Summary
교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.
Abstract
표현의 패턴 및 초파리 게놈 넓은 기준 RNAs의 subcellular 지 방화를 결정 하기 위해 노력 하 고 다양 한 조직에에서, 우리 우리의 원래 형광 현장에 수많은 수정 및 향상 된 개발 했습니다. 교 잡 (물고기) 프로토콜. 처리량 및 비용 효율성을 촉진 하기 위하여 신호 검출 프로브 세대에서 모든 단계는 exon 결정 96 잘 접시를 사용 하 여 수행 됩니다. Digoxygenin (파)-이라는 antisense RNA 프로브 템플릿으로 게놈 DNA 또는 cDNA 클론을 사용 하 여 생산 됩니다. 조직 고정 permeabilization 후에, 프로브는 성적 관심에 때 교배 하 고 biotin, streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 활용 하 고 붙일 활용에 활용 된 안티 발굴 항 체의 승계를 사용 하 여 검색 tyramide, HRP, 존재는 즉시 인접 한 단백질의 전자 밀도가 지역에는 반응성이 매우 높은 중급. 이러한 증폭 및 지역화 단계 두 세포 및 subcellular 사본 지역화를 용이 하 게 하는 강력 하 고 매우 지역화 된 신호를 생성 합니다. 제공 하는 프로토콜은 다양 한 조직 및 발달 단계에서에서 매우 구체적인 신호를 생산 하기 위해 최적화 되었습니다. 참조 또한 동시에 여러 성적 증명서 또는 성적 증명서 및 단백질의 동시 탐지를 허용 하는 추가 변이 대 한 제공 됩니다.
Introduction
RNA-seq 같은 새로운 RNA 게놈 넓은 탐지 방법 우리의 지식과, 유전자 표현는 언제, 어디의 무슨 레벨1에서 크게 확대. 그러나,이 상대적으로 가난한 시간적, 공간적 해상도 제공합니다. RNA 제자리 교 잡에 따라서 세포 및 subcellular 지 방화2의 세부 사항을 공개 고정 조직, 시각적으로 관찰 기록의 공간 배급을 허용 한다. 형광 성 제자리 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 더 많은 공간 해상도를 confocal 빛 시트 현미경3같은 강력한 현미경 검사 법 기술의 사용을 허용 수 있습니다. DAPI 같은 형광 마커 subcellular 관계4설정에 사용할 수 있습니다. 물고기는 또한 subcellular 수준에서 중복의 명확한 표시와 동시에 여러 개의 RNAs 단백질의 관측을 촉진 한다. 독특한 시 약 및 더블 라벨에 필요한 단계는 다음 참조3,5에서 찾을 수 있습니다.
여기에 설명 된 절차 96 잘 결정 플레이트 cDNA 템플릿 생산 (식민지 PCR), RNA 프로브 생산 (T7, T3 또는 SP6 중 합 효소 종속 실행 전사 사용) 에서 제자리 교 잡를 포함 하 여 모든 단계에 대 한 활용 및 형광 신호 개발입니다. 충분 한 수의 배아 또는 조직 각각에 추가 됩니다 수 있도록 일관성과 다양성의 평가 96 잘 접시의 잘. 각 그럼 다른 조사를 받습니다. 신호 개발 후 배아 또는 각 우물에서 조직 현미경 분석에 대 한 개별 현미경 슬라이드에 짓고 있다.
프로브 탐지를 위한 tyramide 신호 증폭 (TSA)를 사용 하 여 뛰어난 subcellular 해상도 5,6,,78강력한 신호를 생성합니다. RNAs의 subcellular 지 방화 발생 하는 거의 모든 RNAs 4,,1011에 표시 되는 중요 한 규제 메커니즘 9 입니다. 이 분석에서는 RNA-seq에 의해 검색 되지 않은 많은 성적은 쉽게 물고기 8에서 검색도 나타났습니다. RNA 교 잡 제자리에서 96 잘 접시에 적응 한 번에 (추가 하는 경우 더 많은 접시를 사용), 큰 데이터 집합의 분석을 가능 하 게 관심의 최대 96 유전자의 분석을 수 있습니다. 작은 섹션으로 번호판을 절단 하 여 메서드는 단지 몇 가지 샘플을 쉽게 적응 됩니다. 제공 하는 프로토콜은 대부분의 유형의 조직에서 RNA 배포판의 분석에 적합 합니다. 표시 되지 않습니다, 그것은 비-초파리 조직으로 잘 적응할 수 있는입니다.
Protocol
1. cDNA 템플릿에서 플라스 미드 PCR 증폭
참고: 고품질 플라스 미드를 사용 하 여 또는 RNA에 대 한 DNA PCR 생성 템플릿을 프로브 합성. 버클리 초파리 게놈 프로젝트에 의해 생성 된 초파리 유전자 컬렉션 (DGC) 라이브러리는 대부분 코딩 유전자 초파리 게놈에서 발견의 범위를 제공 합니다 (표 1a 참조). 이들은 또한 어떤 cDNA 삽입의 증폭에 대 한 보편적인 뇌관의 사용을 허용 한다. 이 PCR 확대는 플라스 미드 DNAs lysates 세균성 문화를 포함 하는 플라스 미드의 존재에서 수행 됩니다. DNA 제품 다음 센스 RNA 프로브 (참조 표 1b)를 생성 하 체 외에 전사에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다.
- 증폭 PCR에 의해 관심사의 유전자의 엑손 특정 지역에 뇌관 디자인 (예. genomic DNA에서), T7 중 합 효소 인식 사이트 센스 끝에 가령.
- 96 잘 접시의 불필요 한 부분 잘라 미만 96 샘플 실험. 씰링 접시 커버 모든 외피와 스토리지에 대 한 참조 자료를 테이프. Microcentrifuge 튜브를 사용 하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정.
참고: 96 잘 접시 비용 절약에 대 한 작은 볼륨으로 늘어난된 처리량, 멀티 채널 펫의 사용을 허용.
| 테이블 1a | ||||
벡터 | 항생제 농도 1:1000 일 |
뇌관 | RNA 중 합 효소 위한 antisense | RNA 중 합 효소. 대 한 감각 |
| pFLC-난 | 앰프 | pBst_SK (-) _F/R | t 3 | T7 |
| pBSt(-) | 앰프 | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | 바로 | pOT2_F/R | S p 6 | T7 |
| pOTB7 | 클 | pOT2_F/R | t 7 | SP6 |
| 표 1b | ||||
| 뇌관 | 순서 | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Reverse | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
표 1: A) 일반 DGC cDNA를 증폭에 대 한 복제 정보를 플라스 미드에 삽입. B) 시퀀스 DGC 플라스 미드에 대 한 보편적인 뇌관의.
- 적절 한 항생제 선택 (1000 X 항생제 주식의 희석 1:1000)와 당 파운드 미디어의 240 µ L의 10 µ L을 추가 하 여 96 잘 문화 접시에
- 포함 하는 플라스 미드의 성장 250 µ L 세균성 문화 (글리세롤 재고)에서 포함 하는 플라스 미드 박테리아. 물개와 바다 표범 어업 테이프.
- 품 (O/N) 37 ° C 하룻밤에 215 rpm에서 떨고.
참고: 세균성 글리세롤 cDNA 플라스 미드 복제 주식 대체 원래 하의 새 복사본을 만듭니다. 이 박테리아를 죽 일 수 있습니다로 원래 세균성 주식을 refreeze 하지. - PCR 템플릿을 생산 90 µ L 압력가 ddH 2 O 새로운 96-잘 PCR 플레이트의 각 음에 O/N 세균성 문화 10 µ L 희석. Thermocycler에서 95 ° C에서 5 분 동안 DNA 변성 적어도 5 분 ice에 접시를 즉시 배치
- 표 2에 의하여 적절 한 보편적인 뇌관을 사용 하 여 준비 PCR 반응.
| 시 약 | 50 μ 샘플 반응 | 96 잘 혼합 (112 x 반응) | 최종 농도 |
| 2 X PCR 중 합 효소 혼합 | 25 μ | 2800 μ | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/μ) | 0.5 μ | 5 6 μ | 0.25 pmol/μ |
| Primer_Rev (25 pmol/μ) | 0.5 μ | μ 56 | 0.25 pmol/μ |
| ddH2O | 22 μ | μ 2464 | < /tr > |
| 총 | 48 μ | 5376 μ |
표 2: PCR 주인 혼합.
- 피 펫, 새로운 96-잘 PCR 플레이트의 각 음에 PCR 마스터 믹스의 aliquot 48 µ L를 사용 하 여. 잘 당 각 변성된 플라스 미드 DNA 템플렛의 2 µ L 추가.
참고: 사이 1 picogram (pg) 플라스 미드 DNA의 1 나노 그램 (ng)를 사용 합니다. 과도 한 DNA 템플렛 PCR 수확량 및 특이성을 감소 시킨다. - 표 3 당 96 잘 PCR 기계를 프로그램 하 고 증폭을 수행.
참고: 72 ° C에서 확장 시간 PCR 제품의 크기에 의해 결정 됩니다 (45 s ≤ 2.0 kb, 1.5 분에 대 한 ≤ 3.0 kb, 3 분에 대 한 ≤ 4.0 kb 및 4.0-5.0 kb 3.5 분). 어 닐 링 온도 (Tm) 뇌관의 순서에 의해 결정 됩니다. 때 뇌관은 동일 하거나 20 이상 nt, Tm으로 계산 됩니다:
Tm (° C) = (CG의 4 X 수) + (2 X 수의)-4.
| 단계 | 온도 | 시간 | Cycle(s) |
| 1 주기 | 초기 변성 | 95 ° C | 3 분 |
| 증폭 변성, 어 닐 링 및 확장 | 95 ° C | 45 초 | < td 행 스팬 = "3" > 30 사이클|
| 54-58 ° C | 45 초 | ||
| 72 ℃ | 45 초-3.5 분 | ||
| 최종 확장 | 72 ° C | 7 분 | 1 주기 |
| 스토리지 | 4 ° C | 개최 |
표 3: PCR 프로그램 권장.
- PCR 제품 강 수 에탄올 (EtOH)와 나트륨 아세테이트 (NaOAC) (표 4 참조).
참고: ddH 2 오 50 µ L을 작성 하는 경우 PCR 반응 볼륨은 50 µ L, - DNA를 침전, 혼합 표 4 및 저장소 샘플 O/N-20 ° C 또는-80 °C.Centrifuge에 30 분에서 구성 요소 c에 4 ° C. 사용 8 채널 매니폴드 피펫은에서 2250 x g에 45-60 분 96 잘 접시
- arefully는 상쾌한을 제거 합니다. 차가운 70%의 160 µ L로 한번 세척 EtOH (RNase 무료) 30 분 2250 x g 4에 ° c.
참고: 침전 된 DNA는 우물의 하단에서 볼 수 있습니다. 짧은 PCR 제품 필요 이상 centrifugations. - 부드럽게 96 잘 접시에 각 잘 액체의 마지막 방울을 제거 하는 종이 타월에 반전 (가능한). 공기 건조 실 온 (RT)에서 1 h 펠 렛 DNA. 25 µ L RNase 무료 물에 침전 된 DNA resuspend.
참고: 1 h 공기 건조는 EtOH 증발의 모든 흔적을 허용할 것 이다. 그러나, 액체 (약 1 µ L)의 아주 작은 볼륨에 완전히 건조에서 DNA 펠 릿을 방지 하기 위해 각 잘 유지 됩니다. 25 µ L를 사용 하 여 50 µ L PCR 반응에 대 한. 다음 단계에서 녹음 방송 생체 외에서 간섭을 유발 하지 않도록이 단계에서 DEPC 처리 수 사용 하지 마십시오.
| 구성 요소 | 볼륨 | 부분 |
| PCR | 50 μ | |
| 100% 에탄올 | 125 μ | PCR의 2.5 X 권 |
| 3 M NaOAc (pH = 5.2, RNase 무료) | 5 μ | PCR의 vol. 10% |
| 총 | 180 μ |
표 4: 50 µ L PCR 반응의 예.
- 1 X 태 버퍼에 1 %agarose 젤에 resuspended DNA 솔루션의 5 µ L을 실행 하 여 크기와 PCR 제품의 수율을 확인.
참고: 총 DNA 템플렛의 250-500 ng는 녹음 방송 반응 생체 외에서 15 µ L에 대 한 필요 합니다. 샘플 더 높은 수익률을 더 희석 수 있습니다. RNA 수익률 또한 시퀀스 및 DNA 템플렛의 길이에 따라 달라 집니다. 발굴-RNA T7 RNA 중 합 효소와 라벨에 대 한 일반적인 가이드에 따라 발굴 표시 된 RNA의 약 10 µ g 1 µ g 선형화 서식 파일에서 생산 됩니다.
2. 센스 프로브를 생성 하기 위해 녹음 방송 생체 외에서.
참고: RNase 없는 환경에서 작동 것이 결정적 이다. 모든 시 약 및 실험실-도자기 (예: 인증된 DNase/RNase 무료 플라스틱 도자기) 무료 RNase 이어야.
| 구성 요소 | 주식 농도 | 볼륨 | 최종 농도 |
| ATP | 100 m m | 7 μ | 10mm |
| CTP | 100 m m | 7 μ | 10 m m |
| GTP | 100mm | 7 & # 956; l | 10mm |
| UTP | 100mm | 4.5 μ | 6.5 m m |
| 발굴-11-UTP | 10 m m | 25 μ | 3.5 m m |
| RNase 무료 물 | < 신안 > | 19.5 μ | |
| 총 | 70 μ |
표 5: 발굴 NTP 믹스 준비.
< 표 테두리 = "1" fo:keep-together.within-페이지 "1" fo:keep =-와-next.within-페이지 "항상" = >(112 x 반응)
표 6: 2 X 전사 마스터 믹스.
표 5에 의하여- 준비 발굴-NTP 믹스.
참고: 실수를 피하기 위해, 항상 정렬 접시는 a 1 접시의 왼쪽된 상단 모서리에. - 새로운 96-잘 PCR 플레이트 (프로브 접시)에 각 음을 표 6에 설명 된 추가 구성 요소. 잘 대응, 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 PCR 제품 (DNA 템플렛)의 7.5 µ L를 추가 합니다. 바다 표범 어업 테이프와 플레이트 커버.
참고: 녹음 방송 반응 당 추가 PCR 제품의 최적의 금액 0.5와 1 µ g 사이 이어야 한다. 밴드에는 젤 크게 약한 또는 더 강렬한 있다면, 반응에 추가 하는 DNA의 볼륨 적절 하 게 조정할 수 있습니다. 정확한 금액은 중요 하지 않다. - DEPC의 35 µ L 합성된 프로브의 3.5-4 h. 혼합 15 µ L ddH 2 O, 125 µ L 100의 취급에 대 한 37 ° C에서 프로브 플레이트를 품 어 %EtOH, 및 3 M NaOAC의 5 µ L (pH = 5.2, RNase 무료). 적어도 30 분 원심 분리기-80 ° C에서 저장 하 고 씻어 1.10.2 및 1.10.3 단계에서 설명한 대로.
- Resuspend 25에서 침전 된 프로브 µ L DEPC의 1 %agarose 젤에 ddH 2 O. 실행 5 µ L 처리 (시간을 실행 < 20 분) 무결성 및 프로브 ( 그림 2)의 수익률을 확인 하.
참고: agarose 젤 DEPC 처리 ddH 2 O와 태 버퍼 만들 수 있어야 합니다. 젤 전기 이동 법 기구 RNA에 대 한 할당 해야만 작동. 낮은 속도로 시간을 실행 하는 더 긴 젤 전기 이동 법 동안 RNA 저하로 이어질 수 있습니다. - 100 µ L 교 잡 솔루션 (표 7)와 저장소-80 ° C까지 필요에 합성 조사의 나머지 20 µ L를 혼합.
참고: 프로브 농도 희석 수 있습니다 더 밴드는 특히 강력한 (그림 2 참조 예) 하는 경우. 하이브리드 솔루션은 RNase 오염 방지에 매우 효과적 이다. 즉시 RNA 강 직을 피하기 위해 resuspended 프로브를 교 잡 솔루션을 추가 합니다. 교 잡 솔루션 0.2 µ m 필터를 통해 필터링 할 수 있다. 조직 샘플, 0.3%의 최종 농도에 트리톤-X-100을 추가 하 여 교 잡 솔루션에 세제 농도 증가.
| 구성 요소 | 볼륨 | 최종 농도 |
| DEPC 처리 ddH2O | 11.85 ml | %23.7% |
| 20 X SSC | 12.5 ml | 25% (5 X) |
| Formamide | 25 ml | %50% |
| 헤 파 린 (50 mg/ml) | 0.1 ml | 0. 2% (0.1 mg/ml) |
| 연어 정자 단일 좌초 DNA | 0.5 ml | %1.0% |
| 트윈-20 | 0.05 ml | %0.1% |
| 총 | 50.00 ml | %100% |
3. 초파리 양육 및 배아, 애벌레와 성인 조직 컬렉션.
참고: 작은 규모 (병)와 질량 (상자) 양육 비행, 비행 실험실 표준 프로토콜을 사용 하 여 25 ° C. 유지 적절 한 성인 및 애벌레 밀도에 cornmeal 기반으로 음식에 고 추가 활성 효 모 분말 식품에 제공 표면.
표준 프로토콜을 수행 하는- 수집 배아 배아 컬렉션의 주요 단계는 그림 3에 나와.
참고: 메탄올에 devitillinized 배아를 rinsing 후 고정된 배아 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최대 1 년. 태아 permeabilization와 후 고정 물고기 프로토콜의 1 일에 수행 됩니다. - 준비 신선한 40 %PFA 재고 솔루션입니다.
DEPC의 10 mL를 혼합 하 여 40 %paraformaldehyde (PFA)의
- 준비 갓 만든된 재고 솔루션 치료 ddH 2 O PFA 및 포함 하는 작은 저 어 바 20 mL 유리 섬광 유리병에 2N 코의 70 µ L의 3.68 g
주의: PFA 잠재적인 급성 및 만성 건강 효과와 매우 독성이 있다. MSDS (물질 안전 데이터 시트)을 읽었고 눈, 피부, 그리고 호흡 기관에 대 한 적절 한 보호와 함께 사용. - 연기 후드, 열에 PFA 완전히 해산 될 때까지 200 ° C에서 난방 접시에 3-5 분에 대 한 유리병을 저 어. 최대한 빨리는 PFA 해산 열에서 PFA 재고 솔루션을 제거 (과열 되지 않습니다).
- 5 분 동안 얼음에 녹아 40 %PFA 재고 솔루션을 냉각 하 고 0.2 µ m 필터와 10 mL 주사기 필터링.
- 준비 갓 만든된 재고 솔루션 치료 ddH 2 O PFA 및 포함 하는 작은 저 어 바 20 mL 유리 섬광 유리병에 2N 코의 70 µ L의 3.68 g
- 3 탈피 하는 애벌레 (L3) 또는 성인 조직 고정, 냉각 및 permeabilization
참고:이 프로토콜은 하루에 완료 되어야 합니다. 그것은 포함 하는 조직을 절 개, 고정, 생 HRP, permeabilization 및 후 고정 냉각.- 준비 고정 솔루션 (수정-I 및 수정-II)에 의하여 표 8.
참고: Picric 산 사용 됩니다 추가 정착 액으로 조직 된 섬세 한 구조를 유지 해야 합니다. 그것은 좋은 정착 제 때 열 대권 외의 조직 전자 현미경 검사 법 (EM)에 대 한 유지 해야 합니다.
경고: Picric 산 불안정 및 다른 재료와 함께 반응과 폭발성 화합물을 만들 수 있다. 사용 및 안전 지침에 따라 저장. - 장소 애벌레 또는 성인 파리 차가운 1x PBS의 10 mL와 수정 100 µ L를 포함 하는 50 mL 플라스틱 튜브에서-난 솔루션. 애벌레 또는 성인 플라이 운동 성 감소를 2 분 동안 얼음에 진정.
- 컷 2-3 m m 오프닝 만들려고 1 mL 플라스틱 팁의 끝에서. 10-30 애벌레 전송 또는 성인 파리 1 mL 팁과 페 트리 접시 (지름 9 c m)으로 1 X PBS의 얕은 층으로 50 mL 튜브 (3.3.2 단계)에서. PBTT의 비트를 추가 하는 것은 표면 장력 줄일 수 있습니다. 신중 하 게 해 부하는 애벌레 (앞쪽에서 열고 앞쪽에 후부에서 조직을 짜) 또는 해 범위에서 날카로운 집게의 쌍에 대 한 관심의 성인 조직.
참고: 약 200-300 애벌레 또는 성인 testes 수 수 해 부하 고 숙련 된 개인에 의해 하루에 고정. - 전송 해 부 200 µ L 피펫은 조직 (여 2 mm 직경을 만들려고 잘라 팁)과 1.5 mL 튜브와 얼음에 저장소에. 다음 단계로 진행 하기 전에 10-15 분 이내 해 부의 각 라운드를 완료.
참고: 계속 추가 라운드 (2 h 시간 창)에서 충분 한 자료를 생성 하는 데 필요한 대로. - 수정 조직 800 µ L의 수정-난 벤치 가기 믹서에 30 분을 위한 솔루션. 일단 800 µ L 1 X PBTT와 최대 30 분으로 2.5 헤 아이스 튜브 유지 린스 조직 제한, 충분 한 조직 수집 때까지 batch-wise 수행이 요구.
- 뚜껑에 메시를 포함 하는 단일 15 mL 플라스틱 관으로 모든 해 부 및 고정 조직 수영장 (튜브 디자인 그림 4 참조). 과잉 액체는 관 뚜껑에 메시를 통해 발음 3 X 5 분 각각 10 mL와 함께 1 X PBTT의 세척. 세제를 제거 하려면 1 X PBS의 10 mL로 두 번 씻어. 그러면 다음 단계에서 과잉 거품.
참고: 경우 튜브의 아래쪽에는 침 몰 하는 해 부 조직, 단계에서 수행할 수 있습니다 일반 결정 또는 0.5-1.5 mL microcentrifuge 튜브 (튜브 당 300-800 µ L 볼륨). - 는 0.3% H 2 O 2 PBS에 실시간 반복에서 15 분의 5 mL와 함께 내 생 HRP 활동을 한 번 더 끄다. 뜨고 뚜껑이 단계 혼합 하지 않고. 1 X PBTT의 10 mL를 사용 하 여 두 번으로 하는 린스 1 X PBTT의 10 mL와 5 분 동안 두 번 세척.
- Permeabilize 80% 아세톤 (-20 ° C, 미리 냉장) 10 mL와 조직-20 ° C 10 분 반전에서 튜브 인큐베이션 기간 동안 두 번. 조직 rehydrate 하 1 X PBTT의 10 mL와 10 분 동안 두 번 세척.
- 린스 5 ml PBTT 플러스 5 ml 교 잡의 10 mL 혼합 솔루션 (1:1). 믹스를 폐기 하 고 10 ml 교 잡 솔루션으로 대체. 샘플-20 ° C까지 필요에 저장할 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 저장 하지 마십시오 샘플 1 주일 이상에 대 한.
- 준비 고정 솔루션 (수정-I 및 수정-II)에 의하여 표 8.
| 구성 요소 | II (10 ml)을 수정 | 수정 I (10 ml) |
| 40 %PFA 주식 | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8.99 ml | 9 ml |
| Picric 산 용액 | 10 μ | - |
4. 제자리에서 교 잡
참고: 프로토콜의이 부분은 필요한 최소 2 일, 샘플 준비, 사전 교 잡 및 교 잡 복용에 하루 1과 프로브 탐지에 배치 2 일입니다. 샘플의 수는 상대적으로 높은 경우 익숙하지 않은 프로토콜, 또는 하루 종일 불가능, 프로토콜 3 일 2 일간 나누어 프로브 탐지 및 신호 증폭의 단계에서 수행 되어야 합니다. 배아 또는 해 부 조직 샘플의 많은 또한 추가적인 일을 처리 해야 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 해 부 조직 샘플에 대 한 모든 단계에 1 X PBTT으로 1 X PBT를 바꿉니다. 추가 세제는 많은 애벌레와 성인 조직, 뇌, 고환 등의 침투에 대 한 필요 합니다. 비록 테스트 하지 1 X PBTT는 태아에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 잘 당 100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시 및 1.5 mL 튜브에 대 한 800 µ L.
- 사전 교 잡 및 교 잡
참고: 단계 4.1.1-4.1.6.2는 태아에서 제자리 교 잡에 대 한. 내 현장에서 애벌레 또는 성인 조직에 대 한이 단계를 건너뜁니다.- 새 15 mL 튜브에 고정된 배아 (-20 ° C에서의 메탄올에 저장)의 제거 2 mL
- . 각 세척에 메탄올 10 mL와 함께 7 분에 대 한 두 번 배아를 씻어. Wa쉬 배아 10 mL의 혼합물 메탄올 및 1 X PBTT (1:1)와 7 분. 씻어 rehydrate 1 X PBTT의 10 mL와 함께 7 분 동안 두 번 배아.
- 태아 permeabilization에 대 한 재고 솔루션 (20 mg/mL)에서 1: 500을 diluting 하 여 중간 성분을 K 솔루션 (40 µ L/mL)을 준비. 스토어-20 ° C. 확인 2.667 ug/mL의 최종 작업 집중에 대 한 1 X PBTT에서 중간 성분을 K 솔루션 1/15을 diluting 하 여 작업 가수분해 K 솔루션.
- Permeabilize 배아 가수분해 K 솔루션 (배아의 작은 숫자에 대 한 더 적은 사용) 작업의 10 mL와 함께. 13 분 부드럽게 반전 튜브 4 회는 인큐베이션 기간 동안 대 한 RT에서 튜브를 품 어. 혼합 하지 않고 1 시간에 대 한 얼음에 가수분해 K 솔루션에서 샘플을 품 어.
참고: 희석 가수분해 K 가진이 비교적 긴 외피 보장 reproducibly 균일 한 permeabilization 및 후속 얼룩. - 배아 permeabilize, 동안을 2 mg/mL 10 X 재고 (20 mg/mL)에서 글리신 솔루션 30 mL의 전체 볼륨에 대 한 1 X PBTT.
- 제거 성분 K 솔루션, 글리신 솔루션 (2 mg/mL)의 10 mL로 씻어 고 2 분 동안 두 번 씻어. 세 번은 글리신을 제거 하려면 1 X PBTT의 10 mL로 씻어.
- 배아의 후 고정입니다.
- 준비 4%의 10 mL PFA (40%의 1 mL PBTT의 9 ml PFA 0.45 μ m 필터를 통해 필터링).
- 4%에서 샘플을 품 어 20 분 세척 3 X 2 분에 대 한 PBTT와 PFA.
- 변성된 교 잡 솔루션을 준비 하는 교 잡 솔루션을 5 분 끓인 다. 전체 96 잘 접시 12 mL의 3 개의 튜브를 사용 합니다. 5 분에 대 한 즉시 얼음에 멋진 1 X PBTT의 10 mL를 한번
- 린스 배아: 교 잡 솔루션 (1:1). 하이브리드 솔루션의 5 mL로 두 번 씻어. Aliquot ~ 20 µ L의 당 또는 태아 (배아 30-40)을 해결 하는 조직 얼음에 96-잘 PCR 플레이트에 고정. 조직 또는 태아는 8 개 채널 매니폴드 피 펫 ( 그림 1 / 비디오)를 사용 하 여 교 잡 솔루션 제거.
참고: 매니폴드 피펫으로는 ‘ 중지 ’ 우물의 바닥 하 고 샘플을 제거에서 팁 방지. 실험 조직 플 로트를 사용 하 여, 위에서 신중 하 게 100 µ L 피펫으로 액체 제거.
- 각 잘 변성된 교 잡 솔루션의 추가 100 µ L. 중 금속 구슬 (자료 및 그림 1 참조)를 포함 하는 마른 목욕 난방 장치를 사용 하 여 56 ° C에서 2.5-3 h의 최소 배아 교배. 5 분 동안 얼음에에서 80 ° C. 즉시 차가운 5 분을 thermocycler를 사용 하는 96-잘 PCR 접시에서
- 변성 100 µ L 준비의 조사. 배아 또는 조직에서 사전 교 잡 솔루션을 제거 합니다. 추가 각 변성된 유전자 특정 프로브 샘플, 바다 표범 어업 테이프 커버 및 난방 장치와 건조 목욕에 금속 구슬에서 16-18 h O/N, 56 ° C에서 교배
5. 프로브 탐지
- 미리 따뜻한 56 ° C 난방 장치에서 표 9에 솔루션. 접시에서 프로브를 제거.
참고: 프로브 사이 다시 사용할 수 있습니다 2-3 번-80 ° C (결코 저장소 어떤 RNA 샘플-20 ° c에서)에 저장 하는 경우. 교 잡 후 이중 좌초 RNA 단일 가닥 RNA 보다 더 안정적 이며 RNase 오염으로 인 한 저하 적습니다.
사용 하는 경우는 다 잘 판 진공 여과 시스템, 조직에 대 한 수집 (어셈블리 자세한 동영상 참조) 프로브를 필터 플레이트 아래 컬렉션 접시를 포함. 교배 시킨된 조직 일반 96 잘 결정 접시 1.2 µ m 기 공 크기 PVDF 막 각 우물의 바닥에와 하나로 교 잡에 대 한 사용에서 전송 해야 합니다.
| 단계 | 솔루션 (56 ° C)를 미리 예 열 | 시간 | 잘 당 볼륨 |
| 1 | 교 잡 솔루션: PBTT (3:1) | 15 분 | 100 μ |
| 2 | 교 잡 솔루션: PBTT (3:1) | 15 분 | 100 μ |
| 3 | 교 잡 솔루션: PBTT (1:1) | 15 분 | 100 μ |
| 4 | 교 잡 솔루션: PBTT (1:3) | 15 분 | 100 μ | 5 | PBTT 3 세척 | 5 분 | 100 μ |
표 9: 교 잡 후 프로브를 세척.
- 일반 접시, 56 난방 단위에서 표 9에 의하여 워시 샘플을 사용 하는 경우 ° C. 경우 진공 매니폴드 시스템을 사용 하 여 온수 솔루션을 사용 하 여 벤치에 진공 시스템 및 vaccuum에 의해 아래에서 즉시 솔루션을 제거. 1 X PBTT와 3 세척 후 일반 접시가 열에서 제거할 수 있습니다 장치
- 준비 항 체입니다.
- Biotin 활용 된 마우스 단일 클로 널 항 발굴 항 체를 diluting 하 여 재고 (1 mg/mL)에서 1 차적인 항 체 솔루션 (2.5 µ g/mL)의 준비 11 mL (소재 목록 참조) PBTTB (1:400)에서. 적은 샘플을 처리 하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정.
- 준비 11 mL 1:1000 streptavidin HRP를 diluting 하 여 재고 (1 mg/mL)에서 동작 하는 streptavidin HRP 솔루션 (1 µ g/mL)의 PBTTB에서 (소재 목록 참조) 켤레. 적은 샘플을 사용 하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정.
- 배아 또는 실시간에 벤치 가기 믹서에 20 분에 대 한 PBTTB (1 X PBTT에서 1% 탈지 우유)와 조직 차단
참고: 필터 PBTTB 필터 막힘 방지 필터 96 잘 접시에 그것을 사용 하기 전에 필터 종이 (학년 3, 6 µ m)를 사용 하 여. PBTB, PBTTB 대신 (추가 0.3 %PBTB-x-100) 프로토콜 중 모든 조직에 대 한 사용 됩니다. - 품 배아 또는 벤치 탑 샘플 믹서에 2 h 항 체 솔루션 (100 µ L/잘) 조직. 1 두 번 린스 x PBTTB. 3 세척 5 분 및 5 X X 10 분 PBTTB. 배아 또는 streptavidin HRP 솔루션 (100 µ L/잘) 1.5 h 벤치탑 샘플 믹서를 사용 하 여 조직에 품 어. 세척 2 X 5 분 PBTTB. 이 시점에서 어둠 속에서 샘플 계속.
참고: 모든 항 체 세척, 동안 조직 불투명도 우유 생산으로 인해 손실 되는, 시도 우유 (PBTTB 대신 PBTT) 없이 세척. - Diluting 100 DAPI 솔루션 준비 PBTTB (1: 100)에 X DAPI.
- 품 배아 또는 DAPI 솔루션 (100 µ L/잘) 벤치 탑 샘플 믹서에 15 분에 대 한 조직. 씻어 4 X 10 분 PBTT. 샘플 O/N 4 ° C에 96 잘 접시를 저장 하거나 다음 단계로 진행.
참고: 프로시저 일시 중지할 수 있습니다 여기.
6. 항 체 탐지 tyramide를 사용 하 여 ( 그림 5 참조)
참고: 여기 수 제 cyanine 3 활용 tyramide 사용 되었다,이 프로토콜에서 설명에 따라 준비 되었다 12 . 많은 실험을 수행 하거나 많은 샘플 테스트,이 돈 상당한 금액을 저장 하는 경우은 효과에 비해 상업용 시 약 (경험)에서. 적은 실험 및 샘플, 상용 cyanine 3-tyramide 사용할 수 있습니다 (자료 참조).
- 워시 샘플 접시 3 X 5 분 1 X PBTT와.
- 준비 tyramide 활성화 (활성화 버퍼) 들어 있는 버퍼 PBTT (희석 30% (w/w) H 2 O 2 주식 1: 5000)에서 H 2 O 2의 0.006%. < l나 > 활성화 버퍼와 접시를 씻어.
- 15 mL 튜브에 활성화 버퍼에 그것을 diluting 하 여 준비 cyanine 3 tyramide 솔루션.
- 배아를 사용 하 여 1:80 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 137 µ L). 애벌레의 조직에 대 한 1:150 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 73 µ L)을 사용 합니다. 성인 고환에 대 한 1: 200 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 55 µ L)을 사용 합니다. 성인 난소에 대 한 1:300 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 36 µ L)를 사용 하 여.
- 벤치탑 샘플 믹서에 2 h cyanine 3 tyramide 솔루션 샘플을 품 어. PBTT 4 번 린스 합니다. 씻어 6 X 10 분 PBTT. 워시 3 X 5 분에 대 한 세제를 제거 하는 PBS.
- 추가 150 µ L/잘 방지 페이드의 설치 미디어. 조직 또는 배아 튜브의 하단에 싱크대를 허용 하려면 4 ° C에서 샘플 O/N을 계속. (아래 조직에 대 한 범위 해 부) 현미경 슬라이드에 샘플을 탑재 하 고 coverslip 커버. 투명 매니큐어와 coverslip의 가장자리를 밀봉.
- 형광 현미경을 사용 하 여 이미지.
참고: 분석의 아이디어를 얻으려면 먼저 부정적인 제어 ‘ 일반적인 ’ 배경.
Representative Results
그림 6 은이 절차를 사용 하 여 얻은 결과의 예를 보여줍니다. 상위 3 패널 패널 표시 예제 늦게 신호 초파리 배아 (amnioserosa, 근육 및 중앙 신경 조직, 다른 조직에 초기 초파리 배아 (그림 6, 패널 A-C), 다음 3의 예를 보여 각각 (그림 6, 패널 D-F). 다음은 예제 3 탈피에서 애벌레 조직 (그림 6, 패널 G J)입니다. 성인 생식 기에서 대표 이미지를 표시 하는 패널 K와 L (난소와 고환, 각각). 수백 개의 이미지는 업로드 하 고 우리의 검색에서 주석 '형광 제자리에 과일 파리 데이터베이스' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
그림 1입니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 프로토콜 및 키 장비 개요. CDNA의의 (A) PCR 증폭 (B) 녹음 방송 생체 외에서 생성 유전자 특정 센스 발굴-96 잘 접시 (b에서 표시 판의 사진)에서 RNA 프로브 표시. (C) 와 (D): 성인 (여성: 남성 비율 2:1. 300-400 파리/병) 파리 3-4 일 동안 친구를 사용할 수 있습니다. 25 ° C에서 표준 cornmeal 음식에 하룻밤 컬렉션에서 배아 통풍이 잘 플라스틱 상자에 전송 됩니다 (컨테이너 크기에 cornmeal 음식의 1 L: 8 "X 8" X 3"LWH) 또는 적절 한 애벌레의 밀도 유지 하는 새로운 병. 조직 컬렉션에 대 한 활성 효 모 분말, 계란 (AEL) 누워 후 48 h 24 음식 위에 뿌리고 해야 합니다. (H E): 교 잡 실험 형광 제자리에서 3 일 연속 수행. 사진 b 8 채널 흡 인기 (사진 c)와 같이 배아 또는 부동 하지 않는 조직, 96-잘 PCR 플레이트를 사용 합니다. 대부분 애벌레 조직 처럼 떠 조직에 대 한 필터 바닥 플레이트 d에서 (사진)를 사용 하 고 낮은 압력 (e에서 사진)를 사용 하는 매니폴드 흡 인기와 바닥에서 액체를 제거 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. RNA 프로브 수익률의 결정입니다. 새로 합성 antisense RNA 프로브 1 %agarose 젤 (5 µ L/레인)에 관찰. 수익률 (밴드의 강도에 따라) 분류 될 수 있다 '낮은 수익률' 3, 10 차선에서 1, 4, 5, 6, 8, 차선에 ' 전형적인 항복' 또는 '고수익' 차선 2, 7, 9, 11 및 12에서에서. '전형적인 수익률' 샘플에 대 한 조사 각 현장에서 실험에 대 한 교 잡 솔루션의 100 µ L에 희석의 10-15 µ L을 사용 합니다. '높은 수익률' 프로브 '전형적인 프로브' 강도 기준으로 밴드 강도 따라 추가 교 잡 솔루션 샘플을 희석. 각 우물에서 대략 동일한 최종 프로브 농도를 목표로 합니다. 화살표 'RNA 프로브', 중 하나를 가리키는 각 차선에 더 높은 악대는 원래 DNA 템플렛 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 주요 대규모 배아 수집 및 고정에 대 한 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 애벌레 또는 부동 조직에서 액체를 제거 하기 위한 수 제 튜브. 일부 애벌레와 성인 조직 고정 중 솔루션에서 부동. 나일론 메쉬 1 mL 팁으로는 흡 인기에 연결 하는 어댑터 뒤 끝을 잘라 200 µ L에 의해 개최이 간단한 도구에 의하여 이루어져 있다. 액체는 어떤 조직을 잃지 않고 안전 하 게 제거할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. Tyramide 신호 증폭. (RNA 생 감각과 센스 RNA 프로브 1) 파기 표시 된 hybridizes. (Biotin 활용 된 1 차적인 항 체 발굴 UTP 사이 2) 면역-선호도 바인딩. (3) HRP streptavidin 바인딩 biotin 활용. (4) HRP catalyzes 단명 cyanine 3 tyramide 래 디 칼 형성 하 cyanine 3 tyramide와 과산화 수소 반응. (5) cyanine 3 tyramide 래 디 칼에 가까운 단백질 티로신 잔류물에 바인딩합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 교 잡 이미지 대표 제자리에 . 각 패널 (녹청에 표시 된) 다른 RNA와 핵 DAPI (빨간색으로 표시)으로 물에의 한 예를 보여 줍니다. (A-C) 초기 초파리 배아의 예입니다. (D, F) 늦은 초파리 배아의 예입니다. (G-J) 예제 3의 탈피 초파리 애벌레 조직 (malphigian tubules, midgut, 침 샘과 근육 각각). (K) 성인 난소입니다. (L) 성인 고환입니다. 각 패널 조사를 교배 시키기 유전자의 이름을 표시 합니다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
설명된 프로토콜 고정 초파리 배아 또는 조직에서 대부분 RNAs의 검출에 대 한 매우 민감한, 재현 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 전통적으로 프로브 탐지의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 방법의 사용 하는 더 많은 것 보다 약간 더 복잡 하지만 물고기에 의해 얻은 해상도 훨씬 더 큰 하 고 감도 비교 또는 향상 7,8. 전체 또는 일부 결정 플레이트를 사용 하 여 관심사의 유전자의 대규모 또는 제한 된 분석에 대 한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 프로브 생성 모두를 검색할 수 있습니다 또는 프로브는 좀 더 구체적으로 설계 된 하지 않는 한 여러 성적 결합 형성에 주목 해야 한다 (즉, 단일 exons). 우리는 작은 적당 한 성공 가진 200 뉴클레오티드 프로브 테스트, 비록 작은 프로브 덜 효과적일 하는 경향이 하 고 덜 특정 수 있습니다. 명확 하 게,이 프로토콜 microRNAs 처리 또는 작은 introns, exons의 검출에 적합 하지 않습니다.
이 이렇게 효소 단계를 사용 하 여 신호 강도 향상, 하지만 신호 강도 비례 식 레벨의 비교적 선형이 고 광범위 한 범위에서 대상 유전자 발현 하 것 처럼 보인다. 더 높은 확대, 신호 puncta 또는 얼룩으로 볼은 세포와 조직 내에서. 비교적 드문 성적 증명서에 대 한 몇 가지 작은 puncta 볼 수 있습니다. 사본 풍부 하 게 증가 함에 따라이 수와 크기에서 성장 한다. 단일 분자 물고기 (smFISH), 것과 같이 단일 작은 puncta 단일 RNAs에 해당 또한 수 고 한다 또한 쉽게 측정할 수 이미징 및 정보학 소프트웨어를 사용 하 여. 동일한 대상에 대 한 우리 큐레이터 이미지와 함께 smFISH를 사용 하 여 얻은 게시 된 이미지의 비교 제안이 더 엄격한 비교 하 여 테스트 해야 하지만 전반적으로, 감도 및 해상도 두 가지 방법의 상대적으로 비슷한는. SmFISH의 훨씬 더 높은 비용을 감안할 때, 여기에 제공 된 메서드는 비용의 일부분에서 비슷한 결과 주어 야 한다. 그러나, 목표는 작은 성적표 또는 성적 증명서의 부분을 검출 하는, smFISH 것이 좋습니다.
일부 물고기 프로브 작은 크기 때문에이 메서드는 대형 또는 중요 한 장벽을 관통 조직에서 더 나은 수도 있습니다. 그러나, 높은 세제 수준 및 조직 고정 및 permeabilization 조작의 사용이이 문제를 해결 하려면 나타납니다. 마지막으로, 초파리 조직 개발, 해 부 조직에 대 한 여기에 설명 된 높은 세제 버퍼 초파리 배아로 대부분 다른 유기 체와 조직에 대 한 또한 작동 해야 한다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대 한 지원 자금 건강 연구의 캐나다 학회 (청소 133473 부여)에 의해 HMK에 교부 금에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
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