Summary
Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.
Abstract
Zahlreiche Techniken wurden entwickelt, um den Fortschritt der DNA-Replikation durch die S-Phase des Zellzyklus folgen. Die meisten dieser Techniken sind in Richtung Aufklärung des Standortes und der Zeitpunkt der Einleitung des Genoms Vervielfältigung, anstatt seine Vollendung verwiesen worden. Es ist jedoch wichtig, dass wir Regionen des Genoms, die letzten Replikation abgeschlossen sind verstehen, weil diese Regionen erhöhten chromosomalen Bruch und Mutation leiden, und sie im Zusammenhang mit Krankheit und Alterung wurden. Hier beschreiben wir, wie wir eine Technik, die verwendet wurde, um die Replikation Einleitung um stattdessen diesen Regionen des Genoms letzte vollständige Replikation identifizieren überwachen ausgedehnt haben. Dieser Ansatz basiert auf einer Kombination der Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Anwendung dieser Technik auf Hefe, kann der Ansatz mit beliebigen Zellen verwendet werden, die in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt sortiert werden können.
Introduction
Eukaryotische Genom Replikation wird eingeleitet, an mehreren diskreten Standorten, genannt Ursprünge der Replikation, von welchen Replikation Gabeln in beide Richtungen (rezensiert in Fragkos Et Al., 20151) gehen. Ursprünge variieren in ihren Zeitplan und die Effizienz der Zündung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Replikation Herkunft Aktivitäten überwachen und die Ursachen dieser Unterschiede zu erhellen. Die Aktivität der einzelnen Ursprünge kann aus einsträngiger DNA2, welche Formulare rund um aktive Ursprung abgeleitet werden oder mithilfe von 2D Gelelektrophorese, um spezielle Replikations Zwischenprodukte3zu überwachen, können beide mit erkannt werden radioaktiven Sonden. Beide Techniken sind leichter in S. Cerevisiae als in Säugerzellen, angewendet, da Ursprünge auf bestimmten bekannten Sequenzen in der ehemaligen beschränkt sind. Mit dem Aufkommen von Microarrays wurde es möglich, die Herkunft weltweit brennen zu beurteilen. Dies geschah zunächst durch Kennzeichnung DNA mit schweren Isotopen, Freisetzung von Zellen aus einem G1 in mittlerer mit leichten Isotope und dann die Bildung von schwer-leicht-Hybrid DNA in das Genom4Überwachung. Die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung erlaubt ähnliche genomweite Überwachung der Herkunft Aktivität ohne das Erfordernis einer teuren Isotopen Kennzeichnung. Zellen wurden in einem Durchflusszytometer laut DNA-Gehalt und ihre DNA ausgesetzt Tiefe Sequenzierung sortiert. Da Sequenz Abdeckung von 1 X bis 2 X im Laufe der S-Phase verläuft, kann relative Replikation Timing durch Vergleich lesen Sie Tiefen der Zellen in der S-Phase, die in G1 oder G25,6bewertet werden. Diese Techniken, vor allem Hefe, führte zu einem tieferen Verständnis der wie DNA-Sequenz, Chromatinstruktur und DNA-Replikation Proteine Herkunft Timing und Effizienz regulieren.
Treue Übertragung der genetischen Information während der Zellproliferation erfordert nicht nur erfolgreiche Initiation der DNA-Replikation, die stattfindet am Ursprung, sondern auch erfolgreichen Abschluss der Replikation, die auftritt, wo Replikations-Gabeln treffen. Wie die Initiation der Replikation variiert der Zeitpunkt der Fertigstellung der Replikation des Genoms mit bestimmten Regionen bleiben bis spät in den Zellzyklus Langzeittransaktionen. Solche Regionen enthalten Sequenzen oder Chromatin Strukturen, die DNA-Polymerasen behindern oder möglicherweise besonders aktive Replikation Ursprünge fern. Spät repliziert Regionen kann als fragile Sites, manifestieren sich die chromosomalen Bruch und höhere Mutationsraten zugeordnet sind, und haben bei Krebs und Altern7,8,9in Verbindung gebracht. Allerdings hat unser Verständnis von wo und wie dies geschieht trotz der Bedeutung der ordnungsgemäßen Abschluss der DNA-Replikation in der Instandhaltung der Genomstabilität weit hinter der Initiation der Replikation hinterher. Und während einzelner Gene, deren späte Replikation mit Krankheit assoziiert wurde, mit z. B. qPCR10, globale Studien zur Aufklärung der Standorte und die zugrunde liegenden Ursachen der letzten Replikation gefehlt untersucht worden. Hier beschreiben wir eine Technik, die wir uns beziehen, um als "G2 Seq" Wir Durchflusszytometrie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung verbinden Aufschluss über die Vollendung des Genoms Replikation in Hefe-11. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auf alle Zellen angepasst werden, die Strömung nach DNA-Gehalt sortiert werden können.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen für Flow Cytometry sortieren
- 15 mL Reagenzgläsern, 8 mL YEPD Brühe enthält, so dass die Kulturen eine Dichte von 5 x 106 bis 1,5 x 107 Zellen pro mL nach Übernachtung Wachstum erreichen zu impfen (siehe Diskussion Hinweis 1).
- Spin-down Hefezellen (1.400 x g, bei Raumtemperatur oder 4 ° C) in eine Schraubkappe Zentrifugenröhrchen 15 mL für 5 min, Zellen in 1,5 mL 70 % igem Ethanol und Transfer nach einem 1,6 mL Microfuge Rohr, lassen diese Sit für 1 h bei Raumtemperatur oder mindestens 3 h auf Eis (Aufschwemmen können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C) (siehe Diskussionspunkt (2)).
- Spin-down Hefezellen in die Microfuge (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, Spin-down (14.000 x g, 4 ° C) für 1 min aufzuwirbeln, Aspirieren überstand, Aufschwemmen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2 , mit 0,25 mg/mL RNAse-Lösung für 1 h bei 50 ° C oder über Nacht bei 37 ° C in Hitze Block oder Wasserbad.
- Fügen Sie 50 µL Proteinase K-Lösung (20 mg/mL Nukleinsäuretablette in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % Gewicht, Volumen Glycerin) und 1 h bei 50 ° c inkubieren
- Spin-down Zellen (14.000 x g, 4 ° C), Aufschwemmen Zellen in 1 mL 50 mM Natriumcitrat, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C), überstand mit Vakuum anzusaugen, Aufschwemmen in 1 mL 1 µM grün Nukleinsäure-Stamm Nukleinsäuretablette in 50 mM Natriumcitrat , pH 7,2 und in der Dunkelheit für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, beschallen 2 X für 2 s (Ausgangsleistung 2 Watt).
(2) Zellsortierung
- Mit einer Zelle Sorter, sortieren Zellen nach DNA-Gehalt in Phasen G1, S, "frühen G2" und "späten G2", sammeln von mindestens 1,6 Millionen haploiden Zellen von jedem Zellzyklus-Phase wie in Abbildung 1 (siehe Diskussionspunkt (3)).
- Zellen auf Microfuge Röhren übertragen und spin-down Zellen für 20 min bei 14.000 x g bei 4 ° C in der Microfuge und aspirieren überstand mit Vakuum (das Pellet kann bei-20 ° C eingefroren auf unbestimmte Zeit gespeichert werden, siehe Diskussion Punkt (4)).
3. DNA-Extraktion und die Vorbereitung der Sequenzierung Bibliotheken
Hinweis: Die folgenden Schritte basieren auf "Protokoll I" in der Hefe Genomic DNA Extraktion Kit (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 120 µL "Verdauung Puffer," eine proprietäre Puffer, der Hefe lytische Enzyme verdauen die Zellwand und 5 µL Hefe lytische Enzym, Aufschwemmen durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 40-60 min ermöglicht.
- Fügen Sie 120 µL "Lysis Buffer," eine proprietäre Puffer, Waschmittel und hart für 10-20 s Wirbel enthält.
- Fügen Sie 250 µL Chloroform - mischen für 1 min.
- Mit Höchstgeschwindigkeit in einem Microfuge für 2 min drehen.
- Laden Sie den Überstand auf der DNA-Bindung Spalte und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge für 1 min.
- Fügen Sie 300 µL "DNA waschen Puffer", ein proprietäres Puffer, Ethanol und Zentrifuge für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in eine Microfuge enthält. Verwerfen der Durchströmung, 300 µL Waschpuffer DNA hinzufügen und wiederholen Sie den Waschvorgang zu.
- Die Spin-Spalte auf ein frisches Microfuge Rohr übertragen, fügen 60 µL Wasser (nicht TE) - 1-3 min warten und dann Zentrifugieren für 10 s, um die DNA zu eluieren.
- Konzentration durch Zugabe von 5 µL DNA zu 195 µL DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Reagenz, das verdünnt 1: 200 in DsDNA-hohe Empfindlichkeit-Puffer und dann Fluoreszenz-Maßnahme in einem Fluorometer, mit 10 µL der mitgelieferten Standards für die Kalibrierung wurde zu messen; zwischen 10 und 50 ng der DNA Gesamtausbeute erwarten.
- Beschallen (Peak Vorfall macht 450, Einschaltdauer 30 % Zyklen pro Burst 200, Behandlung Zeit 60 s, Wasserstand 6) DNA in 250-350 bp Fragmente aufzubrechen.
- Bereiten Sie eine Bibliothek mit DNA-Probe Vorbereitungssatz und es (mindestens 10 Millionen 50 bp Einend-gelesen) auf die DNA-Sequenzierung Instrument im Schnellmodus-Sequenz (vgl. Diskussion (5)).
4. Analyse der Daten und Erstellung von Replikation Sequenzierung Profile
- Ausrichten von Saccharomyces Cerevisiae sacCer3 Genom mit Gsnap12 -Sequenzen (siehe Diskussionspapier (6)).
- Bestimmen Sie, dass pro Basenpaar tiefen mit Bedtools "GenomeCoverageBed" Software13lesen.
- Artifizielle Spikes in Lesen Sie tiefen zu entfernen, falls vorhanden (siehe Diskussionspapier (7)).
- Glatten Tiefen von Chromosom mit Mittelstreifen in eine 20 kb Schiebefenster mit "RunMean" Funktion in R Paket "CaTools" gelesen (siehe Diskussionspapier (8)).
- Plot gelesen tiefen in S Phase Anfang G2 und späten G2 als prozentualer Anteil vollständig replizierten lesen Sie tiefen (siehe Diskussionspapier (9)).
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Representative Results
Wir haben wie oben beschrieben vor spät replizierenden Standorte in der angehenden Hefe verwendet. Tests dieser Ansatz mit einer bekannten späten replizierende Region auf ein künstliches Chromosom erwies sich die Technik präzise und zuverlässig sein. Unsere Ergebnisse haben auch gezeigt, die biologische Bedeutung der rechtzeitigen Abschluss der Replikation zeigen, dass eine spätere replizierende Region auf Chromosom 7, die wir identifiziert als späte Replikation auf der Grundlage unserer G2-Seq-Ergebnisse, verloren war ca. um das Dreifache steuern Sie immer häufiger als eine vergleichbare Region11.
Ein konkretes Beispiel von Ergebnissen mit G2-Seq ist in Abbildung 2dargestellt. Wir hatten das es theoretisiert Regionen des Genoms, die besonders spät in Zellen repliziert eine Protein-Deacetylase namens Sir2 fehlen würde. Abbildung 2A zeigt den Verlauf der Datenanalyse für Wildtyp (blau) und sir2 (rot). Die Rohdaten (oberen Reihen) enthalten große Spitzen, von denen meisten auf das Vorhandensein von Ty Elemente zurückzuführen sind. Diese Spitzen werden entfernt, durch die Begrenzung erfahren Sie Tiefe 2,5 x der Median Tiefe für jede Probe (mittleren Reihen) zu lesen. Die despiked Daten werden dann mit einem 20 kb-Schiebefenster (untere Zeile) geglättet. Zu guter Letzt sind Daten normalisiert und als Verhältnisse zu den Ebenen in G1 geplottet. In Abbildung 2wird eine typische spät repliziert Region, die in der sir2 -Mutante erscheint hervorgehoben.
Abbildung 1. Flow Cytometry Profil Zellzyklus Brüche verwendet; äußere Begrenzungen auf alle Tore markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. (A-B) Fortschreiten der Datenverarbeitung aus Rohdaten (oberen Zeilen), despiked Daten (mittleren Reihen) und Daten (unteren Reihen) für Wildtyp (A) und sir2 (B) geglättet. (C) Verhältnisse S Phase - G2 früh-und spät G2-G1 lesen tiefen. Wildtyp in blau und sir2 in rot. Der markierte Bereich in der oberen rechten Ecke zeigt eine spätere replizierende Region spezifische sir2 Mutant. Skala zeigt Bruchteil der kompletten (2N) Replikation; eine vollständig Langzeittransaktionen Zelle scheint bei 0,5, eine vollständig replizierten Zelle am 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Während diese Technik robust ist und relativ geradlinig, besondere Aufmerksamkeit werden, an folgende gewidmet sollte:
(1) Wir empfehlen, mindestens 12 h Kulturen wachsen, bevor sie Log-Phase erreichen, da Unterschiede im Zellzyklus Distributionen zu manifestieren, wenn Kulturen geerntet werden, nach dem Erreichen der gewünschten Dichte nur 4 h nach der Inokulation. Unsere Annahme ist, dass eine Zellzyklus-Distribution, die ein relativ stabiles Gleichgewicht erreicht hat besser als eine Verteilung eine "echte" Log-Phasenverteilung darstellt, die noch im Fluss ist, wenn eine gesättigte Kultur vor kurzem auf frisches Medium übertragen worden ist.
(2) anstelle der Spinnerei die Zellen vor der Befestigung, können Zellen auch durch 100 % Ethanol direkt die Hefekultur hinzufügen, so dass die Endkonzentration von Ethanol 70 % behoben werden. Zellen können in entweder synthetisch oder reich (YEPD) angebaut werden.
(3) Zellzyklus Phasen sind für die Sortierung nach Plotten Anzahl von Zellen in Abhängigkeit von 530 nm Emission Bereich visualisiert. Wir haben festgestellt, dass die Wendepunkte zwischen G1 und S und S und G2 als robuste Wahrzeichen dienen für die Abgrenzung der S-Phase, und wir die G2 maximal als Grenze nutzen, um frühe und späte G2 zu trennen. Wir verwenden die Begriffe "frühen G2" und "späten G2" für Klarheit und Kürze, vielleicht auf Kosten der Genauigkeit in dem Sinne, dass Zellen technisch in S-Phase bis sie DNA-Replikation abgeschlossen haben. Obwohl die G2-Seq soll sehr späten replizieren Websites zu identifizieren, die voraussichtlich in der späten G2-Fraktion enthüllt werden, sammeln wir S-Phase und frühen G2-Zellen, die Replikation durch alle Phasen des Zellzyklus folgen.
(4) Es ist von entscheidender Bedeutung, dass Zellen sich umgehend nach der Sortierung gesponnen werden. Lassen Sie sich nicht über Nacht vor dem Spinnen sie unten sitzen Zellen. Wir hatten Probleme Zellen durch Zentrifugation erholt, wenn sie bei 4 ° C gelagert wurden, was darauf hindeutet, dass sie beim Sortieren brüchig und mit der Zeit lösen.
(5) so wenig wie 5 Millionen liest ist ausreichend, aber Grundstücke werden Sie weniger glatt mit einer geringeren Anzahl von Mal gelesen. Datensätze mit noch weniger Lesevorgänge können möglicherweise durch Glättung mit Windows größer als 20 kb untergebracht werden, aber wir haben nicht dieses versucht.
(6) jede verbreitete Alignment-Software (z.B., Fliege14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15oder Gsnap12) funktioniert.
(7) Hochdurchsatz Sequenzierungsdaten von Hefe zeigen gelegentliche Spitzen lesen Sie tiefen, die oft Ty Elemente widerspiegeln. Wir beseitigen diese mit der Substitution von 2,5 x mittlere Probe lesen tiefen für lesen Sie tiefen außerhalb der Regionen bekannt, sich wiederholende Abschnitte (z.B. der rDNA) enthalten, die größer als 2,5 X Median. Der rDNA und die Enden der Chromosomen sind ausgeschlossen, weil sie dafür bekannt sind, sich wiederholende Elemente enthalten. Ein Beispiel für diese "despiking" mit der R-Sprache ist die folgende:
# erstellen ein Datenrahmens genannt "liest", die Daten enthalten:
Chr <-Rep ("ChrI", 10)
POS <-Seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
liest <-data.frame ("Chromosom" = chr,
"Standpunkt" = pos,
"Read_depth" = rd)
# "despike" lesen Sie tiefen:
Mal gelesen [, 'despiked'] <-Ifelse (liest [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
Reads[,3])
"Begrenzung" oder "despiking" kann auch durch erreicht werden liest, die mehreren Orten zugeordnet, aber dies verhindert liest, die, zum Beispiel, nur zwei Standorten zugeordnet. Instanzen der Lesevorgänge, die mehr als einen Ort zuordnen, aber noch liefern wertvolle Informationen, sind keine Seltenheit bei der Arbeit mit S. Cerevisiae, deren Genom aus einer uralten Vervielfältigung16geführt.
(8) Wir haben vergleichbare Ergebnisse mit der Funktion "Rollmedian" in das R-Paket "Zoo" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) und die "Runmean" Funktion in das R-Paket "CaTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) Wir haben experimentiert mit zahlreichen Methoden lesen Sie tiefen zu normalisieren, die vergleichbare Ergebnisse gab. Unsere favorisierte Ansatz basiert auf der Annahme, dass zumindest einige Regionen des Genoms voll in unsere S-Phase-Stichprobe repliziert werden. Wir entschlossen die lesen Sie Tiefe, die vollständige Replikation dargestellt, wie der Median Tiefe in unserem Datensatz an Standorten, die frühesten feuern hohes Vertrauen 12 entspricht lesen ("Vertrauensergebnis" > = 7) Ursprünge in einem öffentlich zugänglichen Datenbestand. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & Table = Raghu2001_ori & Ext_format = & format = Tab). Für die meisten Anwendungen der Ansatz für die Normalisierung ist nicht entscheidend und es gibt viele vernünftige Optionen, die meisten einfach nur normalisieren Graf Summen zu lesen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass wenn es große Unterschiede in der Anzahl von sich wiederholenden Sequenzen zwischen Proben gibt, Normalisierung, Graf Summen zu lesen irreführend sein kann. Beispielsweise kann beim Vergleich von zwei Stämme deren rDNA Arrays unterscheiden sich durch mehrere Falten Normalisierung zu lesen zählt insgesamt stellen Sie sicher, Regionen des Genoms des Stammes mit dem größeren rDNA Array artefactually erscheinen, später als die Belastung mit dem kleineren zu replizieren Array.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellt G2-Seq eine logische Erweiterung der bestehenden Techniken für die Replikation zu profilieren. Wie andere Sequenzierung und Microarray-basierte Techniken hat G2-Seq Vorteile gegenüber 2D Analyse des Genoms breite Abdeckung und das Fehlen von Erfordernis der Kenntnis der Lage der Replikation Ursprünge gel. Letzteres ist besonders relevant in Säugetierzellen wo anders als in angehende Hefe, Replikation Ursprung nicht auf spezifische Sequenzen beschränkt sind. Auf der anderen Seite bieten 2D Gele eine Auflösung von molekularen Zwischenprodukte bei der DNA-Replikation völlig unerreichbar durch G2-FF Extending G2-Seq auf andere Organismen, deren Zellen nach DNA-Gehalt sortiert werden können, relativ geradlinig sein sollten, Allerdings macht die stark repetitive Natur der Genome von höheren Eukaryoten Ausrichtung der kurzen lesen Sie Sequenzen viel anspruchsvoller. Neue Technologien der Sequenzierung, die deutlich mehr zu bieten, lesen Sie Länge in dieser Hinsicht nützlich sein kann, zumal G2-Seq zu höheren Fehlerquoten relativ robust sein sollte, die länger liest17zugeordnet werden können. Nach unserer Erfahrung ist das technische Problem, das am ehesten zu Problemen führen lassen Zellen sitzen, nachdem sie geklärt haben und vor der Isolierung der DNA. Diese Zellen scheinen besonders zerbrechlich sein und mit der Zeit lösen und DNA isoliert werden sollten innerhalb von höchstens einer Stunde oder zwei zu sortieren. Viel versprechende zukünftige Richtungen für diese Technik sind Teilung S und G2-Phasen in immer mehr Fraktionen höheren Auflösung der Dynamik des Genoms Replikation von frühzeitige Einleitung, verspätete Fertigstellung zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschuss NIH GM117446 an A.B
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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