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Immunology and Infection

새로운 박테리아 특정의 광학 검사 Confocal 레이저 Endomicroscopy에 의해 전 비보 인간의 폐 조직에 프로브

doi: 10.3791/56284 Published: November 29, 2017

Summary

이 기술은 작은 분자 화학의 급속 한 식별에 대 한 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 인간의 폐 조직, ex vivo에서 박테리아 특정 광학 이미징 에이전트를 평가 하기 위한 효율적인 심사 과정을 설명 합니다. 프로브-번역 잠재력 후보자입니다.

Abstract

속도 세균 검색의 정확도 개선 환자 계층에 대 한 항균의 적절 한 사용을 보장 하기 위해 중요 하다. 세균의 존재를 인식 하는 진단 기술의 개발이이 목표를 달성 하기에 포인트의 케어에 실시간으로 필요. 광학 이미징 호스트 내에서 박테리아의 직접 식별에 대 한 매력입니다. 그러나 화학 프로브 설계 및 검증에 몇몇 시도, 아무도 아직 성공적으로 번역 된 병원으로 조사 했습니다. 여기는 박테리아 관련 프로브 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법 (FCFM)에 의해 몇 군데 말 초 폐 내의 박테리아의 식별에 대 한 유효성 검사 비보 전 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 모델 인간의 폐 조직 비보 전 화면 소설 박테리아 특정 화합물, 밀접 하 게 환자와 발생 될 것으로 예상 하는 이미징 조건을 흉내 낸 영상에 임상 승인된 confocal 레이저 endomicroscopy (CLE) 플랫폼을 사용. 따라서,이 기술에 의해 화합물 심사 잠재적인 임상 추적성의 신뢰를 제공 합니다.

Introduction

이 기술은 CLE 시각화에 대 한 잠재적인 임상 유틸리티와 화합물의 급속 한 식별을 위해 FCFM를 사용 하 여 인간의 폐 조직에 ex vivo에서 박테리아 특정 광학 이미징 에이전트를 평가 하기 위한 신속한 심사 과정을 설명 합니다. 말 초 폐 제자리에 박테리아.

항균 처방 상승 항균 성 저항1의 시대에서 배급 하는 긴급 한 글로벌 요구 사항이입니다. 이 위해, 높은 특이성, 감도, 그리고 실시간으로 세균 감염을 식별 하는 법은 매우 진단 방법의 개발 모색2. 비판적으로 몸이 환자 집중 치료 단위 (ICUs) 내 등에서 폐 렴의 진단을 확인 하는 현재 기술 자주 세균성 문화 기술 함께 일반적인 임상 또는 생체 기능 해석에 의존 aspirated 체액/조직, 결과가 최대 3 일 걸릴 수 있습니다. 또한, 액체에서 세균성 문화 말 초 폐로 얻은 고 검색 더 인접 항공3 의 오염 경향이 종종 문화 부정적 이다 수 반하는 항균 치료 또는 가난한 샘플링 기법. 또한, 연쇄 반응 같은 분자 기술을 지나치게 민감한 환자의 스팟은 걸고 aspirated 체액에 사용 될 때 있습니다. 신흥 진단 접근은 분자 광학 이미징, 제작 현장에서 분자 병 리 조직의 가능성; 그러나, 개발 및 광학 이미징 화합물의 유효성 검사가 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 직접 시각화 가능한 광학 프로브를 통해 박테리아의 잠재적으로 존재의 연구를 허용 하는 매우 강력한 방법 이며 폐 렴의 진화 환자, 그리고 중요 한, 사용 될 수 있는 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 실시간으로 치료에 대 한 응답 현장에서.

CLE은 여러 질병4, 필드 내에서 위장5, 종양학6,7, 그리고 심문 기도 및 치조 낭8, 등 설립된 조사 절차 9. 포인트의 케어 구조 영상 이미징 번들, 임상 내 시경의 작업 채널을 통해 전달 하는 섬유를 사용 하 여 병에 걸리는 직물의 수와 형태 직접 조직 표면 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지를 접촉. 그러나 한계가 남아 있는 일반적인 조 영제에 대 한 필요는. 따라서, 특정 세균 에이전트 같은 질병 특정 프로브를 사용 하 여 직접 의심된 감염의 사이트에 박테리아를 시각화 하 여이 양식 적임의 유틸리티를 확장 크게 수 있습니다. 광학 에이전트 실시간 고해상도 이미징 진단 가능성을 함으로써 다른 기술에 비해 많은 장점이 제공 합니다. 또한, 광학 프로브 여러 대상, 모두 상대적으로 저렴 한 비용 달성된을 질문에 대 한 다중화의 전망 제공. 그러나 아무도 아직 성공적으로 구현 클리닉10광학 에이전트 수가 이러한 목적에 대 한 개발을 받고 있다. 우리 쪽으로 박테리아도 작은 분자 화학 감지기의 라이브러리를 합성 하 고 제자리에서세균성 폐 렴11을 탐지 하기 위한 프로브 함수의 평가 대 한 신속 하 고 효과적인 파이프라인을 개발.

적합 한 프로브 후보를 식별 하려면 다음 필수 구성 요소 FCFM에 의해 비보 전 인간의 폐 조직에 조사의 심문 전에 실현 될 했다: i) 수성 가용성, ii) 특이성 및 급속 하 게 임상적으로 라벨에 대 한 선택 관련 박테리아, iii) 높은 신호 대 잡음 비율, 및 iv) 폐 환경 강 직에 저항. 후자는 평가 bronchoalveolar 게 액체 (BALF)에 의해 급성 호흡 곤란 증후군 (아즈) 환자에서 조건 중 환자 실에 폐에서 분해 하 고 자극적인 환경에 의해 특징입니다. 또한, 프로브 탐지 장치에 의해 임상 승인 광학 CLE 이미징 인간의 폐 치조 조직 내에서 대 한 적합 한 fluorophore를 했다.

가 각의 이러한 필수 구성이 요소는 파이프라인은 다음과 같습니다 (각 단계에서 전달 된 프로브만 실시 했다 앞으로 다음): (1) 조사를 프로브 라이브러리 합성 되었다; (2) 각 프로브 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) 세균성 라벨; 되도록에 대 한 라이브 박테리아의 패널에 추가 되었습니다. (3) 공동 문화 기본 인간 호 중구에서에서 포유류 세포에 세균 라벨의 선택도 CLSM;에 의해 설립 되었다 (4) 안정성과 아즈 환자 BALF 존재 박테리아의 성공적인 라벨 CLSM과 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석;에 의해 결정 되었다 (5) 최적 농도 후보자의 CLSM, 포유류 세포에 박테리아를 유지 했다;에 대 한 선택도 보장에 의해 결정 되었다 (6) 후보에에서 FCFM에 의해 몇 군데 있었다 고 비보 전 인간의 폐 치조 조직 안정성과 그를 위해에 신호--소음 감지에 대 한 적절 한 했다. 단계 6이이 프로토콜 내에서 자세히 설명 되어 있습니다. 1-5 단계에 대 한 방법론은 이전에 보고 된11이었다.

Protocol

모든 인간의 폐 조직 동의 따라 얻은 하 고 연구 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 생물 샘플의 준비

  1. 프로브에의 준비
    1. 각 프로브의 1 m m 재고 솔루션을 만들어 (예를 들어, Calcein 오전, UBI-3, UBI-10 ) 살 균 dH2O, 복합11프로브는 동결 무게를 잘 균형을 사용 하 여. DH2O 추가 볼륨 무게 질량 및 프로브의 분자량에 따라 계산 합니다.
  2. 세균성 문화의 준비
    참고:이 방법에 대 한 황색 포도상구균 표본 변형으로 사용 되었다. 어떤 적절 한 세균성 긴장 든 지 선택할 수 있습니다. 박테리아는 적절 한 자극과 방출 스펙트럼을 레이블 어떤 상업적인 염료 긍정적으로 박테리아를 선택할 수 있습니다.
    1. 신선한 Lysogeny 국물 (파운드)의 한 천 배지 메 마른 루프를 사용 하 여에서 원하는 세균성 긴장의 단일 식민지를 선택 합니다. 문화 미디어에 루프의 끝을 담거 서 식민지 50 mL 원심 분리기 튜브에 파운드의 10 mL에 접종. 37 ° C, 16 h 250 rpm에서 품 어 (또는 밤새 껏).
    2. 야간 문화 100 µ L 900 µ L 1 mL 베트에 파운드를 추가 하 여 하룻밤 문화의 마약595 를 확인 합니다. 595에서 OD를 측정는 분 광 광도 계에 (사용 하는 베트 1 mL 파운드와 함께 빈으로) nm. 취득된 세 10 숙박 문화에 대 한 OD를 곱하십시오.
    3. 야간 문화 subculture입니다. 595에서 광학 밀도 조정 하 여이 작업을 수행 nm (마약595) 0.1에서 10 mL 신선한 파운드의 계산 하룻밤 문화 10 mL에 추가의 필요한 볼륨 조정 0.1 마약595 신선한 파운드. 37 ° C, 문화 (마약595 0.6-0.8), 중간 로그 단계에 도달할 때까지 250 rpm에서 문화를 품 어 대략 4 h.
    4. 문화 광 밀도 (단계 1.2.2) 및 수확 1 x 108 콜로 니 형성 단위 (CFU) (마약595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL)의 세균성 문화 1.5 mL microtube (예를들면, 세균성 문화는 OD595 경우 측정 0.6, 수집 1.67 mL). 문화 작은 공의 박테리아를 1 분 동안 실 온에서 10000 x g에서 원심 워시 번 인산에에서 펠 릿 resuspending (pipetting 아래로 신중 하 게) 하 여 식 염 수 (PBS) 버퍼링에 1 mL PBS, 위에서 centrifuging, 상쾌한, 삭제 반복 펠 릿. 알아서 하지 때 제거는 상쾌한 세균 펠 릿을 꺼내. 1 mL PBS에에서 마지막 펠 릿을 resuspend.
      참고: 각 라벨 절차에 대 한 필요에 따라 많은 샘플을 준비 합니다. 프로토콜 다음 단계 1.2.5.1, 1.2.5.2, 또는 1.2.5.3 최대 1 시간에 대 한 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
    5. 세균성 얼룩
      1. Calcein 오전으로 박테리아를, 씻어 세균성 문화에 1 µ M의 최종 농도에 염료를 추가 합니다. 300 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 문화를 품 어. 단계 1.2.4 과잉 염료를 제거 하에서 원심 분리 하 여 PBS 3 번에서 counterstained 세균 현 탁 액을 씻어. 1 mL PBS에에서 resuspend, 100 µ L 스테인드 박테리아 마약595 0.5 Calcein 오전의 200 µ L를 PBS에서 1:1 희석. 프로토콜 최대 1 시간에 대 한 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
      2. 레이블을 테스트 프로브 (예를 들어, UBI-3 또는 UBI-10), 박테리아 100 µ L 세균성 문화의 마약595 0.5에서 200 µ L PBS를 PBS에서 1:1 희석. 10 µ M. 최종 농도에 프로브 중 반전에 microtube 박테리아와 조사 철저 하 게 혼합 되도록 여러 번 추가 합니다.
        참고: 이미징 프로브를 임상 상황이의 추가 후에 즉시 수행 되어야 한다.
      3. 컨트롤을 준비 하려면 흠 없는 세균 샘플, 문화의 흠 없는의 200 µ L를 PBS로 1:1 희석 100 µ L595 0.5 샘플 명이.
  3. 인간의 폐 조직 비보 전 준비
    참고: 인간의 폐 조직 샘플은 폐 암에 대 한 외과 절제술을 받은 환자에서 얻은 했다. 영상에 사용 하는 모든 조직 암 성장에서 정상적인 폐 조직 샘플에서 얻은 했다. 샘플 신선한 운영 극장에서 촬영 되었고 사용까지-80 ° C에서 microtubes 또는 원심 분리기 튜브에 저장.
    1. 이미징, 직전 드라이 아이스에 냉동 실에서 인간의 폐 조직 샘플을 제거 합니다. 실내 온도에, 약간; 해 동 조직 허용 1 x 4 m m2 섹션으로 메스와 슬라이스를 충분.
      참고: 해빙의 레벨은 중요 하다; 너무 냉동 조직 것입니다 하지 슬라이스, 깨짐 없이 해 동 하 고 조직을 너무 부드러운 슬라이스.
    2. 집게를 사용 하 여, 96-잘 분명 평면 바닥 조직 문화 접시의 우물으로 슬라이스 인간의 폐 조직 장소. 어떤 사용 되지 않는 인간의 폐 조직 즉시 반환 스토리지 컨테이너 및 장소-80 ° C 냉동 고로 다시 전송에 대 한 드라이 아이스에.
    3. 100 µ L PBS는 피 펫으로 각 폐 조직 샘플을 추가 합니다. 피 펫 팁을 사용 하 여 모든 조직 PBS에서 (그리고 우물의 벽에 붙어 하지). 조직을 약간 팽창 것입니다 그리고 플 로트 수 있습니다. 샘플 솔루션에는 조직에서 거르는 어떤 혈액 수 있도록 몇 분 동안에 PBS를 둡니다. 많은 가능한 PBS를 제거 합니다. 조직 피 펫 팁;의 끝을 차단할 수 있습니다. 이 방지 하기 위해 플레이트/팁 배치 각도 하려고 합니다.
    4. 플라스틱의 흠 없는 100 µ L, Calcein 분류 오전, 또는 테스트 프로브 레이블이 각 잘 포함 폐 조직에 박테리아. 또한 폐 조직 및 100 µ L PBS 컨트롤을 설정 합니다. 이러한 제어 웰 스 박테리아 없이 프로브 추가할 수 있습니다 배경 형광 또는 조사의 일반적인 활성화 증가 측정 하기 위해 혼자 폐 조직에 의해. 폐 조직 및 PBS 잘도 포함 되어야 합니다.

2. FCFM와 CLE 장치 이미징

  1. CLE 장치 설정
    참고: 준비 CLE 시스템 워밍업 레이저 수 있도록 교정 하기 전에 20 분.
    1. 시스템의 변압기의 뒷면에 on/off 스위치를 누르고 지정 된 컴퓨터를 켭니다. 레이저 스캐닝 유닛 (LSU)의 앞에 온/오프 버튼을 누릅니다. 장치가 켜져 있는지 나타내는 녹색 빛의 모양을 확인 합니다.
    2. CLE 소프트웨어 아이콘에 더블 클릭. 로그인 세부 정보를 입력 하 고 (10-30 s)를 초기화 하는 LSU에 대 한 기다립니다.
    3. 새로운 FCFM 섬유를 이미징의 사용, 설치와 함께 제공 된 CD가 필요 합니다. 컴퓨터 CD 드라이브에 설치 CD를 삽입 하 고 화면 지침을 따르십시오.
    4. 청소기 섬유와 FCFM 이미징 섬유 커넥터 장치를 청소 하십시오. 어떤 먼지/먼지를 제거 하는 앞으로 모션에서 청소 리본에 커넥터를 문질러. LSU의 앞에서 보호 노란색 뚜껑을 제거 합니다.
    5. 멈출 때까지 부드럽게 실버 허브 반시계 회전 하 여 LSU 허브를 준비 합니다. 평평한 면이 위쪽으로 향하게 하는 커넥터의 허브로 FCFM 이미징 섬유 커넥터를 삽입 합니다. 장소에 섬유를 누른 실버 허브 시계 방향으로 돌려 두 번 클릭 합니다. 추가 45 °에 의해 실버 허브 시계 방향으로 회전 하 여 연결을 완료 합니다.
      참고: 섬유 인식 되지 않으면 확인 이미징 섬유 FCFM을 설치 하 고 올바른 방향으로 연결 되었습니다.
    6. 팝업 FCFM 섬유 보정 이미지를 완료 하기 위한 지침을 따릅니다. 3 스텝이 있다: (1) FCFM 이미징 섬유 시험 (단계 2.1.7-2.1.8), (2) 배경 수집 (2.1.9 단계), (3) 섬유 검출 (단계 2.1.10).
    7. 화면에서 '시작 레이저' 버튼을 누릅니다. 레이저 센터 것입니다.
    8. 신선한 튜브 선택 (노란색: 보정; 빨간색: 청소, 블루: 린스) 보정에서 키트 하 고 화면 지침에 따라: 노란색 유리병에 섬유를 이미징 FCFM의 선단부를 배치 및 증가 대 한 모니터, 형광 시계 다음 장소는 (감동) 없이 빨간 유리병으로 섬유 팁. 기다려야 형광에 대 한 (컴퓨터 모니터와 같이) 사라집니다. 마지막으로 린스 섬유 팁 블루 유리병에.
      참고: 형광 사라지지 않습니다 경우 8% H2O2 와 렌즈 청소 조직 FCFM 이미징 섬유를 청소 하 고 다시 시작. 만족 스러운 결과 얻을 수 있습니다 때까지 과정을 반복 (이미지 품질은 분명, 그리고 흙에서 아무 마크는 명백한).
    9. FCFM 블루 유리병에 섬유를 이미징 놓습니다. '레이저 ' 시작 '' 때이 옵션을 계산 다음 키를 누릅니다.
    10. FCFM 노란색 유리병에 섬유를 이미징 놓습니다. '레이저 ' 시작 '' 때이 옵션을 계산 다음 키를 누릅니다.
    11. 자동된 교정 중에 빨간 유리병에 배치 하 여 섬유를 이미징 FCFM의 원심 끝 청소 > 10 s, 뒤에 대 한 파란색 유리병 > 4 s, 소프트웨어에 의해 표시 된 대로.
  2. CLE와 데이터 수집
    1. 설치, 다음 저장 위치와 파일 접두사를 선택 하는 창이 열립니다. 데이터 저장소에 대 한 원하는 폴더를 선택 하 고 따라 접두사 이름을.
    2. 연산자에서 쉽게 액세스할 수 있도록 발 페달을 놓습니다. 왼쪽된 페달: 레이저 온/오프; 센터 페달: 일시 중지; 바로 페달: 녹화/중지.
      참고: 레이저 컨트롤 또한 화면 컨트롤을 통해 액세스할 수 있습니다.
    3. '시작' 화면을 클릭 하거나 레이저에 차례로 왼쪽된 발 페달을 누릅니다. 이 수집을 시작 하 고 100% 레이저 파워 및 12 프레임/s (기본 설정)의 프레임 속도 사용 하 여 이미지를 얻을 것 이다.
      참고: 다른 응용 프로그램에 대 한 이러한 설정은 화면 샘플 유형에 따라 필요한 경우에 변경할 수 있습니다.
    4. 각 세균 현 탁 액 샘플 이미지.
      1. FCFM 이미징 섬유의 선단부를 삽입 하 고 천천히 샘플이 정지를 통해 섬유를 이동.
      2. 어떤 길이 든 지의 동영상을 기록 (최대 10 분) 오른발 페달을 누르거나 섬유 샘플 주위 천천히 이동 화면 기록 컨트롤을 선택 하 여.
      3. 8% H2O2 와 렌즈 청소 샘플 사이의 조직 FCFM 이미징 섬유의 선단부를 청소.
        참고: 일반적인 비디오 길이 10-30 s의 생체 외에서 영상에 대 한 충분 한 있습니다.
    5. 각 폐 조직 샘플의 이미지.
      1. FCFM 샘플에 섬유를 이미징, 섬유의 끝과 조직 사이의 직접 접촉 이루어집니다 보장의 선단부를 삽입 합니다. 부드럽게 샘플이 주위 이미징 섬유의 끝을 이동 합니다.
        참고: 조직에서 섬유의 끝을 해제; 초점면에서 조직 제거 됩니다. 그러나,이 조직에 고착 하지 레이블이 박테리아의 이미지를 사용할 수 있습니다.
      2. 어떤 길이 든 지의 동영상을 기록 (최대 10 분) 오른발 페달을 누르거나 섬유 샘플 주위 천천히 이동 화면 기록 컨트롤을 선택 하 여.
        참고: 일반적으로, 30의 비디오 길이 s는 ex vivo 영상 조직에 대 한 충분 한.
      3. 조직 및 8% H2O2 샘플 사이 청소 하는 렌즈를 FCFM 이미징 섬유의 선단부를 청소 합니다.
  3. 시스템 해제
    1. 왼쪽된 발 페달을 눌러 또는 클릭 하 여 레이저를 끄고는 화면 버튼.
    2. 멈출 때까지 반시계 실버 LSU 허브를 설정 하 여 FCFM 이미징 섬유 CLE 장치에서 분리 합니다. 부드럽게 섬유 커넥터를 당겨서는 LSU에서 LSU 허브에서 섬유를 이미징 FCFM를 제거 합니다.
    3. 청소 하 고 소독 8% H2O2 와 렌즈 청소 조직 FCFM 이미징 섬유. FCFM 이미징 섬유의 근 위 끝을 LSU 장치 보호 캡을 반환 합니다. 저장 상자에서 섬유를 부드럽게 장소.
    4. 닫기 데이터 소프트웨어 캡처하고 외부 USB 장치에 저장 된 파일을 복사 합니다. 컴퓨터를 종료 하 고 3에 대 한 전면 패널 I/O를 눌러 LSU 장치 설정 s 녹색 불빛이 사라질 때까지.
    5. 인간의 폐 조직 및 지역 규정에 따라 박테리아의 처분.

3. 데이터 분석

  1. 소프트웨어를 열고 소프트웨어 대시보드에서 '이동' 아이콘을 통해 컴퓨터에 적절 한 디렉터리를 선택 하 여 분석에 대 한 파일을 가져올. 또는, 파일 드래그 하 고 소프트웨어 대시보드에 될 수 있습니다.
  2. 각 비디오 파일을 열을 더블 클릭 합니다. 동영상 최적화 된 컬러 룩 업 테이블 (LUT) 자동으로 재생 됩니다 고 색상 테이블 조정. 자동 강도 강도 눈금 막대 위에 있는 자동 선택 단추를 클릭 하 여 확장을 비활성화 합니다. 때 단추 주위 없는 검은 그림자는 기능이 비활성화 됩니다.
    참고: 자동 강도 스케일링 불가능해 비교 하 고 동일한 데이터 세트에서 동영상을 분석 하는 각 비디오에 걸쳐 연속 대비 향상을 방지 하기 위해 비활성화 해야 합니다.
  3. 원하는 강도 최선의 대비를 주고 최소 및 최대 막대를 이동 하 여 확장을 선택 합니다. 히스토그램 도구를 사용 하 여 때 넓은 동적 범위를 보장 하기 위해 스케일링 강도 선택 하는.
    참고: 동적 범위는 같은 이미지는 포화 되지 않도록 (즉, 이미지의 채도 나타내는 백색 지역 제한), 그렇게 낮은 강도 기능 하지 싶 었 어.
  4. 원하는 확장 달성 되 면 오른쪽 '기본 (녹색)'으로 나열 된 드롭다운 메뉴 단추에 클릭 합니다. 룩 업 테이블을 저장 하는 옵션을 선택 합니다. 원하는 위치에는 LUT를 저장 합니다.
  5. 서로 대 한 데이터 집합 내에서 비디오, 마우스 오른쪽으로 클릭 하 여 '기본 (녹색)' 드롭 다운 메뉴 동일한 LUT를 적용 하 고 ' 부하 LUT'를 선택 합니다. 일관 된 강도 데이터 집합 내에서 모든 비디오 스케일링을 적용 하려면 해당 파일을 선택 합니다.
  6. '영화 릴' 버튼을 클릭 하 여 처리 된 비디오를 내보냅니다. 원하는 비디오 형식 선택, 예: '목적을 위해 프레 젠 테이 션'는.mpg 파일을 생산할 예정 이다. '내보내기'를 누르고 비디오 파일을 저장할 파일 위치를 선택 했다. 단일 프레임의 스냅샷은 '카메라' 버튼을 클릭 하 여 내보낼 수 있습니다. 그것은.png,.bmp, 또는.jpg 파일을 저장할 수 있습니다. 파일 대상을 선택 하 고 저장을 누릅니다.
    참고: 동영상 다음 프레 젠 테이 션 또는 더 정량화의 준비에 대 한 모든 소프트웨어에 가져올 수 있습니다. 레이블이 지정 된 박테리아는 점으로 녹색 '점멸' 비디오에서 시각화 됩니다. 나타나는 검은 치경 공간 폐 조직 구조 정렬된 형광 가닥으로 명백한 될 것입니다.

Representative Results

이 연구에서 우리가 비보 전 인간의 치경 폐 조직 모델 임상 승인된 CLE 장치를 사용 하 여 감염의 새로운 박테리아 관련 프로브의 급속 한-심사에 대 한 메서드를 증명 하고있다.

(엘라 스 틴과 콜라겐의 높은 풍부) 때문에이 지역은 자연스럽 게 높은 형광 488 nm 레이저8로 FCFM에 의해 CLE은 말 초 폐 내의 구조 정보를 얻기 위해 적합 합니다. 반대로, 치경 공간 형광 하지 않습니다, 그리고 같은 조직 구조와 공기 공간이 사이의 수 있도록 고대비 시각 (그림 1).

질병의 추가 관련 프로브 또는 박테리아 관련 프로브 등 대비 에이전트 실시간으로 얻을 수 질병 과정에 대 한 기능 정보를 사용 해야 합니다. 우리는 이전 합성 고 박테리아 관련 라이브러리의 초기 생체 외에서 심사 프로브11; 어디 세균-특이성, 분해 안정성, 그리고 시간이 지남에 따라 세균 막 내 보존 결정 했다. 유망한 박테리아 관련 조사 (UBI-10)는 세균 세포 막 (UBI-3) 내 불 쌍 한 보존 한 뿐만 아니라 연구에서 확인 되었다. 이러한 S. 구 균을 분류 하는 데 사용 된 상용 counterstaining (Calcein 오전)의 제어에 비해 했다.

흠 없는, Calcein 오전, UBI-3, 그리고 유비 10 S. 구 균 을 분류 했다 몇 군데에 FCFM에 의해 100 %488 nm 레이저 파워와 12 프레임/s (그림 2)의 프레임 속도. PBS에서 레이블이 없는 박테리아 했다 몇 군데 어디 형광 신호 감지 했다. 이 때 레이블이 박테리아 했다 몇 군데 달리입니다. 유비-3와 UBI 10 세균성 정지 했다 FCFM에 의해 몇 군데, 어디 그것은 솔루션의 일반적인 배경 형광 PBS 유일한 컨트롤에 비해 상승 했다,이 때문에 NBD (프로브 fluorophore)의 작은 금액을 방출지 않습니다 분명 했다 그러나 형광 신호 수성 해결책,, 밝은 punctate 점 세척 단계에 대 한 필요 없이 솔루션을 통해 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이것은 극 지 환경에서 NDB에서 방출 하는 형광 신호 증가 , 세균 막. Calcein 오전 이므로 하지 활성화 프로브, 세균성 얼룩 후 세척 단계 솔루션에 높은 형광 배경의 언바운드 프로브를 제거 하는 데 필요한. 3 UBI, UBI-10 같은 레이블이 박테리아, 박테리아 Calcein 오전 표시 밝은 녹색 punctate 점으로 FCFM에 의해 솔루션에서 발견 했다. 비디오 형식에 데이터 수집,이 점을 '트윙클' 코어 사이 아웃 포커스,이 방법에 의해 이미징 레이블이 박테리아의 특성 특성의 이동에 나타납니다.

레이블이 지정 된 박테리아 했다 이후 인간의 폐 조직 ex vivo의 작은 조각에 추가 하 고 FCFM (그림 3)에 의해 다시 몇 군데. PBS 또는 레이블 없는 S. 구 균 은 폐 조직에 추가 되었다, 폐 조직 autofluorescent 구조 (콜라겐과 엘라 스 틴의 밝은 녹색 가닥과 치경 공간의 어두운 영역으로 본) 검색 되었습니다. Punctate 점 없음 이러한 제어 조건에 대 한 발견 했다. 마찬가지로, 유일한 폐 조직 구조 (그리고 punctate 점 없음) S. 구 균 플러스 UBI-3; 폐 조직 상태에 대 한 가시화 했다 이 프로브는 시간 안정적으로 유지 되지 나타내는 세균 세포 막 , 그것은 밖으로 세척 되었다 또는 (이전 시연된11)으로 폐 조직 내에서 네이티브 분해 효소 존재 저하.

그러나, 밝은 punctate 점 Calcein 오전 긍정적인 컨트롤 S. 구 균 샘플을 표시 하 고 가장 유망한 박테리아 관련 조사 (UBI-10) S. 구 균 샘플 볼 수 있었다. '반짝이' 점 강한 조직 autofluorescence (그림 3)에 불구 하 고 보였다. 따라서, FCFM에 의해 얻은 결과 생체 외에서 사전 심사 CLSM, 의해 박테리아 관련 프로브 패널의와 동시에 하 고 시연 영상 실시간으로 감염에 대 한 임상 관련 검색 방법.

여기에 제시 된 결과 폐 때문에 그것의 독특한 autofluorescence FCFM에 의해 이미징에 대 한 적절 한 장기 시스템 임을 보여 줍니다. 밝은 독특한 구조 CLE 연산자를 치조 공간에서 다는 것을 확인 하실 수 있습니다. 어두운 치경 공기 낭과 함께이 지역 고대비 붙일 레이블된 박테리아 이미징에 대 한 완벽 한 배경을 제공 합니다.

비록이 연구에서 제시 하는 박테리아의 탐지 품질로 밝은 punctate 점 들을 시각화 하 여 결정 됩니다, 그것은 특성 프레임별으로 보조 소프트웨어 사용 하 여 추가 하는 punctate 점의 수를 정할 수 수 있습니다. 프로브 라이브러리입니다.

Figure 1
그림 1: 인간 폐 조직 autofluorescence의 정적 이미지. 인간의 폐 조직 비보 전 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법 (FCFM), 488 nm 여기, 100% 레이저 전원, 및 12 프레임/미 엘라 스 틴과 콜라겐을 사용 하 여의 confocal 레이저 endomicroscopy (CLE) 이미지는 높은 형광 (false 녹색 색), 반면 치경 공간, 그리고 검은 영역으로 나타납니다. 이 그림은 Akram 에서 수정 되었습니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Confocal 레이저 endomicroscopy (CLE) 이미지에에서 레이블이 S. 구 균 . 488 nm 여기, 100% 레이저 전원, 및 12 프레임/s. Labeled 박테리아 높은 형광 punctate 점 (틀린 색깔된 녹색)으로 표시, fibered 공초점 형광 현미경 검사 법 (FCFM) 미리 레이블이 박테리아의 이미지를 사용 했다. 이 그림은 Akram 에서 수정 되었습니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 3
그림 3: 레이블된 S. 구 균으로 인간의 폐 조직에 ex vivo의 confocal 레이저 endomicroscopy (CLE) 이미지. Fibered 공초점 형광 현미경 검사 법 (FCFM) 인간의 폐 조직 비보 전 이미지에 사용 된 고 미 균, 488 nm 여기, 100% 레이저 전원, 및 12 프레임/s. Labeled 박테리아에 쇼 높은 형광 punctate 점 (거짓 색으로 녹색) Calcein 오전 또는 UBI 10 때 폐 조직 샘플 내에서. 높은 대비 박테리아 치조 공간 내에서 이미지가 포함 된 관찰 됩니다. 이 그림은 Akram 에서 수정 되었습니다. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.  

Discussion

두 번째를 담당으로 하는 더 낮은 호흡 기관 감염 질병의 높은 부담 세계적으로12,13, 그리고 상당한 상승에 수 항균 방지 박테리아에 기인 하는 감염 되었습니다 보고14. 폐 렴 입원에 대 한 일반적인 원인은 남아 있다. 중 환자 실, 폐 염의 개발 진단 불확실성에 의해 혼합 이며 매우 높은 사망률 속도15와 연결 됩니다. 폐 렴의 발병 기간 동안 박테리아 증식 치경의 공간 내에 원심 폐 건강에 최소한의 microbiota와 상대적으로 무 균 지역.

상대적으로 늦게 단계 비보 전 유효성 검사 박테리아-특정 광학 이미징 프로브11, 하지만 설계, 합성,이 방법에 설명 합니다 및이 유효성 검사 단계를 시작 하기 전에 조사 평가 필수적으로 이전 표시11 .

CLE 질병 질문에 대 한 새로운 임상 기술을 현장에서 실시간으로 상태 이다. 그것은 많은 이점이 의심된 폐 병 리, 생 검 및 게 액체의 컬렉션을 포함 수 있습니다 조사를 위한 전통적인 기술 제공 합니다. Biopsies 침략은 통풍된 환자에서 사망률 및 사망을 일으킬 수 있습니다 그리고 수집된 게 액체는 종종 위 항공에서 박테리아와 오염. 그러나 폐 렴의 검출에 CLE의 사용은 다소 호환 이미징의 빈약한 가용성으로 인해 제한 된 프로브는 많은 공동된 노력10에 불구 하 고 질병의 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 빨리 폐 렴을 진단의 전망 제공 CLE 광학 에이전트와 결합 하 고 덜 접촉 현재 표준 연습에 비해.

이 프로토콜에 중요 한 단계는 샘플 준비와 CLE 플랫폼의 설치에 있습니다. 인체 조직 관련 최종 임상 응용 프로그램 얻기도이 연구에서와 같이 인간의 폐 조직 같은 중요 하다. 그것은 인간의 조직 조직 autofluorescence의 범위 큰 간 종 변화를 표시 하 고 따라서 몇 군데 되 고 박테리아 프로브의 감도 오해 수 있습니다 때문에 사용 해야 합니다. 또한, 검색 및 인간의 폐 조직의 사용에 대 한 윤리를 얻는 것은 필수입니다. 기술 수준, 올바른 청소에서 이미징 LSU 플랫폼, 및 교정에 이미징 섬유의 부착 박테리아의 동등한 숫자 각 폐 조직 샘플에 추가 보장은 좋은 해상도 일관 된 이미지에 대 한 필수적입니다. 프로브 패널 심사에 대 한이 메서드의 유틸리티 확대, 다양 한 병원 균, 폐 렴의 원인이 되는 에이전트 될 것 같은 절차를 반복 하는 필요 합니다.

이 기술의 가장 큰 한계는 임상 승인된 CLE 장치는 단 하나의 레이저 (488 nm). 따라서, 현재, 프로브 디자인 fluorophore의 선택 제한 됩니다이 시스템 사용에 대 한 임상 승인 단색 여기 파장 660 nm의 근 적외선 장치 존재 하지만. 그것은 매우 바람직한 박테리아 프로브 감도 조직 autofluorescence의 수준 향상에 괴기 하 게 뚜렷한 fluorophore와 개발 프로브를 사용 하려면 동일한 장치 내에서 구현 하는 두 번째 레이저 라인을가지고. 듀얼 컬러 CLE 장치를 개발 하는 동안 하지 임상 승인 하거나 또는 그들의 비용이 상당한16이다.

CLE에서 생체 외에서 병원 성 박테리아 및 비보 전 인간의 폐 조직 화면 잠재적인 프로브를 사용 하 여 기존의 생체 외에서 기술이 cytometry CLSM, 및 임상 유틸리티 간의 격차 다리. 이 단계 제공 자신감 앞으로 임상 CLE와 결합을 수행 하기 위해 유망한 화합물을 선택할 때 이미징; 그리고 표시 여부 테스트 조사 대상 특이성을 유지 또는 어떤 대상 오프 라벨, 조직에 직접 바인딩 같은 보여 줍니다 또는 쇼 호스트와 불안정 분해 효소를 제공할 것입니다. 그것은 또한 인간의 폐 조직 플러스 완전히 프로브 바인딩 및 실시간으로 활성화의 속도 특성 박테리아의 샘플을 직접 각 가능한 프로브를 추가 하는 타당 한 것입니다.

우리는 빠르게 환자의 말 초 폐 내 이미징에 대 한 그들의 잠재력을 평가 하기 위해 새로운 박테리아 관련 프로브 심사에 대 한 우리의 파이프라인 병원에 훨씬 더 빨리 번역 될 것을 믿습니다. 이것은 주로 박테리아 관련 프로브 그 microdose을 의미 하는 bronchoscope의 작업 채널 아래로 삽입 카 테 터를 통해 폐 내에서 로컬로 배달 될 수 있기 때문에 (< 100 µ g) 금액 전달 될 수 있습니다. 따라서, 조직의 배달 및 화합물의 biodistribution 아니다 관심사, 신체 내에서, 또는 핵 영상과 다른 많은 감염 대상에 대 한 경우입니다. 또한, 독성의 위험을 감소 같은 작은 복용량에서 이미징 프로브를 제공 (비록 독성 심사 번역에 필요한 것) 합병증을 관련. 탐사선의 문제, 다음 테 다음 FCFM 섬유 및 심문 CLE, 거의 같은 방식으로 우리가이 메서드 내에서 수행 하는 폐의 같은 지역에 의해 대체 될 수 있습니다. 이미징은 프로브 탐지 농도를 멀리 세척 하기 전에 빠르게 프로브 설치에 따라 수행 되어야 한다.

그것은 또한 질병을 식별의 그 심사 주의 하는 것이 중요이 기술에 의해 프로브 박테리아 이미징 에이전트에 국한 되어서는 안 하지만 염증 같은 다른 목표와 프로브의 유효성 검사를 또한 확장할 수. 이 방법은 또한 신체 내에서 FCFM 통해 상상 허용 하는 다른 질병 위치에 적응할 수 있어야 합니다.

Disclosures

KD:에 딘 버 러 분자 이미징의 설립자 감독입니다. 마우나케아 기술 고 문으로에서 받은 컨설팅.

MB:에 딘 버 러 분자 이미징의 설립자 감독입니다.

Acknowledgments

우리는 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC, 영국) 학 제 공동 연구 그랜트 EP/K03197X/1, 보건 및 Wellcome 신망 건강 혁신 도전 기금 (HICF)을 통해 감사 하 고 싶습니다. . 자금 참조 번호: 0510-069입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

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References

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새로운 박테리아 특정의 광학 검사 Confocal 레이저 Endomicroscopy에 의해 <em>전 비보</em> 인간의 폐 조직에 프로브
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Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).More

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

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