Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Roman bakteri özel optik tarama Ex Vivo insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları

doi: 10.3791/56284 Published: November 29, 2017

Summary

Bu teknik ex vivo insan akciğer dokusu, bakteri özel optik görüntüleme aracılarına yünden confocal floresan mikroskopi hızlı teşhis edilmesi için kullanılan küçük molekül kimyasal tarafından değerlendirilmesi için bir verimli tarama işlemini açıklar sonda-adaylar çevrilebilir potansiyele sahip.

Abstract

Bakteriyel algılama doğruluğunu ve hız iyileştirilmesi, hasta stratifikasyon ve antimicrobials uygun kullanımını sağlamak için önemlidir. Bakteriyel varlığı tanımak için tanılama yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde bu hedefe ulaşmak için yapılan gerçek zamanlı bakım noktası gereklidir. Optik görüntüleme doğrudan ana içinde bakteri tanımlanması için çekici bir yaklaşımdır. Kimyasal sonda tasarım ve doğrulama çeşitli girişimler araştırdık, ancak hiçbiri henüz başarıyla kliniğe çevrildi. Burada bakteri özel probları yünden confocal Floresans mikroskobu (FCFM) tarafından yansıma distal akciğer içinde bakteri tanımlanması için ex vivo doğrulanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Modelimiz ex vivo insan Akciğer doku ve klinik olarak onaylanmış confocal lazer endomicroscopy (CLE) platformu ekran roman bakteri özel bileşenleri, yakından hasta ile karşılaştı bekleniyor görüntüleme koşulları taklit görüntüleme için kullanılan. Bu nedenle, bu tekniği ile bileşikler eleme potansiyel klinik tractability güven sağlar.

Introduction

Bu teknik ex vivo insan akciğer dokusunun görüntülenmesi için potansiyel klinik yardımcı programı ile bileşikler hızlı tanımlanması için FCFM kullanarak görev tarafından bakteri özel optik görüntüleme aracılarına değerlendirmek için bir hızlı tarama süreci anlatılmaktadır distal akciğer içinde in situbakteri.

Antimikrobiyal yükselen Antimikrobiyal direnç1dönemde reçete tayın için acil bir küresel gereksinimi vardır. Bu amaçla, tanı yöntemleri ile yüksek özgüllük, duyarlılık ve gerçek zamanlı olarak bakteriyel enfeksiyon tanımlamak için hangi hareket çoğu son derece gelişimi2aradı. Bu yoğun bakım üniteleri (ICUs), içinde gibi kritik hasta hastalarda pnömoni tanısı onaylamak için güncel teknikler çoğunlukla bakteri kültürü teknikleri yanında non-spesifik klinik veya radyolojik özellikler yorumlama kullanır emişli sıvıları/sonuçlar üretmek için 3 gün sürebilir dokular. Ayrıca, sıvı bakteri kültürü distal akciğer telkin ve daha proksimal airways3 den kirlenme için eğilimli ve sık sık kültür eşlik eden antimikrobiyal tedavi ya da zavallı örnekleme teknikleri nedeniyle negatiftir. Ayrıca, Polimeraz zincir reaksiyonu gibi moleküler teknikleri overtreatment hastaların riske emişli sıvılar üzerinde kullanıldığında aşırı duyarlıdır. Ortaya çıkan tanı in situ Moleküler Patoloji dokuların bir olasılık yapma moleküler optik görüntüleme yaklaşımıdır; Ancak, geliştirme ve doğrulama optik görüntüleme bileşiklerin gereklidir. Yine de, bakterilerin alınabilen optik sonda üzerinden doğrudan görselleştirme potansiyel varlığı çalışma izin vermek için çok güçlü bir yöntem olduğunu ve pnömoni evrimi hasta ve önemlisi, ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde çalışma için kullanılan olabilir yanıt-e doğru gerçek zamanlı tedaviler in situ durumdaki.

CLE Gastroenteroloji5, Onkoloji6,7ve airways ve alveoler keseleri8, sorguya için alanları içinde de dahil olmak üzere birden çok hastalıklar4, kurulan soruşturma işlemdir 9. bakım noktası yapısal görüntüleme hastalıklı doku bir lif klinik bir endoskop çalışma kanalı ile geçer paket Imaging kullanarak sağlar ve formları doğrudan tarafından confocal mikroskobu yansıması için doku yüzeyi ile temas. Ancak, hala bir sınırlama genel kontrast ajanlar için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, hastalık gibi belirli bakteriyel ajanlar, belirli probları kullanımını büyük ölçüde bu modalite yarar genişletmek olabilir doğrudan sitesinde şüpheli enfeksiyon bakteri görselleştirme tarafından. Optik ajanlar tanılama potansiyeli olan gerçek zamanlı, yüksek kararlılık düşsel etkinleştirerek diğer teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Ayrıca, birden çok hedef, nispeten düşük maliyetli olarak tüm elde sorguya için çoğullama olasılığı optik sonda sunuyoruz. Hiçbiri henüz başarıyla içinde klinik10uygulanmıştır ancak optik aracılarının sayısını böyle bir amaç için geliştiriliyor. Biz küçük molekül kimyasal probları Kütüphanesi bakteri doğru özgüllük ile sentezlenmiş ve hızlı, etkili bir boru hattı bakteriyel pnömoni in situ11algılamak için sonda ile değerlendirilmesi için geliştirilen.

Uygun prob adaylarını tanımlamak için aşağıdaki Önkoşullar sonda ex vivo insan akciğer dokusu üzerinde sorgulama önce FCFM tarafından yerine getirilmesi gerekiyordu: i) sulu çözünürlük, II) özgüllük ve hızla klinik olarak etiketleme için seçicilik ilgili bakteri, III) yüksek sinyal gürültü oranı ve IV) bozulması akciğer ortamında direnç. İkinci bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) tarafından hastalarda akut respiratuar distress Sendromu (ARDS), ile hangi bakımda akciğer proteolitik ve inflamatuar ortamlarda ile karakterize bir durumdur değerlendirildi. Ayrıca, sondalar bir klinik olarak onaylanmış optik görev görüntü aygıtı içinde insan akciğer alveolar doku tarafından algılama için uygun bir fluorophore olması gerekiyordu.

Her biri aşağıdaki önkoşulları yerine sorguya çekmek için boru hattı şöyleydi (her aşamada geçti probları ileri diğerine yapılmıştır): (1) probları araştırılması için bir kütüphane sentez; (2) her sonda bir panel confocal lazer tarama bakteriyel etiketleme sağlamak için (CLSM) mikroskopi için canlı bakteri eklendi; (3) seçicilik üzerinde birincil insan nötrofil ile ortak kültürleri memeli hücrelerinde bakteriyel etiketleme, CLSM tarafından kuruldu; (4) istikrar ve bakteri varlığında ARDS hasta BALF başarılı etiketlerine göre CLSM ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi tarafından kararlı; (5) adayların en iyi konsantrasyon bakteri memeli hücreleri üzerinde muhafaza için seçicilik sağlama CLSM tarafından tespit edilmiştir; (6) adaylar tarafından FCFM süspansiyon görüntüsü ve istikrar emniyetini ex vivo insan akciğer alveolar doku üzerinde sinyal gürültü algılama için yeterli. Adım 6 bu iletişim kuralı içinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Adım 1-5 için metodoloji daha önce bildirilen11oldu.

Protocol

Tüm insan Akciğer doku Onam elde edildi ve çalışma bölgesel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. biyolojik örnekler hazırlanması

  1. Probları hazırlanması
    1. 1 mM bir hisse senedi çözüm her sonda kadar yapmak (örneğin, Calcein AM, UBI-3, UBI-10, vb) steril dH2içinde O, bileşik11sonda dondurularak tartmak için ince bir denge kullanarak. Ağırlığını kitle ve molekül ağırlığı sonda eklemek için dH2O hacmi dayalı hesaplamak.
  2. Bakteriyel kültürlerde hazırlanması
    Not: Bu yöntem için Staphylococcus aureus suret soy kullanıldı. Herhangi bir uygun bakteriyel zorlanma seçilebilir. Uygun bir uyarma ve emisyon spectra ile bakteri etiketleri herhangi bir ticari boya olumlu bakteri etiketlemek için seçilebilir.
    1. Bir koloni istenen bakteriyel baskı bir taze Lysogeny suyu (LB) agar plaka bir kısır döngü kullanarak seçin. Döngünün sona kültür medya içine daldırma tarafından 50 mL santrifüj tüpü 10 mL lb içine koloni aşılamak. 37 ° c, 250 rpm 16 h için kuluçkaya (veya bir gece).
    2. Gecede kültür OD595 900 µL LB 1 mL küvet içinde 100 µL gecede kültür ekleyerek belirlemek. OD, 595 ölçmek bir Spektrofotometre (bir küvet ile 1 mL LB boş bir parola kullanarak) nm. OD gecede kültür elde etmek için 10 tarafından elde edilen OD çarpın.
    3. Alt kültür gecede kültür. 595, optik yoğunluk ayarlayarak bunu nm (OD595) taze LB. 10 0,1 mL için hesaplamak için 10 mL eklenecek gecede kültür gerekli hacmi 0,1 için OD595 ayarlamak için taze LB. 37 ° c, 250 orta log fazı (OD595 0,6 - 0,8), kültür ulaşıncaya kadar rpm kültür kuluçkaya yaklaşık 4 h.
    4. Kültür optik yoğunluk (Adım 1.2.2) ve hasat 1 x 108 koloni birimleri (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) bakteri kültürü (bakteriyel kültür OD595 iseörneğin, 1.5 mL microtube şekillendirme ölçmek 0,6, toplamak 1,67 mL). Kültür 10.000 x g bakteri cips için 1 dakika için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Yıkama Pelet fosfat içinde iki kez arabelleğe alınmış serum (PBS) resuspending (yukarı ve aşağı dikkatle pipetting tarafından) 1 mL PBS, yukarıdaki gibi centrifuging, süpernatant atarak ve yinelenen Pelet. Bakteriyel Pelet süpernatant kaldırırken çıkarmak değil için dikkat ediniz. Son Pelet 1 mL PBS resuspend.
      Not: gerektiği gibi çok sayıda örnekleri etiketleme her yordam için hazır olun. Protokol burada için en fazla 1 saat adım 1.2.5.1, 1.2.5.2 veya 1.2.5.3 gelir, duraklatılmış.
    5. Bakteriyel boyama
      1. Calcein AM bakterilerle etiketlemek için boya 1 µM son bir konsantrasyon yıkanmış bakteri kültürü içine ekleyin. Kültür için 300 devir / dakikada sallayarak ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Counterstained bakteriyel süspansiyon Santrifüjü adım fazla boya kaldırmak için 1.2.4 gibi tarafından PBS 3 kere içinde yıkayın. 1 mL PBS resuspend, 100 µL 1: 0.5 Calcein dilerim OD595 200 µL lekeli bakteri elde etmek için PBS içinde 1 oranında seyreltin. Protokol burada en fazla 1 saat için duraklatılmış.
      2. Test probları (örneğin, UBI-3 veya UBI-10), bakterilerle etiketlemek için 100 µL bakteri kültürü 1: OD595 0,5 200 µL PBS elde etmek için PBS içinde 1 oranında seyreltin. Ekleme ya sondalar 10 µM. son bir konsantrasyon için microtube birkaç kez bakteri ve sonda ayrıntılı karıştırma sağlamak için ters çevir.
        Not: Görüntüleme hemen klinik senaryo taklit etmek için sonda eklenmesinden sonra yapılmalıdır.
      3. Denetim hazırlamak için595 0,5 örnek günahı bakteriyel örnekleri, 1:1 200 µL günahı, elde etmek için PBS ile kültürünün seyreltik 100 µL OD.
  3. Ex vivo insan akciğer dokusunun hazırlanması
    Not: İnsan Akciğer doku örneği akciğer Karsinom için cerrahi rezeksiyon uygulanan hastalardan elde edilmiştir. Görüntüleme için kullanılan tüm Doku örneklerinden kanserli büyüme uzak normal akciğer dokusunun elde edildi. Örnekleri ameliyathane taze alınan ve kadar kullanmak mikrotüpler ya da santrifüj tüpleri-80 ° C'de depolanan.
    1. Hemen önce görüntüleme, dondurucu kuru buz üzerinde insan Akciğer doku örneği kaldırın. Oda sıcaklığında doku biraz çözülme izin; neşterle 1 x 4 mm2 bölüme dilimlenmiş için yeterli.
      Not: çözdürme düzeyini önemlidir; çok donmuş ve doku, yonga olmadan çok çözdürülen dilim değil ve dilim çok yumuşak bir dokudur.
    2. Forseps kullanarak, dilimlenmiş insan akciğer dokusunun bir 96-şey açık düz alt doku kültürü tabak kuyu yerleştirin. Herhangi bir kullanılmayan insan Akciğer doku hemen yeri ve saklama kabı kuru buz-80 ° C dondurucu taşınmaya geri dönün.
    3. 100 µL PBS her akciğer doku örneği bir pipet ile ekleyin. Pipet ucu tüm doku içinde PBS kaplı (ve iyi duvarlara yapışmış değil) emin olmak için kullanın. Doku biraz kabarma olacaktır ve savrulabilir. PBS dokudan çözüm içine leach için herhangi bir kan izin vermek bir kaç dakika için örnek çıkarma. PBS mümkün olduğunca çoğunu olmaktan çıkarın. Doku pipet ucu sonu engelleyebilir; Bunu engellemek için plaka/ipucu yerleşim açı çalışın.
    4. 100 µL günahı, pipet, Calcein etiketli veya bakteri de içeren her akciğer doku testi-sonda etiketli. Ayrıca akciğer dokusu ve 100 µL PBS denetimleriyle ayarlayın. Bu denetim wells için probları bakteri olmadan herhangi bir artış arka plan Floresans ve/veya non-spesifik harekete geçirmek-sonda in ölçmek için tek başına akciğer dokusu tarafından eklenebilir. Bir de akciğer dokusu ve PBS ile de dahil edilmelidir.

2. FCFM görev aygıtla ile görüntüleme

  1. CLE cihazın kurmak
    Not: görev sistemi 20 dk önce kalibrasyon ısınmak lazer izin vermek için hazır olun.
    1. Trafo sisteminin arkasındaki açma/kapama tuşuna basın ve belirlenen bilgisayarı açın. Birim (LSU) tarama lazer önündeki açma/kapama düğmesine basın. Birim açık olup olmadığını gösteren yeşil ışık doğrulayan.
    2. CLE yazılım simgesine çift tıklayın. Giriş bilgilerini girin ve LSU (10-30 s) başlatmak bekleyin.
    3. Yeni FCFM lifleri Imaging kullanım için sağlanan CD ile kurulum gereklidir. Yükleme CD'sini bilgisayara CD sürücüsüne takın ve ekrandaki yönergeleri izleyin.
    4. FCFM görüntüleme fiber bağlayıcı birim bir fiber temiz temiz. Bağlayıcı herhangi bir toz/kiri çıkarmak için ileri bir hareketle temizlik Şeritteki RUB'dir. Koruyucu sarı kapak LSU önünden kaldırın.
    5. LSU hub durana kadar gümüş hub yönünün hafifçe döndürerek hazırlayın. FCFM görüntüleme fiber bağlayıcı bağlayıcı yukarı bakacak şekilde düz tarafıyla hub'a takın. Fiber yere tutun ve iki kez oturana kadar gümüş hub saat yönünde döndürün. Bir daha 45 ° tarafından gümüş hub saat yönünde çevirerek bağlantıyı tamamlamak.
      Not: lif tanınmıyorsa, fiber Imaging FCFM yüklü ve doğru yönde bağlı emin olun.
    6. Fiber kalibrasyon Imaging FCFM tamamlamak için açılır pencere olacak yönergeleri izleyin. 3 adım vardır: (1) FCFM görüntüleme fiber testi (Adım 2.1.7 - 2.1.8), (2) arka plan edinme (Adım 2.1.9), (3) fiber algılama (Adım 2.1.10).
    7. Ekranda 'başlangıç lazer' düğmesine basın. Lazer merkezi.
    8. Taze ampul seçin (Sarı: ayarla; kırmızı: clean; mavi: durulama) kalibrasyon gelen kit ve ekrandaki yönergeleri izleyin: lif sarı şişe Imaging FCFM distal sonuna yerleştirin ve izlemek için artış Floresans izleme ile ilgili olarak, sonra yer Fiber uç (olmadan karıştırma) kırmızı şişe içine. Floresan için kaybolmaya (bilgisayar monitöründe gösterildiği gibi) bekleyin. Sonunda fiber uç mavi şişede durulayın.
      Not: floresan geçmiyorsa, % 8 H2O2 ve lens temizleme dokulara FCFM görüntüleme varlığımla temizlemek ve yeniden başlamak. Tatmin edici sonuçlar elde edilir kadar işlemi tekrarlayın (görüntü kalitesi açıktır ve hiçbir işaretleri çamurdan belirgin).
    9. Lif mavi şişe Imaging FCFM yerleştirin. 'Lazer Başlat 'Bu bir seçenek haline hesaplamak tarafından' takip' tuşuna basın.
    10. Lif sarı şişe Imaging FCFM yerleştirin. 'Lazer Başlat 'Bu bir seçenek haline hesaplamak tarafından' takip' tuşuna basın.
    11. Otomatik kalibrasyon sırasında fiber için kırmızı şişe koyarak Imaging FCFM distal sonu temiz > 10 için mavi şişe ardından s > 4 s, yazılım tarafından belirtildiği gibi.
  2. Veri toplama görev ile
    1. Kurulum, depolama konumunu ve dosya öneki seçin bir pencere açılacaktır. Veri depolama için istediğiniz klasörü seçin ve önek uygun şekilde adlandırın.
    2. Onlar-ebilmek var olmak kolayca giriş operatörü tarafından ayak pedalları yerleştirin. Sol pedal: lazer açık/kapalı; Merkezi pedal: Duraklat; Şu pedal: Kaydet/Durdur.
      Not: Lazer denetimler ekrandaki denetimler erişilebilir.
    3. 'Başlat' ekran'ı tıklatın veya lazer üzerinde açmak için sol ayak pedalı tuşuna basın. Bu satın alma başlatın ve görüntüleri % 100 lazer güç ve 12 kare/s (varsayılan ayarlar) kare hızı kullanarak elde edilir.
      Not: diğer uygulamalar için bu ayarlar ekranda gerekirse, örnek türüne bağlı olarak değiştirilebilir.
    4. Görüntü her bakteriyel süspansiyon örnekleri.
      1. Distal FCFM görüntüleme fiber sonuna yerleştirin ve yavaş yavaş süspansiyon örnek sorgulamaya aracılığıyla fiber taşıyın.
      2. Kayıt herhangi bir uzunlukta videoları (10 dakikaya kadar) sağ ayak pedal basarak veya fiber yavaş yavaş örnek hareket ederken ekranda kayıt denetimleri seçme.
      3. %8 H2O2 ve lens temizleme doku örnekleri arasında FCFM görüntüleme varlığımla distal sonu temiz.
        Not: Tipik video uzunlukları 10-30 s in vitro görüntüleme için yeterlidir.
    5. Görüntü her akciğer doku örnekleri.
      1. Lif örnek Imaging, fiber sonu ve doku arasında doğrudan temas yapılır sağlanması FCFM distal ucunu bağlayın. Yavaşça örnek sorguya çekmek için görüntüleme fiber sonuna gitme.
        Not: lif dokuyu uzak sonu kaldırma doku odak düzlem kaldırır; Ancak, bu dokusu ile yapıştırılır değil etiketli bakteri görüntü için kullanılabilir.
      2. Kayıt herhangi bir uzunlukta videoları (10 dakikaya kadar) sağ ayak pedal basarak veya fiber yavaş yavaş örnek hareket ederken ekranda kayıt denetimleri seçme.
        Not: Genellikle, video uzunluğu 30's ex vivo görüntüleme dokular için yeterli.
      3. FCFM görüntüleme fiber distal sonu lens doku ve % 8 H2O2 örnek arasında Temizleme ile temizleyin.
  3. Sistem kapatma
    1. Sol ayak pedalı tuşuna basarak veya tıklatarak lazer kapatmak ekran düğmesi.
    2. FCFM görüntüleme fiber durana kadar gümüş LSU hub saat yönünün tersine çevirerek CLE aygıtından çıkarın. LSU merkezden lif lif bağlayıcı LSU hafifçe çekerek Imaging FCFM kaldırın.
    3. Temiz ve dezenfekte % 8 H2O2 ve lens temizleme dokulara FCFM görüntüleme varlığımla. Koruyucu kapaklar proksimal sonuna FCFM görüntüleme lif ve LSU biriminin ön geri dönün. Fiber yavaşça depolama kutuya koyun.
    4. Yakın veri yazılım yakalama ve kaydedilmiş dosyaları harici bir USB aygıtına kopyalayabilir. Bilgisayarı kapatın ve 3 için ön panel I/O basarak LSU cihazı kapatmak yeşil ışık kaybolana kadar s.
    5. İnsan Akciğer doku ve bakteri göre yerel düzenlemelere uygun bir biçimde atın.

3. veri analizi

  1. Açık bilgisayar yazılımı ve yazılım kontrol panelinde 'Git' simgesinden bilgisayarda uygun dizine seçerek analiz için dosyaları alabilirsiniz. Alternatif olarak, dosyaları sürükledi ve yazılım Pano düştü.
  2. Onları açmak için video her dosyaya çift tıklayınız. Videolar otomatik olarak en iyi duruma getirilmiş renk arama tablosu (LUT) ile oynayacak ve renk tablosu ayarlayın. Ölçeklendirme, yoğunluk ölçek çubuğunun üzerinde değnek düğmesini tıklatarak otomatik yoğunluk devre dışı bırakın. Ne zaman yok siyah düğmenin çevresinde gölgeleme özelliği devre dışıdır.
    Not: Otomatik yoğunluk ölçekleme ve aynı veri kümesi videolardan imkansız yapmak her video boyunca sürekli kontrast geliştirme önlemek için devre dışı bırakılmalıdır.
  3. En iyi kontrast vermek için minimum ve maksimum barlar taşıyarak ölçekleme istenen yoğunluğunu seçin. Geniş dinamik alan sağlamak için ölçekleme yoğunluk seçilmesi yakalandığında çubuk grafik aracını kullanın.
    Not: öyle ki görüntüleri değil doygun dinamik alanı olduğundan emin olun (Yani doygunluk gösteren beyaz bölgeler görüntünün sınırı), böylece düşük yoğunluklu özellikleri kaçırmayın.
  4. İstenen ölçekleme elde sonra 'Default (yeşil)' listelenen açılan menü düğmesinin üzerinde sağ tıklayın. LUT kaydetme seçeneğini seçin. LUT istediğiniz bir konuma kaydedin.
  5. Birbirlerine veri kümesi içinde video, 'Default (yeşil)' damla aşağı yemek listesi üzerinde sağ tıklayarak aynı LUT uygulamak ve 'Yük LUT' seçin. Bir veri kümesi içindeki tüm videoları ölçeklendirmesinin tutarlı yoğunluğu uygulamak için uygun dosyayı seçin.
  6. İşlenmiş videolar 'film reel' düğmesini tıklatarak dışa aktarın. İstediğiniz video biçimini, örneğin 'amaçlı tanıtım', seçin bir .mpg dosya üretmek. 'Verme' tuşuna basın ve video dosyasını kaydetmek için dosya konumu seçti. Anlık görüntüleri tek kare 'kamera' düğmesini tıklatarak dışa aktarılabilir. Bir .png, .bmp veya .jpg dosya kaydetmek mümkündür. Dosya hedef seçin ve Kaydet tuşuna basın.
    Not: Videoları sonra sunuları veya daha fazla miktar hazırlanması için herhangi bir yazılım içine alınabilir. Etiketli bakteri video yeşil 'yanıp sönen' nokta olarak görüntülenir. Akciğer doku yapısı siyah görünen alveoler boşlukla sipariş edilen floresan lifler, belli olacak.

Representative Results

Bu çalışmada, roman bakteri özel probları ex vivo insan alveoler Akciğer doku modelinde enfeksiyonunun klinik olarak izin verilen bir görev aygıt kullanarak hızlı tarama için bir yöntem göstermiştir.

Bu bölge (nedeniyle yüksek bolluk elastin ve kolajen) doğal olarak bir 488 nm lazer8ile heyecanlı zaman son derece floresan olduğu gibi görev FCFM tarafından distal akciğer içinde yapısal bilgi elde etmek için uygundur. Diğer taraftan, alveoler alanı değil belli ve bu nedenle doku yapısı ve hava sahasına olmak arasında yüksek karşıtlık sağlar (şekil 1) görüntülenir.

Hastalık ilavesi ile ilgili probları veya Kontrast Ajanlar, bakteri özel sondalar gibi gerçek zamanlı olarak elde edilecek hastalığı işlemlerle ilgili fonksiyonel bilgileri etkinleştirmeniz gerekir. Daha önce bir sentez anlatmıştık ve bakteri özel bir kütüphane ilk vitro tarama11probları; Bakteriyel-özgüllük nerede, proteolitik istikrar ve zaman içinde bakteri zarı içinde saklama kararlıydım. Umut verici bir bakteri özel sonda (UBI-10), hem de bir o zavallı saklama bakteriyel hücre zarı (UBI-3) içinde gösterdi çalışma içinde tespit edilmiştir. Bunlar ticari counterstaining (Calcein AM) S. aureusetiketli için kullanılan bir kontrolünü için karşılaştırıldı.

Günahı, Calcein AM, UBI-3 ve UBI-10 S. aureus etiketli süspansiyon FCFM tarafından % 100 488 nm lazer güç ve 12 kare/s (Şekil 2) bir kare hızı ile görüntüsü. PBS etiketlenmemiş bakteri görüntüsü nerede, floresan sinyal yok algılanabilir. Bu otelde etiketli bakteri aksine görüntüsü. Bakteriyel süspansiyonlar UBI-3 veya UBI-10 ile FCFM tarafından görüntüsü nerede, çözümün genel arka plan Floresans PBS tek kontrollere göre yüksek, bunun nedeni NBD (sonda fluorophore) az miktarda yayarlar belli oldu Floresans sinyal sulu çözüm içinde ancak, parlak punctate noktalar açıkça yıkama adım gerek kalmadan çözüm boyunca görülebilir. NDB polar bir ortamda yayılan Floresans sinyal artışı nedeniyle bu Yani, bakteriyel membran. Bakteriyel boyama sonra yıkama adım çözümde ilişkisiz sonda yüksek floresan arka planı kaldırmak için gerekli Calcein AM alınabilen bir soruşturma değil. Etiketli bakteri, Calcein AM ile etiketli bakteri UBI-3 ve UBI-10 gibi çözümde FCFM tarafından parlak yeşil punctate noktalar tespit edildi. Video formatında veri toplanır gibi 'twinkle çekirdeğine ve odak, karakteristik bir özellik bu yöntem tarafından görüntüleme etiketli bakteri girip geçerken için ' Bu noktalar görünür.

Etiketli bakteri daha sonra ex vivo insan Akciğer doku küçük dilimlere eklendi ve tekrar FCFM (şekil 3) tarafından görüntüsü. Sadece PBS veya etiketlenmemiş S. aureus akciğer dokusu ile eklendi nerede, yalnızca Akciğer doku autofluorescent yapısı (kollajen ve elastin parlak yeşil ipliklerini ve alveoler uzayın karanlık bölgeler görülen) tespit edilmiştir. Punctate hiçbir noktalar için bu denetim koşullarda tespit edildi. Benzer şekilde, tek Akciğer doku yapısı (ve hiçbir punctate noktalar) Akciğer doku koşul ve S. aureus plus UBI-3 için görüntülenir; Bu sonda stabil içinde muhafaza edildi değil olduğunu gösteren bakteriyel hücre membran Yani, o yıkandı ve/veya yerel proteolitik enzimler (daha önce gösterdiği11) olarak akciğer dokusu içinde varlığında bozulmuş.

Ancak, parlak punctate noktalar her iki Calcein AM olumlu denetim S. aureus örnek etiketli ve en umut verici bakteri özel soruşturma (UBI-10) S. aureus örnek ile görünür. 'Pırıltı' noktalar güçlü doku autofluorescence rağmen (şekil 3) görünür. Böylece, FCFM tarafından elde edilen sonuçları bakteri özel probları CLSM tarafından panel vitro ön tarama ile tutarlılık vardı ve enfeksiyonlar gerçek zamanlı görüntüleme için bir klinik algılama yöntemi gösterdi.

Burada sunulan sonuçlar akciğer kendi kendine özgü autofluorescence nedeniyle FCFM tarafından görüntüleme için bir uygun organ sistemi olduğunu ispat. Parlak farklı yapıları alveoler uzayda olduğunu belirlemek görev operatör izin. Karanlık alveoler hava kesesi ile birleştiğinde bu bölgeler, yüksek kontrastlı fluorescently etiketli bakteri görüntüleme için mükemmel zemin sunar.

Bu çalışma içinde sunulan bakteri tespiti niteliksel parlak punctate noktalar görselleştirme tarafından belirlenmesine karşın, kare kare daha fazla için ikincil bir yazılım kullanarak karakterize punctate nokta sayısını ölçmek mümkün olabilir sonda kütüphaneleri.

Figure 1
Şekil 1: Statik görüntü insan akciğer dokusu autofluorescence. Confocal lazer endomicroscopy (CLE) görüntü ex vivo insan akciğer dokusunun yünden confocal Floresans mikroskobu (FCFM), 488 nm uyarma, % 100 lazer güç ve 12 kare/s. Elastin ve kolajen kullanarak son derece floresan (sahte yeşil renkli), Oysa alveoler alanı değil ve siyah bölgeleri görüntülenir. Bu rakam Akram ve arkdeğiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Confocal lazer endomicroscopy (CLE) görüntü etiketli S. aureus süspansiyon. Yünden confocal Floresans mikroskobu (FCFM) önceden etiketli bakteri görüntü için kullanılan, 488 nm uyarma, % 100 lazer güç ve 12 kare/s. Labeled bakteri son derece floresan punctate noktalar (yanlış renkli yeşil) gösteriyor. Bu rakam Akram ve arkdeğiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 3
Şekil 3: Confocal lazer endomicroscopy (CLE) görüntü etiketli S. aureusile ex vivo insan akciğer dokusunun. Yünden confocal Floresans mikroskobu (FCFM) görüntü ex vivo insan akciğer dokusu ile kullanılan ve S. aureus, 488 nm uyarma, % 100 lazer güç ve 12 kare/s Labeled bakteri gösteri son derece floresan punctate noktalar (yanlış renkli etiketli Calcein AM veya UBI-10 ile etiketli zaman Akciğer doku örneği içinde yeşil). En yüksek kontrasta nerede bakteri alveoler alanı içinde yansıma görülmektedir. Bu rakam Akram ve arkdeğiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  

Discussion

Alt solunum yolu enfeksiyonları hesap ikinci en yüksek hastalık yükünün küresel12,13ve önemli bir artış içinde atfedilen için antimikrobiyal dirençli bakteri enfeksiyonları bildirilen14numara olmuştur. Pnömoni hastaneye yatış için ortak bir neden kalır. Bakımda, bir zatürree gelişimi tanılama belirsizlik içinde bileşik olduğunu ve bir son derece yüksek mortalite hızı15ile ilişkilidir. Zatürree başlangıcı sırasında distal akciğer, nispeten az microbiota sağlık ile steril bir alan alveoler alan içinde bakteri çoğalırlar.

Bakteri özel optik görüntüleme probları11, ama tasarımı, sentezi, nispeten geç sahne ex vivo doğrulanması bu yöntem açıklanır ve daha önce gösterilen11, bu doğrulama adımı başlamadan önce sonda değerlendirme şarttır .

CLE hastalığı sorguya bir ortaya çıkan klinik tekniği in situ gerçek zamanlı olarak devletler olduğunu. Biyopsi ve lavaj sıvı toplanması içerebilir şüpheli akciğer patoloji soruşturma için geleneksel teknikleri birçok avantaj sunar. Biyopsisi invaziv ve morbidite ve mortalite havalandırılmış hastalarda neden olabilir ve toplanan lavaj sıvı genellikle üst solunum yolları bakteri ile kontamine olduğunu. CLE Detection pnömoni ancak biraz sınırlı uyumlu görüntüleme zavallı durumu nedeniyle hangi hastalığı, birçok uyumlu çabaları10rağmen fonksiyonel bilgi sağlayabilir probları kullanmaktır. CLE optik ajanlar ile birleştirerek daha hızlı pnömoni tanısı olasılığı sunuyor ve daha az invaziv için geçerli standart bir uygulama ile karşılaştırıldığında.

Bu iletişim kuralı için kritik adım numune hazırlama ve görev platformunun kurulumu vardır. İnsan dokusu son klinik uygulamaya yönelik alma da bu çalışma içinde gösterildiği gibi insan akciğer dokusu gibi önemlidir. Doku autofluorescence ölçüde büyük türler arası değişimleri gösterir ve bu nedenle yansıma bakteri-sonda duyarlılığını saptırmak çünkü insan dokusu kullanmak gereklidir. Ayrıca, etik ve insan Akciğer doku kullanımı için elde etmek esastır. Bir teknik temizlik düşük düzey, doğru görüntüleme fiber ek görüntüleme LSU platformu ve Kalibrasyon eşdeğer bakteri sayıda Akciğer doku örnekleri eklendikten sağlanması gibi iyi bir çözünürlük ve tutarlı görüntüleme için esastır. Belgili tanımlık yarar probları panelleri süzmek için bu yöntemin daha da genişletmek için yordamı patojenler, pnömoni sorumlu ajan olma olasılığı olanlar gibi bir dizi yinelenen gereklidir.

Bu tekniğin en büyük sınırlama klinik olarak izin verilen görev aygıt yalnızca bir lazer olmasıdır (488 nm). Bu nedenle, şu anda, fluorophore sonda tasarım yelpazesi klinik olarak onaylanmış tek renk aygıtları uyarma ile yakın kızılötesi ve 660 nm dalga boyu var olmayan bu sistem ile kullanmak için sınırlı olsa da. Bu doku autofluorescence düzeyi üzerinde bakteri-sonda duyarlılığı artırmak için hayalice ayrı bir fluorophore ile geliştirilecek bir sonda etkinleştirmek için aynı aygıt içinde uygulanan ikinci bir lazer çizgi var son derece arzu edilir. Çift renkli görev aygıtları geliştirme aşamasında olan ederken, onlar da değil klinik olarak onaylanır ve/veya maliyet önemli16.

Patojenik bakteri ve ex vivo insan akciğer dokusu ekran potansiyel probları ile kullanarak görev vitro Akış Sitometresi ve CLSM gibi geleneksel vitro teknikleri ve klinik yarar arasında köprü. Bu adım güven ile klinik görev birleştiğinde olabilir ileri taşımak umut verici bileşikler seçerken Imaging sunuyor; ve olup olmadığı test sonda hedef özgüllük, tutar veya herhangi bir hedef kapalı, doku, doğrudan bağlanma gibi etiketleme gösterir veya istikrarsızlık ile ev sahibi proteolitik enzimler gösterir olarak gösterge sağlar. Ayrıca her biri alınabilen probları doğrudan insan Akciğer doku artı tam hızı gerçek zamanlı olarak harekete geçirmek ve sonda bağlama karakterize etmek için bakteri, örnekleri eklemek için uygun olacaktır.

Biz hızla görüntüleme distal akciğer hastalarının içinde potansiyeli değerlendirmek için roman bakteri özel probları süzmek için bizim boru hattı kliniğe çok daha hızlı çeviri neden olur inanıyorum. Bunun nedeni büyük ölçüde bakteriler özel sonda yerel olarak bu microdose anlam bir bronkoskop çalışma kanal eklenen bir kateter akciğerinden içinde teslim (< 100 µg) tutarların teslim edilecektir. Bu nedenle, sistemik teslimat ve biodistribution bahçedeki değil bir endişe birçok diğer enfeksiyon hedeflerin bünyesinde veya nükleer görüntüleme ile olduğu gibi. Ayrıca, görüntüleme sonda içinde küçük bir doz teslim toksisite riskini azaltır ilgili komplikasyonlar (toksisite tarama çeviri için gerekli olacağını rağmen). Sonda korumak, kateter sonra FCFM lif ve görev tarafından biz bu yöntemi içinde gerçekleştirdiyseniz aynı şekilde sorguya akciğer aynı bölgeye göre değiştirilebilir. Görüntüleme sonda uzakta belirlenemeyen konsantrasyonları yıkar önce sonda yüklemesini hızla takip yapılmalıdır.

Bu tarama hastalığı tanımlama unutmamak önemlidir probları bu tekniği ile bakteriyel görüntüleme acentelere sınırlı olmamalı, ama aynı zamanda iltihabı gibi alternatif hedefleri olan probları doğrulama genişletmek olabilir. Bu yaklaşım Ayrıca görüntüleme FCFM üzerinden izin verilen nerede diğer hastalık konumlara bünyesinde adapte olması.

Disclosures

KD: Kurucu Direktörü Edinburgh moleküler görüntüleme. Alınan danışmanlık Mauna Kea Technologies danışman olarak.

MB: Kurucu Direktörü Edinburgh moleküler görüntüleme.

Acknowledgments

Mühendislik ve fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC, Birleşik Krallık) disiplinler arası araştırma işbirliği hibe EP/K03197X/1, Sağlık Bakanlığı ve Wellcome Trust sağlık yenilik sorun Fonu (HICF) aracılığıyla teşekkür etmek istiyorum . Finansman referans numarası: 0510-069.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016).
  2. Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).
  3. Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14, (11), 1123-1135 (2014).
  4. Neumann, H., Kiesslich, R. Yamada's Textbook of Gastroent. John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).
  5. Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80, (6), 928-938 (2014).
  6. Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, (1), 11-18 (2014).
  7. Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50, (8), 711-716 (2014).
  8. Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
  9. Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6, (5), 444-449 (2009).
  10. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4, (3), 163-174 (2016).
  11. Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6, (12), 6971-6979 (2015).
  12. Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2, (3), 238-246 (2014).
  13. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, (9859), 2095-2128 (2012).
  14. Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2, (1), 6 (2013).
  15. Chastre, J., Fagon, J. -Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165, (7), 867-903 (2002).
  16. Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21, (4), 046009-046009 (2016).
Roman bakteri özel optik tarama <em>Ex Vivo</em> insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).More

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter