRP 的存在下, 产生一个高度反应性的中间体, 结合到紧邻的蛋白质的电子密集区域。这些放大和定位步骤产生了一个强大的和高度本地化的信号, 有利于细胞和亚单元转录定位。所提供的协议经过了优化, 可以在各种组织和发育阶段产生高度特异的信号。此外, 还提供了额外的变异, 同时检测多个成绩单, 或抄本和蛋白质。

Introduction

新的全基因组 rna 检测方法, 如 rna 序列, 极大地扩展了我们对何时何地表达基因的认识, 以及在什么级别的1。然而, 这些提供了相对较差的时间和空间分辨率。RNA 原位杂交允许在固定组织中视觉上观察转录物的空间分布, 从而揭示细胞和亚型本地化2的细节。使用荧光原位杂交 (fish) 允许更多的空间分辨率, 因为它允许使用强大的显微镜技术, 如共焦和光片显微镜3。荧光标记 (如 DAPI) 也可用于建立亚细胞关系4。鱼类还有助于观察多个 rna 和蛋白质同时有明确的重叠在亚细胞水平的迹象。double-labeling 所需的独特试剂和步骤可在以下参考资料3,5中找到。

这里描述的程序利用96井孔板的所有步骤, 包括 cDNA 模板生产 (菌落 PCR), RNA 探针生产 (使用 T7, T3 或 SP6 聚合酶依赖性径流转录),原位杂交,荧光信号的发展。在96井板的每个井中加入足够数量的胚胎或组织, 以便评估一致性和变异性。每一个井然后接受不同的探针。信号发育后, 每个井中的胚胎或组织都在各自的显微镜切片上排列, 进行显微分析。

使用 tyramide 信号放大 (TSA) 进行探针检测产生了具有特殊的亚细胞分辨率5,6,7,8的鲁棒信号。rna 的亚细胞定位是一个重要的调节机制9 , 它出现在几乎所有 rna 的41011中。这些分析还显示, 许多未被 RNA 序列检测到的记录被鱼8轻易检测到。RNA 的适应原位杂交到96井板允许分析最多96基因的兴趣 (如果更多的板块被使用), 使得分析大数据集成为可能。通过将板块切割成更小的部分, 这种方法也很容易适应少数样品。所提供的协议适用于大多数类型组织中 RNA 分布的分析。虽然没有显示, 它也适用于非果蝇组织。

Protocol

1. pcr 扩增质粒的 cDNA 模板

注意: 使用高质量的质粒或 pcr 生成的 DNA 模板进行 RNA 探针合成。由伯克利 果蝇 基因组项目生成的 果蝇 基因库 (DGC) 库提供了在 果蝇 基因组中发现的大多数编码基因的覆盖率 (见表 1a)。这些还允许使用普遍引物放大任何 cDNA 插入。这些 PCR 放大是在质粒 dna 中存在的质粒的裂解细菌培养。然后, DNA 产品被用作 体外 转录的模板, 生成反义 RNA 探针 (见表 1b).

  1. 设计引物通过 PCR ( e. g 从基因组 DNA) 放大感兴趣基因的特定外显子区域, 最好是在反义端的 T7 聚合酶识别站点上.
  2. 对于少于96样本的实验, 切掉不需要的96个板的部分。盖板与密封胶带 (见材料) 的所有孵化和存储。如果使用离心管, 请相应地调整音量.
    注:96-井板允许使用多通道管增加吞吐量, 以及较小的体积, 以节省成本.
pBst (-) 放大器 pBst_SK (-) T7 T3 pOT2
表 1a

抗生素
工作浓度 1:1000

引物
rna 聚合酶

反义
rna 聚合酶. 对于
感官
pFLC 放大 pBst_SK (-) _F/R T3 T7
pOT2_F/R SP6 T7
pOTB7 pOT2_F/R T7 SP6
表 1b
入门 序列
pOT2_Forward 5 和 #39;-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 和 #39;
pOT2_Reverse 5 和 #39;-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 和 #39;
pBst_SK (-) _Forward 5 和 #39;-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 和 #39;
pBst_SK (-) _Reverse 5 和 #39;-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 和 #39;

表 1: A) 一般 DGC 克隆信息, 用于在质粒中放大 cDNA 插入物。B) DGC 质粒的通用引物序列.

  1. 在96个培养皿中增加250和 #181; 通过添加240和 #181, 对 LB 培养基中的细菌培养 l 进行适当的抗生素选择 (1:1000 稀释 1000 X 抗生素库存), 以及10和 #181; 原始的 l含有质粒的细菌 (从甘油库存)。密封胶带.
  2. 在37和 #176 中以 215 rpm 的抖动进行孵化; 在夜间 (O/N).
    注: 制作一份新的细菌甘油 cDNA 质粒克隆砧木以取代原来的。不要冻结原始细菌的库存, 因为这可能会杀死细菌.
  3. 生产 pcr 模板, 稀释10和 #181; 90 和 #181 中的 O/N 细菌培养 l; 高压蒸 ddH 2 在一个新的96井 pcr 板的每个井中的每一个的 o。变性的 DNA 为5分钟, 在95和 #176; C thermocycler。立即把盘子放在冰上至少5分钟.
  4. 使用适当的通用引物制备 PCR 反应, 每表 2.
2 x PCR 聚合酶 25 和 #956; 2800 和 #956; l 1 x Primer_For (25 pmol/和 #956; l) 0.5 和 #956; l 56和 #956; /tr >
试剂 50 和 #956; 示例响应 96 井混音
(112x反应)
最终浓度
0.25 pmol/和 #956; l
Primer_Rev (25 pmol/和 #956; l) 0.5 和 #956; l 56 和 #956; l 0.25 pmol/和 #956;
ddH2O 22 和 #956; l 2464 和 #956; l
总计 48 和 #956; l 5376 和 #956; l

表 2: 聚合 PCR 主组合.

  1. 使用吸管、分48和 #181; pcr 大师的 L 混合到一个新的96井 pcr 板的每个井。每井添加2和 #181; 每个变性质粒 DNA 模板 L.
    注: 使用 1 picogram (pg) 至1克 (ng) 质粒 DNA。过量的 DNA 模板降低了 PCR 的产量和特异性.
  2. 按表3编程96井 PCR 机并进行放大.
    注: 延长时间在72和 #176; C 是由 PCR 产品的大小 (四十五年代为和 #8804; 2.0 kb, 1.5 min 为和 #8804; 3.0 kb, 3 min 为和 #8804; 4.0 kb 和 3.5 min 4.0-5.0 kb)。退火温度 (Tm) 由引物序列确定。当底漆等于或超过 20 nt 时, tm 被计算为:
    tm (和 #176; C) = (4 x 的 CG 数) + (2 x 的个数)-4.
时间 td 行跨度 = "3" > 30 周期 72 和 #176; c 45 sec-3.5 分钟 最终扩展 存储
步骤 温度
初始变性 95 和 #176; c 3 分钟 1 循环
放大
变性, 退火和扩展
95 和 #176; c 45 秒
54-58 和 #176; c 45 秒
72 和 #176; c 7 分钟 1 循环
4 和 #176; C 保留

表 3: 推荐的 PCR 程序.

  1. PCR 产品沉淀与乙醇 (乙醇) 和乙酸钠 (NaOAC) (见表 4).
    注: 如果 PCR 反应体积小于 50, #181; l, 填充50和 #181; l 与 ddH 2 O。
    1. 来沉淀 DNA 将表4中的组件和存储样品在-20 和 #176; c 或30分钟在-80 和 #176; c. 离心 96-井板45-60 分钟 2250 x g at 4 和 #176; c. 使用8通道流形吸管到 carefully 除去上清液。用160和 #181 冲洗一次, 70% 乙醇 (核糖核酸), 30 分钟, 2250 x g 在4和 #176; C.
      注: 沉淀的 DNA 可以在井底看到。更短的 PCR 产品需要更长的 centrifugations.
    2. 在纸巾上轻轻地倒置96井板, 以去除每个井中的最后一滴液体 (尽可能多地)。室温下空气干燥的 DNA 颗粒 1 h (RT)。重25和 #181 的沉淀 DNA; 我核糖核酸免费的水.
      注: 1 小时空气干燥将允许所有的乙醇蒸发的痕迹。然而, 一小体积的液体 (约1和 #181; L) 应保持在每井, 以防止 DNA 颗粒完全干燥。使用25和 #181; l 为50和 #181; l PCR 反应。在这一阶段不要使用 DEPC 处理过的水, 以避免与 体外 转录在以下步骤中的干扰.
组件 音量 部分
PCR 50 和 #956; l
100% 乙醇 125 和 #956; l 2.5 X vol. pcr
3M NaOAc (pH = 5.2, 核糖核酸自由) 5 和 #956; 10% vol. pcr
180 和 #956; l

表 4:50 和 #181 的示例; PCR 反应.

  1. 通过运行5和 #181 来检查 PCR 产品的大小和产量; 悬浮 DNA 溶液在 1 X 泰缓冲区的1% 琼脂糖凝胶中的 L.
    注:15 和 #181 共需要 250-500 ng DNA 模板; L 体外 转录反应。产量较高的样品可以进一步稀释。RNA 的产量也取决于 DNA 模板的序列和长度。根据 T7 rna 聚合酶的挖掘 rna 标记的一般指南, 大约10和 #181; g 的挖掘标记 rna 是生产从1和 #181; g 线性化的模板.

2。 体外 转录生成反义探针.

注意: 在无核糖核酸的环境中工作是至关重要的。所有试剂和实验室洁具必须核糖核酸免费 (如认证 dnasei/核糖核酸免费塑料制品).

GTP 100 mm 7956; l Dig-11-UTP 10 mm 25 和 #956; l 3.5 mm 核糖核酸自由水
组件 库存集中 最后的浓度
ATP 100 mm 7 和 #956; l 10 mm
CTP 100 mm 7 和 #956; l 10 mm
10 mm
UTP 100 mm 4.5 和 #956; l 6.5 mm
>> 19.5 和 #956; l
全部 70 #956;

表 5: 挖掘-NTP 混合准备. 表边框 = "1" fo: 保持在一起. 在页内 = "1" fo: 保持-下. 在页内 = "始终" > 组件 15 和 #956; l 反应 96 井拌 (112x 反应)
最终具体. 5X 转录缓冲 3.00 和 #956; l 3.00 和 #956; l 1 x 挖掘-NTP 混合 (10 mM) 0.75 和 #956; l 0.75 和 #956; l 0.5 mM 核糖核酸抑制剂 0.25 和 #956; l 0.25 和 #956; l 0.67 U/与 #956; l RNA 聚合酶 (T7 或 T3 或 SP6) 2.00 和 #956; l 2.00 和 #956; l 2.67 U/和 #956; l 核糖核酸自由水 1.50 和 #956; l 1.50 和 #956; l 总计 7.50 和 #956; l 7.50 和 #956; l

表 6: 2X 转录主组合.

  1. 准备按表5的挖掘-NTP 组合.
    注意: 为了避免错误, 总是对齐板, 这样, A1 是在左上角的板块.
  2. 将表6中所描述的组件添加到一个新的96井 PCR 板 (探针板) 中。使用多通道吸管将 PCR 产物 (DNA 模板) 的7.5 和 #181 L 添加到每个相应的井中。用密封胶带盖板.
    注: 每转录反应所添加的 PCR 产物的最佳用量应介于0.5 至1和 #181 之间;如果凝胶上的带子明显较弱或更强烈, 则添加到反应中的 DNA 量可以相应地调整。确切的金额并不重要.
  3. 在37和 #176 孵育探头板; C 为 3.5-4 h. 混合15和 #181; l 的合成探针与35和 #181; DEPC 处理 ddH 2 O, 125 和 #181; l 100% 乙醇, 和5和 #181; l 3 M NaOAC (pH = 5.2, 核糖核酸自由)。存储在-80 和 #176; C 为至少30分钟离心和洗涤, 如步骤1.10.2 和1.10.3 所述.
  4. 重25和 #181 中的沉淀探头; DEPC 处理 ddH 2 o. 运行5和 #181; l 在1% 琼脂糖凝胶 (运行时间和 #60; 20 分钟) 检查探头的完整性和成品率 ( 图 2 ).
    注: 琼脂糖凝胶必须与 DEPC 处理的 ddH 2 O 和泰缓冲器。凝胶电泳仪只应分配给 RNA 工作。更长的凝胶运行时间在低速可能导致 RNA 退化在电泳期间.
  5. 将余下的20和 #181; 合成探针的 l 与100和 #181; l 杂交解决方案 (表 7) 和存储在-80 和 #176; C, 直到需要.
    注意: 如果频带特别健壮, 探头浓度可以稀释更多 (请参见 图 2 中的示例)。杂交解决方案是非常有效的防止核糖核酸污染。立即加入杂交解决方案的悬浮探针, 以避免 RNA 降解。杂交解决方案必须通过0.2 和 #181; m 过滤器过滤。对于组织样本, 增加 Triton-X-100 的浓度为 0.3%, 以提高杂交溶液中的洗涤剂浓度.
组件 音量 最终集中
DEPC 处理 ddH2O 11.85 ml 23.7%
20 X SSC 12.5 ml 25% (5 X)
甲酰胺 25 ml 50%
肝素 (50 毫克/毫升) 0.1 ml 0. 2% (0.1 毫克/毫升)
鲑鱼精子单绞 DNA 0.5 毫升 1.0%
Tween-20 0.05 ml 0.1%
总计 50.00 ml 100%
p 类 = "jove_content "fo: 保持在一起. 在页内 =" 1 "> 表 7: 杂交解决方案.

3. 果蝇 饲养和胚胎、幼虫和成人组织收集.

注意: 对于小规模 (瓶子) 和质量 (盒) 的苍蝇饲养, 使用标准的苍蝇实验室协议的玉米为基础的食物在25和 #176; c. 保持适当的成人和幼体密度, 并提供额外的活性酵母粉的食物曲面.

  1. 根据标准协议收集胚胎。在 图 3 中说明了胚胎采集的主要步骤.
    注: 在甲醇中冲洗 devitillinized 胚后, 固定胚胎可储存在-20 和 #176; C 为一年。胚胎性和 post-fixation 在《鱼类议定书》1天执行.
  2. 准备新的40% 粉煤灰库存解决方案。
    1. 通过将10毫升 DEPC 处理的 ddH 2 O 与3.68 克粉煤灰和70和 #181 混合, 准备一个新制作的40% 甲醛 (粉煤灰) 的库存解决方案. 2N KOH 在一个20毫升玻璃闪烁瓶中含有一个小的轰动酒吧.
      注意: 粉煤灰具有剧毒, 具有潜在的急性和慢性健康影响。阅读 MSDS (材料安全数据表), 并使用适当的保护眼睛, 皮肤和呼吸道.
    2. 在通风罩内, 在200和 #176 的加热板上加热和搅拌瓶3-5 分钟, 直到粉煤灰完全溶解。一旦粉煤灰溶解 (不要过热), 从热中除去粉煤灰库存溶液.
    3. 冷却溶解在冰上的40% 粉煤灰库存解决方案5分钟, 并过滤0.2 和 #181; m 过滤器和10毫升注射器.
  3. 第三龄幼虫 (L3) 或成人组织固定、淬火和性 注意: 此协议应在一天内完成。包括组织解剖、固定、内源性 HRP 猝灭、性和 post-fixation。
    1. 按照表8准备修复解决方案 (修复 i 和修复程序 II).
      注: 苦味酸酸是一种额外的固定剂, 当组织有一个微妙的结构, 必须保存。当组织超微结构必须保存在电子显微镜 (EM) 中时, 它不是一个好的定影剂.
      警告: 苦味酸酸是不稳定的, 有能力与其他材料的反应和制造爆炸性化合物。根据安全准则使用和存储.
    2. 将幼虫或成人苍蝇放在50毫升的塑料管中, 其中含有10毫升的冷 1 X PBS 和100和 #181; 我的解决方案冰镇2分钟, 减少幼虫或成人的飞行动力.
    3. 切断1毫升塑料尖端的尖端, 以创建一个2-3 毫米的开口。将10-30 只幼虫或成人苍蝇与1毫升尖端转化为培养皿 (9 厘米直径), 从50毫升管 (步骤 3.3.2) 的浅层 1 X PBS。加入少量的 PBTT 可以降低表面张力。在解剖范围内仔细解剖幼虫 (从前到后挤压组织, 从后向前) 或成人组织的兴趣与锋利的镊子.
      注意: 大约有200-300 幼虫或成人睾丸可由有经验的人在一天内解剖和固定.
    4. 用200和 #181 转移解剖组织; L 吸管 (与尖端切断, 创造一个2毫米直径开口) 成1.5 毫升管和储存在冰上。10-15 分钟内完成每一次解剖, 然后再前进到下一步.
      注: 继续进行额外的回合 (在一个2小时的时间窗口内), 以产生足够的材料需要.
    5. 用800和 #181 修复组织; 在一台台式搅拌机上安装30分钟固定解决方案 L。用800和 #181 冲洗组织一次; L 1 X PBTT, 并在冰上保持管最高2.5 小时. 由于30极小的极限, 这需要进行间歇, 直到有足够的组织已经收集.
    6. 将所有解剖和固定组织放入一个15毫升塑料管中, 其中包含盖子的网格 (请参见 图 4 用于管设计)。通过管盖上的网孔吸出多余的液体。洗 3 x 5 分钟, 每10毫升 1 x PBTT。冲洗两次, 用10毫升 1 X PBS 去除洗涤剂。这可以防止下一步中出现多余的气泡.
      注: 如果解剖的组织下沉到底部的管, 步骤可以执行在常规孔板或 0.5-1.5 毫升离心管 (300-800 和 #181; L 体积每管).
    7. 在 RT 中为 15 min, 在 PBS 中对 5 mL 0.3% H 2 O 2 内源性 HRP 活动进行淬火. 重复一次。在这一步保持盖子打开, 不混合。用10毫升 1 X PBTT 冲洗两次。洗两次5分钟, 10 毫升 1 X PBTT.
    8. Permeabilize 组织10毫升80% 丙酮 (-20 和 #176; c, pre-chilled) 在-20 和 #176; c 为 10 min. 在潜伏期两次倒置管。洗两次10分钟, 10 毫升 1 X PBTT 水化组织.
    9. 用5毫升 PBTT + 5 毫升杂交溶液 (1:1) 的10毫升混合液冲洗. #160;D iscard 混合, 替换为 10 ml 杂交溶液。样品可以存储在和 #160;-20 和 #176; C 直到需要。为了取得最佳效果, 请不要将示例存储超过一周.
苦味酸酸解决方案 10 和 #956; l
组件 修复 i (10 ml) 修复 II (10 ml)
40% 粉煤灰库存 1 ml 1 ml
PBTT 8.99 ml 9 ml
nt "fo: 保持在一起. 在页内 =" 1 "> 表 8: 修复组织的解决方案.

4. 原位 杂交

注: 该协议的这一部分至少需要2天, 在1天进行样品制备、、和杂交, 并探测2天。如果样本数相对较高, 如果不熟悉该协议, 或全天不可能, 则应在3天内执行协议, 并将探头检测和信号放大的步骤划分为2天。大量的胚胎或解剖组织样本也可能需要额外的天数来处理。对于解剖组织样品, 更换 1 x PBT 和 #160; 1 x PBTT 在所有步骤, 除非另有说明。额外的洗涤剂是需要的渗透许多幼体和成人组织, 如大脑和睾丸。虽然没有测试, 1 X PBTT 也可用于胚胎。使用100和 #181; 96 井板和800和 #181; l 为1.5 毫升管.

  1. 前杂交和杂交
    注: 步骤 4.1. 1-4. 1.6. 2 为胚胎 原位杂交。对于幼虫或成人组织 原位 杂交, 跳过这些步骤。
    1. 将2毫升固定胚胎 (在甲醇中储存在-20 和 #176; C) 移至新的15毫升管。每洗一次, 用10毫升的甲醇洗涤7分钟的胚胎。洼sh 胚为7分钟, 10 毫升的甲醇混合物和 1 X PBTT (1:1)。清洗胚胎两次7分钟, 10 毫升 1 X PBTT 到水化.
    2. 用于胚胎性, 通过稀释1:500 的原料溶液 (20 毫克/毫升) 制备中间蛋白酶 K 溶液 (40 和 #181; 升/毫升)。存储在-20 和 #176; c. 通过稀释在 1 X PBTT 中的中间蛋白酶 k 溶液1/15 进行工作蛋白酶 k 溶液, 最后工作浓度为2.667 微克/毫升.
    3. Permeabilize 胚胎与10毫升的工作蛋白酶 K 溶液 (较少用于较小数量的胚胎)。孵育管在 RT 13 分钟轻轻倒置管4次在孵化期间。在冰上孵育 1 h 的蛋白酶 K 溶液中的样品而不混合.
      注意: 这相对较长的孵化与稀释蛋白酶 K 确保性均匀性和后续染色.
    4. 当胚胎 permeabilize 时, 在 1 x PBTT 中从 10 x 库存 (20 毫克/毫升) 制作一个2毫克/毫升甘氨酸溶液, 总体积为30毫升.
    5. 去除蛋白酶 K 溶液, 用10毫升的甘氨酸溶液冲洗 (2 毫克/毫升), 每两次洗涤2分钟。用10毫升的 1 X PBTT 冲洗三次以除去甘氨酸.
    6. 胚胎后固定。
      1. 准备10毫升4% 粉煤灰 (1 毫升40% 粉煤灰在9毫升的 PBTT, 过滤通过0.45 和 #181; m 过滤器).
      2. 在4% 的粉煤灰中孵育样品20分钟, 用 PBTT 洗涤 3 X, 每次2分钟.
      3. 准备变性杂交溶液, 煮沸的杂交解决方案为5分钟。对于一个完整的96井板, 使用三管12毫升。冰立即冷却5分钟.
      4. 冲洗胚胎和 #160; 一次与10毫升的 1 X PBTT: 杂交解决方案 (1:1)。用5毫升的杂交溶液冲洗两次。分 ~ 20 和 #181; 在冰上, 将固定的胚胎 (30-40 个胚胎) 或稳定的组织放入 96-井的 PCR 板上。使用8通道流形吸管 ( 图 1 /视频 ) 从组织或胚胎中去除杂交溶液。 注: 歧管吸管有一个和 #8216; 停止和 #8217; 防止提示进入井底并除去样品。对于使用漂浮的组织进行的实验, 用100和 #181 小心地除去液体; 从顶部取出吸管.
    7. 在每个井中添加100和 #181; L 的变性杂交溶液。在56和 #176 前杂交胚胎至少 2.5-3 小时; C 使用含有金属珠子的干浴加热装置 (参见材料和 图 1 ).
    8. 变性100和 #181; 在96井 PCR 板上使用 thermocycler 5 分钟, 在80和 #176 上准备好的探针; c. 立即在冰上冷却5分钟。从胚胎或组织中去除、溶液。在每个样品上加入变性基因探针, 在56和 #176 上盖上密封胶带和杂交; C 用于16-18 小时/N, 在干浴加热单元的金属珠下.

5。探测检测

  1. 预热56和 #176 中表9中的解决方案; C 加热单元。从盘中取出探头.
    注意: 如果存储在-80 和 #176, 探头可以重复使用2-3 次; c (不要在-20 和 #176 中存储任何 RNA 样本; c)。杂交后, 双绞股 rna 比单链 rna 更稳定, 不易受到核糖核酸污染造成的降解.
    如果使用 a 井板真空过滤系统为组织, 一个收集板应该包括在滤板之下收集探针 (参见录影为汇编细节)。杂交组织将需要从常规的96井孔板转移到一个与1.2 和 #181; m 孔径 PVDF 膜在每个井的底部.
杂交解决方案: PBTT (3:1) 15 min 100 及 #956; l 杂交解决方案: PBTT (1:3) 15 min 100 及 #956; l r >
步骤 预热解决方案 (56 和 #176; C) 时间 每井容量
1 杂交解决方案: PBTT (3:1) 15 min 100 和 #956;
2
3 杂交解决方案: PBTT (1:1) 15 min 100 和 #956;
4 5 PBTT 3 洗涤 5 分钟 100 和 #956; l

表 9: 杂交后冲洗探针.

  1. 如果使用普通板, 请在56和 #176 的加热单元中按表9洗涤样品; #160; 如果使用真空歧管系统, 在工作台上使用真空系统加热解决方案, 并立即从下面真空。在第三洗涤用 1 X PBTT 之后, 正常板材可以从热化单位被去除.
  2. 准备抗体。
    1. 在 PBTTB (1:400) 中, 通过稀释生物素-共轭小鼠单克隆抗体 (见材料清单), 从砧木 (1 毫克/毫升) 中制备11毫升的主抗体溶液 (2.5 和 #181; g/毫升)。如果处理较少的示例, 请相应地调整卷.
    2. 在 PBTTB 中, 通过稀释1:1000 亲和-hrp 共轭 (见材料清单), 从砧木 (1 毫克/毫升) 中制备11毫升的亲和-hrp 溶液 (1 和 #181; g/ml)。如果使用较少的示例, 请相应地调整卷.
  3. 将 PBTTB (1% 脱脂牛奶在 1 X PBTT) 中的胚胎或组织在 RT 的台式搅拌机上进行20分钟的拦截.
    注: 过滤器 PBTTB 使用滤纸 (3 级, 6 和 #181; m) 之前使用它在 96-井滤板, 以避免堵塞过滤器。而不是 PBTB, PBTTB (PBTB 与额外的 0.3% Triton-X-100) 是用于所有组织在协议期间.
  4. 在台式样品混合器中, 在抗体溶液中孵育胚胎或组织 (100 和 #181; 升/井) 2 小时。用 1x PBTTB 冲洗两次。洗涤 3 x 为 5 min 和 5 x 为10分钟与 PBTTB。用亲和-HRP 溶液 (100-#181; L/井) 孵育胚胎或组织, 使用台式样品混合器 1.5 h。用 PBTTB 洗涤 2 X 5 分钟。从这一点上保持样品在黑暗中.
    注: 在所有抗体洗涤期间, 如果组织丢失由于牛奶产生的不透明度, 尝试洗涤, 不用牛奶 (PBTT 而不是 PBTTB).
  5. 在 PBTTB (1:100) 中稀释 100 X DAPI, 准备一个 DAPI 溶液.
  6. 用 DAPI 溶液 (100 和 #181; L/好) 在台式样品搅拌机上孵育15分钟的胚胎或组织。用 PBTT 洗涤 4 X 10 分钟。在4和 #176 中将96井板与样品一起储存, 或者继续下一步.
    注意: 在此过程中可以暂停.

6。使用 tyramide 的抗体检测 (请参见 图 5 )

注意: 这里自制的菁3共轭 tyramide 被使用, 根据在 12 中描述的协议编写.如果做许多实验或测试许多样品, 这节省了大量的钱, 是有效的比商业试剂 (从经验)。为了减少实验和样品, 可以使用商业上可用的菁 3-tyramide (见材料).

  1. 洗涤样品板 3 x 为 5 min 与 1 x PBTT.
  2. 准备 tyramide 激活缓冲区 (激活缓冲区), 包含0.006% 的 H 2 O 2 PBTT (稀释 30% (w/w) h 2 O 2 库存 1:5000).
  3. 我我用激活缓冲器冲洗盘子
  4. 用15毫升管中的活化缓冲液将其稀释, 以制备菁 3-tyramide 溶液。
    1. 对于胚胎, 使用1:80 稀释 (137 和 #181; 在11毫升的活化缓冲液中, tyramide 3)。对于幼虫组织, 使用1:150 稀释剂 (73 和 #181; 在11毫升的活化缓冲液中, 用 3-tyramide)。对于成人睾丸, 使用1:200 稀释剂 (55 和 #181; 在11毫升的活化缓冲液中, 用 3-tyramide)。对于成人卵巢, 使用1:300 稀释剂 (36 和 #181; 在11毫升的活化缓冲液中, 用 3-tyramide).
  5. 在台式样品混合器上用 3-tyramide 溶液为2小时孵育样品。用 PBTT 冲洗四次。用 PBTT 洗涤 6 X 10 分钟。用 PBS 清洗 3 X 5 分钟, 去除洗涤剂.
  6. 添加150和 #181; 防安装介质的 L/井。将样品保存在4和 #176; C 允许组织或胚胎沉到管子的底部。在显微镜下安装标本 (在解剖范围内组织) 和覆盖片。用透明指甲油封住片的边缘.
  7. 图像使用荧光显微镜.
    注意: 首先分析负控制, 得到 #8216; 非特异性和 #8217; 背景。
    和 #160;

Representative Results

图 6显示了使用此过程获得的结果的示例。前3面板显示了早期的果蝇胚胎 (图 6, 面板 A-C) 的示例, 接下来的3面板显示了在不同组织 (amnioserosa、肌肉和中枢神经系统中有信号的晚期果蝇胚胎的示例。分别 (图 6, 面板 D-f)。接下来是第三龄幼虫组织的例子 (图 6, J 型面板)。K 和 L 组显示成人性腺 (卵巢和睾丸分别) 的代表性图像。在我们可搜索的 "荧光原位果蝇数据库" (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)) 上上载并标注了数以百计的图像。

Figure 1
图1。荧光原位杂交 (fish) 协议和关键设备概述.(A) cDNA 的 pcr 扩增。(b) 体外转录在一个96井板中生成基因特异的反义挖掘标记 RNA 探针 (如 B 所示的板的照片)。(C)(D):成人 (女性: 男性比率 2:1. 300-400 苍蝇/瓶) 苍蝇可以交配3-4 天。在25° c 的标准玉米面食品上过夜收集的胚胎被转移到一个通风良好的塑料盒 (1 升的玉米面食品在一个容器大小: 8 "x 8" x 3 "高) 或新瓶保持适当的幼体密度。对于组织收集, 活性酵母粉应洒在食物的顶部 24, 48 小时后产卵 (快)。(E 到 H):荧光原位杂交试验连续3天进行。对于不漂浮的胚胎或组织, 使用96井 PCR 板, 如图 b 所示, 8 通道器 (相片 c)。对于漂浮的组织, 像大多数幼体组织一样, 使用一个滤底板 (在 d 中的照片), 并使用低压下的流形器从底部去除液体 (e 中的照片)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。RNA 探针产量的测定。在1% 琼脂糖凝胶 (5 µL/车道) 上观察到的新合成反义 RNA 探针。产量可以被分类 (根据带的强度) 作为 "低收益" 在车道3和 10, ' 典型的出产量 ' 在车道 1, 4, 5, 6 和 8, 或 "高收益" 在车道 2, 7, 9, 11 和12。对于具有 "典型产量" 的样品, 使用10-15 µL 探针稀释100µL 的杂交溶液为每个原位实验。根据波段强度相对于 "典型探针" 强度, 将探针的 "高收率" 稀释样品与附加杂交溶液。目的是在每个井中有大致相等的最终探针浓度。箭头指向一个 ' RNA 探针 ', 在每条车道上的更高的波段是原始的 DNA 模板。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。large-scale 胚胎采集和固定的主要步骤.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。自制的管子, 用于从幼虫或漂浮的组织中除去液体.一些幼虫和成人组织在固定期间漂浮在溶液中。这个简单的工具由一个尼龙网格由一个200µL 削减尖端, 后跟一个1毫升小费作为适配器连接到一个器。液体可以安全地去除, 而不会丢失任何组织。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。Tyramide 信号放大.(1) 用内源感 rna hybridizes 的反义 rna 探针。(2) 生物素-共轭主抗体与挖双绞线之间的免疫亲和结合。(3) HRP 共轭亲和结合生物素。(4) HRP 催化菁 3-tyramide 和过氧化氢反应形成短命的菁 3-tyramide 基。(5) 菁 3-tyramide 基与邻近蛋白的酪氨酸残留物结合。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。代表原位杂交图像.每个面板显示一个不同的 RNA (显示在青色) 和细胞核染色的 DAPI (以红色显示) 的例子。(A-C)早期的果蝇胚胎的例子。(D、F)晚期果蝇胚胎的示例。(G-J)例第三龄幼虫果蝇幼体组织 (malphigian 管、中肠、涎腺和肌肉分别)。(K) 成人卵巢。(L) 成人睾丸。每个面板都显示探针与之杂交的基因的名称。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

所描述的协议为检测固定的果蝇胚胎或组织中的大多数 rna 提供了一种高度重现性、灵敏和经济的方法。虽然比传统的碱性磷酸酶探针检测方法稍微复杂一些, 但鱼获得的分辨率要大得多, 灵敏度是可比较或改进的7,8。通过使用整体或部分孔板, 该协议可用于 large-scale 或有限分析的兴趣基因。应该注意的是, 所生成的探针可能检测到所有或多个成绩单拼接形式, 除非探头更具体地设计 (即单显)。尽管我们已经测试了小到200核苷酸的探针, 但有合理的成功, 较小的探针往往不太有效, 而且可能不太具体。显然, 此协议不适用于检测小内含子、显或处理的 rna。

虽然这种方法使用酶的步骤, 以提高信号的强度, 信号强度似乎成正比的目标基因表达在一个相对线性和广泛的表达水平。在高倍率下, 信号被视为细胞和组织内的点或斑点。为相对地罕见的抄本仅少数微小的点被看见。随着成绩单的增多, 这些增长的数量和规模。与单分子鱼 (smFISH) 一样, 单个的小点也可以对应于单一的 rna, 并且还应该使用成像和信息学软件进行量化。使用 smFISH 与我们为同一目标所策划的图像进行对比, 表明这两种方法的整体性、灵敏度和分辨率是相对相似的, 尽管这应该通过更严格的比较来测试。鉴于 smFISH 的费用要高得多, 这里提供的方法应该以成本的一小部分给出类似的结果。然而, 如果目标是检测小的成绩单, 或不同部分的成绩单, 建议 smFISH。

由于一些鱼探头的体积较小, 这种方法在穿透组织大或有明显障碍的情况下也会更好。然而, 我们使用更高的洗涤剂水平和组织固定和性调整似乎解决了这个问题。最后, 虽然开发了为果蝇组织, 这里描述的高洗涤剂缓冲的组织也应该为果蝇胚胎以及大多数其他有机体和组织工作。

Disclosures

作者没有竞争的金融利益。

Acknowledgments

该项目的资金支助是由加拿大卫生研究所的 HMK 赠款提供的 (赠款拖把 133473)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
Agarose Bioshop AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide Bioshop FOR001.500
Glycerol Bioshop GLY002.4
Glycine Bioshop GLN001.500
Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
Name Company Catalog Number Comments
Solutions Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

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References

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高分辨率荧光<em>原位</em>杂交在<em>果蝇</em>胚胎和组织中使用 Tyramide 信号放大
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Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).More

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

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