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Immunology and Infection

उपंयास जीवाणुओं के ऑप्टिकल स्क्रीनिंग-फोकल लेजर Endomicroscopy द्वारा विवो मानव फेफड़े के ऊतकों पर विशिष्ट जांच

Published: November 29, 2017 doi: 10.3791/56284
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1EPSRC Proteus Hub, MRC Centre of Inflammation Research, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2School of Chemistry, EaStChem, University of Edinburgh

Summary

यह तकनीक बैक्टीरिया का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल स्क्रीनिंग प्रक्रिया का वर्णन-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग एजेंटों के भीतर पूर्व vivo मानव फेफड़ों के ऊतकों, फाइबर द्वारा छोटे अणु रासायनिक की तेजी से पहचान के लिए फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच-अनुवाद क्षमता के साथ उंमीदवारों ।

Abstract

गति और बैक्टीरियल पता लगाने की सटीकता में सुधार रोगी स्तरीकरण के लिए महत्वपूर्ण है और रोगाणुरोधी के उचित उपयोग सुनिश्चित करने के लिए. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, नैदानिक तकनीक के विकास के बिंदु पर वास्तविक समय में बैक्टीरियल उपस्थिति की पहचान करने के लिए देखभाल की आवश्यकता है । मेजबान के भीतर बैक्टीरिया की प्रत्यक्ष पहचान के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग एक आकर्षक दृष्टिकोण है । रासायनिक जांच डिजाइन और सत्यापन में कई प्रयास की जांच की गई है, लेकिन कोई भी अभी तक सफलतापूर्वक क्लिनिक में अनुवाद किया गया है । यहां हम बैक्टीरिया की पहचान के लिए एक विधि के पूर्व vivo सत्यापन के लिए बाहर फेफड़े के भीतर बैक्टीरिया विशिष्ट जांच का वर्णन, फाइबर्ड फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FCFM) द्वारा imaged । हमारे मॉडल पूर्व vivo मानव फेफड़े के ऊतकों और एक नैदानिक अनुमोदित फोकल लेजर endomicroscopy (CLE) मंच उपन्यास बैक्टीरिया-विशिष्ट इमेजिंग यौगिकों, बारीकी से रोगियों के साथ सामना किया जा करने के लिए अपेक्षित इमेजिंग शर्तों की नकल की स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया । इसलिए, इस तकनीक के द्वारा स्क्रीनिंग यौगिकों संभावित नैदानिक पथ का विश्वास प्रदान करता है ।

Introduction

इस तकनीक में बैक्टीरिया का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग प्रक्रिया का वर्णन-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग एजेंटों के भीतर पूर्व vivo CLE द्वारा मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए संभावित नैदानिक उपयोगिता के साथ यौगिकों की तेजी से पहचान के लिए FCFM का उपयोग visualizing सीटू मेंबाहर फेफड़े में बैक्टीरिया ।

वहां एक अत्यावश्यक वैश्विक आवश्यकता है राशन रोगाणुरोधी बढ़ती रोगाणुरोधी प्रतिरोध1के युग में विहित करने के लिए । इस अंत करने के लिए, नैदानिक तरीकों जो उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता के साथ बैक्टीरियल संक्रमण की पहचान करने के लिए कार्य के विकास, और वास्तविक समय में अत्यधिक2की मांग कर रहे हैं । वर्तमान तकनीक गंभीर रूप से ठीक रोगियों में निमोनिया के निदान की पुष्टि करने के लिए, ऐसे गहन देखभाल इकाइयों के भीतर उन (ICUs) के रूप में, अक्सर से बैक्टीरियल संस्कृति तकनीक के साथ गैर विशिष्ट नैदानिक या रेडियोलॉजिकल सुविधाओं की व्याख्या पर निर्भर aspirated द्रव/ऊतकों, जो परिणाम उत्पादन करने के लिए 3 दिन तक लग सकते हैं । इसके अलावा, तरल पदार्थ से बैक्टीरियल संस्कृति बाहर फेफड़े में जगाकर और पुनर्प्राप्त अधिक समीपस्थ एयरवेज3 से संक्रमण के लिए प्रवण है और अक्सर संस्कृति नकारात्मक सहवर्ती रोगाणुरोधी थेरेपी या गरीब नमूना तकनीक के कारण है । इसके अतिरिक्त, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया के रूप में आणविक तकनीक पीढ़ी संवेदनशील होते हैं जब aspirated तरल पदार्थ पर इस्तेमाल किया, रोगियों के अधिक उपचार खतरे में डाल. एक उभरते नैदानिक दृष्टिकोण आणविक ऑप्टिकल इमेजिंग है, सीटू में बना ऊतकों की आणविक विकृति एक संभावना; हालांकि, ऑप्टिकल इमेजिंग यौगिकों के विकास और सत्यापन की आवश्यकता है । फिर भी, बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष दृश्य, activatable ऑप्टिकल जांच के माध्यम से संभावित एक बहुत शक्तिशाली तरीका उपस्थिति और रोगी में निमोनिया के विकास के अध्ययन की अनुमति है, और महत्वपूर्ण बात, मेजबान के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-रोगज़नक़ में बातचीत सीटू में रीयल-टाइम में उपचारों की प्रतिक्रिया ।

CLE कई रोगों में एक स्थापित खोजी प्रक्रिया है4, गैस्ट्रोएंटरोलॉजी5, कैंसर विज्ञान6,7के क्षेत्रों के भीतर सहित, और एयरवेज और वायुकोशीय sacs8पूछताछ के लिए, 9. यह एक फाइबर इमेजिंग बंडल, जो एक नैदानिक एंडोस्कोप का काम कर चैनल के माध्यम से गुजरता है और ऊतक सतह के साथ सीधे संपर्क करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा छवि के रूप में किया जाता है का उपयोग कर रोगग्रस्त ऊतक के बिंदु की देखभाल संरचनात्मक इमेजिंग सक्षम बनाता है । हालांकि, एक सीमा है कि सामांय कंट्रास्ट एजेंटों के लिए की जरूरत है । इसलिए, विशिष्ट बैक्टीरियल एजेंटों के रूप में रोग विशिष्ट जांच, का उपयोग काफी, सीधे संदिग्ध संक्रमण के स्थल पर बैक्टीरिया visualizing द्वारा इस रूपरेखा की उपयोगिता का विस्तार सकता है । ऑप्टिकल एजेंट वास्तविक समय, नैदानिक क्षमता के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग को सक्षम करने के द्वारा अंय तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करते हैं । इसके अलावा, ऑप्टिकल जांच कई ठिकानों से पूछताछ के लिए मल्टीप्लेक्स की संभावना प्रदान करती है, सभी अपेक्षाकृत कम लागत पर हासिल की । ऑप्टिकल एजेंटों के एक नंबर के विकास के तहत इस तरह के एक उद्देश्य के लिए कर रहे हैं, लेकिन कोई भी अभी तक सफलतापूर्वक क्लिनिक के भीतर लागू किया गया है10। हम बैक्टीरिया के प्रति विशिष्टता के साथ छोटे अणु रासायनिक जांच के एक पुस्तकालय संश्लेषित किया है और सीटू11में बैक्टीरियल निमोनिया का पता लगाने के लिए जांच समारोह के मूल्यांकन के लिए एक तेजी से, प्रभावी पाइपलाइन विकसित की है ।

उपयुक्त जांच उंमीदवारों की पहचान करने के लिए, निंनलिखित किसी और चीज के लिए FCFM द्वारा पूर्व vivo मानव फेफड़े के ऊतकों पर जांच की पूछताछ से पहले पूरा किया जाना था: i) जलीय घुलनशीलता, द्वितीय) विशिष्टता और selectivity तेजी से नैदानिक लेबलिंग के लिए प्रासंगिक बैक्टीरिया, iii) एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, और iv) फेफड़ों के वातावरण के भीतर क्षरण के लिए प्रतिरोध । उत्तरार्द्ध तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS), जो एक शर्त है कि आईसीयू में फेफड़ों में proteolytic और भड़काऊ वातावरण की विशेषता है के साथ रोगियों से bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इसके अलावा, जांच मानव फेफड़े वायुकोशीय ऊतक के भीतर एक नैदानिक अनुमोदित ऑप्टिकल CLE इमेजिंग डिवाइस द्वारा पता लगाने के लिए एक उपयुक्त fluorophore था ।

इन आवश्यकताओं के प्रत्येक के लिए पूछताछ करने के लिए पाइपलाइन के रूप में इस प्रकार था (प्रत्येक चरण में, केवल जांच कि पारित अगले करने के लिए आगे ले जाया गया): (1) जांच की जानी करने के लिए एक पुस्तकालय संश्लेषित किया गया था; (2) प्रत्येक जांच के लिए फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के लिए जीवित बैक्टीरिया के एक पैनल के लिए जोड़ा गया था जीवाणु लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए; (३) प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल के साथ सह-संस्कृतियों में स्तनधारी कोशिकाओं पर जीवाणु लेबलिंग का selectivity CLSM द्वारा स्थापित किया गया; (४) ARDS रोगी BALF की उपस्थिति में जीवाणुओं की स्थिरता और सफल लेबलिंग CLSM और मैट्रिक्स असिस्टेड लेसर Desorption/Ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था; (5) उंमीदवारों की इष्टतम एकाग्रता CLSM द्वारा निर्धारित किया गया था, स्तनधारी कोशिकाओं पर बैक्टीरिया के लिए selectivity सुनिश्चित बनाए रखा गया था; (6) उंमीदवारों को निलंबन में FCFM द्वारा और पूर्व vivo मानव फेफड़े वायुकोशीय ऊतक पर स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए और है कि संकेत करने वाली शोर का पता लगाने के लिए पर्याप्त था छवि थे । चरण 6 इस प्रोटोकॉल के भीतर विवरण में वर्णन किया गया है । 1-5 चरणों के लिए क्रियाविधि पहले रिपोर्ट किया गयाहै11 ।

Protocol

सभी मानव फेफड़े के ऊतकों को सूचित सहमति निंनलिखित प्राप्त किया गया था और अध्ययन क्षेत्रीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. जैविक नमूनों की तैयारी

  1. जांच की तैयारी
    1. एक 1 मिमी स्टॉक समाधान प्रत्येक जांच (जैसे, Calcein AM, यूबीआई-3, यूबीआई-10, आदि) बाँझ डीएच2ओ में, एक ठीक संतुलन का उपयोग कर फ्रीज वजन करने के लिए सूख जांच यौगिक11. डीएच2O की मात्रा की गणना की जांच के तौला द्रव्यमान और आणविक वजन के आधार पर जोड़ने के लिए ।
  2. बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी
    नोट: इस विधि के लिए, Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस अनुकरणीय दबाव के रूप में उपयोग किया गया था । किसी भी उपयुक्त जीवाणु तनाव का चयन किया जा सकता है । किसी भी व्यावसायिक डाई कि एक उचित उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ बैक्टीरिया लेबल के लिए सकारात्मक लेबल बैक्टीरिया का चयन किया जा सकता है ।
    1. एक ताजा Lysogeny शोरबा (पौंड) से वांछित जीवाणु तनाव का एक एकल कॉलोनी का चयन एक बाँझ पाश का उपयोग कर प्लेट । एक ५० मिलीलीटर में पौंड के 10 मिलीलीटर में कॉलोनी लगाना संस्कृति मीडिया में पाश के अंत सूई से केंद्रापसारक ट्यूब । ३७ ° c, 16 घंटे के लिए २५० rpm पर मशीन (या रात भर) ।
    2. एक 1 एमएल cuvette में ९०० µ एल पौंड के लिए रातोंरात संस्कृति के १०० µ एल जोड़कर रातोंरात संस्कृति के आयुध डिपो५९५ का निर्धारण । ५९५ एनएम पर आयुध डिपो को मापने (एक cuvette का उपयोग करते हुए एक spectrophotometer में 1 मिलीलीटर पौंड के रूप में एक खाली) । रातोंरात संस्कृति के लिए आयुध डिपो प्राप्त करने के लिए 10 से प्राप्त आयुध डिपो गुणा ।
    3. रात भर संस्कृति को उपसंस्कृति । ५९५ एनएम (ओडी५९५) पर ऑप्टिकल घनत्व का समायोजन करके यह मत ताजा पौंड के 10 मिलीलीटर में ०.१ के लिए 10 मिलीलीटर ताजा पौंड के लिए जोड़ा जा करने के लिए की आवश्यकता मात्रा की गणना करने के लिए आयुध डिपो५९५ ०.१ को समायोजित करने के लिए । ३७ ° c, २५० rpm पर संस्कृति की मशीन जब तक संस्कृति मध्य प्रवेश चरण (आयुध डिपो५९५ ०.६-०.८), लगभग 4 एच तक पहुंचता है ।
    4. माप संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व (कदम 1.2.2) और फसल 1 x 108 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) (आयुध डिपो५९५ ~ 1-1 x 108 CFU/एमएल) बैक्टीरियल संस्कृति के एक १.५ मिलीलीटर microtube में (उदा, अगर बैक्टीरियल कल्चर है ओडी५९५ ०.६, कलेक्ट १.६७ mL). 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १०,००० x जी में संस्कृति के लिए जीवाणु गोली । दो बार फॉस्फेट में गोली धोना (pipetting ऊपर और नीचे ध्यान से) reसस्पैंड द्वारा खारा (पंजाब) बफर 1 एमएल पंजाब में गोली, ऊपर के रूप में, केंद्रापसारक supernatant खारिज, और दोहरा । supernatant को हटाते समय बैक्टीरियल गोली को उखाड़ फेंकना नहीं ध्यान रखना । 1 एमएल पंजाब में अंतिम गोली स्थगित ।
      नोट: प्रत्येक लेबलिंग प्रक्रिया के लिए आवश्यक के रूप में कई नमूने तैयार करें । प्रोटोकॉल यहां 1 h, चरण 1.2.5.1, 1.2.5.2, या 1.2.5.3 के बाद के लिए रोका जा सकता है ।
    5. बैक्टीरियल धुंधला
      1. Calcein के साथ बैक्टीरिया लेबल करने के लिए, धोया बैक्टीरियल संस्कृति में 1 µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डाई जोड़ें । ३०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संस्कृति की मशीन । पंजाब में counterstained बैक्टीरियल सस्पेंशन 3 बार के रूप में कदम 1.2.4 अतिरिक्त डाई हटाने के लिए केंद्रापसारक द्वारा धो लो । 1 एमएल में फिर सस्पेंड हुए पंजाबियों, पतला १०० µ एल 1:1 में पंजाब के आयुध डिपो के २०० µ एल प्राप्त करने के लिए५९५ ०.५ Calcein दाग बैक्टीरिया हूं । यहां 1 h तक के लिए प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।
      2. परीक्षण जांच (उदा., यूबीआई-3 या यूबीआई-10) के साथ बैक्टीरिया को लेबल करने के लिए, पंजाब में बैक्टीरियल कल्चर 1:1 के १०० µ एल को २०० µ एल पंजाब में ओडी५९५ ०.५ प्राप्त करने के लिए । या तो जांच के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें 10 µ एम. पलटना microtube कई बार बैक्टीरिया और जांच के लिए पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
        नोट: इमेजिंग तुरंत नैदानिक परिदृश्य की नकल करने के लिए जांच के अलावा के बाद किया जाना चाहिए ।
      3. इस पर नियंत्रण दाग बैक्टीरियल नमूने तैयार करने के लिए, १०० µ की संस्कृति 1:1 के साथ पंजाब के लिए unसना हुआ आयुध डिपो के २०० µ l प्राप्त करने के लिए५९५ ०.५ नमूना पतला.
  3. पूर्व vivo मानव फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी
    नोट: मानव फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों फेफड़ों कार्सिनोमा के लिए शल्य लकीर के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया गया । इमेजिंग के लिए प्रयुक्त सभी ऊतक सामांय फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों से कैंसर के विकास से दूर प्राप्त किया गया था । नमूने ऑपरेटिंग थिएटर से ताजा ले लिया और microtubes में संग्रहित किया गया या-८० ° c उपयोग तक में ट्यूब केंद्रापसारक ।
    1. इमेजिंग से पहले तुरंत, सूखी बर्फ पर फ्रीजर से मानव फेफड़े के ऊतकों के नमूने निकालें । कमरे के तापमान पर, ऊतक गल थोड़ा करने की अनुमति; बस काफी एक स्केलपेल के साथ 1 x 4 मिमी2 वर्गों में कटा हुआ हो ।
      नोट: गल का स्तर महत्वपूर्ण है; बहुत जमे हुए और ऊतक बंद छिल के बिना टुकड़ा नहीं होगा, बहुत गल और ऊतक भी टुकड़ा करने के लिए नरम है ।
    2. संदंश का प्रयोग, एक ९६ के कुओं में कटा हुआ मानव फेफड़ों के ऊतकों जगह-अच्छी तरह से स्पष्ट फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति की थाली । वापस किसी भी अप्रयुक्त मानव फेफड़ों के ऊतकों को तुरंत भंडारण कंटेनर और जगह के परिवहन के लिए सूखी बर्फ पर-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर लौटें ।
    3. एक पिपेट के साथ प्रत्येक फेफड़ों के ऊतकों के नमूने के लिए १०० µ l पंजाबियों जोड़ें । यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें कि सभी ऊतक पंजाबियों में शामिल है (और अच्छी तरह से दीवारों के लिए अटक नहीं) । ऊतक थोड़ा प्रफुल्लित और फ्लोट हो जाएगा । कुछ मिनट के लिए नमूने पर पंजाबियों छोड़ समाधान में ऊतक से नमकीन पानी के लिए अनुमति देते हैं । जितना संभव हो सके पंजाबियों को उतना निकालें । ऊतक पिपेट टिप के अंत ब्लॉक कर सकते हैं; आदेश इस को रोकने के लिए प्लेट कोण/
    4. पिपेट १०० µ एल के दाग, Calcein लेबल हूं, या परीक्षण जांच एक अच्छी तरह से युक्त फेफड़ों के ऊतकों को बैक्टीरिया लेबल । इसके अलावा फेफड़ों के ऊतकों और १०० µ एल पंजाबियों के साथ नियंत्रण स्थापित । इन कुओं को नियंत्रित करने के लिए, बैक्टीरिया के बिना जांच पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में किसी भी वृद्धि को मापने के लिए जोड़ा जा सकता है और/या अकेले फेफड़े के ऊतकों द्वारा जांच के गैर विशिष्ट सक्रियण । फेफड़े के ऊतकों और पंजाबियों के साथ एक अच्छी तरह से भी शामिल किया जाना चाहिए ।

2. FCFM के साथ CLE डिवाइस के साथ इमेजिंग

  1. CLE डिवाइस का सेट अप करें
    नोट: CLE प्रणाली 20 मिनट अंशांकन से पहले लेजर गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए तैयार ।
    1. सिस्टम के ट्रांसफॉर्मर के पीछे पर/बंद स्विच दबाएँ और निर्दिष्ट कंप्यूटर पर चालू करें । लेज़र स्कैनिंग इकाई (LSU) के सामने पर/बंद बटन दबाएँ । हरी बत्ती के प्रकटन की पुष्टि करें, यह दर्शाता है कि इकाई चालू है ।
    2. CLE सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करें । लॉगिन विवरण दर्ज करें और LSU (10-30 s) को प्रारंभ करने के लिए प्रतीक्षा ।
    3. नए FCFM इमेजिंग फाइबर के उपयोग के लिए, आपूर्ति की गई सीडी के साथ स्थापना आवश्यक है । स्थापना cd को कंप्यूटर cd ड्राइव में डालें और ऑनस्क्रीन निर्देशों का पालन करें ।
    4. एक फाइबर क्लीनर के साथ FCFM इमेजिंग फाइबर कनेक्टर इकाई को साफ. एक आगे की गति में सफाई रिबन पर कनेक्टर रगड़ किसी भी धूल/ LSU के सामने से सुरक्षात्मक पीली टोपी निकालें ।
    5. धीरे से यह बंद हो जाता है जब तक चांदी हब विरोधी दक्षिणावर्त घूर्णन द्वारा LSU हब तैयार करें । ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कनेक्टर के समतल साइड के साथ हब में FCFM इमेजिंग फाइबर कनेक्टर डालें । जगह में फाइबर पकड़ो और यह दो बार क्लिक जब तक सिल्वर हब दक्षिणावर्त घुमाएँ. एक आगे ४५ ° द्वारा सिल्वर हब दक्षिणावर्त घूर्णन द्वारा कनेक्शन पूरा करें ।
      नोट: यदि फाइबर पहचाना नहीं गया है, तो जांचें कि FCFM इमेजिंग फाइबर स्थापित किया गया है और सही ओरिएंटेशन में कनेक्टेड है ।
    6. FCFM इमेजिंग फाइबर अंशांकन को पूरा करने के लिए पॉप-अप होगा जो निर्देशों का पालन करें । इसमें 3 स्टेप्स हैं: (1) FCFM इमेजिंग फाइबर टेस्ट (steps 2.1.7-2.1.8), (2) बैकग्राउंड अधिग्रहण (step 2.1.9), (3) फाइबर डिटेक्शन (step 2.1.10) ।
    7. स्क्रीन पर ' स्टार्ट लेजर ' बटन दबाएं । लेजर केंद्र होगा ।
    8. चुनें ताजा शीशियों (पीला: जांचना; लाल: स्वच्छ; नीला: कुल्ला) अंशांकन किट से और परदे पर निर्देशों का पालन करें: पीली शीशी में FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर का अंत प्लेस और मॉनिटर पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि के लिए देखो, तो जगह लाल शीशी में फाइबर टिप (सरगर्मी के बिना) । प्रतिदीप्ति के लिए प्रतीक्षा करें (जैसा कंप्यूटर मॉनीटर पर दिखाया गया है) अदृश्य करने के लिए । अंत में नीले रंग की शीशी में फाइबर टिप कुल्ला ।
      नोट: प्रतिदीप्ति गायब नहीं करता है, तो 8% H2O2 और लेंस की सफाई के ऊतकों के साथ FCFM इमेजिंग फाइबर साफ और फिर से शुरू करते हैं । प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं (छवि गुणवत्ता स्पष्ट है, और गंदगी से कोई निशान स्पष्ट कर रहे हैं).
    9. FCFM इमेजिंग फाइबर को नीली शीशी में रखें । प्रेस ' शुरू लेजर ' के बाद ' गणना ' जब यह एक विकल्प बन जाता है ।
    10. FCFM इमेजिंग फाइबर को पीली शीशी में रखें । प्रेस ' शुरू लेजर ' के बाद ' गणना ' जब यह एक विकल्प बन जाता है ।
    11. स्वचालित अंशांकन के दौरान, FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर के अंत के लिए लाल शीशी में रखकर साफ > 10 एस, > 4 एस के लिए नीले रंग की शीशी के बाद, के रूप में सॉफ्टवेयर के द्वारा संकेत दिया ।
  2. CLE के साथ डेटा संग्रह
    1. सेटअप के बाद, संग्रहण स्थान और फ़ाइल उपसर्ग का चयन करने के लिए एक विंडो खुलेगी । डेटा संग्रहण के लिए इच्छित फ़ोल्डर का चयन करें और तदनुसार उपसर्ग का नाम दें.
    2. पैर पैडल प्लेस ताकि वे आसानी से ऑपरेटर द्वारा पहुंचा जा सकता है । वाम पेडल: लेजर/ केंद्र पेडल: रोकें; सही पेडल: रिकार्ड/
      नोट: लेजर नियंत्रण भी परदे पर नियंत्रण के माध्यम से पहुंचा जा सकता है ।
    3. ऑनस्क्रीन ' स्टार्ट ' पर क्लिक करें या लेजर पर बारी करने के लिए बायां पैर-पेडल दबाएं । इस अधिग्रहण शुरू और १००% लेजर शक्ति और 12 फ्रेम के एक फ्रेम दर का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करेगा/s (डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स) ।
      नोट: अन्य अनुप्रयोगों के लिए, नमूना प्रकार के आधार पर आवश्यक हो, तो ये सेटिंग्स स्क्रीन पर परिवर्तित किया जा सकता है ।
    4. बैक्टीरियल सस्पेंशन नमूनों में से प्रत्येक छवि ।
      1. FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर का अंत डालें और नमूना पूछताछ करने के लिए निलंबन के माध्यम से धीरे से फाइबर ले जाएँ.
      2. सही पैर पेडल दबाकर या परदे पर रिकॉर्ड नियंत्रण का चयन करके किसी भी लंबाई (अप करने के लिए 10 मिनट) के रिकॉर्ड वीडियो, के रूप में फाइबर नमूने के चारों ओर धीरे चलता है.
      3. 8% एच2हे2 और लेंस के नमूनों के बीच सफाई के ऊतकों के साथ FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर का अंत साफ ।
        नोट: ठेठ वीडियो की लंबाई 10-30 s के लिए पर्याप्त है इन विट्रो इमेजिंग ।
    5. फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों में से प्रत्येक छवि ।
      1. नमूने में FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर का अंत डालें, यह सुनिश्चित करना कि फाइबर के अंत और ऊतक के बीच सीधा संपर्क किया जाता है । धीरे नमूना पूछताछ करने के लिए चारों ओर इमेजिंग फाइबर के अंत ले जाएँ.
        नोट: फाइबर के अंत के ऊतक से दूर उठाने फोकल विमान से ऊतक निकाल देंगे; हालांकि, यह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता छवि लेबल बैक्टीरिया है कि ऊतक का पालन नहीं कर रहे हैं ।
      2. सही पैर पेडल दबाकर या परदे पर रिकॉर्ड नियंत्रण का चयन करके किसी भी लंबाई (अप करने के लिए 10 मिनट) के रिकॉर्ड वीडियो, के रूप में फाइबर नमूने के चारों ओर धीरे चलता है.
        नोट: आमतौर पर, 30 एस के वीडियो लंबाई ऊतक पर पूर्व vivo इमेजिंग के लिए पर्याप्त हैं ।
      3. लेंस सफाई ऊतकों और नमूनों के बीच 8% एच2हे2 के साथ FCFM इमेजिंग फाइबर के बाहर का अंत साफ ।
  3. सिस्टम बंद करना
    1. लेजर बंद बाएं पैर पेडल दबाकर या परदे पर बटन पर क्लिक करके स्विच करें ।
    2. CLE डिवाइस से FCFM इमेजिंग फाइबर सिल्वर LSU हब anticlockwise जब तक यह बंद हो जाता है बंद कर डिस्कनेक्ट । धीरे से LSU से फाइबर कनेक्टर खींचकर LSU हब से FCFM इमेजिंग फाइबर निकालें ।
    3. साफ और 8% एच2हे2 और लेंस सफाई ऊतकों के साथ FCFM इमेजिंग फाइबर को संक्रमित । FCFM इमेजिंग फाइबर के समीपस्थ अंत करने के लिए सुरक्षात्मक टोपियां और LSU इकाई के सामने लौटें । स्टोरेज बॉक्स में फाइबर को धीरे से लगाएं ।
    4. डेटा कैप्चर सॉफ़्टवेयर बंद करें और किसी भी सहेजी गई फ़ाइलों की किसी बाहरी USB डिवाइस पर प्रतिलिपि बनाएं । कंप्यूटर शट डाउन करें और जब तक हरी बत्ती गायब हो जाती है तब तक LSU डिवाइस को 3 s के लिए फ्रंट पैनल I/
    5. स्थानीय विनियमों के अनुसार मानव फेफड़ों के ऊतकों और बैक्टीरिया के निपटान.

3. डेटा विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर खोलें और सॉफ्टवेयर डैशबोर्ड पर ' जाओ ' आइकन के माध्यम से कंप्यूटर पर उपयुक्त निर्देशिका का चयन करके विश्लेषण के लिए फ़ाइलों को आयात. वैकल्पिक रूप से, फ़ाइलों को खींचा जा सकता है और सॉफ्टवेयर डैशबोर्ड में गिरा दिया ।
  2. प्रत्येक वीडियो उंहें खोलने के लिए फ़ाइल पर डबल क्लिक करें । वीडियो स्वचालित रूप से अनुकूलित रंग लुकअप टेबल (LUT) और रंग तालिका समायोजित के साथ खेलेंगे । स्वत: तीव्रता स्केलिंग को अक्षम करें, तीव्रता स्केल पट्टी के ऊपर छड़ी बटन पर क्लिक करके । बटन के आस-पास कोई काला छाया नहीं है जब सुविधा अक्षम किया गया है ।
    नोट: स्वचालित तीव्रता स्केलिंग प्रत्येक वीडियो भर में सतत विपरीत वृद्धि को रोकने के लिए, यह असंभव की तुलना और एक ही डेटा सेट से वीडियो का विश्लेषण करने के लिए अक्षम किया जाना चाहिए ।
  3. सबसे अच्छा विपरीत देने के लिए न्यूनतम और अधिकतम सलाखों के ले जाकर वांछित तीव्रता स्केलिंग का चयन करें । विस्तृत डायनेमिक श्रेणी कैप्चर की गई है यह सुनिश्चित करने के लिए तीव्रता स्केलिंग का चयन करते समय हिस्टोग्राम उपकरण का उपयोग करें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि गतिशील रेंज ऐसी है कि छवियों संतृप्त नहीं कर रहे हैं (यानी छवि है, जो संतृप्ति का संकेत के सफेद क्षेत्रों को सीमित), ताकि कम तीव्रता सुविधाओं को याद नहीं कर रहे हैं.
  4. एक बार वांछित स्केलिंग हासिल किया गया है, ड्रॉपडाउन मेनू बटन ' के रूप में डिफ़ॉल्ट (ग्रीन) ' सूचीबद्ध पर ठीक क्लिक करें । LUT को सहेजने के लिए विकल्प का चयन करें । LUT को किसी इच्छित स्थान पर सहेजें ।
  5. डेटा सेट के भीतर एक दूसरे वीडियो के लिए, सही पर क्लिक करके एक ही LUT लागू ' डिफ़ॉल्ट (ग्रीन) ' ड्रॉप डाउन मेनू और चुनें ' लोड LUT ' । किसी dataset में सभी वीडियो के लिए संगत तीव्रता स्केलिंग लागू करने के लिए उपयुक्त फ़ाइल का चयन करें ।
  6. ' मूवी रील ' बटन पर क्लिक करके प्रोसेस्ड वीडियोज एक्सपोर्ट करें । वांछित वीडियो प्रारूप का चयन करें, उदाहरण के लिए ' प्रस्तुति प्रयोजनों के लिए ', जो एक. mpg फ़ाइल का उत्पादन होगा. प्रेस ' निर्यात ' और वीडियो फ़ाइल को बचाने के लिए फ़ाइल स्थान चुना । एक फ्रेम के स्नैपशॉट ' कैमरा ' बटन पर क्लिक करके निर्यात किया जा सकता है । किसी. png,. bmp, या. jpg फ़ाइल को सहेजना संभव है । फ़ाइल गंतव्य चुनें और सहेजें दबाएं ।
    नोट: वीडियो फिर प्रस्तुतियों या आगे ठहराव की तैयारी के लिए किसी भी सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है । लेबल बैक्टीरिया ' हरे ' निमिष वीडियो में डॉट्स के रूप में कल्पना कर रहे हैं । फेफड़ों के ऊतकों संरचना के रूप में फ्लोरोसेंट किस्में का आदेश दिया स्पष्ट हो जाएगा, वायुकोशीय काले दिखने अंतरिक्ष के साथ ।

Representative Results

इस अध्ययन में, हम एक नैदानिक अनुमोदित CLE डिवाइस का उपयोग कर संक्रमण के एक पूर्व vivo मानव वायुकोशीय फेफड़ों के ऊतक मॉडल में उपंयास बैक्टीरिया-विशिष्ट जांच की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है ।

FCFM द्वारा CLE अच्छी तरह से बाहर फेफड़े के भीतर संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुकूल है, इस क्षेत्र के रूप में (elastin और कोलेजन का एक उच्च बहुतायत के कारण) स्वाभाविक रूप से अत्यधिक फ्लोरोसेंट जब एक ४८८ एनएम लेजर के साथ उत्साहित है8। इसके विपरीत, वायुकोशीय अंतरिक्ष fluoresce नहीं है, और इस तरह के रूप में सक्षम बनाता है ऊतक संरचना और हवा अंतरिक्ष के बीच उच्च विपरीत visualized किया जा करने के लिए (चित्र 1) ।

रोग संबंधित जांच या इसके विपरीत एजेंटों के अलावा, बैक्टीरिया विशेष जांच के रूप में रोग प्रक्रियाओं के बारे में कार्यात्मक जानकारी को सक्षम करने के लिए वास्तविक समय में प्राप्त किया जाना चाहिए । हम पहले संश्लेषण का वर्णन किया है और इन विट्रो में प्रारंभिक बैक्टीरिया की एक पुस्तकालय की स्क्रीनिंग-विशिष्ट जांच11; जहां जीवाणु-विशिष्टता, proteolytic स्थिरता, और समय के साथ बैक्टीरियल झिल्ली के भीतर प्रतिधारण निर्धारित किया गया था । अध्ययन के भीतर एक आशाजनक जीवाणु-विशिष्ट जांच (यूबीआई-10) की पहचान की गई थी, साथ ही जीवाणु कोशिका झिल्ली (यूबीआई-3) के भीतर खराब अवधारण दिखाया गया था । ये वाणिज्यिक counterstaining (Calcein AM) के नियंत्रण की तुलना में थे जो S. स्ताफ्य्लोकोच्चुसको लेबल करने के लिए उपयोग किया गया था ।

अनदाग, Calcein एएम, यूबीआई-3, और यूबीआई-10 लेबल S. स्ताफ्य्लोकोच्चुस १००% ४८८ एनएम लेजर पावर और 12 फ्रेंस के फ्रेम दर के साथ FCFM द्वारा निलंबन में imaged थे (चित्रा 2) । जहां पंजाब में unलेबल्ड बैक्टीरिया छवि थे, कोई फ्लोरोसेंट संकेत पता लगाने की थी । इस के विपरीत में है जब लेबल बैक्टीरिया imaged थे । जहां यूबीआई-3 या यूबीआई-10 के साथ बैक्टीरियल सस्पेंशन FCFM द्वारा imaged किया गया था, यह स्पष्ट है कि पंजाब के समाधान की सामांय पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति केवल नियंत्रण की तुलना में ऊंचा था, यह इसलिए है क्योंकि NBD (जांच fluorophore) की एक छोटी राशि का उत्सर्जन करता है प्रतिदीप्ति संकेत जलीय समाधान में, तथापि, उज्ज्वल कबरा डॉट्स समाधान भर में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, एक धोने कदम के लिए की आवश्यकता के बिना । यह एक ध्रुवीय वातावरण अर्थात्में NDB से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि के कारण है, बैक्टीरियल झिल्ली. Calcein AM एक activatable जांच नहीं है, तो एक धोने कदम के बाद बैक्टीरियल दाग समाधान में असीम जांच के उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए आवश्यक था । यूबीआई 3 और यूबीआई-10 लेबल बैक्टीरिया की तरह, Calcein AM के साथ लेबल बैक्टीरिया FCFM द्वारा समाधान में चमकीले हरे कबरा डॉट्स के रूप में पाए गए । के रूप में डेटा वीडियो प्रारूप में एकत्र कर रहे हैं, इन बिंदुओं को ' ट्विंकल ' के रूप में वे कोर और में और ध्यान से बाहर ले जाने के लिए, इमेजिंग इस विधि द्वारा लेबल बैक्टीरिया की एक विशिष्ट विशेषता दिखाई देते हैं ।

लेबल बैक्टीरिया बाद में पूर्व विवो मानव फेफड़े के ऊतकों के छोटे स्लाइस करने के लिए जोड़ा गया है और FCFM (चित्रा 3) द्वारा फिर से imaged । जहां केवल पंजाब या अनलेबल्ड एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस फेफड़ों के ऊतकों को जोड़ा गया था, केवल फेफड़ों के ऊतकों फ्लोरोसेंट संरचना का पता लगाया गया था (के रूप में देखा चमकदार हरी किस्में कोलेजन और elastin और वायुकोशीय अंतरिक्ष के अंधेरे क्षेत्रों) । इन नियंत्रण शर्तों के लिए कोई कबरा डॉट्स नहीं पाए गए । इसी प्रकार, केवल फेफड़े के ऊतकों की संरचना (और कोई कबरा डॉट्स) के साथ फेफड़े के ऊतकों की हालत के लिए visualized था एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस प्लस यूबीआई-3; यह दर्शाता है कि इस जांच के जीवाणु कोशिका झिल्ली अर्थात्के भीतर छुरा नहीं रखा गया था, यह बाहर धोया और/या फेफड़ों के ऊतकों के भीतर देशी proteolytic एंजाइमों की उपस्थिति में नीचा दिखाया गया है (के रूप में पहले से प्रदर्शित11) ।

हालांकि, चमकीले कबरा डॉट्स दोनों Calcein में दिखाई दे रहे थे सकारात्मक नियंत्रण एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस नमूना, और सबसे होनहार बैक्टीरिया के साथ विशिष्ट जांच (यूबीआई-10) एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस नमूना । ' मरते ' डॉट्स मजबूत ऊतक autofluorescence (चित्रा 3) के बावजूद दिखाई दे रहे थे । इस प्रकार, FCFM द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ सहमति में थे इन विट्रो पूर्व-CLSM द्वारा बैक्टीरिया विशेष जांच के पैनल की स्क्रीनिंग, और वास्तविक समय में इमेजिंग संक्रमण के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक जांच विधि का प्रदर्शन किया ।

यहां प्रस्तुत परिणाम प्रदर्शित करता है कि फेफड़ों अपनी विशिष्ट autofluorescence के कारण FCFM द्वारा इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त अंग प्रणाली है । उज्ज्वल विशिष्ट संरचनाओं CLE ऑपरेटर निर्धारित करने के लिए कि वे वायुकोशीय अंतरिक्ष में है की अनुमति देते हैं । इन क्षेत्रों, डार्क वायुकोशीय एयर sacs के साथ युग्मित इमेजिंग फ्लोरोसेंट उच्च कंट्रास्ट के साथ बैक्टीरिया लेबल के लिए एकदम सही पृष्ठभूमि प्रदान करते हैं ।

हालांकि इस अध्ययन के भीतर प्रस्तुत बैक्टीरिया का पता लगाने के गुणात्मक उज्ज्वल कबरा डॉट्स visualizing द्वारा निर्धारित किया जाता है, यह फ्रेम द्वारा कबरा डॉट्स फ्रेम की संख्या में एक माध्यमिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के क्रम में आगे की विशेषता को यों तो संभव हो सकता है जांच पुस्तकालयों ।

Figure 1
चित्र 1: मानव फेफड़े के ऊतकों autofluorescence की स्थैतिक छवि । फोकल लेसर endomicroscopy (CLE) की छवि पूर्व vivo मानव फेफड़े ऊतक फाइबर्ड फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FCFM) का उपयोग कर, ४८८ एनएम उत्तेजना, १००% लेजर पावर, और 12 फ्रेम/एस Elastin और कोलेजन अत्यधिक फ्लोरोसेंट है (झूठी रंग का हरा), जबकि वायुकोशीय स्थान नहीं है, और काले क्षेत्रों के रूप में प्रकट होता है । यह आंकड़ा अकरम एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: फोकल लेसर endomicroscopy (CLE) के निलंबन में लेबल के स्ताफ्य्लोकोच्चुस की छवि । फाइबर्ड फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FCFM) छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था पूर्व लेबल बैक्टीरिया, पर ४८८ एनएम उत्तेजना, १००% लेजर पावर, और 12 तख्ते/लेबल बैक्टीरिया अत्यधिक फ्लोरोसेंट कबरा डॉट्स के रूप में दिखाने के लिए (झूठी रंग का हरा). यह आंकड़ा अकरम एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्र 3: फोकल लेजर endomicroscopy (CLE) की छवि पूर्व vivo मानव फेफड़े के ऊतकों के साथ लेबल एस स्ताफ्य्लोकोच्चुस। फाइबर्ड फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FCFM) छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था विवो मानव फेफड़े के ऊतकों और लेबल स्ताफ्य्लोकोच्चुस, पर ४८८ एनएम उत्तेजना, १००% लेजर पावर, और 12 फ्रेम्स/लेबल बैक्टीरिया दिखाने के रूप में अत्यधिक फ्लोरोसेंट कबरा डॉट्स (झूठी रंग Calcein AM या यूबीआई-10 के साथ लेबल जब फेफड़े के ऊतकों के नमूने के भीतर हरा) । उच्चतम विपरीत देखा है जहां बैक्टीरिया वायुकोशीय अंतरिक्ष के भीतर छवि है । यह आंकड़ा अकरम एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।  

Discussion

रोग के दूसरे सबसे अधिक बोझ के लिए कम श्वसन पथ संक्रमण विश्व स्तर पर12,13, और रोगाणुरोधी प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए जिंमेदार ठहराया संक्रमण की संख्या में एक पर्याप्त वृद्धि14बताया गया है । निमोनिया अस्पताल में भर्ती होने के लिए एक आम कारण रहता है । आईसीयू में, एक निमोनिया के विकास के नैदानिक अनिश्चितता से जटिल है और एक अत्यंत उच्च मृत्यु दर15के साथ जुड़ा हुआ है । निमोनिया की शुरुआत के दौरान, बैक्टीरिया बाहर फेफड़े के वायुकोशीय अंतरिक्ष के भीतर पैदा, एक क्षेत्र है कि अपेक्षाकृत बाँझ है, स्वास्थ्य में न्यूनतम microbiota के साथ.

इस विधि का वर्णन करता है अपेक्षाकृत देर मंच पूर्व vivo सत्यापन बैक्टीरिया विशेष ऑप्टिकल इमेजिंग जांच के11, लेकिन डिजाइन, संश्लेषण, और जांच मूल्यांकन शुरू करने से पहले इस मांयता कदम आवश्यक है, के रूप में पहले दिखाया गया है11 .

CLE वास्तविक समय में सीटू में रोग राज्यों से पूछताछ के लिए एक उभरती हुई नैदानिक तकनीक है. यह संदिग्ध फुफ्फुसीय विकृति है, जो एक बायोप्सी और लेवेज द्रव का संग्रह शामिल हो सकता है की जांच के लिए पारंपरिक तकनीक पर कई लाभ प्रदान करता है । बायोप्सी इनवेसिव और हवादार रोगियों में रुग्णता और मृत्यु का कारण बन सकता है, और एकत्र लेवेज द्रव अक्सर ऊपरी एयरवेज से बैक्टीरिया के साथ दूषित है । निमोनिया का पता लगाने में CLE का उपयोग लेकिन कुछ हद तक संगत इमेजिंग जांच जो रोग के कार्यात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं की खराब उपलब्धता की वजह से सीमित है, कई ठोस प्रयासों के बावजूद10. ऑप्टिकल एजेंटों के साथ CLE का मेल निमोनिया का निदान तेजी से और कम इनवेसिव वर्तमान मानक अभ्यास की तुलना में की संभावना प्रदान करता है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयारी और CLE मंच के सेटअप में हैं । मानव ऊतक अंतिम नैदानिक आवेदन करने के लिए प्रासंगिक प्राप्त करने के रूप में इस अध्ययन के भीतर प्रदर्शित मानव फेफड़े के ऊतकों के रूप में भी महत्वपूर्ण है । यह मानव ऊतक का उपयोग करने के लिए आवश्यक है क्योंकि ऊतक autofluorescence की हद तक बड़ी अंतर प्रजातियों भिन्नता से पता चलता है, और इसलिए बैक्टीरिया की संवेदनशीलता को गुमराह कर सकते हैं-जांच imaged जा रहा है. इसके अतिरिक्त, मानव फेफड़ों के ऊतकों की पुनर्प्राप्ति और उपयोग के लिए नैतिकता प्राप्त करना आवश्यक है । एक तकनीकी स्तर से, इमेजिंग LSU मंच के लिए सही सफाई, इमेजिंग फाइबर का लगाव, और अंशांकन अच्छा संकल्प और सुसंगत इमेजिंग के लिए आवश्यक है, के रूप में बैक्टीरिया के बराबर संख्या सुनिश्चित कर रहा है प्रत्येक फेफड़ों के ऊतकों के नमूने के लिए जोड़ रहे हैं । आगे की जांच पैनलों के लिए इस विधि की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, रोगजनकों की एक सीमा के साथ प्रक्रिया दोहरा, जैसे कि निमोनिया के रोगज़नक़ एजेंट होने की संभावना के रूप में आवश्यक है ।

इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है कि नैदानिक अनुमोदित CLE डिवाइस केवल एक लेज़र (४८८ एनएम) है । इसलिए, वर्तमान में, जांच डिजाइन के लिए fluorophore का चयन इस प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए सीमित है, हालांकि चिकित्सकीय अनुमोदित एकल रंग उपकरणों ६६० एनएम और निकट अवरक्त के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ मौजूद हैं । यह अत्यधिक वांछनीय है एक दूसरी लेजर एक ही डिवाइस के भीतर लागू करने के लिए एक जांच सक्षम करने के लिए एक वर्णक्रमीय अलग fluorophore के साथ विकसित करने के लिए बैक्टीरिया में सुधार-जांच संवेदनशीलता ऊतक autofluorescence के स्तर पर । Whilst दोहरे रंग CLE उपकरणों के विकास के अधीन हैं, वे या तो नैदानिक अनुमोदित नहीं कर रहे है और/या उनकी लागत16महत्वपूर्ण है ।

विट्रो में CLE रोगजनक बैक्टीरिया और पूर्व vivo मानव फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करने के लिए संभावित जांच स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो तकनीकों में प्रवाह cytometry और CLSM, और नैदानिक उपयोगिता के रूप में पारंपरिक के बीच अंतर पुलों । इस कदम को आगे ले नैदानिक CLE इमेजिंग के साथ युग्मित करने के लिए होनहार यौगिकों का चयन करते समय आत्मविश्वास प्रदान करता है; और क्या परीक्षण जांच लक्ष्य विशिष्टता का कहना है, या के रूप में संकेत प्रदान करेगा किसी भी बंद लक्ष्य लेबलिंग, ऊतक, या मेजबान proteolytic एंजाइमों के साथ अस्थिरता से पता चलता है के रूप में सीधे बाध्यकारी । यह भी activatable जांच के प्रत्येक सीधे मानव फेफड़े के ऊतकों से अधिक बैक्टीरिया के नमूनों को जोड़ने के लिए उचित होगा, पूरी तरह से जांच बाध्यकारी और वास्तविक समय में सक्रियण की गति को चिह्नित ।

हम मानते है कि तेजी से उपंयास बैक्टीरिया-विशिष्ट जांच के लिए हमारी पाइपलाइन रोगियों के बाहर फेफड़ों के भीतर इमेजिंग के लिए उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए क्लिनिक के लिए बहुत तेजी से अनुवाद में परिणाम होगा । यह काफी हद तक है क्योंकि बैक्टीरिया विशेष जांच एक bronchoscope के काम चैनल नीचे डाला कैथेटर के माध्यम से फेफड़ों के भीतर स्थानीय रूप से वितरित किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि microdose (< 100 µ g) मात्रा दिया जा सकता है । इसलिए, प्रणालीगत वितरण और यौगिक का वितरण एक चिंता का विषय नहीं है, के रूप में शरीर के भीतर कई अंय संक्रमण के लक्ष्य के लिए मामला है, या परमाणु इमेजिंग के साथ । इसके अलावा, इस तरह के एक छोटे से खुराक में इमेजिंग जांच देने विषाक्तता संबंधित जटिलताओं के जोखिम को कम कर देता है (हालांकि विषाक्तता स्क्रीनिंग अनुवाद के लिए आवश्यक होगा) । जांच के जगाकर के बाद, कैथेटर तो FCFM फाइबर और CLE द्वारा पूछताछ की फेफड़े के एक ही क्षेत्र से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, बहुत उसी तरह हम इस विधि के भीतर प्रदर्शन किया है । इमेजिंग जांच से पहले जांच की स्थापना के बाद तेजी से किया जाना चाहिए undetectable सांद्रता के लिए दूर बहाकर ।

यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रोग की जांच-पड़ताल इस तकनीक द्वारा जांच जीवाणु इमेजिंग एजेंटों तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी सूजन के रूप में वैकल्पिक लक्ष्य, के साथ जांच के सत्यापन के लिए विस्तार कर सकता है । यह दृष्टिकोण भी शरीर के भीतर अंय रोग स्थानों के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए जहां FCFM के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति है ।

Disclosures

केडी: एडिनबर्ग आणविक इमेजिंग के संस्थापक निदेशक । सलाहकार के रूप में Mauna कीआ टेक्नोलॉजीज से परामर्श प्राप्त किया ।

एमबी: एडिनबर्ग आणविक इमेजिंग के संस्थापक निदेशक ।

Acknowledgments

हम इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC, यूनाइटेड किंगडम) को धन्यवाद देना चाहूंगा कि स्वास्थ्य नवाचार चैलेंज फंड (HICF) के माध्यम से स्वास्थ्य विभाग और वेलकम ट्रस्ट के साथ K03197X/ . फंडिंग संदर्भ संख्या: 0510-069 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२९ ऑप्टिकल जांच बैक्टीरियल संक्रमण फोकल लेजर endomicroscopy बाहर फेफड़े अनुवाद गहन चिकित्सा इकाई ऑप्टिकल इमेजिंग ।
उपंयास जीवाणुओं के ऑप्टिकल स्क्रीनिंग-फोकल लेजर Endomicroscopy द्वारा <em>विवो</em> मानव फेफड़े के ऊतकों पर विशिष्ट जांच
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Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

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