Summary
Den nuværende protokol beskriver en metode, som brugere kan vedligeholde levedygtighed af akut hippocampus og kortikale skive præparater under indsamlingen af Kernemagnetisk resonans mikroskopi data.
Abstract
Denne protokol beskriver de procedurer, der er nødvendige for at understøtte normale metaboliske funktioner af akut hjernen skive præparater under indsamlingen af magnetisk resonans (MR) mikroskopi data. Mens det er muligt at udføre hr. samlinger på levende, skåret pattedyrvæv, sådanne eksperimenter har traditionelt været begrænset af opløsning grænser og er dermed i stand til at visualisere væv mikrostruktur. Omvendt, hr. protokoller, der opnå mikroskopiske billedopløsning krævede anvendelse af faste prøver at imødekomme behov for statisk, uforanderlig forhold gennem langvarige scanning gange. Den nuværende protokol beskriver den første tilgængelige hr. teknik, der gør det muligt for billeddannelse af levende, pattedyr vævsprøver ved mikroskopisk opløsninger. Sådanne data er af stor betydning for forståelsen af hvordan patologi-baseret kontrast ændringer, der sker på det mikroskopiske niveau indflydelse indholdet af makroskopiske hr. scanninger som dem, der anvendes i klinikken. Endnu en sådan forståelse er realiseret, diagnostiske metoder med større følsomhed og nøjagtighed kan blive udviklet, som vil oversætte direkte til tidligere sygdom behandling, mere præcis terapi overvågning og bedre patienternes resultater.
Mens metoden beskrevet fokuserer på hjernen skive præparater, er protokollen kan tilpasses til enhver skåret væv skive i betragtning af at der foretages ændringer på gas og perfusate præparater til at rumme det væv specifikke metaboliske behov. Vellykket gennemførelse af protokollen bør resultere i levende, akut skive præparater, der udviser hr. diffusion signal stabilitet i perioder op til 15,5 h. De primære fordele ved det nuværende system over andre hr. kompatibel perfusion apparater er dens forenelighed med hr. mikroskopi hardwaren kræves for at opnå højere opløsning og evnen til at levere konstant, uafbrudt flow med omhyggeligt regulerede perfusate betingelser. Reduceret proeve gennemløb er en overvejelse med dette design som eneste væv skive kan være afbildet på et tidspunkt.
Introduction
Som magnetisk resonans imaging (MRI) systemer har støt udviklet sig til stadig højere Feltstyrker, har flere detaljer om sammensætning og status for levende væv bliver mærkbar. Trods sådan hardware forskud er hr. imaging på resolutioner tilstrækkeligt til at visualisere de cellulære strukturer af væv stadig ikke tilgængelige i klinikken. Cellulære niveau Karakteristik af væv skal som følge heraf udledes, når de overvejer indholdet af kliniske scanninger. Sådanne inferens kræver kendskab til tilsvarende processer udledes data taget i modelsystemer, som kan observeres direkte. Traditionelt, indgår disse modeller celler fra akvatiske organismer såsom Xenopus laevis oocyt og Aplysia californica L7 neuron1,2. Disse var blandt de første dyrs celler til rådighed for observation med hr. metoder på grund af deres atypisk stor størrelse: ca 1000 μm og 300 μm diameter, henholdsvis. Seneste fremskridt inden for hardwaredesign har tilladt for en af de største eksempler på pattedyrceller — α-motor neuron — til afbildning ved hjælp af hr. mikroskopi-teknikker på faste væv3,4. Mens disse undersøgelser påvist direkte visualisering af pattedyr cellulære materiale ved hjælp af hr., faste prøverne ansat afviger betydeligt i deres hr. egenskaber fra levende væv og dermed ikke kan tjene som en tilsvarende repræsentant model5, 6. Endnu vigtigere, kræver observere hr. kontrast forandringer, der sker i koncert med komplekse biologiske processer levende eksempler, der kan desorienterede og målt i løbet af de billeddiagnostiske eksperiment.
For at lette hr. mikroskopi undersøgelser på levende væv er præsenteres en protokol, der som omfatter kommercielle microimaging hardware7 interface til en specialbygget, hr. kompatibel, i boringen oxygenator og perfusion enheden tidligere beskrevet8 . Unikke fordele af dette design omfatter cellulære niveau for problemløsning i mammale væv og præcision kontrol over opløst gas indhold og pH i stedet for væv perfusion. Også, i modsætning til fleste eksplantat hr. undersøgelser, som afbryder perfusion under image erhvervelse at undgå flow artefakter, dette design understøtter brugen af kontinuerlig perfusion under dataindsamling, som har vist sig at forbedre fysiologiske tilstand isoleret væv9,10. Endelig sin lukkede optagelse kammer og skive-opbevaring hardware støtte i at reducere sandsynligheden for motion artefakter, der ellers kunne opstå under langvarige billedsamling.
Mens den nuværende protokol beskriver procedurer, der svarer til brug med akut hippocampus og kortikale skiver, præcis kontrol over perfusate metabolitter gør det muligt for dette system til at rumme en bred vifte af forskellige vævstyper og forsøgsbetingelser. Begrænsninger af dette design omfatter en reduktion i stikprøven throughput sammenlignet med en multi skive perfusion afdeling11; men denne begrænsning kan overvindes i fremtiden bruge multi coil arrays.
Også, mens de beskrevne system kan være ansat i vandret eller lodret konfigurationer, den nuværende protokol har dens anvendelse i en lodret orienteret, 600 MHz-spektrometer. Ethvert system kan hr. microimaging undersøgelser — typisk smal-boring (≤6 cm), høj felt (≥500 MHz) spektrometre — vil rumme oxygenator og perfusion udstyr beskrevet. Men ændringer imaging spolen, gradient, sonde system eller andre væsentlige billedbehandling hardware ansat kan nødvendiggøre ændringer af perfusion udstyr og hr. scanningsparametre.
Protocol
alle dyreforsøg beskrevet følge retningslinjerne i de nationale akademier i Sciences ' Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev gennemgået og godkendt af University of Florida ' Sørensen Institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC). Følg alle gældende regler og forordninger når engagerende i animalsk emnet forskning.
1. forberedelse af Perfusate til vedligeholdelse af centralnervesystemet væv
- gøre friske kunstige cerebrospinalvæske (aCSF).
- Til at generere 2 L af bikarbonat-buffered aCSF perfusate, måle ud af 1.500 mL vand renset af dobbelt destillation eller omvendt osmose i en 4 L målekolbe. Placere en magnetisk røre bar i kolben og agitere væsken ved hjælp af et rør plade.
- i renset vand opløses i følgende mængder af salte: 14.03 g (120 mM) natriumchlorid, 4,37 g (26 mM) natriumbikarbonat, 0,41 g (1,5 mM) monobasic kalium fosfat, 0.69 g (1,4 mM) magnesium sulfat en, 0,59 g (2 mM) calcium chlorid dihydrat, 0,45 g (3 mM) kaliumchlorid, og 3,6 g (10 mM) glukose.
Bemærk: Kemiske indholdet af perfusate vil variere afhængigt af de specifikke metaboliske krav af vævet og de ønskede betingelser for eksperimentet. - Blandes grundigt denne løsning, indtil alle salte har opløst. Justere lydstyrken til 2 L bruge ekstra renset vand.
- Test osmolalitet af aCSF ved hjælp af et frysepunkt depression osmometer. Justere til 300 mOsm/kg ved hjælp af sorbitol. Tilføjelsen af 324 mg sorbitol til 2 L 299 mOsm/kg aCSF perfusate vil øge osmolalitet til 300 mOsm/kg (ca. 1 mOsm pr. 324mg).
Bemærk: ACSF kan opbevares ved 4 ° C i en lufttæt, forseglet flaske i en periode ikke må overstige 24 h.
2. Sat op Perfusion System
- forberede aCSF perfusate.
- Ekvilibreres aCSF til stuetemperatur (~ 23 ° C) mens gasning med 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min) via direkte boblende for ikke mindre end 1 h.
Bemærk: Forskellige vævstyper eller ønskede forsøgsbetingelser kan kræve justering af perfusate temperatur eller gas indhold. De ønskede betingelser for opløst gas indhold i perfusate kan styres nøjagtigt ved at variere de procent koncentrationer af de enkelte komponenter af udbuddet gas ( figur 1). - Når aCSF når den krævede temperatur og carbogen mætning, bekræfte, at pH i det fysiologiske interval (7,3-7.4). Fortsat boble gas direkte ind i perfusate reservoir (1/16 L/min) i løbet af forsøget for at opretholde ordentlig opløst ilt indhold og pH betingelser fremmer sund tissue stofskifte.
- Ekvilibreres aCSF til stuetemperatur (~ 23 ° C) mens gasning med 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min) via direkte boblende for ikke mindre end 1 h.
- Prime linjerne perfusion.
- Submerge fjorden rør tilsluttet peristaltiske mikro-pumpen i den forberedte aCSF (300 mOsm, pH 7.3-7.4, løbende gasset).
- Pass oxygenator enhed ( figur 2) og perfusion linjer gennem både magneten bore og gradient coil stack (top til bund) og sæt spoler afsat indtil sonde forsamling. Hænge oxygenator ovenfor et bægerglas for at fange eventuelle aCSF spildevand.
Bemærk: Afhængigt af systemdesign Mr muligvis perfusion linjerne skal overføres via magnet boring og gradient spoler eller sonde krop base før grunding systemet med aCSF. Bekræfte, at perfusion linje placering ikke vil forstyrre samling af sonden krop eller indsættelse af sonden i boringen før du begynder proceduren priming. - Bekræfter den tilsigtede strømningshastighed (2 mL/min) er valgt og begynde at udfylde linjerne perfusion af tænde pumpen.
- Invertere tom, i linje boble fælde så at aCSF vil fortrænge luften indeholdt inde.
- Tilslutte oxygenator ' s gas havn til en anden kilde til carbogen (enten en manifold eller en sekundær carbogen cylinder) og sat en gennemstrømningshastighed på 1 / 16L/min.
- Bekræfter, at carbogen flyder over oxygenator ' s gas-exchange membran ved dypning udstødning port oven på oxygenator til vand.
- Når aCSF registreres dryp fra perfusion kammer, rense enhver synlig gasbobler fra linjerne indstrømning af manuel agitation.
- Bekræfter oxygenator fungerer korrekt ved nedsænkning ilt elektroden i den aCSF flyder fra perfusion afdeling.
Bemærk: Læsning på måleren ilt skal tilnærme procentdelen af ilt indeholdt i den medfølgende gas.
3. Væv forberedelse
- eutanasi
- sted en rotte (125-150 g) ind i induktion salen en anæstesi maskine og eksponere til 4% isofluran i et luftfartsselskab end ilt gas med en hastighed på 1 L/min i 4 min.
- Fjerne den ubevidste rotte fra anæstesi afdeling.
- Udføre en oprettende refleks test ved at placere rotten i den liggende stilling. Kontrollere for eventuelle bevægelser — hoved drejning, ben løft, ryg fleksible m.m. — indikerer, at dyret er at dreje ind på sin mave.
- Udføre en øje-blink refleksiv test ved at trykke på den åbne øjet af dyret ved hjælp af en vatpind. Kontrollere for eventuelle svar — låg lukning, muskeltrækninger, etc. — til denne sanseindtryk.
- Endelig, udføre en legemsdel-trække refleks test ved at klemme huden mellem tæerne af rotte ' s strakt ryg ben med pincet eller hemostats. Check for fleksion af legoh
Bemærk: i tilfælde af en positiv refleksiv testresultatet, Fortsæt ikke med eutanasi. - i tilfælde af at nogen af de tre refleks test fremkalder en reaktion, returnere rotten straks til anæstesi-afdeling og giver mulighed for en yderligere 2 min eksponering for 4% isofluran.
- Udføre alle tre refleksiv test i deres helhed. Gentag 2 min anæstesi eksponering som nødvendigt og kun fortsætte, når en komplet mangel på svar på alle tre refleksiv tests er blevet observeret.
- Aflive rotten via guillotine halshugning.
- Hjerne resektion
- fjerne rotte hjernen ved grov dissektion. Start med hovedet i den liggende stilling. Ved hjælp af saks, klippe rostrally gennem huden fra bagsiden af halsen til næsen og udsætte kraniet.
- Fjerne bløde væv fra overfladen af kraniet med en stump sonde.
- Arbejder ud fra den caudale ende, fjerne occipital, parietal og frontale knogler i kraniet ved hjælp af rongeurs.
- Trække dura ved at skære langs den langsgående revne med micro saks og peeling tilbage lag fra begge hjernehalvdele.
- Fjerne hjernen fra kraniet ved at dreje hovedet til den liggende stilling og afskar hjernenerver på den ventrale side.
- Skive isolation
- returnere hjernen til den liggende position og isolere den central del indeholder hippocampus ved at fjerne alle væv caudale til den tværgående revne og rostralt for fimbria. To skære langs tværplan (dvs. koronale skiver) med en straight-kanter razor.
- Anbringer hjernen ' s caudale-de fleste fly til midten af en vibratome skæring bad ved hjælp af ren lim.
- Tilføje iskold, carbogen boblede aCSF til vibratome skæring bad og placere nylon opbevaring hardware inde.
- Skære 300 μm tykke skiver at få 3 til 4 brugbar skive præparater per halvkugle (6 til 8 i alt).
- Isolere en hippocampus eller kortikale afsnit fra en halvkugle og trim skive, så det passer inden for microcoil ' s 5 mm diameter væv godt.
4. Prøve positionering og Perfusion System forsamling
- spole forberedelse
- Fyld microcoil ' s væv kammer med iltet aCSF fra vibratome ' s skæring bad ved hjælp af en overførsel pipette.
- Tage trimmet hjernen prøve og placere regionen af interesse (f.eks. pyramide cellelag) over microcoil ved hjælp af et dissekere muligheder.
- Indsætte væv opbevaring indretning (nylon mesh net påsat nylon skive) at fastholde prøve position i hele den billeddiagnostiske eksperiment.
Bemærk: Fortsæt hurtigt gennem prøven positionering procedure for at minimere eksponering for intense lys. Give ekstra iltet aCSF efter behov ved hjælp af en overførsel pipette.
- Montage i boringen oxygenator, microcoil og sonden
- sikre den modificerede microcoil Forsamling ( figur 3) i en tabel klemme og anbringer i boringen oxygenator enheden ved at indsætte den acetal støtte pind ind i hullet på toppen af spolen.
- Seal perfusion system ved at placere perfusion kammer over microcoil ' s væv godt og gjorden de to sammen ved hjælp af en miniature kabelbinderen.
- Trim overskydende længde fra kabel tie ved hjælp af bidetang.
Bemærk: Efter vellykket forsegling, perfusate bør observeres spændende gennem udstrømning linjer og ingen lækage skal være tydelig omkring silikone tætning af perfusion kammer. Undladelse af at bekræfte disse betingelser før sonden samling kunne resultere i alvorlige skader på imaging hardware. - Når aCSF kan ses dryp i affald reservoiret, tage microcoil og oxygenator og vedhæfte forsamlingen til toppen af imaging sonde kroppen.
- Skub gradient stakken over forsamlingen og sæde farveforløb på toppen af sonden. Fotografier beskriver den relative placering og korrekt tilslutning af spolen, oxygenator og sonde hardwarekomponenter er fastsat ( figur 4).
5. Udfører hr. billede indsamling
- indsættelse forsamlede sonden i magneten bore
- sted sonde kroppen tæt på spektrometret bore åbning i bunden af magneten.
- Trække overskydende længden af perfusion linjer gennem boringen åbning i toppen af magneten.
- Når alle de tilgængelige slæk er blevet taget op fra linjerne perfusion, advance sonde kroppen ind i magneten bar i bunden mens du samtidig fjerner mere slæk fra perfusion linjer fra toppen af boringen.
- Tråd de to sikre skruer i bunden af sonden til de tilsvarende slots af shim stak.
- Før man går videre, check at perfusion linjer ikke var klemt eller snoet under sonde indsættelse af bekræfter aCSF udstrømning i affald reservoiret.
Bemærk: Manglende evne til at bekræfte perfusate udstrømning kan resultere i permanent beskadigelse perfusion linjer og risici katastrofale skader på hr. imaging hardware. - i tilfælde af, at ingen perfusate ses spændende returslangen i affald reservoiret, fjerne den sonde og bekræfte, at perfusate flow har genoptaget inden du forsøger at genindsætning. En skematisk layout af samlet perfusion system og imaging spektrometeret har været beskrevet tidligere 8.
- Forbinder selve Probe
- vedhæfte vandledninger tilstrømning og udstrømning fra gradient chiller.
- Tænde pumpen til gradient chiller og bekræfte indstillingen vand temperatur (19 ° C).
- Lægger luftslangen fra luften chiller enhed til selve sonden ved hjælp af et spændebånd.
- Drej flow knop på air chiller enhed til den " 1 " holdning.
- Tillægger sonde kroppen termoelement wire.
- Lægger det koaksiale kabel fra preamp til radio frekvens (RF) input/output sonden kroppen ' s proton (H) kanal.
- Fastgør strømkablet fra de gradient forstærkere til selve sonde.
- Inside the RF kabinet, Tænd power B0 kompensation enhed, alle tre gradient forstærkere (x, y, z), og den overordnede unit.
- Forbereder spektrometeret
- sætte den tilsigtede boring temperatur ved hjælp af modulet variabel temperatur tilpasning på konsollen.
- Match (impedans) og tune (frekvens) RF kredsløb ved at justere de variable kondensatorer i sonden. Dette opnås ved at manipulere tryllestave i bunden af sonden kroppen.
- Justere de aktuelle indstillinger for spektrometeret ' s shim spoler til at maksimere magnetfelt homogenitet på prøven.
- Begynde billedsamling
- indsamle pilot billeder til at bestemme rumlige placeringen af din prøve inden magneten bore. Typiske parametre for en to-dimensionelle gradient ekko er som følger (TR/TE = 100/4 ms, gennemsnit = 1, pulse vinkel = 30 o, tid = 6 sek, matrix = 64 x 64, synsfelt = 0,3 x 0,3 cm, opløsning = 47 x 47 μm).
- Indsamle diffusion-vægtede piloter for at bekræfte korrekte scanning geometri og væv holdning, hvis det er relevant. Typiske parametre til to dimensionelle diffusion-vægtede pilot scanning er som følger (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gennemsnit = 1, b = 1200 (1860 effektiv) s/mm 2, matrix = 64 x 64, synsfelt = 0,2 x 0,2 cm opløsning = 31 μm).
- Indsamle en diffusion-vægtede tidsserier for at bestemme stabilitet kendetegner akut skive forberedelse. Typiske parametre for en to-dimensionelle diffusion vejede billede er som følger (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gennemsnit = 42, b = 1200 s/mm 2, matrix = 64 x 64, synsfelt = 0,2 x 0,2 cm, opløsning = 31 μm). Bemærk: Kendetegner stabilitet i et givet system vil variere fra den beskrevne protokol afhængig af faktorer såsom hr. kontrast ansat (f.eks. T1, T2, diffusion, modtagelighed), den fysisk undertrykkelse af netbårne studerede, og hr. signal ændring pr. tidsenhed som følge af sagde undertrykkelse af netbårne.
Representative Results
Perfusate forberedelse
Efter vellykket beskæftigelse af enheden i boringen iltning, vil gasser i den medfølgende carbogen nå 100% mætning betingelser inden for aCSF perfusate. Dette kan påvises ved at variere koncentrationen af ilt i den medfølgende gas og måle ændringen i opløst iltindhold i aCSF perfusate i perfusion kammeret ved hjælp af en ilt meter (figur 1)8. Ifølge Henrys lov er mængden af opløst gas, der er i ligevægt med en flydende prøve direkte proportional med partialtrykket af denne gas, forudsat at temperaturen forbliver konstant12. Med denne viden og præcision gasstandarder, er det muligt at kvantificere mængden af opløst ilt indeholdt i en aCSF-prøven som beskrevet. Dette opnås ved kalibrering af ilt måleren ved hjælp af mættede opløsninger (direkte boblede i 1 time eller mere) af aCSF er udsat for gasser med kendt sammensætning: en gas med høj iltkoncentration som carbogen (95% O2) og en anden med lavt iltindhold koncentration som kvælstof (0% O2). Målinger kan bagefter tages af nedsænkning spidsen af ilt elektrode i en prøve. Bekræftelse, i boringen oxygenator fungerer korrekt kan opnås ved at måle overløbet fra perfusion godt. Den procentvise opløst ilt skal som målt ved måleren ilt matche procent koncentrationen af ilt leveret i udbuddet gas. Hvis de målte værdier er lavere end i udbuddet gas, ville det foreslå en hardwarefejl, der kan føre til metaboliske insufficiens i væv skive.
Prøven udseende og adfærd
Akut skive præparater, der modtager perfusion tilstrækkelige nok til at levere nødvendige metabolitter og bære væk metaboliske affald snart nå en tilstand af relativ stabilitet. Fra dette punkt, akut skiver kan blive udsat for eksterne undertrykkelse af netbårne og deres reaktioner på disse ændringer kan måles for videnskabelig undersøgelse. For hr. eksperimenter er tracking signal om interesse over tid et almindeligt anvendte praksis at vise den relative stabilitet af akut skive præparater13. Diffusion-vægtede signalet er særligt følsomme over for ændringer i et væv vand mobilitet, indhold og distribution, som kan blive værdsat af brugen af denne kontrast mekanisme til at opdage infarkter i iskæmisk slagtilfælde14,15. Plotte normaliseret diffusion signalet over tid i akut kortikale skiver vedligeholdes under en række perfusion betingelser viser forholdsvis stabilitet (2 ± 3% over 15,5 h) efter væv isolation er opnået (figur 5). Diffusion signal stabilitet blev opretholdt uanset perfusion betingelser (periodisk eller kontinuerlig) eller MR scanning længde (kort [4 min] eller lange [1,5 h])8. Hvis skiver ikke udviser signal stabilitet over tid, som den skarpe diffusion signal stigning observeret i levende cortex, som ikke modtog perfusion, er tyder på suboptimal forsøgsbetingelser. Undertrykkelse af netbårne eksperimenter bør ikke forsøges forud for bekræftelse af stabil signalforhold i Skive præparater.
Ud over signal stabilitet, skal korrekt prøve positionering bekræftes på billedsamling. Selv om prøven position styres under væv placering på dissekere mikroskop, forskydninger i stikprøven holdning kan forekomme under montagen perfusion apparater eller hårdhændet behandling af spolen eller sonde før indsættelse i magneten. Bekræftelse af korrekt hippocampus placering kan opnås ved at indsamle kort (2 min), pilot scanner med diffusion kontrast (figur 6). Fordi den pyramideformede cellelag er mere følsomme over for diffusion vægtning end de tilstødende hippocampus bladplader, vises denne struktur som en mørkere band i diffusion-vægtede billeder. Opsætninger, der ikke viser denne karakteristiske egenskab indeholder off-center prøver og vil sandsynligvis nødt til at blive gentaget.
Figur 1: Opløst iltindholdet af aCSF perfusate som en funktion af procent O2 indhold i medfølgende gas. Carbogen blandinger med indhold af varierende koncentrationer af ilt (95%, 60% og 19%) er ansat som en levering gas. Procent opløst ilt aflæsningerne er derefter taget fra perfusion godt og i forhold til to kendte objekter: en perfusate reservoir direkte boblede med carbogen (95% O2) og en perfusate reservoir udsat for atmosfæriske forhold (23% O2 ). I hvert enkelt tilfælde, den procentvise iltmætning på webstedet af væv perfusion tilgange 100% O2 koncentration inden for den carbogen blanding anvendes. Fejllinjer er lig med standardafvigelsen af stikprøvers middelværdi. Figur gengivet med tilladelse fra den oprindelige artikel8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk tegning af i boringen oxygenator og perfusion afdeling. Dette diagram viser detaljerede designelementer ansvarlig for funktionen af disse kritiske enheder. Friske perfusate, der er blevet pumpet gennem en boble fælde træder oxygenator gennem toppen af en 10 mm NMR rør. Dermed, det overgange i en meget gas-gennemtrængelige silikoneslanger (blå segment), der er rullet omkring en åben, 5 mm NMR rør indlejret i. Carbogen gas leveres gennem toppen af 5mm rør ind i salen gennem open-ended bunden og passerer hen over den snoede silikoneslanger før du afslutter oxygenator gennem en udluftningsanordning hul i 10 mm rør cap. Under denne eksponering, bliver perfusate strømmer gennem silikone røret mættet med kemiske komponenter i den medfølgende gasblanding. Når du afslutter oxygenator, gennem perfusate direkte ind i perfusion salen før returslangen fører til en affaldsindsamling reservoir. Andre komponenter kritisk til dette design omfatter acetal støtte pind, som tillader oxygenator til at stå lodret på toppen af den modificerede RF microcoil, en silikone Skive (rød ring), som danner den væsketætte tætning mellem den oxygenator perfusion kammer og det microcoil væv godt, og kablet binde notch, som rummer placering af stemmelighed kabel bruges til at danne denne reversible forsegling. Dette tal er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra den oprindelige artikel8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ændringer til microcoil forsamlingen, som tillader interface til i boringen oxygenator. To riller 3,0 mm x 1,5 mm (sorte pile) blev skåret i siden af den forsamling, der rumme bredden af stemmelighed kabel bruges til at forsegle perfusion kammer. En kanal (15 mm x 3 mm x 4 mm) forbinder olivenlundene på tværs af den tilbage ansigt af spolen. To nylon rum placeret i siderne af kanal (røde pile) act som en fangst til kabel tie hovedet, som letter den forsegling procedure. Et hul (2 mm x 14 mm) boret i toppen af spolen Forsamling (gul arrow) støtte slutter sig til acetal pind for at sikre oxygenator. Dette tal er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra den oprindelige artikel8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: foto montage beskriver den relative placering og korrekt montering af microcoil, oxygenator og sonde komponenter. Disse billeder har vigtigste hardwarekomponenter i boringen oxygenator og microperfusion enhed og illustrere, hvordan de enkelte dele interface med hinanden. (A) sprængskitse foto viser den relative placering af alle komponenter inden forsegling af væv godt eller samling af sonden kroppen. Omhu har truffet til at vise den relative placering af dele præcist; men en del af perfusion linjer er blevet fordoblet tilbage i denne serie således at alle komponenterne passer ind i billedramme. (1 = sonde hoved, 2 = microcoil forsamling, 3 = nylon væv fastholdelse ring, 4 = perfusion, 5 = kabelbinderen, 6 = i boringen oxygenator, 7 = gradient spoler, 8 = boble fælde). (B) komponenter efter coil og oxygenator forsamling. I dette billede, er nylon fastholdelse ring blevet placeret i den microcoil væv nå til sikre en prøve. Acetal støtte peg på basis af oxygenator er blevet sikret i den tilsvarende hul oven på microcoil. Silikone pakning på den åbne ende af perfusion godt er blevet placeret over væv godt, og et kabel tie har strammet omkring disse komponenter at forsegle perfusion kammer. Endelig, i bunden af microcoil er forbundet til toppen af sonden hoved. (C) komponenter efter sonde forsamling. I panelet sidste er overskydende længde fra kabel-tie blevet trimmet flugter med microcoil. Gradient coil stakken er derefter gled ind i position ved omhyggeligt fremrykkende cylinder mod sonden mens den passerer de overskydende perfusion linjer, oxygenator og microcoil gennem sin hule center. Når gradienter er forbundet til sonde hoved, er de holdes på plads ved at skrue den sikre krave på sonden over gevind bunden af gradienter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Diffusion signal stabilitet i superfused akut kortikale skiver. (A) normaliseret diffusion signal værdier i fire akut skiver udsat for forskellige superfusion paradigmer afbildes over i en periode på op til 21,5 h efter aktiv dødshjælp. Skiver forblive inden for ± 5% af deres oprindelige diffusion signal måling i en periode på 15,5 h efter eutanasi uanset om superfusion er kontinuerlig eller intermitterende og uafhængig af hr. scan længde (1,5 h eller 4 min). Signal optagelser taget fra formaldehyd-fast cortex tjene som den positive kontrol (n = 1) for stabilitet på grund af statisk, uforanderlig karakter af fast vævsprøver. Omvendt, diffusion signal måles i en levende skive fraværende superfusion support (n = 1) fungerer som en kontrol for metaboliske mangel. Eksperimentets parametre af forskellige undersøgelser med superfusion er som følger: kontinuerlig (superfusion altid på, tid pr scan = 1,5 h), intermitterende (superfusion på til 10 min interval mellem scanninger, tid pr scan = 1,5 h), lang interval, lang scan (superfusion på under scanningen, men sat på pause i 10 min. mellem scanninger, tid pr scan = 1,5 h), lange interval, korte scanning (superfusion på for 1,5 h interval mellem scanninger, tid pr scan = 4 min). (B) analyserede data viser gruppe betyder de fire live-skive superfusion eksperimenter fra panelet (A). Diffusion signal profil fra de grupperede, superfused kortikale skiver udstiller lille variation over tid (2 ± 3% over 15,5 h), mens kontrolelementet ikke perfunderet (n = 1) udstiller dramatiske signal ustabilitet tidligt i eksperimentet (15% af 6,5 h). Dette tal er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra den oprindelige artikel8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: bekræftelse af hippocampus skive placering under pilot imaging. Inden du kører en udvidet hr. mikroskopi session, korrekt placering af stikprøven er afgørende for at sikre ressourcer som scanner tid og dyrt perfusate tilsætningsstoffer er ikke spildt. Den pyramideformede cellelag i regionen CA1 hippocampus kan visualiseres i hurtigere (4,3 min), lavere opløsning (31 μm x 31 μm i-fly) pilot scanninger til at sikre, at væv af interesse er placeret korrekt i forhold til mikro-spolen. Scanningsparametre fælles for begge billeder er som følger: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gennemsnit = 1. (A) b = 0 (227 effektiv) s/mm2. I denne indledende scanning er stratum pyramidale kun synligt som en grå, diagonal band centreret i den spole excitation profil. (B) b = 1.200 (1,860 effektiv) s/mm2. På højere diffusion stemmevægte, interlamellar kontrast øger den pyramideformede cellelag bliver mørkere end væv i de tilstødende bladplader (ovenfor: stratum oriens; nedenfor: stratum radiatum). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver procedurer for metaboliske Standardvedligeholdelse akut hjernen skive præparater gennemgår Kernemagnetisk resonans mikroskopi. Denne procedure er den eneste metode øjeblikket er til rådighed, der giver mulighed for visualisering af levende mammale væv med hr. ved beslutninger i stand til at løse celler. Mens de perfusate betingelser beskrevet er skræddersyet til centralnervesystemet væv, protokollen er bredt kan tilpasses til enhver form for levende væv forberedelse gennem justeringer af perfusate og gas bestanddele samt perfusion strømningshastighed og temperatur.
De mest almindelige problemer, der er tilbøjelige til at være stødt på under de beskrevne procedurer omfatter dem relateret til fejl i metabolit levering. Udfældning af calciumsalte kan opstå inde i aCSF under gasformige insufficiens som følge af svigt i den bikarbonat buffer system. Sådanne bundfald kan blokere linjerne perfusion og resultere i alvorlige hardware skader. Hvis salt bundfald der observeres i perfusate efter sonde forsamling, ophøre perfusion flow straks ved at slukke den peristaltiske pumpe. Bekræfte tilstedeværelsen af tilstrækkelig natriumbikarbonat niveauer (4,37 g/2 L) i perfusate, CO2 niveauer (5,0%) i levering gas og carbogen gasflow (1/16 L/min) i både reservoir og oxygenator. Endelig, bekræfte pH niveauer er stabiliseret i de fysiologiske interval (7,3-7.4). I tilfælde af, at ilt gas og pH niveauer stadig ikke er reguleret ordentligt, bør gas-exchange membran udskiftes.
Hvis skiver ikke udviser signal stabilitet over den tilsigtede eksperimentelle tidsforløb, bekræfte at de korrekte kemiske bestanddele er til stede i aCSF blandingen og at den korrekte osmolalitet (300 mOsm) og pH (7,3-7,4) bevares. Sørg også for, carbogen gas er leveret til perfusate reservoir og oxygenator på 1/16 L/min. Hvis disse trin ikke korrekt perfusate betingelser, tilrådes udskiftning af gas-exchange membran. Hvis væv stabilitet ikke opnås efter fejlfinding perfusate betingelser, overveje forfinelse af kirurgisk protokollen med fokus på at minimere tidsintervallet mellem væv høst og perfusion ansøgning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), og National Science Foundation (kooperative aftale nr. DMR-1157490) gennem de nationale højt magnetisk felt Laboratory (NHMFL) avancerede magnetisk resonans billeddannelse og spektroskopi (AMRIS) facilitet på UF og staten Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
