Summary
L'attuale protocollo descrive un metodo mediante il quale gli utenti possono mantenere la vitalità delle preparazioni fetta hippocampal e corticale acuta durante la raccolta dei dati di microscopia a risonanza magnetica.
Abstract
Questo protocollo descrive le procedure necessarie per supportare le normali funzioni metaboliche delle preparazioni fetta cerebrale acuto durante la raccolta dei dati di microscopia a risonanza magnetica (MR). Mentre è possibile eseguire il signor collezioni su tessuti di mammiferi viventi, asportato, tali esperimenti hanno tradizionalmente Stati vincolati da limiti di risoluzione e così sono in grado di visualizzare la microstruttura del tessuto. Al contrario, signor protocolli che hanno raggiunto la risoluzione dell'immagine microscopica ha richiesto l'uso di campioni fissati per rispondere all'esigenza per condizioni statiche, immutabile oltre i tempi di scansione lunga. L'attuale protocollo descrive la prima tecnica di MR disponibile che permette l'imaging dei campioni di tessuto vivente, mammiferi a risoluzioni al microscopio. Tali dati sono di grande importanza per la comprensione dei cambiamenti di contrasto come base di patologia che si verificano all'influenza di livello microscopico il contenuto di macroscopica signor scansioni come quelli utilizzati nella clinica. Una volta tale comprensione è realizzato, metodi diagnostici con una maggiore sensibilità e precisione possono essere sviluppati, che si traduca direttamente al trattamento di malattia precedente, più accurato monitoraggio della terapia e migliorare i risultati pazienti.
Mentre la metodologia descritta si concentra sulla preparazione di fetta di cervello, il protocollo è adattabile a qualsiasi fetta di tessuto asportato, dato che vengono apportate modifiche ai gas e perfusato preparativi per soddisfare specifiche esigenze metaboliche del tessuto. Corretta esecuzione del protocollo dovrebbe risultare in preparazioni di fetta living, acuta che presentano MR stabilità del segnale di diffusione per periodi fino a 15,5 h. I vantaggi primari del sistema attuale sopra altri apparecchi di perfusione compatibile MR sono la compatibilità con l'hardware di microscopia del signor necessario per ottenere il più alto immagini ad alta risoluzione e capacità di fornire un flusso costante e ininterrotto con attentamente condizioni di perfusato regolamentato. Campione ridotto throughput è una considerazione con questo disegno come affettare un solo tessuto può essere imaged in un momento.
Introduction
Come sistemi di imaging a risonanza magnetica (MRI) hanno progredito costantemente a intensità di campo sempre più elevati, maggiori dettagli circa la composizione e lo stato dei tessuti viventi sono diventati riconoscibili. Nonostante tali progressi hardware, risonanza magnetica a risoluzioni sufficiente per visualizzare le strutture cellulari dei tessuti non è ancora disponibile nella clinica. Di conseguenza, caratteristiche di livello cellulare dei tessuti devono essere dedotto quando si considera il contenuto delle analisi cliniche. Tale inferenza richiede la conoscenza di processi equivalenti raccolte dai dati rilevati in sistemi modello che possono essere osservati direttamente. Tradizionalmente, questi modelli inclusi cellule da organismi acquatici come gli ovociti di Xenopus laevis e Aplysia californica L7 neurone1,2. Questi sono stati tra le prime cellule animali disponibili per l'osservazione con MR metodi per via delle loro dimensioni in maniera atipica: circa 1000 μm e 300 μm di diametro, rispettivamente. Più recentemente, i progressi nella progettazione hardware hanno permesso per uno dei più grandi esempi di cellule di mammifero — il α-motoneuroni — essere imaged utilizzando tecniche di microscopia di RM in tessuto fisso3,4. Mentre questi studi hanno dimostrato la visualizzazione diretta del materiale cellulare dei mammiferi utilizzando MR, i campioni fissi impiegati differiscono in modo significativo nelle loro proprietà di MR da tessuto vivo e così non possono servire come un equivalente modello rappresentativo di5, 6. Ancora più importante, osservare i cambiamenti di contrasto signor che si verificano in concerto con complessi processi biologici richiede campioni di vita che possono essere perturbati e misurati nel corso dell'esperimento imaging.
Per facilitare gli studi di microscopia del signor su tessuti viventi, un protocollo è presentato che comprende microimaging commerciale hardware7 interfacciato ad un costruito appositamente, signor compatibile, in foro ossigenatore e perfusione dispositivo precedentemente descritto8 . Vantaggi unici di questo disegno includono funzionalità di risoluzione a livello cellulare in tessuti di mammiferi e controllo di precisione sul contenuto di gas disciolto e pH presso il sito della perfusione tissutale. Inoltre, a differenza della maggioranza degli studi di MR espianto che interrompono l'aspersione durante acquisizione immagine per evitare artefatti di flusso, questo design supporta l'utilizzo di aspersione continua durante la raccolta di dati che è stato indicato per migliorare la condizione fisiologica di isolato tessuti9,10. Infine, gli aiuti di hardware chiuso registrazione camera e fetta-ritenzione nel ridurre la probabilità di artefatti da movimento che potrebbero altrimenti verificarsi durante prolungati collezione di immagini.
Mentre l'attuale protocollo descrive procedure appropriate per l'utilizzo con fettine ippocampali e corticali acute, un controllo preciso sui metaboliti di perfusato permette questo sistema di ospitare una vasta gamma di tipi di tessuti diversi e condizioni sperimentali. Limitazioni di questo disegno includono una riduzione nel rendimento del campione rispetto ad un multi-slice aspersione camera11; Tuttavia, questa limitazione può essere superata in futuro utilizzando le matrici multi-bobina.
Mentre il sistema descritto può essere impiegato in configurazioni sia orizzontale o verticale, l'attuale protocollo dispone inoltre, l'utilizzo in un orientamento verticale, spettrometro di 600 MHz. Qualsiasi sistema in grado di MR microimaging studi — in genere stretto-foro (≤ 6 cm), spettrometri ad alto campo (≥ 500 MHz) — ospiterà le apparecchiature ossigenatore e perfusione descritte. Tuttavia, le modifiche per la bobina di imaging, gradiente, sistema sonda o altro hardware di imaging essenziale impiegati possono richiedere alterazioni l'impianto di aspersione e parametri di scansione di MR.
Protocol
tutti gli esperimenti sugli animali descritti seguono le linee guida stabilite nelle accademie nazionali delle scienze ' Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati esaminati e approvati dalla University of Florida ' s Comitato di uso (IACUC) e istituzionale cura degli animali. Seguire tutte le norme e regolamentazioni applicabili quando si innesta nella ricerca animale soggetto.
1. preparazione del perfusato per la manutenzione dei tessuti del sistema nervoso centrale
- fare fresco liquido cerebrospinale artificiale (aCSF).
- Per generare 2 L di perfusato aCSF con tampone di bicarbonato, misurare 1.500 mL di acqua purificata per doppia distillazione o osmosi inversa in un matraccio da 4 L. Introdurre un ancoretta magnetica nel matraccio e agitare il liquido utilizzando una piastra stir.
- In acqua purificata, sciogliere le seguenti quantità di sali: 14,03 g (120 mM) di cloruro di sodio, bicarbonato di sodio 4,37 g (26 mM), fosfato di potassio monobasico 0,41 g (1,5 mM), 0,69 g (1,4 mM) solfato di magnesio eptaidrato, calcio 0,59 g (2 mM) cloruro diidrato, cloruro di potassio di 0,45 g (3 mM) e 3,6 g (10 mM) di glucosio.
Nota: I contenuti chimici del perfusato variano a seconda delle esigenze metaboliche specifiche del tessuto e le condizioni desiderate dell'esperimento. - Mescolare questa soluzione accuratamente fino a quando tutti i sali si sono dissolti. Regolare il volume a 2 L usando acqua purificata supplementare.
- Test il osmolality del aCSF utilizzando un Osmometro di depressione del punto di congelamento. Regolare a 300 mOsm/kg utilizzando sorbitolo. Aggiunta di 324 mg di sorbitolo a 2 L di 299 mOsm/kg aCSF perfusato aumenterà osmolalità a 300 mOsm/kg (circa 1 mOsm a 324mg).
Nota: Il aCSF può essere memorizzato a 4 ° C in un flacone sigillato ermeticamente, per un periodo non superiore ai 24 h.
2. Impostare il sistema di perfusione
- preparare il perfusato aCSF.
- Equilibrato aCSF a temperatura ambiente (~ 23 ° C) mentre gassazione con carbogen 95% (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) tramite bubbling diretto per non meno di 1 h.
Nota: Diversi tipi di tessuto o condizioni sperimentali desiderate potrebbero richiedere la modifica del perfusato temperatura o gas contenuto. Le condizioni richieste per il contenuto di gas disciolti nel perfusato possono essere controllate con precisione variando le concentrazioni percentuali dei singoli componenti del gas di alimentazione ( Figura 1). - Una volta che il aCSF raggiunge la temperatura desiderata e la saturazione di carbogen, confermare che il pH è nella gamma fisiologica (7,3-7,4). Continuare a gas bolla al serbatoio di perfusato (1/16 L/min) nel corso dell'esperimento al fine di mantenere corretto dissolto ossigeno contenuto e condizioni di pH favorevole al metabolismo dei tessuti sani.
- Equilibrato aCSF a temperatura ambiente (~ 23 ° C) mentre gassazione con carbogen 95% (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) tramite bubbling diretto per non meno di 1 h.
- Adescare le linee di aspersione.
- Immergere il tubo di ingresso collegato al micro-pompa peristaltica nel preparato aCSF (300 mOsm, pH 7,3-7,4, continuamente gassificato).
- Pass l'ossigenatore dispositivo ( Figura 2) e linee di perfusione attraverso sia il magnete alesaggio e bobina di gradiente stack (alto verso il basso) e impostare le bobine da parte fino all'assemblaggio di sonda. Appendere l'ossigenatore sopra un becher per catturare qualsiasi effluente aCSF.
Nota: A seconda del design del sistema MRI, linee di perfusione potrebbero essere necessario passare attraverso il foro di magnete e bobine di pendenza o corpo sonda base prima dell'innesco del sistema con aCSF. Confermare tale posizionamento della linea di perfusione non interferirà con l'Assemblea del corpo sonda o inserimento della sonda nel foro prima di iniziare la procedura di rabbocco. - Confermare la portata desiderata (2 mL/min) è selezionata e iniziare a riempire le linee di aspersione di accensione della pompa.
- Capovolgere il ferma-bolle di vuoto, in linea, in modo che aCSF soppianterà l'aria contenuta all'interno.
- Collegare l'ossigenatore ' s gas porta ad una seconda fonte di carbogen (un collettore o un cilindro di carbogen secondario) e impostare una portata di 1 / 16L/min
- Confermare quel carbogen è che scorre sopra l'ossigenatore ' della membrana di scambio di gas s immergendo l'orificio dello scarico in cima l'ossigenatore in acqua.
- Una volta aCSF rilevato gocciolante dalla camera di aspersione, eliminare eventuali bolle di gas visibili dalle righe dell'afflusso di agitazione manuale.
- Confermare l'ossigenatore è corretto funzionamento immergendo l'elettrodo di ossigeno in aCSF che scorre dalla camera di aspersione.
Nota: La lettura del contatore di ossigeno deve essere approssimativamente la percentuale di ossigeno contenuta all'interno di gas erogato.
3. Preparazione dei tessuti
- eutanasia
- posto un ratto (125-150 g) nella camera di induzione di una macchina di anestesia e di esporre a 4% isoflurane in un vettore di ossigeno del gas ad un tasso di 1 L/min per 4 min.
- Rimuovere il ratto incosciente dal vano di anestesia.
- Eseguire un test reflex raddrizzante inserendo il ratto nella posizione supina. Controllare eventuali spostamenti — testa tornitura, gamba di sollevamento, spina dorsale, flessione, ecc — indicativo che l'animale sta girando sul suo stomaco.
- Eseguire un test di riflessivo occhiolino toccando l'occhio aperto dell'animale con un batuffolo di cotone. Verifica per qualsiasi risposta — coperchio di chiusura, contrazioni muscolari, ecc. — a questo input sensoriale.
- Infine, eseguire un arto-ritirare prova riflesso pizzicando la pelle tra le dita del ratto ' s outstretched gamba posteriore con una pinzetta o emostatiche. Verifica per la flessione della gamba
Nota: nel caso di un risultato positivo del test riflessivo, non procedere con l'eutanasia. - Nel caso in cui uno dei tre test riflesso provoca una risposta, restituire il ratto immediatamente alla camera di anestesia e consentire per altri 2 minuti di esposizione al 4% isoflurane.
- Eseguire tutti e tre i test riflessivi sopra nella loro interezza. Ripetere l'esposizione di anestesia 2 min come necessario e procedere solo una volta è stata osservata una completa mancanza di risposta a tutte le tre prove riflessive.
- Eutanasia ratto tramite decapitazione ghigliottina.
- Resezione cervello
- rimuovere il cervello del ratto da dissezione lorda. Iniziare con la testa in posizione prona. Utilizzando le forbici, tagliare rostralmente attraverso la pelle dalla parte posteriore del collo al naso ed esporre il cranio.
- Rimuovere i tessuti molli dalla superficie del cranio con una sonda smussata.
- Lavorando dall'estremità caudale, rimuovere l'occipitale, parietali e osso frontale del cranio usando Pinze ossivore.
- Ritrarre la dura madre tagliando lungo la fessura longitudinale con micro-forbici e peeling indietro lo strato da entrambi gli emisferi.
- Rimuovere il cervello dal cranio girando la testa nella posizione supina e troncare i nervi cranici dal lato ventrale.
- Fetta isolamento
- tornare il cervello in posizione prona e isolare la parte centrale contenente l'ippocampo rimuovendo tutti i tessuti caudali alla fenditura trasversa e rostrali per il fimbria. Fare due tagli lungo il piano trasversa (cioè coronale fette) con un rasoio retti.
- Apporre il cervello ' aereo la maggior parte caudale s al centro di una vasca di taglio vibratome usando la colla del cianoacrilato.
- Aggiungere ghiacciata, carbogen gorgogliare aCSF al bagno taglio vibratome e posizionare l'hardware di ritenzione in nylon all'interno.
- Fette dello spessore di taglio 300 μm per ottenere 3-4 preparazioni di fetta utilizzabile per emisfero (6 a 8 in totale).
- Isolare un ippocampo o sezione corticale da un emisfero e tagliare la fetta in modo che si inserisce all'interno del microcoil ' tessuto di diametro di 5 mm s ben.
4. Esempio di posizionamento e assemblaggio del sistema di perfusione
- bobina preparazione
- Fill il microcoil ' camera di tessuto s con ossigenato aCSF del vibratome ' bagno di taglio s utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Prendere l'esempio di cervello profilati e posizionare la regione di interesse (ad es. strato delle cellule piramidali) sopra il microcoil utilizzando un ambito di dissezione.
- Inserire il dispositivo di ritenzione di tessuto (rete di nylon netto applicata a rondella in nylon) per mantenere la posizione di campione in tutto l'esperimento imaging.
Nota: Procedere rapidamente attraverso l'esempio di posizionamento procedura per ridurre al minimo l'esposizione a luce intensa. Fornire ulteriori aCSF ossigenato secondo necessità utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Montaggio in foro ossigenatore, microcoil e sonda
- fissare il gruppo microcoil modificate ( Figura 3) in un morsetto da tavolo e apporre il dispositivo nel foro ossigenatore inserendo il perno supporto acetale nel foro sulla parte superiore della bobina.
- Sigillare il sistema di perfusione posizionando la camera di aspersione sopra il microcoil ' tessuto s bene e i due insieme con le fascette in miniatura di cinching.
- Tagliare la lunghezza in eccesso dalla fascetta con tagliafili.
Nota: Durante la sigillatura successo, perfusato dovrebbe osservare uscendo attraverso le linee di deflusso e nessuna perdita dovrebbe essere evidente attorno alla guarnizione in silicone di camera di aspersione. Per confermare queste condizioni prima del montaggio della sonda potrebbe comportare gravi danni a imaging hardware. - Una volta aCSF può essere visto gocciolare nel serbatoio rifiuto, prendere il microcoil e ossigenatore e montare la parte superiore del corpo sonda imaging.
- Far scorrere lo stack di gradiente dell'Assemblea e sede della sfumatura in cima la sonda. Fotografie di dettagliare il posizionamento relativo e il corretto collegamento della bobina, ossigenatore e sonda componenti hardware sono fornite ( Figura 4).
5. Eseguire la raccolta di immagini di MR
- inserimento sonda assemblata nel magnete foro
- posto il corpo della sonda in prossimità dello spettrometro Foro apertura nella parte inferiore del magnete.
- Ritrarre la lunghezza in eccesso delle linee di perfusione attraverso il foro di apertura nella parte superiore del magnete.
- Una volta tutto il margine di flessibilità disponibile è stato ripreso dalle linee di perfusione, anticipo il corpo della sonda nel magnete foro alla base eliminando contemporaneamente più margine di flessibilità dalle linee di aspersione dalla parte superiore del foro.
- Infilare le due viti di fissaggio alla base della sonda nelle fessure corrispondenti dello stack shim.
- Prima di procedere, verificare che linee di aspersione non erano schiacciati o piegati durante l'inserimento della sonda confermando aCSF deflusso nel serbatoio rifiuto.
Nota: La mancata conferma di perfusato deflusso può causare danni permanenti alla perfusione linee e rischi catastrofici danni a risonanza magnetica hardware. - Nel caso in cui nessun perfusato è visto uscire sulla linea di ritorno al serbatoio dei rifiuti, rimuovere il corpo della sonda e confermare che il flusso di perfusato ha ricominciato prima di tentare di reinserimento. Un layout schematico dello spettrometro di sistema e la formazione immagine di aspersione assemblato è stato descritto in precedenza 8.
- Collegando il corpo della sonda
- collegare le linee di afflusso e deflusso dell'acqua dal refrigeratore gradiente.
- Accendere la pompa per gradienti refrigeratore e confermare l'impostazione della temperatura dell'acqua (19 ° C).
- Collegare il tubo dell'aria dall'unità chiller aria al corpo sonda utilizzando una fascetta stringitubo.
- Ruotare la manopola di flusso dell'unità del refrigeratore di aria per la " 1 " posizione.
- Collegare il cavo di termocoppia al corpo sonda.
- Collegare il cavo coassiale dal preamplificatore a radio frequenza (RF) ingresso/uscita sul corpo sonda ' channel protone (H) s.
- Collegare il cavo di alimentazione da amplificatori gradiente al corpo sonda.
- All'interno il ricevitore radio mobile, attivare l'alimentazione per l'unità di compensazione B0, tutti tre amplificatori gradienti (x, y, z) e l'unità master.
- Preparando lo spettrometro
- impostare la temperatura di foro previsto tramite il modulo di regolazione di temperatura variabile alla console.
- Match (impedenza) e sintonizzare il circuito (frequenza) la RF regolando i condensatori variabili all'interno della sonda. Ciò avviene modificando le bacchette alla base del corpo sonda.
- Regolare le impostazioni correnti per lo spettrometro ' bobine di spessore s per massimizzare l'omogeneità del campo magnetico al campione.
- Iniziare la raccolta di immagini
- raccogliere immagini pilota per determinare la posizione spaziale del vostro campione all'interno del magnete del foro. Parametri tipici per un due dimensionale Eco di pendenza sono come segue (TR/TE = 100/4 ms, medie = 1, angolo di impulso = 30 o, tempo = matrice di sec, 6 = 64 x 64, campo di vista = 0,3 x 0,3 cm, risoluzione = 47x47 μm).
- Raccogliere diffusione-appesantita piloti al fine di confermare la posizione di tessuto e geometria corretta scansione se applicabile. Parametri tipici per un due dimensionale diffusione-appesantita pilota scansione sono come segue (TR/TE = 2000/11,6 ms, tempo = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medie = 1, b = 1200 (valida dal 1860) s/mm 2, matrix = 64 x 64, campo di vista = 0,2 x 0,2 centimetri risoluzione = 31 μm).
- Raccogliere una serie temporale di diffusione-appesantita per determinare le caratteristiche di stabilità della preparazione fetta acuta. Parametri tipici per un immagine pesata due dimensionale diffusione sono come segue (TR/TE = 2000/11,6 ms, tempo = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medie = 42, b = 1200 s/mm 2, matrix = 64 x 64, campo di vista = 0,2 x 0,2 cm, risoluzione = 31 μm). Nota: Che caratterizza la stabilità in un dato sistema varierà dal protocollo descritto a seconda di fattori quali il contrasto di MR impiegato (ad esempio T1, T2, diffusione, suscettibilità), la perturbazione fisica studiato e il cambiamento del segnale di MR per unità di tempo derivanti da detto perturbazione.
Representative Results
Preparazione di perfusato
All'occupazione riuscita del dispositivo nel foro ossigenazione, gas presenti nella dotazione carbogen raggiungerà condizioni di saturazione del 100% entro il perfusato aCSF. Questo può essere dimostrato variando la concentrazione di ossigeno del gas fornito e misurazione delle variazioni nel contenuto di ossigeno disciolto nel perfusato aCSF all'interno della camera di aspersione utilizzando un ossigeno contatore (Figura 1)8. Secondo la legge di Henry, la quantità di gas disciolti che è in equilibrio con un campione di liquido è direttamente proporzionale alla pressione parziale di quel gas, purché la temperatura rimane costante12. Usando questa conoscenza e precisione gas standard, è possibile quantificare la quantità di ossigeno disciolto contenuta all'interno di un campione di aCSF come descritto. Questo risultato è ottenuto mediante la calibrazione del misuratore di ossigeno utilizzando soluzioni sature (gorgogliare direttamente per 1 h o più) di aCSF essendo esposti a gas di composizione nota: un gas con concentrazione di ossigeno elevata come carbogen (95% O2) e un altro con basso tenore di ossigeno concentrazione come l'azoto (0% O2). In seguito, misurazioni possono essere effettuate immergendo la punta dell'elettrodo ossigeno in un campione. Conferma che l'ossigenatore in foro funzioni correttamente è possibile misurando l'effluente da perfusione bene. La percentuale di ossigeno disciolto come misurato al contatore di ossigeno deve corrispondere la concentrazione percentuale di ossigeno nei gas di alimentazione. Se i valori misurati sono inferiori a quelli del gas di alimentazione, questo suggerirebbe un errore hardware che potrebbe portare a insufficienza metabolica nella fetta del tessuto.
Comportamento e l'aspetto del campione
Preparazioni di fetta acuta che ricevono aspersione sufficiente per fornire metaboliti necessari e portare via i rifiuti metabolici presto raggiungono uno stato di relativa stabilità. Da quel punto, fettine acute possono essere soggette a perturbazioni esterne e le loro risposte a questi cambiamenti possono essere misurate per lo studio scientifico. Per gli esperimenti di MR, rilevamento del segnale di interesse nel corso del tempo è una pratica comunemente usata per dimostrare la stabilità relativa di fetta acuta preparazioni13. Il segnale di diffusione-appesantita è particolarmente sensibile ai cambiamenti nella mobilità dell'acqua di un tessuto, contenuto e distribuzione, come può essere apprezzato dall'uso di questo meccanismo di contrasto per rilevare gli infarti nel colpo ischemico14,15. Tracciare il segnale normalizzato diffusione nel corso del tempo a fette corticale acute mantenuto sotto una varietà di condizioni di perfusione dimostra relativamente stabilità (2 ± 3% oltre 15,5 h) dopo l'isolamento del tessuto viene raggiunto (Figura 5). Stabilità del segnale di diffusione è stata mantenuta indipendentemente dalle condizioni di perfusione (continue o intermittente) o lunghezza di scansione MRI (breve [4 min] o [1,5 h] long)8. Se le fette non esibiscono stabilità del segnale nel tempo, ad esempio l'aumento del segnale di forte diffusione osservata nella corteccia vivente che non hanno ricevuto l'aspersione, questo è indicativo di non ottimali condizioni sperimentali. Esperimenti di perturbazione non dovrebbero essere tentati prima della conferma delle condizioni di segnale stabile nelle preparazioni di fetta.
Oltre alla stabilità del segnale, il posizionamento corretto del campione deve essere confermato al momento della raccolta di immagini. Anche se la posizione del campione viene controllata durante il posizionamento del tessuto al microscopio per dissezione, cambiamenti di posizione del campione possono verificarsi durante l'assemblaggio dell'apparato di aspersione, o dovuti della bobina o sonda prima dell'inserimento nel magnete. Conferma del corretto posizionamento hippocampal può essere realizzata raccogliendo breve (2 min), pilota scansioni con contrasto di diffusione (Figura 6). Poiché lo strato delle cellule piramidali è più sensibile alla ponderazione di diffusione di lamine hippocampal adiacenti, questa struttura verrà visualizzati come una fascia più scura nelle immagini diffusione-appesantita. Le impostazioni che non vengono visualizzati questa caratteristica contengono campioni fuori centro e saranno probabilmente bisogno di essere ripetuta.
Figura 1: Dissolto il tenore di ossigeno di perfusato aCSF in funzione della percentuale O2 contenuto in gas erogato. Carbogen miscele contenenti concentrazioni variabili di ossigeno (95%, 60% e 19%) sono impiegate come un gas di alimentazione. Percentuale di ossigeno disciolto letture sono poi prese da perfusione bene e rispetto a due controlli noti: un serbatoio di perfusato gorgogliare direttamente con carbogen (95% O2) e un serbatoio di perfusato esposti agli agenti atmosferici (23% O2 ). In ogni caso, la saturazione percentuale di ossigeno presso il sito del tessuto aspersione approcci 100% della concentrazione O2 all'interno della miscela di carbogen utilizzata. Barre di errore sono uguali per la deviazione standard dei mezzi del campione. Figura riprodotta con permesso dal originale articolo8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: disegno della camera nel foro dell'ossigenatore e perfusione schematico. Questo diagramma Mostra elementi di progettazione dettagliata responsabile della funzione di questi dispositivi critici. Perfusato fresca che è stata pompata attraverso un gorgogliatore entra l'ossigenatore attraverso la parte superiore di un tubo di NMR di 10 mm. In questo modo, passa in un gas altamente della tubazione del silicone permeabile (segmento blu) che è avvolto attorno ad un tubo 5 mm NMR a tempo indeterminato, nidificato all'interno. Carbogen gas fornito attraverso la parte superiore del tubo 5mm entra nella camera attraverso il fondo a tempo indeterminato e passa sopra la tubazione del silicone spirale prima di uscire l'ossigenatore attraverso un foro di sfiato nel tappo tubo 10 mm. Durante questa esposizione, il perfusato che scorre attraverso il tubo di silicone è saturato con i componenti chimici della miscela gas fornito. All'uscita l'ossigenatore, perfusato passa direttamente nella camera di aspersione prima di entrare la linea di ritorno che conduce ad un serbatoio di raccolta dei rifiuti. Altri componenti critici a questo design includono il perno di supporto dell'acetale che permette l'ossigenatore a stare in verticale in cima la modificate microcoil RF, una rondella in silicone (anello rosso) che forma il sigillo a tenuta di liquido tra camera di aspersione di ossigenatore e tacca del tessuto di microcoil bene e la fascetta che accomoda il posizionamento di un legame cavo utilizzato per formare questo sigillo reversibile. Questa figura è stata modificata e riprodotta con l'autorizzazione dall'originale articolo8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: modifiche all'assembly microcoil che consentono un'interfaccia l'ossigenatore in foro. Due scanalature 3,0 mm x 1,5 mm (frecce nere) sono state tagliate a lato dell'assembly che ospitare la larghezza di una fascetta utilizzata per sigillare la camera di aspersione. Un canale (15 x 3 x 4 mm) collega i boschetti in tutta la faccia posteriore della bobina. Due spazi in nylon posizionati ai lati dell'atto di canale (frecce rosse) come un fermo per la testa del cavo cravatta che facilita la procedura di tenuta. Praticare un foro (2 x 14 mm) nella parte superiore della bobina (giallo arrOW) si unisce all'acetale supportano peg per fissare l'ossigenatore. Questa figura è stata modificata e riprodotta con l'autorizzazione dall'originale articolo8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Photo montage dettagliare il posizionamento relativo e il corretto assemblaggio del microcoil, ossigenatore e sonda componenti. Queste immagini sono dotate di componenti hardware chiave del dispositivo ossigenatore e microperfusion nel foro e illustrano come le parti separate interfacciano uno con l'altro. Foto di vista esplosa (A) Mostra il posizionamento relativo di tutti i componenti prima del montaggio del corpo della sonda o di tenuta del tessuto bene. Ha avuto cura di visualizzare la posizione relativa delle parti con precisione; Tuttavia, una sezione delle linee di perfusione è stata raddoppiata indietro in questa serie così che tutti i componenti in forma all'interno della cornice di immagine. (1 = sonda testa, 2 = microcoil assembly, 3 = anello di ritenzione del tessuto di nylon, 4 = aspersione Beh, 5 = fascetta ferma-cavo, 6 = ossigenatore in foro, 7 = bobine di pendenza, 8 = gorgogliatore). (B) componenti Assemblea bobina e ossigenatore. In questa immagine, l'anello di ritenzione in nylon è stato inserito all'interno del pozzo di tessuto di microcoil per garantire un campione. Il perno di supporto dell'acetale sulla base dell'ossigenatore è stato protetto nel corrispondente foro in cima il microcoil. La guarnizione in silicone sull'estremità aperta della perfusione ben piazzata sopra il pozzo di tessuto, e una fascetta sia stretto intorno a questi componenti per sigillare la camera di aspersione. Infine, la base della microcoil è stata collegata alla parte superiore della testa sonda. (C) componenti seguendo assieme sonde. Nell'ultimo pannello, lunghezza eccedente dalla fascetta è stato tagliato a filo con il microcoil. Lo stack di bobina di gradiente è poi scivolò nella posizione avanzando attentamente il cilindro verso la sonda mentre passando le linee di perfusione in eccesso, ossigenatore e microcoil attraverso il suo centro vuoto. Una volta che le pendenze sono allacciate alla testa della sonda, essi sei tenuti in posizione avvitando il collare di fissaggio sulla sonda sopra la base filettata dei gradienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: stabilità del segnale di diffusione in fette corticali acute superfusi. (A) valori di segnale normalizzato di diffusione in quattro fette acuti sottoposti a differenti paradigmi sopraffusione vengono tracciati nel tempo per un periodo di fino a 21,5 h dopo l'eutanasia. Fette rimangono entro il ± 5% di loro misura del segnale di diffusione iniziale per un periodo di 15,5 h dopo l'eutanasia a prescindere se sopraffusione è continuo o intermittente e dipende dalla lunghezza di scansione MR (1,5 h o 4 min). Registrazioni di segnale prelevate dalla corteccia formaldeide-fisso servono come controllo positivo (n = 1) per la stabilità a causa della natura statica, immutabile dei campioni di tessuto fisso. Al contrario, diffusione segnale misurato in una fetta dal vivo assente di sopraffusione supporto (n = 1) serve come controllo per deficit metabolico. Parametri di esperimento delle diverse prove sopraffusione sono i seguenti: continuo (sopraffusione sempre puntuale, per scansione = 1,5 h), intermittente (sopraffusione su per 10 min di intervallo tra le scansioni, tempo per scansione = 1,5 h), lungo intervallo di scansione lunga (superfusione su durante la scansione, ma in pausa per 10 minuti tra le scansioni, tempo per scansione = 1,5 h), il lungo intervallo, breve scansione (sopraffusione su per intervallo di 1,5 h tra le scansioni, tempo per scansione = 4 min). (B) gruppo Analyzed dati visualizzando significa dei quattro esperimenti sopraffusione live-fetta dal pannello (A). La diffusione del segnale profilo da raggruppate, fette corticali superfusi esibisce piccola variazione nel tempo (2 ± 3% oltre 15,5 h) considerando che il controllo non perfusi (n = 1) esibisce instabilità segnale drammatico presto nell'esperimento (15% di h 6,5). Questa figura è stata modificata e riprodotta con l'autorizzazione dall'originale articolo8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: conferma della disposizione di fettine di ippocampo durante la formazione immagine pilota. Prima di eseguire un signor estesa sessione di microscopia, corretto posizionamento del campione è fondamentale per garantire risorse quali scanner e costoso perfusato additivi non sono sprecati. Lo strato delle cellule piramidali nella regione CA1 dell'ippocampo può essere visualizzata in più veloce (4,3 min), abbassare il scansioni pilota ad alta risoluzione (31 μm x 31 μm in piano) per garantire il tessuto di interesse sia posizionato correttamente in relazione la micro-bobina. Parametri di scansione comuni a entrambe le immagini sono come segue: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medie = 1. (A) b = 0 (227 efficace) s/mm2. In questa analisi preliminare, il corneum pyramidale è appena visibile come un grigio, banda diagonale centrato nel profilo di eccitazione della bobina. (B) b = 1.200 (1.860 efficace) s/mm2. All'indirizzo di diffusione maggiore ponderazione, Interlamellari contrasto aumenta come lo strato delle cellule piramidali diventa più scuro di tessuti in lamine adiacenti (sopra: strato oriens; qui sotto: strato radiato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
L'attuale protocollo descrive le procedure necessarie per la manutenzione ordinaria metabolica delle preparazioni di fetta di cervello acuto sottoposti a microscopia a risonanza magnetica. Questa procedura è l'unico metodo attualmente disponibile che permette la visualizzazione di tessuti dei mammiferi viventi con il signor a risoluzioni in grado di risolvere le cellule. Mentre il perfusato condizioni descritte sono adattate specificamente ai tessuti del sistema nervoso centrale, il protocollo è ampiamente adattabile a qualsiasi modo di vivere preparazione dei tessuti mediante aggiustamenti di perfusato e gas costituenti, come pure la portata di perfusione e temperatura.
I più comuni problemi suscettibili di presentarsi durante le procedure descritte sono quelli correlati a errori nel rifornimento del metabolita. Precipitazione di sali di calcio può verificarsi all'interno del aCSF durante insufficienza gassoso a causa di errori nel sistema di buffering del bicarbonato. Tali precipitati possono ostruire le linee di perfusione e provocare danni all'hardware grave. Se sale precipitati sono osservate nel perfusato seguendo assieme sonde, cessare immediatamente di aspersione flusso disattivando la pompa peristaltica. Confermare la presenza di sufficienti livelli di bicarbonato di sodio (4,37 g/2L) nel perfusato, livelli di CO2 (5,0%) nel gas di alimentazione e flusso di gas di carbogen (1/16 L/min) in serbatoio e ossigenatore. Infine, di confermare i livelli di pH sono stabilizzati nella gamma fisiologica (7,3-7,4). Nel caso in cui i livelli di pH e gas di ossigeno ancora non sono regolati in modo appropriato, dovrebbe sostituire la membrana di scambio di gas.
Se le fette non esibiscono stabilità del segnale nel tempo-corso sperimentale previsto, confermare che il corretti costituenti chimici sono presenti nella miscela aCSF e che siano mantenute le corrette osmolalità (300 mOsm) e pH (7,3-7,4). Inoltre, assicurarsi di carbogen gas viene fornita per il contenitore del perfusato e ossigenatore a 1/16 L/min. Se questi passaggi non si corregge il perfusato condizioni, sostituzione della membrana di scambio di gas è consigliato. Se la stabilità dei tessuti non viene raggiunta dopo la risoluzione dei problemi le condizioni di perfusato, considera la raffinatezza del protocollo chirurgico con un focus su riducendo al minimo l'intervallo di tempo tra l'applicazione di vendemmia e l'aspersione del tessuto.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH 1R01EB012874-01) (1R21NS094061-01A1) (S10RR031637) e la National Science Foundation (accordo cooperativo No. DMR-1157490) attraverso l'impianto di laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) avanzate Magnetic Resonance Imaging e spettroscopia (AMRIS) UF e dello stato della Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
