Summary
Denna teknik beskriver en effektiv screening process för att utvärdera bakterier-specifika optisk imaging agenter inom ex vivo mänsklig lungvävnad, av fibered confocal fluorescensmikroskopi för snabb identifiering av små molekyler kemiska PROBE-kandidater med översättningsbara potential.
Abstract
Det är viktigt för patientens stratifiering och för att säkerställa lämplig användning av antimikrobiella medel att förbättra hastighet och precision för bakteriell upptäckt. Att uppnå detta mål, utveckling av diagnostiska tekniker att erkänna bakteriella närvaron i realtid på den point-of-care krävs. Optisk imaging för direkt identifiering av bakterier inom värden är en attraktiv metod. Flera försök på kemiska sonden design och validering har undersökts, men ingen har ännu lyckats översatts till kliniken. Här beskriver vi en metod för ex vivo validering av bakterier-specifika prober för identifiering av bakterier inom distala lungorna, fotograferad av fibered confocal fluorescensmikroskopi (FCFM). Vår modell används ex vivo mänsklig lungvävnad och en kliniskt godkänd confocal laser endomicroscopy (CLE) plattform till skärmen roman bakterier-specifika imaging föreningar, noga härma imaging villkoren förväntas uppkomma med patienter. Därför ger screening föreningar genom denna teknik förtroende potentiella kliniska tractability.
Introduction
Denna teknik beskriver en snabb screening process för att utvärdera bakterier-specifika optisk imaging agenter inom ex vivo mänsklig lungvävnad av CLE med FCFM för snabb identifiering av föreningar med potentiella kliniska verktyg för att visualisera bakterier i den distala lung i situ.
Det finns ett brådskande globala krav att ransonera antimikrobiella förskrivning i eran av ökande antibiotikaresistens1. Därför sökte utveckling av diagnostiska metoder som fungerar att identifiera bakteriell infektion med hög specificitet, känslighet, och i realtid är mycket2. Nuvarande metoder för att bekräfta en diagnos av lunginflammation i kritiskt sjuk patienter, såsom de inom intensivvårdsavdelningar (IVA), är ofta beroende av tolkningen av icke-specifika kliniska eller radiologiska funktioner tillsammans med bakteriekultur tekniker från aspirerade vätskor eller vävnaderna, vilket kan ta upp till 3 dagar att producera resultat. Dessutom bakterieodling från vätska ingjutit i distala lungan och Hämtad är benägna att kontaminering från mer proximala airways3 och är ofta kultur negativt på grund av samtidig antimikrobiell terapi eller dålig urvalsmetoder. Dessutom, är molekylära tekniker såsom polymeraskedjereaktion alltför känslig när det används på aspirerade vätskor, att riskera överbehandling av patienter. Framväxande diagnostiska tillvägagångssätt är molekylära optisk imaging, att göra i situ molekylär patologi av vävnader en möjlighet; utveckling och validering av optisk imaging föreningar krävs dock. Dock direkt visualisering av bakterier, via activatable Optiska prober är potentiellt en mycket kraftfull metod för att möjliggöra studier av förekomsten och utvecklingen av lunginflammation hos patienten, och viktigast, kunde användas att studera värd-patogen interaktioner i svar på behandling i realtid jordbaserad.
CLE är en etablerad undersökande förfarande i flera sjukdomar4, inklusive inom områdena gastroenterologi5, onkologi6,7, och för sökning i luftvägarna och alveolära säckar8, 9. det möjliggör point-of-care strukturell avbildning av sjuk vävnad med hjälp av en fiber imaging bunt, som passerar genom kanalen arbeta av en klinisk endoskop och former direkt kontakt med vävnadsytan för att avbildas av konfokalmikroskopi. Dock är en begränsning som återstår behovet av generiska kontrastmedel. Användning av sjukdom särskilda sonder, såsom specifika bakterier agenter, kunde därför kraftigt utöka nyttan av denna stödform genom att direkt visualisera bakterier på platsen för misstänkt infektion. Optiska agenter erbjuder många fördelar jämfört med andra tekniker genom att möjliggöra realtid, hög upplösning imaging med diagnostiska potential. Dessutom erbjuder optisk sonder utsikterna för multiplexing för sökning i flera mål, alla uppnås till en relativt låg kostnad. Ett antal optiska agenter är under utveckling för ett sådant ändamål, men ingen har ännu genomförts framgångsrikt inom kliniken10. Vi har syntetiserat ett bibliotek av liten molekyl kemiska sonder med specificitet mot bakterier och utvecklat en snabb, effektiv rörledning för utvärdering av sonden funktion för att upptäcka bakteriell lunginflammation i situ11.
För att identifiera lämpliga sonden kandidater, hade följande krav uppfyllas innan förhör av sonden på ex vivo mänsklig lungvävnad av FCFM: i) vattenlöslighet, ii) specificitet och selektivitet för snabbt märkning kliniskt relevanta bakterier, iii) en hög signal-brus-förhållande, och iv) motståndskraft mot nedbrytning i lung-miljön. Den senare bedömdes av bronkoalveolär lavage vätska (BALF) från patienter med akut andnödssyndrom (ARDS), som är ett tillstånd som kännetecknas av proteolytiska och inflammatoriska miljöer i lungan på IVA. Dessutom hade sonderna ha en lämplig fluorophore för detektion av ett kliniskt godkänd optiska CLE bildenhet inom human alveolär lungvävnad.
Rörledningen att förhöra var och en av dessa förutsättningar var följande (i varje skede, endast sonder som passerat har överförts till nästa): (1) ett bibliotek av sonder för utredas syntetiserades; (2) varje sond lades till en panel av levande bakterier för confocal laserscanning mikroskopi (CLSM) för att säkerställa bakteriell märkning; (3) selektivitet av bakteriell märkning över däggdjursceller i samtidig kulturer med primära humana neutrofiler grundades av CLSM; (4) stabilitet och framgångsrika märkning av bakterier i närvaro av ARDS patienten BALF bestämdes av CLSM och Matrix Assisted Laser Desorption och jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF) Mass Spectrometry; (5) optimala koncentrationen av kandidaterna var beslutsam vid CLSM, att garantera selektivitet för bakterier över däggdjursceller upprätthölls; (6) kandidater var fotograferad av FCFM i suspension och på ex vivo human alveolär lungvävnad att säkerställa stabilitet och att den signal-brus var tillräcklig för att upptäcka. Steg 6 beskrivs i detalj i detta protokoll. Metodik för steg 1-5 har varit tidigare rapporterade11.
Protocol
Alla mänsklig lungvävnad erhölls efter informerat samtycke och studien har godkänts av regionala etikkommittén.
1. beredning av biologiska prover
-
Beredning av sonder
- Göra upp en 1 mM stamlösning av varje sond (t.ex., Calcein AM, UBI-3, UBI-10, etc.) i steril dH2O, med fina våg för att väga den frystorkade sond förening11. Beräkna volymen av dH2O lägga till baserat på vägd massa och molekylvikt av sonden.
-
Beredning av bakteriekulturer
Obs: Denna metod, Staphylococcus aureus användes som föredöme stammen. Någon lämplig bakteriell stam kan väljas. Eventuella kommersiella färgämne som etiketter bakterier med en lämplig magnetisering och utsläpp spectra kan väljas till positivt etikett bakterierna.- Välj en enda koloni av önskad bakteriestam från en färsk Lysogeny buljong (LB) agarplatta med hjälp av en steril ögla. Inokulera kolonin i 10 mL LB i ett 50 mL centrifugrör med doppning i slutet av slingan i kultur media. Inkubera vid 37 ° C, 250 rpm för 16 h (eller över natten).
- Bestämma den OD595 övernattning kultur genom att lägga till 100 µL av övernattning kultur 900 µL LB i en 1 mL kyvetten. Mäta OD på 595 nm (med en kyvetten med 1 mL LB som en tom) i en spektrofotometer. Multiplicera den erhållna OD 10 att få OD för övernattning kulturen.
- Subkultur övernattning kulturen. Gör detta genom att justera den optiska densiteten vid 595 nm (OD595) 0,1 i 10 ml av färska LB. beräkna nödvändig mängd övernattning kultur läggas till 10 mL färsk LB att justera den OD595 till 0,1. Inkubera vid 37 ° C, 250 rpm tills kulturen når mitten av log fas (OD595 0,6 - 0,8), kulturen ca 4 h.
- Mäta kultur optiska densitet (1.2.2 steg) och skörd 1 x 108 kolonibildande-enheter (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) av den bakteriella kulturen som ingår i en 1,5 mL mikrorör (t.ex., om den bakteriella kulturen är OD595 0,6, samla 1,67 mL). Centrifugera kulturen på 10 000 x g i rumstemperatur i 1 min till pellet bakterierna. Tvätta pelleten två gånger i fosfat buffrad saltlösning (PBS) av omblandning (pipettering upp och ner noggrant) pelleten i 1 mL PBS, centrifugering som ovan, kasta bort supernatanten och upprepande. Se till att inte rubba den bakteriella pelleten när du tar bort supernatanten. Återsuspendera slutliga pelleten i 1 mL PBS.
Obs: Förbereda så många prover som krävs för varje märkning förfarande. Protokollet kan pausas här för upp till 1 h, följt av steg 1.2.5.1, 1.2.5.2 eller 1.2.5.3. - Bakteriella färgning
- Etikettera bakterierna med Calcein AM, lägga färgen till en slutlig koncentration på 1 µM in i tvättad bakteriella kulturen. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C med skakningar vid 300 rpm kulturen. Tvätta counterstained bakteriesuspensionen i PBS 3 gånger genom centrifugering som i steg 1.2.4 ta bort överflödig färg. Återsuspendera i 1 mL PBS, späd 100 µL 1:1 i PBS att få 200 µL OD595 0,5 Calcein är betsad bakterier. Protokollet kan pausas här för upp till 1 h.
- Etikettera späd bakterierna med test sonder (t.ex., UBI-3 eller UBI-10), 100 µL av den bakteriella kulturen 1:1 i PBS att erhålla OD595 0,5 i 200 µL PBS. Lägga till antingen av sonderna till en slutlig koncentration av 10 µM. Invertera mikroröret flera gånger för att säkerställa noggrann blandning av bakterierna och sonden.
Obs: Imaging bör utföras omedelbart efter tillsats av sonden att efterlikna det kliniska scenariot. - För att förbereda kontroll OD ofärgade bakteriell prover, utspädd 100 µL av kultur 1:1 med PBS att få 200 µL ofärgade595 0,5 provet.
-
Beredning av ex vivo mänsklig lungvävnad
Obs: Human lung vävnadsprover erhölls från patienter som genomgår kirurgisk resektion för lungcancer. Alla vävnad används för imaging erhölls från prover av normal lungvävnad från cancersvulst. Prover togs färskt från operationssalen och lagras i mikrorör eller Centrifugera rören vid-80 ° C fram till användning.- Omedelbart före imaging, ta bort de mänskliga lungan vävnadsprov från frysen på torris. Vid rumstemperatur, tillåta vävnaden Tina något; precis tillräckligt för att vara skuret med en skalpell i 1 x 4 mm2 sektioner.
Obs: Upptining är viktigt; för fryst och vävnaden kommer inte skiva utan flisning, alltför tinade och vävnaden är för mjuk att skära. - Med pincett, placera skivad mänsklig lungvävnad i brunnar i en 96-väl klart platt-botten vävnadsodling-plattan. Eventuella oanvända mänsklig lungvävnad omedelbart återvända till förvaringsbehållare och placera på torris för transport tillbaka till-80 ° C frysen.
- Tillsätt 100 µL PBS till varje lunga vävnadsprov med en pipett. Använda pipettspetsen för att säkerställa alla vävnaden är täckt av PBS (och inte fastnat på väggarna i brunnen). Vävnaden kommer att svälla något och kan flyta. Lämna PBS på prov i några minuter så att alla blodet att läcka ut från vävnaden i lösningen. Avlägsna så mycket av PBS som möjligt. Vävnaden kan blockera slutet av pipettspetsen; försök att vinkla plattan/tip placeringen för att förhindra detta.
- Pipettera 100 µL av ofärgade, Calcein är märkt eller testproben märkta bakterier till varje brunn innehållande lungvävnad. Också ställa in kontroller med lungvävnad och 100 µL PBS. Till dessa kontrollbrunnar, kan sonder utan bakterier läggas för att mäta någon ökning i bakgrunden fluorescens och/eller icke-specifik aktivering av sonden av lungvävnad ensam. En brunn med lungvävnad och PBS bör också inkluderas.
- Omedelbart före imaging, ta bort de mänskliga lungan vävnadsprov från frysen på torris. Vid rumstemperatur, tillåta vävnaden Tina något; precis tillräckligt för att vara skuret med en skalpell i 1 x 4 mm2 sektioner.
2. imaging med CLE enheten med FCFM
-
Set up av CLE enhet
Obs: Förbereda CLE systemet 20 min före kalibrering till att lasern kan värma upp.- Tryck på på/av-knappen på baksidan av transformatorn i systemet och slå på den angivna datorn. Tryck på på/av-knappen på framsidan av laser scanning enhet (LSU). Kontrollera utseendet på grönt ljus, som anger att enheten är påslagen.
- Dubbelklicka på ikonen för CLE-programvaran. Ange inloggningsuppgifter och vänta på LSU att initiera (10-30 s).
- För användning av nya FCFM imaging fibrer, är installation med medföljande CD nödvändig. Sätt in installations-CD i datorns CD-enhet och följ anvisningarna på skärmen.
- Ren FCFM fiber kontakt bildenheten med en fiber cleaner. Gnugga kontakten på menyfliken rengöring i en framåtgående rörelse ta bort damm/smuts. Ta bort gula skyddshöljet från framsidan av LSU.
- Förbereda LSU navet genom att försiktigt vrida navet silver moturs tills det tar stopp. Anslut FCFM imaging fiber kontakten i navet med den platta sidan av kontakten uppåt. Håller fibern på plats och vrid navet silver medurs tills det klickar två gånger. Slutför anslutningen genom att vrida medsols silver navet av ytterligare 45°.
Obs: Om fibern inte känns igen, kontrollera att den FCFM imaging fiber har installerats och ansluten i rätt riktning. - Följ instruktionerna som kommer pop-up för att fylla den FCFM imaging fiber kalibrering. Det finns 3 steg: (1) FCFM avbildning fiber test (steg 2.1.7 - 2.1.8), (2) bakgrund förvärv (steg 2.1.9), (3) fiber upptäckt (steg 2.1.10).
- Tryck på knappen 'starta laser' på skärmen. Lasern kommer att centrera.
- Välj färska injektionsflaskor (gul: kalibrera; röd: Rengör; blå: Skölj) från kalibreringen kit och följ anvisningarna: placera den distala änden av den FCFM imaging fiber i injektionsflaskan med gula och titta på för att öka i fluorescens på skärmen och placera den fiber tips i injektionsflaskan röd (utan omrörning). Vänta på fluorescensen (som visas på bildskärmen) att försvinna. Skölj slutligen fiber spets i blå injektionsflaskan.
Obs: Om fluorescensen inte försvinner, rengör FCFM imaging fibern med 8% H2O2 och lins rengöring vävnader och börja igen. Upprepa processen tills tillfredsställande resultat (bildkvaliteten är klart och inga märken från smuts syns). - Placera den FCFM imaging fiber i injektionsflaskan med blå. Tryck på 'start laser' följt av 'beräkna' när detta blir ett alternativ.
- Placera den FCFM imaging fiber i injektionsflaskan med gula. Tryck på 'start laser' följt av 'beräkna' när detta blir ett alternativ.
- Under den automatiska kalibreringen, rengör den distala änden av den FCFM imaging fiber genom att placera i röda injektionsflaskan för > 10 s, följt av blå injektionsflaskan för > 4 s, indikerat av programvaran.
-
Datainsamling med CLE
- Efter installationen öppnas ett fönster att välja lagringsplats och fil prefix. Välj önskad mapp för lagring av data, och namnet prefixet med detta.
- Placera pedaler så att de lätt kan nås av operatören. Vänster pedal: laser på/av; Center pedal: pausa; höger pedal: spela in/stoppa.
Obs: Laser kontrollerna kan också nås via reglage på skärmen. - Klicka på 'start' på skärmen eller trycker på vänstra foten-pedalen för att aktivera lasern. Detta kommer att starta förvärv och få bilder med 100% lasereffekt och en bildhastighet av 12 bildrutor/s (standardinställningar).
Obs: För andra program, kan dessa inställningar ändras på skärmen om det behövs, beroende på provet. - Bild varje av bakteriesuspensionen proverna.
- Infoga den distala änden av FCFM imaging fiber och flytta fibern långsamt genom suspensionen att förhöra provet.
- Spela in videor av valfri längd (upp till 10 min) genom att trycka på höger fotpedal eller välja på skärmen registrera kontroller, eftersom fibern går långsamt runt provet.
- Ren den distala änden av FCFM imaging fiber med 8% H2O2 och lins rengöring vävnader mellan prover.
Obs: Typisk video längder på 10-30 s är tillräckliga för in vitro- imaging.
- Bild varje lunga vävnadsprov.
- Infoga den distala änden av den FCFM imaging fiber i provet, säkerställa att direktkontakt mellan slutet av fibern och vävnaden görs. Flytta försiktigt i slutet av imaging fiber runt att förhöra provet.
Obs: Lyft i slutet av fiber från vävnaden kommer att ta bort vävnad från fokalplanet; Detta kan dock användas till bild märkta bakterier som inte följs vävnaden. - Spela in videor av valfri längd (upp till 10 min) genom att trycka på höger fotpedal eller välja på skärmen registrera kontroller, eftersom fibern går långsamt runt provet.
Obs: Vanligtvis video längder 30 s är tillräckliga för ex vivo imaging på vävnad. - Ren den distala änden av FCFM imaging fiber med linsrengöringsvätska vävnader och 8% H2O2 mellan prover.
- Infoga den distala änden av den FCFM imaging fiber i provet, säkerställa att direktkontakt mellan slutet av fibern och vävnaden görs. Flytta försiktigt i slutet av imaging fiber runt att förhöra provet.
-
Stänga av systemet
- Stänga av lasern genom att trycka på vänster fotpedal eller genom att klicka på knappen på skärmen.
- Koppla FCFM imaging fiber från CLE-enheten genom att vrida navet silver LSU moturs tills det tar stopp. Ta bort den FCFM imaging fiber från LSU-navet genom att försiktigt dra fiber kontakten från LSU.
- Rengör och desinfektera FCFM imaging fibern med 8% H2O2 och lins rengöring vävnader. Återgå skyddshättorna till den proximala änden av FCFM imaging fiber och framsidan av LSU enheten. Placera försiktigt fibern i rutan lagringsplats.
- Nära data fånga programvara och kopiera sparade filer till en extern USB-enhet. Stäng av datorn och stänga av LSU enheten genom att trycka på panelen I/O för 3 s tills den grön lampan försvinner.
- Kassera mänsklig lungvävnad och bakterier enligt lokala bestämmelser.
3. dataanalys
- Öppna programvaran och importera filer för analys genom att välja lämplig katalog på datorn via ikonen 'Gå till' på instrumentpanelen för programvara. Alternativt kan filer dras och släppas in i instrumentpanelen för program.
- Dubbel klick på varje videofil att öppna dem. Videoklipp spelas upp automatiskt med optimerad färgtabellen (LUT) och färgtabell justera. Inaktivera automatisk intensiteten skalning, genom att klicka på knappen wand ovanför intensitet skalstapeln. Funktionen inaktiveras när det finns ingen svart skuggning runt knappen.
Obs: Automatisk intensitet skalning måste vara inaktiverad för att förhindra kontinuerlig kontrastförbättring hela varje video, gör det omöjligt att jämföra och analysera videor från samma data set. - Välj önskad intensitet skalning genom att flytta de lägsta och högsta barerna att ge den bästa kontrasten. Använda histogramverktyget när välja intensitet skalning för att säkerställa det bredaste dynamiska omfånget fångas.
Anmärkning: Se till att det dynamiska omfånget är sådan att bilderna inte är mättade (dvs begränsa de vita regionerna i bilden, som visar mättnad), så att låg intensitet funktioner inte missat. - När man uppnått önskad skalning, högerklicka över dropdown menyn knappen som anges som 'Default (grön)'. Välj alternativet att spara på LUT. Spara LUT till önskad plats.
- För varandra video i datauppsättningen, tillämpas den samma LUT genom att högerklicka över 'Default (grön)' rullgardinsmenyn och välj 'Ladda LUT'. Välj rätt fil att tillämpa konsekventa intensitet skalning till alla videor i en datamängd.
- Exportera bearbetade videor genom att klicka på knappen 'film reel'. Välj önskad videoformat, t ex 'för presentation ändamål', som kommer att producera en .mpg fil. Tryck på 'Export' och valde plats att spara videofilen. Ögonblicksbilder av enskilda bildrutor kan exporteras genom att klicka på knappen 'kamera'. Det är möjligt att spara en .png, .bmp eller .jpg fil. Välj filen destination och tryck Spara.
Obs: Videor kan sedan importeras till någon programvara för beredning av presentationer eller ytterligare kvantifiering. Märkt bakterier visualiseras som gröna 'blinkar' punkter i videon. Lunga vävnad struktur skall framgå som beställt fluorescerande trådar, med alveolär utrymme visas svart.
Representative Results
I denna studie har vi visat en metod för snabb-screening av nya bakterier-specifika prober i ex vivo human alveolär lunga vävnad modell av infektion med en kliniskt godkänd CLE-enhet.
CLE av FCFM är väl lämpad för att erhålla strukturell information inom distala lungan, eftersom denna region (på grund av en hög överflöd av elastin och kollagen) är naturligtvis starkt fluorescerande när glada med en 488 nm laser8. Omvänt, alveolära utrymmet fluorescerar inte, och som sådan möjliggör hög kontrast mellan vävnadsstrukturen och luftar utrymme ska visualiseras (figur 1).
Tillägg av sjukdom relaterade sonder eller kontrastmedel, såsom bakterier-specifika prober bör möjliggöra funktionell information om sjukdomsprocesser inhämtas i realtid. Vi har tidigare beskrivit syntesen och inledande i vitro screening av ett bibliotek av bakterier-specifika sonder11; där bakteriell-specificitet, bestämdes proteolytiska stabilitet och lagring inom bakteriell membranet över tid. En lovande bakterier-specifika sond (UBI-10) identifierades inom studien, samt en som visade dålig lagring inom bakteriell cellmembranet (UBI-3). Dessa jämfördes med en kontroll av kommersiella counterstaining (Calcein AM) som användes till märkt S. aureus.
Ofärgade, var Calcein AM, UBI-3 och UBI-10 märkt S. aureus avbildade i suspension av FCFM med 100% 488 nm laser power och en bildhastighet av 12 bildrutor/s (figur 2). Omärkta bakterier i PBS var avbildade, var ingen fluorescerande signal detekterbar. Detta är i motsats till när märkta bakterier var avbildade. Där bakteriell suspensioner med UBI-3 eller UBI-10 var fotograferad av FCFM, var det uppenbart att den allmänna bakgrund fluorescensen av lösningen var förhöjda jämfört med PBS endast kontroller, detta beror på att NBD (sonden fluorophore) avger en liten mängd fluorescens signal i vattenlösning, men ljusa punktuell prickar syns tydligt i hela lösningen, utan behov av en tvättningen. Detta beror på en ökning av fluorescens signal som avges från NDB i en polar miljö dvs, bakteriell membranet. Calcein AM är inte en activatable sonden, så en TVÄTTNINGSSTEGET efter bakteriell färgning var tvungen att ta bort hög fluorescerande bakgrund av obundna sonden i lösningen. Som UBI-3 och UBI-10 identifierades märkta bakterier, bakterier märkt med Calcein AM i lösning av FCFM som ljusa gröna punktuell prickar. Uppgifterna samlas i videoformat, förefaller dessa prickar 'twinkle' när de flyttar mellan kärnor och in-och ut av fokus, ett karakteristiskt drag av imaging märkta bakterier av denna metod.
Märkt bakterierna var därefter läggs till små skivor av ex vivo mänsklig lungvävnad och fotograferad igen av FCFM (figur 3). Där endast PBS eller omärkta S. aureus lades till lungvävnad, upptäcktes endast lunga vävnad autofluorescent struktur (ses som ljusa gröna trådar av kollagen och elastin och mörka områden alveolära utrymme). Ingen punktuell prickar upptäcktes för dessa villkor för kontroll. På samma sätt var bara lunga vävnad struktur (och ingen punktuell prickar) visualiserat för villkoret lunga vävnad med S. aureus plus UBI-3; som anger att denna sond inte behölls stabilt inom bakteriella cell membran dvs, det var tvättas eller bryts ned i närvaro av infödda proteolytiska enzymer i lungvävnaden (som tidigare visat11).
I båda Calcein AM märkt positivt kontrollprov S. aureus och med mest lovande bakterier-specifika sonden (UBI-10) S. aureus prov syntes dock ljusa punktuell prickar. 'Blinka' prickar var synliga trots den starka vävnad autofluorescens (figur 3). Således resultaten av FCFM var i samstämmighet med in vitro- pre screening av panelen av bakterier-specifika prober av CLSM, och visat en kliniskt relevant detektionsmetod för imaging infektioner i realtid.
De resultat som presenteras här visar att lungcancer är en lämplig organsystem för avbildning av FCFM på grund av dess distinkta autofluorescens. De ljusa distinkta strukturerna tillåter CLE operatören att avgöra att de är i det alveolära utrymmet. Dessa områden, tillsammans med mörka alveolära luftblåsor ger en perfekt bakgrund för imaging fluorescently märkta bakterier med hög kontrast.
Även om upptäckten av bakterier inom denna studie bestäms kvalitativt genom att visualisera ljusa punktuell prickar, kunde det vara möjligt att kvantifiera antalet punktuell punkter bildruta för bildruta med en sekundär programvara för att ytterligare karakterisera sonden bibliotek.
Figur 1: Statisk bild av mänsklig lunga vävnad autofluorescens. Confocal laser endomicroscopy (CLE) bilden av ex vivo mänsklig lungvävnad använder fibered confocal fluorescensmikroskopi (FCFM), på 488 nm excitation, 100% lasereffekt och 12 ramar/s. Elastin och kollagen är starkt fluorescerande (falskt färgad grön), alveolära utrymme är inte, och visas som svart regioner. Denna siffra har ändrats från Akram et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Confocal laser endomicroscopy (CLE) bilden av märkt S. aureus i suspension. Fibered confocal fluorescensmikroskopi (FCFM) användes till bild pre märkta bakterier, på 488 nm excitation, 100% lasereffekt och 12 ramar/s. märkt Visa bakterier som starkt fluorescerande punktuell prickar (falska färgade grön). Denna siffra har ändrats från Akram et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Confocal laser endomicroscopy (CLE) bilden av ex vivo mänsklig lungvävnad med märkta S. aureus. Fibered confocal fluorescensmikroskopi (FCFM) användes till bild ex vivo mänsklig lungvävnad och märkt S. aureus, på 488 nm excitation, 100% lasereffekt och 12 ramar/s. märkt bakterier Visa som starkt fluorescerande punktuell prickar (falska färgade grön) inom lunga vävnad provet när märkt med Calcein AM eller UBI-10. Den högsta kontrasten observeras där bakterier är avbildade inom det alveolära utrymmet. Denna siffra har ändrats från Akram et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Nedre luftvägsinfektioner står för näst högsta sjukdomsbördan globalt12,13, och en betydande ökning av antalet infektioner som tillskrivs antimikrobiella resistenta bakterier har varit rapporterade14. Lunginflammation är fortfarande en vanlig orsak till sjukhusinläggning. På IVA, utvecklingen av en lunginflammation förvärras av diagnostisk osäkerhet och är associerade med en extremt hög dödlighet klassar15. Under början av lunginflammation föröka bakterier inom alveolära distala lungan, ett område som är relativt sterilt, med minimal bakterieflora i hälsa.
Denna metod beskriver relativt sent skede ex vivo validering av bakterier-specifika optisk imaging sonder11, men design, syntes, och sonden utvärdering innan du påbörjar denna valideringsstegen är imperativ, som tidigare visat11 .
CLE är en framväxande klinisk teknik för förhör sjukdom uppger i situ i realtid. Det erbjuder många fördelar jämfört med traditionella tekniker för att utreda misstänkt pulmonell patologi, som kan innebära en biopsi och insamling av lavage vätska. Biopsier är invasiv och kan orsaka sjuklighet och dödlighet hos ventilerade patienter, och insamlade lavage vätska är ofta förorenat med bakterier från de övre luftvägarna. Användningen av CLE för detektion av lunginflammation är dock något begränsad på grund av dålig tillgång till kompatibla imaging sonder som kan tillhandahålla funktionell information av sjukdom, trots många samordnade insatser10. Kombinera CLE med optiska medel erbjuder möjligheten att diagnostisera lunginflammation snabbare och mindre jämfört invasivt med nuvarande praxis.
De kritiska steg till detta protokoll är i provberedning och inställning av CLE plattformen. Att erhålla mänsklig vävnad som är relevanta för den slutliga kliniska ansökan är också viktiga, såsom mänsklig lungvävnad som visat inom denna studie. Det är nödvändigt att använda mänsklig vävnad eftersom omfattningen av vävnad autofluorescens visar varierar kraftigt mellan arter, och kan därför vilseleda känsligheten hos bakterier-sonden som avbildas. Dessutom är det viktigt att erhålla etik för hämtning och användning av mänsklig lungvävnad. Från en teknisk nivå, rätt rengöring är fastsättning av imaging fiber till imaging LSU plattform och kalibrering viktigt för bra upplösning och konsekvent avbildning, som är att säkerställa att motsvarande antal bakterier läggs till varje lunga vävnadsprov. För att ytterligare öka nyttan av denna metod för screening paneler av sonder, är det nödvändigt att upprepa proceduren med ett utbud av patogener, såsom de sannolikt att smittämnen av lunginflammation.
Den största begränsningen av denna teknik är att kliniskt godkänd CLE enheten har endast en laser (488 nm). Därför, för närvarande, val av fluorophore för sonden design är begränsad för användning med detta system, men kliniskt godkänd enskild färg enheter finns med excitation våglängder av 660 nm och infrarött. Det är önskvärt att ha en andra laserlinje genomföras inom samma enhet till aktivera en sond utvecklas med ett spektralt distinkta fluorophore att förbättra bakterier-probe känslighet över vilken nivå av vävnad autofluorescens. Tvåfärgad CLE enheter är under utveckling, de är antingen inte är kliniskt godkända och/eller deras kostnad är betydande16.
CLE in vitro- som med patogena bakterier och ex vivo mänsklig lungvävnad till skärmen potentiella sonder överbryggar gapet mellan konventionella in vitro- metoder såsom flödescytometri och CLSM och klinisk nytta. Detta steg erbjuder förtroende när du väljer lovande föreningar att bära fram för att vara tillsammans med kliniska CLE imaging; och kommer att lämna uppgift om huruvida testade sonden upprätthåller målet specificitet, eller visar någon off-target märkning, såsom bindande direkt till vävnad, eller visar instabilitet med värd proteolytiska enzymer. Det skulle också vara relevant att lägga till var och en av de activatable sonderna direkt på prover av mänsklig lungvävnad plus bakterier, att fullständigt karakterisera hastigheten på sonden bindning och aktivering i realtid.
Vi tror att vår pipeline för snabbt screening roman bakterier-specifika prober för att bedöma deras potential för imaging inom den distala lungan av patienter kommer att resultera i mycket snabbare översättning till kliniken. Detta beror till stor del om bakterier-specifika sonden kunde levereras lokalt inom lungan genom en kateter insatt ner kanalen arbeta av en bronkoskop, vilket innebär att microdose (< 100 µg) belopp kunde levereras. Därför är systemiska leverans och biodistribution av föreningen inte en oro, som är fallet för många andra infektion mål inom kroppen, eller med Kärn avbildning. Leverera imaging sonden i en så liten dos minskar dessutom risken för toxicitet relaterade komplikationer (även om toxicitet screening skulle krävas för översättning). Efter instillation av sonden, katetern skulle sedan kunna ersättas av FCFM fiber och samma område i lungan förhördes av CLE, ungefär på samma sätt som vi har utfört inom denna metod. Imaging bör utföras snabbt efter installation av sonden innan sonden tvättar bort till omätbara koncentrationer.
Det är också viktigt att notera att screening av sjukdom-identifierande sonder genom denna teknik bör inte begränsas till bakteriell-imaging agenter, men kan också sträcka sig till validering av sonder med alternativa mål, såsom inflammation. Denna strategi bör också anpassas till andra sjukdom platser i kroppen där imaging via FCFM är tillåtet.
Disclosures
KD: Grundare chef för Edinburgh molekylär avbildning. Mottagna konsulttjänster från Mauna Kea Technologies som rådgivare.
MB: Grundare chef för Edinburgh molekylär avbildning.
Acknowledgments
Vi vill tacka Engineering och Physical Sciences Research Council (EPSRC, Storbritannien) tvärvetenskapligt forskningssamarbete grant EP/K03197X/1, Institutionen för hälsa och Wellcome Trust genom hälsa Innovation Challenge Fund (HICF) . Finansiering referensnummer: 0510-069.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS - wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. , Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016).
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. Yamada's Textbook of Gastroent. , John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
