Sondas de rastreio óptico do romance bactérias específicas no tecido de pulmão humano Ex Vivo por Endomicroscopy Laser Confocal

Summary

Esta técnica descreve um processo de triagem eficiente para avaliar agentes de imagem óptico de bactérias específicas dentro ex vivo tecido de pulmão humano, por microscopia de fluorescência confocal desfibrado para a identificação rápida de pequenas moléculas químicas sonda-candidatos com potencial traduzível.

Abstract

Melhorar a velocidade e a precisão da detecção bacteriana é importante para a estratificação do paciente e para garantir o uso adequado de antimicrobianos. Para atingir esse objetivo, o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico para reconhecer a presença bacteriana em tempo real no ponto-de-cuidado é necessário. Imagem latente ótica para identificação directa das bactérias dentro do host é uma abordagem atraente. Várias tentativas em química sonda design e validação foram investigados, porém nenhum ainda foram com sucesso traduzidos para a clínica. Aqui nós descrevemos um método para validação de ex vivo de sondas de bactérias específicas para identificação de bactérias dentro do pulmão distal, fotografada por microscopia de fluorescência confocal desfibrado (FCFM). Nosso modelo usado ex vivo tecido de pulmão humano e uma plataforma de endomicroscopy (CLE) laser confocal clinicamente aprovado para romance tela bactérias específicas de imagem compostos, estreitamente simulando condições de imagem deverá ser encontrado com os pacientes. Portanto, compostos de triagem por esta técnica proporciona confiança de rastreabilidade clínica potencial.

Introduction

Esta técnica descreve um processo de seleção rápida para avaliar agentes de imagem óptico de bactérias específicas dentro ex vivo do tecido pulmonar humano por CLE usando FCFM para a rápida identificação de compostos com potencial utilidade clínica para poder Visualizar bactérias no pulmão distal em situ.

Há uma necessidade urgente de global de racionar a prescrição de antimicrobianos na época de crescente resistência aos antimicrobianos¹. Para este fim, o desenvolvimento de métodos de diagnóstico que actuam para identificar infecção bacteriana com alta especificidade, sensibilidade e em tempo real são altamente procurado². As técnicas atuais para confirmar um diagnóstico de pneumonia em pacientes criticamente doente, tais como aqueles dentro de unidades de terapia intensiva (UTI), muitas vezes dependem de interpretação específico características clínicas ou radiológicas juntamente com técnicas de cultura bacteriana de aspirados líquidos/tecidos, que pode demorar até 3 dias para produzir resultados. Além disso, cultura bacteriana de fluido instilado para o pulmão distal e obtida é propenso à contaminação das vias aéreas mais proximal³ e é muitas vezes cultura negativa devido à concomitante terapêutica antimicrobiana ou técnicas de amostragem pobre. Além disso, técnicas moleculares como a reação em cadeia da polimerase são excessivamente sensíveis quando usado em fluidos aspirados, arriscando overtreatment dos pacientes. Uma abordagem de diagnóstica emergente é imagem ótica molecular, fazendo em situ patologia molecular dos tecidos uma possibilidade; no entanto, o desenvolvimento e validação de compostos de imagem ópticos é necessário. Não obstante, visualização directa de bactérias, através de sondas ópticas ativáveis potencialmente é um método muito poderoso para permitir o estudo da presença e evolução da pneumonia no paciente e o mais importante, pode ser usada para estudar interações patógeno-hospedeiro em resposta a terapias em tempo real no local.

CLE é um procedimento investigativo estabelecido em várias doenças⁴, incluindo no âmbito de Gastroenterologia⁵, oncologia^6,7e para interrogar airways e sacos alveolares^{8, 9}. permite point-of-care por imagens estruturais do tecido doente usando uma fibra bundle, que passa através do canal de trabalho do endoscópio clínico de imagem e formas de contato direto com a superfície do tecido a ser fotografada por microscopia confocal. No entanto, uma limitação que permanece é a necessidade de agentes de contraste genérico. Portanto, a utilização de sondas específicas da doença, tais como agentes bacterianos específicos, poderia expandir consideravelmente a utilidade desta modalidade visualizando diretamente as bactérias no local da suspeita de infecção. Agentes ópticos oferecem muitas vantagens sobre outras técnicas, permitindo a geração de imagens em tempo real, de alta resolução com potencial diagnóstico. Além disso, sondas ópticas oferecem a perspectiva de multiplexação para interrogar alvos múltiplos, todos obtidos a um custo relativamente baixo. Um número de agentes ópticos está em desenvolvimento para tal finalidade, no entanto, nenhum ainda foram implementados com êxito dentro da clínica¹⁰. Nós temos sintetizado uma biblioteca de sondas químicas pequena molécula com especificidade para bactérias e desenvolvido um pipeline rápido, eficaz para a avaliação da função da sonda para a detecção de pneumonia bacteriana em situ¹¹.

Para identificar candidatos de sonda apropriado, os seguintes pré-requisitos tinham que ser preenchidas antes da interrogação da sonda em tecido de pulmão humano ex vivo por FCFM: solubilidade i) aquosa, ii) especificidade e seletividade para rapidamente rotulagem clinicamente bactérias relevantes, iii) uma alta relação sinal-ruído e iv) resistência à degradação do ambiente do pulmão. O último foi avaliado por líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) de pacientes com síndrome da angústia respiratória (Sara), que é uma condição que é caracterizada por ambientes proteolíticas e inflamatórias no pulmão na UTI. Além disso, as sondas tinham que ter um fluoróforo adequado para a detecção por um clinicamente aprovado CLE de imagens dispositivo óptico dentro do tecido alveolar pulmonar humana.

O pipeline para interrogar cada um destes pré-requisitos foi a seguinte (em cada fase, apenas sondas que passado foram reportadas para a próxima): (1) uma biblioteca de sondas para ser investigado foi sintetizada; (2) cada sonda foi adicionada a um painel de bactérias vivas para laser confocal, microscopia (CLSM) para garantir a rotulagem bacteriana; (3) seletividade de rotulagem bacteriana sobre células de mamíferos em culturas co com neutrófilos humanos primários foi estabelecida por CLSM; (4) estabilidade e sucesso rotulagem de bactérias na presença do paciente de SDRA BALF foi determinada por CLSM e Matrix Assisted Laser dessorção/ionização-tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa; (5) concentração ideal dos candidatos foi determinada por CLSM, garantindo seletividade para bactérias em células de mamíferos foi mantida; (6) candidatos foram pelo FCFM em suspensão e em ex vivo humano alveolar tecido pulmonar para garantir estabilidade e que o sinal-ruído era adequado para a deteção. Passo 6 é descrito em detalhes neste protocolo. Metodologia para as etapas 1 a 5 tem sido relatado anteriormente¹¹.

Protocol

Todo tecido de pulmão humano foi obtido após consentimento informado e o estudo foi aprovado pelo Comitê de ética Regional.

1. preparação de amostras biológicas

1. Preparação de sondas
   1. Compõem uma solução stock de 1 mM de cada sonda (por exemplo, calceína AM, UBI-3, UBI-10, etc.) em estéril dH₂O, usando um delicado equilíbrio de pesar o liofilizado sonda composto de¹¹. Calcule o volume de dH₂O para adicionar baseia a massa pesada e o peso molecular da sonda.
2. Preparação de culturas bacterianas
   Nota: Para este método, o Staphylococcus aureus foi usado como a cepa exemplar. Qualquer estirpe bacteriana adequada pode ser selecionado. Qualquer corante comercial que rotula as bactérias com uma excitação adequada e espectros de emissão pode ser selecionado para rotular positivamente as bactérias.
   1. Selecione uma única colônia de estirpe bacteriana desejado de uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) fresco com uma ansa estéril. Inocule a colônia em 10 mL de LB num tubo de centrífuga de 50 mL por mergulhando os meios de cultura com o fim do loop. Incubar a 37 ° C, 250 rpm para 16 h (ou durante a noite).
   2. Determine o OD₅₉₅ da cultura durante a noite, adicionando 100 µ l da cultura durante a noite, para µ l 900 LB em uma cubeta de 1 mL. Medir a D.O. a 595 nm (usando uma cubeta com 1 mL LB, como um espaço em branco) em um espectrofotômetro. Multiplique o OD obtido por 10 para obter o OD para a cultura durante a noite.
   3. Subcultura da cultura durante a noite. Para fazer isso, ajustar a densidade óptica em 595 nm (OD₅₉₅) a 0,1 em 10 mL de lb fresco calcular o volume necessário de cultura durante a noite para ser adicionado a 10 mL fresco LB para ajustar o OD₅₉₅ a 0,1. Incubar a cultura a 37 ° C, 250 rpm até que a cultura atinja a fase de log de mid (OD₅₉₅ 0.6 - 0.8), aproximadamente 4 h.
   4. Medir a densidade óptica da cultura (etapa 1.2.2) e colheita 1x10⁸ unidades formadoras (CFU) (OD₅₉₅ ~ 1-1 x 10⁸ UFC/mL) de cultura bacteriana em um microtubo de 1,5 mL (por exemplo, se a cultura bacteriana é OD₅₉₅ 0,6, recolher 1,67 mL). Centrifugar a cultura a 10.000 x g, à temperatura ambiente durante 1 min para as bactérias de Pelotas. Lavagem a pelota duas vezes em fosfato tampão salino (PBS), pipetando resuspending (acima e para baixo com cuidado) a pelota em 1 mL de PBS, centrifugação, como acima, descartar o sobrenadante e repetindo. Tome cuidado para não deslocar o pellet bacteriano quando retirar o sobrenadante. Resuspenda o pellet final em 1 mL de PBS.
      Nota: Prepare tantas amostras conforme necessário para cada procedimento de rotulagem. O protocolo pode ser uma pausa aqui para até 1 h, seguido pelo passo 1.2.5.1, 1.2.5.2 ou 1.2.5.3.
   5. Mancha bacteriana
      1. Para rotular as bactérias com calceína AM, adicione o corante para uma concentração final de 1 µM na cultura bacteriana lavada. Incube a cultura por 30 min a 37 ° C com agitação a 300 rpm. Lave a counterstained suspensão bacteriana em PBS 3 vezes por centrifugação como na etapa 1.2.4 para remover o corante em excesso. Resuspenda em 1 mL de PBS, diluir 100 µ l de 1:1 em PBS para obter 200 µ l de OD₅₉₅ calceína 0,5 estou manchado de bactérias. O protocolo pode ser uma pausa aqui para até 1 h.
      2. Para rotular as bactérias com pontas de prova (por exemplo, UBI-3 ou UBI-10), diluir 100 µ l de cultura bacteriana 1:1 em PBS para obter OD₅₉₅ 0.5 em 200 µ l PBS. Adicione que qualquer um dos testes para uma concentração final de 10 µM. inverter o microtubo várias vezes para assegurar uma mistura completa de bactérias e a sonda.
         Nota: A imagem deve ser realizada imediatamente após a adição da sonda para simular o cenário clínico.
      3. Para preparar o controle unstained amostras bacterianas, diluir 100 µ l de cultura, 1:1 com PBS para obter 200 µ l de imaculado OD₅₉₅ 0.5 amostra.
3. Preparação do ex vivo tecido de pulmão humano
   Nota: As amostras de tecido do pulmão humano foram obtidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica para carcinoma de pulmão. Obteve-se todo o tecido usado para a imagem latente de amostras de tecido pulmonar normal longe o crescimento canceroso. As amostras foram colhidas fresco do teatro operacional e armazenadas em microtubos ou centrifugar tubos a-80 ° C até o uso.
   1. Imediatamente antes da imagem latente, retire a amostra de tecido do pulmão humano do freezer em gelo seco. À temperatura ambiente, permitir que o tecido descongelar ligeiramente; apenas o suficiente para ser cortada com um bisturi em seções de 1 x 4 mm² .
      Nota: O nível de descongelamento é importante; também congelado e o tecido não vai cortar sem lascar, também descongelados e o tecido é muito mole fatiar.
   2. Usando fórceps, coloque o tecido de pulmão humano fatiado em poços de uma placa de cultura de tecidos claros 96 poços de fundo plano. Retorno qualquer tecido de pulmão humano não utilizados imediatamente para o recipiente de armazenamento e coloque sobre o gelo seco para o transporte de volta para o freezer-80 ° C.
   3. Adicione 100 µ l PBS para cada amostra de tecido pulmonar com uma pipeta. Use a ponta da pipeta para garantir todo o tecido é coberto com a PBS (e não preso às paredes do poço). O tecido vai inchar um pouco e pode flutuar. Deixe a PBS sobre a amostra por alguns minutos permitir que qualquer sangue para lixiviar do tecido para a solução. Retire o máximo da PBS quanto possível. O tecido pode bloquear o fim da ponta da pipeta; Tente a colocação da placa/ponta do ângulo para evitar isso.
   4. Pipetar 100 µ l de imaculado, calceína estou rotulada ou teste-sonda rotulado de bactérias para cada bem contendo tecido pulmonar. Também configurar os controles com tecido de pulmão e 100 µ l PBS. Para esses poços de controle, sondas sem bactérias podem ser adicionadas para medir qualquer aumento na fluorescência do fundo e/ou ativação inespecífica da sonda por tecido pulmonar sozinho. Um poço com tecido pulmonar e PBS também deve ser incluído.

2. a imagem com o dispositivo CLE com FCFM

1. Configurar dispositivo CLE
   Nota: Prepare o sistema CLE 20 min antes de calibração para permitir que o laser aquecer.
   1. Pressione o interruptor on/off na parte de trás do transformador do sistema e ligar o computador designado. Pressione o botão liga/desliga na parte frontal da unidade (LSU) de digitalização a laser. Confirme o aparecimento da luz verde, indicando que o aparelho é ligado.
   2. Duplo clique no ícone do software CLE. Insira os detalhes de login e aguardar a LSU inicializar (10-30 s).
   3. Para uso de novo FCFM fibras de imagens, a instalação com o CD fornecido é necessária. Insira o CD de instalação na unidade de CD do computador e siga as instruções na tela.
   4. Limpe a imagem FCFM fibra unidade conector com uma líquido de limpeza de fibra. Esfregue o conector na faixa de limpeza em um movimento para a frente para remover qualquer poeira/sujeira. Remova a tampa de protecção amarela da frente da LSU.
   5. Prepare o hub LSU girando suavemente o hub prateado anti-horário até parar. Insira o conector de fibra FCFM imagem no eixo com o lado liso do conector virado para cima. Prender a fibra no lugar e girar o cubo de prata para a direita até ouvir um clique duas vezes. Complete a conexão girando o cubo de prata no sentido horário por um mais 45°.
      Nota: Se a fibra não é reconhecida, verifique o FCFM fibra de imagem tem sido instalado e ligado na orientação correta.
   6. Siga as instruções que irão surgir para completar o FCFM imagem calibração de fibra. Existem 3 etapas: (1) FCFM imagem fibra teste (etapas 2.1.7 - 2.1.8), aquisição (2) o plano de fundo (etapa 2.1.9), deteção de fibra (3) (etapa 2.1.10).
   7. Pressione o botão 'Iniciar laser' na tela. Centralizam o laser.
   8. Selecione os frascos frescos (amarelo: calibrar; vermelho: limpar; azul: enxaguar) através da calibragem kit e siga as instruções na tela: Coloque a extremidade distal do FCFM fibra de imagem dentro do frasco amarelo e cuidado para o aumento na fluorescência no monitor e, em seguida, coloque o ponta de fibra dentro do frasco vermelho (sem agitação). Aguardar a fluorescência (como mostrado no monitor do computador) para desaparecer. Finalmente, enxágue a ponta de fibra no frasco azul.
      Nota: Se a fluorescência não desaparecer, limpar a fibra da imagem latente de FCFM com 8% H₂O₂ e tecidos de limpeza da lente e começar de novo. Repita o processo até que obtêm-se resultados satisfatórios (a qualidade da imagem é clara, e sem marcas de sujeira são aparentes).
   9. Coloque o FCFM fibra de imagem dentro do frasco azul. Pressione 'start do laser' seguido de 'calcular' quando isso se torna uma opção.
   10. Coloque o FCFM fibra de imagem dentro do frasco amarelo. Pressione 'start do laser' seguido de 'calcular' quando isso se torna uma opção.
   11. Durante a calibração automatizada, limpe a extremidade distal da fibra de imagem, colocando no frasco vermelho para o FCFM > 10 s, seguido do frasco azul para > 4 s, como indicado pelo software.
2. Coleta de dados com CLE
   1. Após a instalação, irá abrir uma janela para selecionar o local de armazenamento e o prefixo do arquivo. Selecione a pasta desejada para o armazenamento de dados e o nome o prefixo conformemente.
   2. Coloque os pedais para que eles podem ser facilmente acessados pelo operador. Pedal esquerdo: laser ligado/desligado; pedal de centro: pausa; Bem pedal: gravar/parar.
      Nota: Os controles do laser também podem ser acessados por meio de controles na tela.
   3. Clique em 'Iniciar' na tela ou pressione o pedal esquerdo para ativar o laser. Isto irá iniciar a aquisição e obter imagens usando o poder do laser de 100% e uma taxa de quadros de 12 quadros/s (configurações padrão).
      Nota: Para outras aplicações, essas configurações podem ser alteradas na tela, se necessário, dependendo do tipo de amostra.
   4. Imagem de cada uma das amostras suspensão bacteriana.
      1. Insira a extremidade distal da fibra de imagem FCFM e mover a fibra lentamente através da suspensão para interrogar a amostra.
      2. Gravar vídeos de qualquer tamanho (até 10 min) pressionando o pedal do pé direito ou selecionando os controles na tela de registro, como a fibra se move lentamente em torno da amostra.
      3. Limpe a extremidade distal da fibra FCFM imagem com 8% H₂O₂ e tecidos entre amostras de limpeza de lentes.
         Nota: Típicos vídeo comprimentos de 10-30 s são suficientes para a imagem latente em vitro .
   5. Imagem de cada uma das amostras de tecido do pulmão.
      1. Inserir a extremidade distal da FCFM a imagem da fibra para a amostra, garantindo que o contato direto entre a extremidade da fibra e o tecido é feito. Mova a extremidade da fibra de imagem ao redor para interrogar a amostra.
         Nota: Elevação final da fibra longe o tecido irá remover o tecido do plano focal; no entanto, isso pode ser usado para imagem rotuladas bactérias que não se adere ao tecido.
      2. Gravar vídeos de qualquer tamanho (até 10 min) pressionando o pedal do pé direito ou selecionando os controles na tela de registro, como a fibra se move lentamente em torno da amostra.
         Nota: Normalmente, a comprimentos de 30 s são suficientes para a imagem latente ex vivo no tecido.
      3. Limpe a extremidade distal da fibra FCFM de imagens com tecidos e 8% H₂O₂ entre amostras de limpeza de lentes.
3. Desligar o sistema
   1. Desligar o laser, pressionando o pedal esquerdo ou clicando o botão na tela.
   2. Desconecte-se da fibra de imagem FCFM o dispositivo CLE rodando o hub LSU prateado no sentido anti-horário até parar. Remova o FCFM imagem da fibra do hub LSU puxando levemente o conector de fibra da LSU.
   3. Limpe e Desinfecte a fibra da imagem latente de FCFM com 8% H₂O₂ e tecidos de limpeza de lentes. Retorno as tampas de protecção para a extremidade proximal da fibra de imagens FCFM e a frente da unidade LSU. Coloque a fibra suavemente na caixa de armazenamento.
   4. Fechar os dados software de captura e copie todos os arquivos salvos para um dispositivo USB externo. Desligue o computador e desligue o dispositivo LSU pressionando o painel frontal I/O por 3 s, até que desapareça a luz verde.
   5. Dispor de tecido pulmonar humano e bactérias de acordo com os regulamentos locais.

3. análise de dados

1. Abra o software e importar os arquivos para análise, selecionando o diretório apropriado no computador através do ícone 'Ir para' no painel de software. Alternativamente, arquivos podem ser arrastados e solto no painel de instrumentos de software.
2. Clique duas vezes em cada arquivo de vídeo para abri-los. Os vídeos automaticamente vão jogar com a tabela de pesquisa otimizada cor (LUT) e ajustar a tabela de cores. Desative a intensidade automática dimensionamento, clicando no botão varinha acima da barra de escala de intensidade. O recurso é desativado quando não há nenhum sombreamento preto ao redor do botão.
   Nota: Escala de intensidade automática deve ser desativado para impedir o melhoramento contínuo ao longo de cada vídeo, tornando-se impossível de comparar e analisar vídeos a partir do mesmo conjunto de dados.
3. Selecione a intensidade desejada, dimensionamento, movendo as barras de mínimas e máximos para dar o melhor contraste. Use a ferramenta histograma quando selecionar a intensidade de dimensionamento para assegurar a mais ampla faixa dinâmica é capturado.
   Nota: Certifique-se que a faixa dinâmica é tal que as imagens não estão saturadas (isto é, limitar as regiões brancas da imagem, que indicam a saturação), para que recursos de baixa intensidade não são perdidos.
4. Uma vez que o dimensionamento desejado foi alcançado, botão direito do mouse sobre o botão de menu dropdown listado como '' padrão' (verde). Selecione a opção para salvar o LUT. Salve o LUT em um local desejado.
5. Para o outro vídeo dentro do conjunto de dados, aplicar a mesma LUT clicando com o botão direito sobre o '' padrão' (verde) no menu suspenso e selecione 'Carga LUT'. Selecione o arquivo apropriado aplicar intensidade consistente de escala para todos os vídeos dentro de um dataset.
6. Vídeos de exportação processado clicando no botão 'carretel de filme'. Selecione o formato de vídeo desejado, por exemplo, 'para fins de apresentação', que irá produzir um arquivo. mpg. Pressione 'Exportar' e escolheu o local do arquivo para salvar o arquivo de vídeo. Instantâneos de quadros simples podem ser exportados clicando no botão 'câmera'. É possível salvar um arquivo. jpg,. bmp ou. png. Escolher o destino do arquivo e pressione salvar.
   Nota: Vídeos então podem ser importados para qualquer software para preparação de apresentações ou quantificação ainda mais. Rotulado de bactérias são visualizadas como pontos verdes 'piscar' no vídeo. A estrutura do tecido pulmonar será aparente como vertentes fluorescentes ordenadas, com espaço alveolar aparecendo preto.

Representative Results

Neste estudo, temos demonstrado um método para a rápida-seleção da novela sondas específicas de bactérias em um ex vivo humano pulmão alveolar tecido modelo de infecção usando um dispositivo CLE clinicamente aprovado.

CLE por FCFM é bem adequado para a obtenção de informações estruturais dentro do pulmão distal, como nesta região (devido a uma grande abundância de elastina e colágeno) naturalmente é altamente fluorescente quando excitado com uma 488 nm laser⁸. Por outro lado, o espaço alveolar não fluorescem, e como tal permite alto contraste entre a estrutura do tecido e o espaço aéreo ser visualizada (Figura 1).

A adição de doença relacionadas com sondas ou agentes de contraste, como sondas de bactérias específicas deverá permitir informação funcional sobre processos de doenças a serem obtidos em tempo real. Descrevemos anteriormente a síntese e seleção inicial em vitro de uma biblioteca de bactérias específicas sondas¹¹; onde a especificidade bacteriana, estabilidade proteolítica, retenção e dentro da membrana bacteriana ao longo do tempo foi determinado. Uma sonda de bactérias específicas promissor (UBI-10) foi identificada dentro do estudo, bem como aquele que mostrou pobre retenção dentro da membrana celular bacteriana (UBI-3). Estes foram comparados a um controle de comercial counterstaining (calceína AM) que foi usado para rotulado de S. aureus.

Inocente, calceína AM, UBI-3 e 10-UBI rotulado de S. aureus foram fotografada em suspensão por FCFM com 100% 488 nm laser de potência e uma taxa de quadros de 12 quadros/s (Figura 2). Onde foram fotografadas sem rótulo bactérias em PBS, nenhum sinal fluorescente era detectável. Isso é contrário quando bactérias rotuladas foram fotografadas. Onde suspensões bacterianas com UBI-3 ou UBI-10 foram fotografadas por FCFM, era aparente que a fluorescência de fundo geral da solução foi elevada em comparação com PBS únicos controles, isto é porque NBD (o sonda fluoróforo) emitem uma pequena quantidade de sinal de fluorescência em solução aquosa, no entanto, pontos brilhantes punctate são claramente visíveis em toda a solução, sem a necessidade de uma etapa de lavagem. Isto é devido a um aumento no sinal de fluorescência emitida a partir de NDB em um ambiente polar ou seja, a membrana bacteriana. Calceína AM não é uma sonda ativável, portanto uma etapa de lavagem depois da coloração bacteriana foi necessária para remover o fundo fluorescente alto da sonda não acoplado na solução. Como UBI-3 e 10-UBI rotulado a bactérias, bactérias rotuladas com calceína AM foram detectados em solução por FCFM como pontos punctate verdes brilhantes. Como os dados são coletados em formato de vídeo, esses pontos parecem 'brilha', como eles se movem entre núcleos e entrar e sair de foco, um traço característico de bactérias rotulados de imagens por este método.

As bactérias rotuladas foram posteriormente adicionadas à fatias pequenas de ex vivo tecido de pulmão humano e fotografadas novamente por FCFM (Figura 3). Onde somente PBS ou sem rótulo S. aureus foi adicionado ao tecido de pulmão, apenas a estrutura de autofluorescent de tecido pulmonar foi detectada (visto como um brilhantes verdes fibras de colágeno e elastina e áreas escuras do espaço alveolar). Não há pontos punctate foram detectados para estas condições de controle. Da mesma forma, o único pulmão tecido estrutura (e não pontos punctate) foi visualizados para a condição de tecido pulmonar com S. aureus mais UBI-3; indicando que esse teste não foi mantido estável dentro o bacteriano célula membrana ou seja, ele foi lavado fora e/ou se degrada na presença de enzimas proteolíticas nativas dentro do tecido pulmonar (como demonstrado anteriormente,¹¹).

No entanto, pontos brilhantes punctate eram visíveis em ambos a calceína AM rotulada amostra de S. aureus controle positivo e com a sonda mais promissor de bactérias específicas (UBI-10) S. aureus a amostra. Os pontos 'brilhando' eram visíveis, apesar da tecido forte autofluorescência (Figura 3). Assim, os resultados obtidos por FCFM estavam em concordância com a em vitro pré-seleção do painel de sondas específicas de bactérias por CLSM e demonstraram um método de deteção clinicamente relevantes para a imagem latente infecções em tempo real.

Os resultados aqui apresentados demonstram que o pulmão é um sistema de órgão apropriado para a imagem latente por FCFM devido ao seu distintiva autofluorescência. As estruturas distintivas brilhantes permitem que o operador CLE determinar que estão no espaço alveolar. Nestas regiões, juntamente com os sacos de ar alveolares escuros fornecem o pano de fundo perfeito para bactérias fluorescente etiquetadas com alto contraste de imagem.

Embora a detecção de bactérias apresentados no presente estudo é determinada qualitativamente através da visualização de pontos brilhantes punctate, poderia ser possível quantificar o número de pontos punctate frame por frame usando um software secundário fim para promover caracterizar bibliotecas de sonda.

Figura 1: Imagem estática do pulmão humano tecido autofluorescência. Imagem de endomicroscopy (CLE) laser confocal de ex vivo o tecido de pulmão humano usando microscopia de fluorescência confocal desfibrado (FCFM), em 488 nm de excitação, poder do laser de 100% e 12 quadros/s. elastina e colágeno são altamente fluorescente (false de cor verde), Considerando que o espaço alveolar não é e aparece como regiões pretas. Esta figura foi modificada de Akram et al. ¹¹ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem de endomicroscopy (CLE) laser confocal de rotulada de S. aureus em suspensão. Microscopia de fluorescência confocal desfibrado (FCFM) foi usada para bactérias previamente rotuladas de imagem, em 488 nm de excitação, poder do laser de 100% e 12 quadros/s. rotulada bactérias mostram como pontos punctate altamente fluorescentes (falsa cor verde). Esta figura foi modificada de Akram et al. ¹¹ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3: Imagem de endomicroscopy (CLE) laser confocal de ex vivo tecido de pulmão humano com etiquetados S. aureus. Microscopia de fluorescência confocal desfibrado (FCFM) foi usado para imagem ex vivo humano tecido pulmonar e rotulado de S. aureus, em 488 nm de excitação, poder do laser de 100% e 12 quadros/s. rotulada bactérias mostrar como pontos punctate altamente fluorescentes (cor falsa -verde) dentro a amostra de tecido do pulmão quando rotulado com calceína AM ou UBI-10. O maior contraste é observado onde as bactérias são cuja imagem dentro do espaço alveolar. Esta figura foi modificada de Akram et al. ¹¹ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  

Discussion

Infecções do tracto respiratório inferior representam a segunda maior carga da doença globalmente^12,13e um substancial aumento o número de infecções atribuídas a bactérias resistentes aos antimicrobianos tem sido relatado¹⁴. Uma pneumonia continua a ser uma causa comum de internação hospitalar. Na UTI, o desenvolvimento de uma pneumonia é agravado pela incerteza diagnóstica e está associado com uma taxa de mortalidade extremamente alta¹⁵. Durante o início da pneumonia, bactérias proliferam-se dentro do espaço alveolar do pulmão distal, uma área que é relativamente estéril, com microbiota mínimo em saúde.

Este método descreve relativamente tarde palco ex vivo validação de bactérias específicas óptico de imagem sondas¹¹, mas o design, síntese e avaliação da sonda antes de iniciar esta etapa de validação é imperativa, como mostrada anteriormente¹¹ .

CLE é uma técnica clínica emergente para interrogar doença afirma em situ em tempo real. Oferece muitas vantagens sobre as técnicas tradicionais para investigar suspeita patologia pulmonar, que pode envolver uma biópsia e a coleção do fluido de lavagem. Biópsias são invasivas e podem causar morbidade e mortalidade em pacientes ventilados, e fluido de lavagem coletadas muitas vezes está contaminado com bactérias de vias aéreas superiores. O uso de CLE na detecção de pneumonia é no entanto um pouco limitada devido à pobre disponibilidade de imagem compatível com sondas que podem fornecer informação funcional da doença, apesar de muitos esforços concertados¹⁰. Combinando CLE com agentes óptico oferece a possibilidade de diagnosticar uma pneumonia mais rápido e menos invasiva em relação ao atual prática padrão.

Os passos críticos no presente protocolo são a preparação da amostra e a configuração da plataforma de CLE. Obtenção de tecidos humanos relevantes para a aplicação clínica final também é importante, tais como tecido de pulmão humano, como demonstrado no presente estudo. É necessário usar o tecido humano, porque a extensão do tecido autofluorescência mostra grande variação entre as espécies e, portanto, pode induzir em erro a sensibilidade da bactéria-sonda sendo fotografada. Além disso, a obtenção de ética para recuperação e uso de tecido de pulmão humano é essencial. De uma técnica correta, nível limpeza, acessório da fibra da imagem latente para a plataforma de imagem da LSU e calibração é essencial para boa resolução e imagem consistente, como é assegurar um número equivalente de bactérias é adicionado para cada amostra de tecido do pulmão. Para ampliar a utilidade deste método para painéis de testes de triagem, é necessário repetir o procedimento com uma variedade de agentes patogénicos, tais como aqueles susceptível de ser agentes causadores de pneumonia.

A maior limitação dessa técnica é que o dispositivo CLE clinicamente aprovado tem apenas um laser (488 nm). Portanto, atualmente, a seleção de fluoróforo para design de sonda é limitada para uso com este sistema, embora clinicamente aprovado única cor existem dispositivos com comprimentos de onda de excitação de 660 nm e infravermelho. É altamente desejável ter uma segunda linha de laser implementada dentro do mesmo dispositivo para permitir que uma sonda a ser desenvolvido com um fluoróforo espectralmente distinto para melhorar a sensibilidade de bactérias-sonda sobre o nível do tecido autofluorescência. Enquanto dispositivos CLE duplo-cor estão em desenvolvimento, eles também são não clinicamente aprovados e/ou seu custo significativo¹⁶.

CLE em vitro usando bactérias patogênicas e ex vivo do tecido pulmonar humano para sondas potenciais tela preenche a lacuna entre técnicas convencionais em vitro como citometria de fluxo e CLSM e utilidade clínica. Essa etapa oferece confiança ao selecionar compostos promissores de reporte para ser acoplado com CLE clínica de imagem; e irá fornecer indicação sobre se a sonda testada mantém a especificidade do alvo, ou demonstra qualquer rotulagem fora do alvo, tais como a ligação diretamente para o tecido ou mostra instabilidade com host enzimas proteolíticas. Também seria pertinente para adicionar cada uma das sondas ativáveis diretamente para amostras de tecido pulmonar humano além de bactérias, para caracterizar plenamente a velocidade de ligação da sonda e a ativação em tempo real.

Acreditamos que nosso pipeline para triagem rapidamente novas sondas de bactérias específicas para avaliar o seu potencial para a imagem latente dentro do pulmão distal de pacientes irá resultar em uma tradução muito mais rápida para a clínica. Isto é em grande parte porque a sonda de bactérias específicas pode ser entregue localmente dentro do pulmão através de um cateter inserido abaixo do canal de trabalho de um broncoscópio, significando que microdose (< 100 µ g) montantes podem ser entregue. Portanto, entrega sistêmica e biodistribuição do composto não é uma preocupação, como é o caso de muitos outros alvos de infecção dentro do corpo, ou com imagem nuclear. Além disso, entregando a sonda da imagem latente em tais doses pequenas reduz o risco de toxicidade relacionados com complicações (apesar de rastreio de toxicidade seria necessário para a tradução). Após a instilação da sonda, o cateter pode então substituído pela fibra FCFM e a mesma região do pulmão interrogado por CLE, da mesma forma que temos realizado dentro deste método. Imagem latente deve ser realizada rapidamente após a instalação da sonda antes da sonda lava a concentrações indetectáveis.

Também é importante observar essa triagem da doença-identificando sondas por esta técnica não deve ser limitadas aos agentes bacterianos de imagem, mas também poderia estender para a validação das sondas com destinos alternativos, tais como inflamação. Esta abordagem também deve ser adaptável para outros locais da doença dentro do corpo onde a imagem via FCFM é admissível.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Small benchtop microcentrifuge
96-well plate	Corning	3370	Assay plate
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S	Cletop	14110601	Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes	Fisher Scientific	11568663	Micro pipettes
Falcon tube (50 mL)	Scientific Lab Supplies	352070	50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - wash media
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi	Sciquip	SQ-4020	Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth	Sigma Aldrich (Miller)	L3522	LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette	Sigma Aldrich	C5416-100EA	For spectrophotometry
Thermomixer comfort	Eppendorf	41102422	Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer	Biochrom WPA		Spectrophotometer