Summary
Vi beskriver en teknikk for å kombinere flowcytometri og høy gjennomstrømning sekvensering å identifisere sent etterligner områder i genomet.
Abstract
Mange teknikker er utviklet for å følge utviklingen av utryddelse S fasen av cellen syklus. De fleste av disse teknikkene har vært rettet mot utviklingen av plasseringen og tidsberegningen for initiering av genomet duplisering i stedet for fullføring. Imidlertid er det avgjørende at vi forstår områder av genomet som er sist å fullføre replikering, fordi disse områdene lide forhøyede nivåer av chromosomal brudd og mutasjon, og de har blitt assosiert med både sykdom og aldring. Her beskriver vi hvordan vi har utvidet en teknikk som er brukt til å overvåke replikering innvielsen å i stedet identifisere disse regionene i genomet sist komplett replikasjon. Denne tilnærmingen er basert på en kombinasjon av flowcytometri og høy gjennomstrømning sekvensering. Selv om denne rapporten fokuserer på bruk av denne teknikken til gjær, kan tilnærming brukes med alle celler som kan sorteres i en flyt cytometer etter DNA innhold.
Introduction
Eukaryote genomet replikering startes på flere separate områder, kalt opprinnelsen til replikering fra hvilke replikering gafler fortsette i begge retninger (omtalt i Fragkos et al., 20151). Opprinnelse varierer i både timing og effektiviteten av skyte, og flere teknikker er utviklet for å overvåke replikering opprinnelse aktivitet og belyse årsakene til denne varianten. Aktiviteten til individuelle opprinnelse kan være avledet fra nivåer av enkelt-strandet DNA2, hvilke skjemaer rundt aktive opprinnelse, eller ved hjelp av 2D gel geleelektroforese overvåke bestemte replikering mellomprodukter3, begge kan oppdages med radioaktivt sonder. Begge disse teknikkene brukes lettere i S. cerevisiae enn i pattedyrceller, fordi opprinnelse er begrenset til bestemte kjente sekvenser i det tidligere. Med ankomsten av microarrays ble det mulig å vurdere opprinnelse avfyring globalt. Dette ble først gjort av merking DNA med tunge isotoper ut celler fra en G1 blokk i middels inneholder lys isotoper og deretter overvåking dannelsen av tunge lys hybrid DNA over genomet4. Innføring av høy gjennomstrømning sekvensering tillatt lignende genomet hele overvåking av opprinnelse aktivitet uten krav til dyre isotopanrikning merking. Celler er sortert i en flyt cytometer etter DNA innhold og DNA utsatt for dyp sekvensering. Fordi sekvens dekning provenyet fra 1 x 2 x i løpet av S fase, kan relativ replikering timing vurderes ved å sammenligne Les dypet av celler i S fasen de i G1 eller G25,6. Disse teknikkene, spesielt på gjær, førte til en dypere forståelse av hvordan DNA sekvens, chromatin struktur og DNA replikering proteiner regulere opprinnelse timing og effektivitet.
Trofaste overføring av genetisk informasjon under cellular spredning krever ikke bare vellykket oppstart av utryddelse, som finner sted på opprinnelse, men også vellykket gjennomføring av replikering, som oppstår der replikering gafler møtes. Som Innvielse av replikering varierer tidspunktet for ferdigstillelse av replikering over genomet med visse regioner gjenværende unreplicated selv sent i cellen syklus. Slike områder kan være spesielt fjernt fra aktive replikering opprinnelse eller inneholder sekvenser eller chromatin strukturer som hindrer DNA polymerases. Sent replikere regioner kan manifestere seg som sårbare områder som er tilknyttet chromosomal brudd og høyere mutasjon priser, og har vært innblandet i kreft og aldring7,8,9. Men til tross for betydningen av riktig gjennomføring av utryddelse i vedlikehold av genomet stabilitet, har vår forståelse av hvor og hvordan dette skjer ligget langt bak av replikering innvielse. Og mens enkelte gener som sent replikering har vært forbundet med sykdommen har vært undersøkt med, for eksempel qPCR10, globale studier rettet mot Klargjørende plasseringene og underliggende årsaker sen replikering har manglet. Her beskriver vi en teknikk vi se som "G2 seq" der vi kombinerer flowcytometri med høy gjennomstrømning sekvensering å belyse ferdigstillelse av genomet replikasjon i gjær11. Med mindre endringer, kan denne protokollen tilpasses celler som kan flyt-sortert etter DNA innhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av celler for Flow cytometri sortering
- Vaksinere 15 mL test-rør som inneholder 8 mL hver av YEPD kjøttkraft slik at kulturer nå en tetthet 5 x 106 til 1,5 x 107 celler per mL etter overnatting vekst (se diskusjon note 1).
- Nedspinning gjærceller (1400 x g i romtemperatur eller 4 ° C) i en 15 mL skrukork sentrifuge rør i 5 min, resuspend celler i 1,5 mL 70% etanol, og overføre til en 1.6 mL microfuge tube, la dette sitte i 1 time i rom temperatur eller minst 3 h på isen ( kan lagres på ubestemt tid på 4 ° C) (se diskusjon poeng (2)).
- Nedspinning gjærceller i microfuge (14.000 x g, 4 ° C) for 1 min, resuspend i 1 mL 50 mM natriumsitrat, pH 7.2, rotere ned (14.000 x g, 4 ° C) for 1 min, Sug opp nedbryting, resuspend i 1 mL 50 mM natriumsitrat, pH 7.2 , som inneholder 0,25 mg/mL RNAse løsning for 1t 50 ° C eller over natten på 37 ° C i varme blokk eller vann bad.
- Legge til 50 µL proteinasen K løsning (20 mg/mL resuspended i 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% vekt til volum glyserol) og Inkuber 1t på 50 ° C.
- Nedspinning celler (14.000 x g, 4 ° C), resuspend celler i 1 mL 50 mM natriumsitrat, pH 7.2, spinne ned (14.000 x g, 4 ° C), Sug opp nedbryting med vakuum, resuspend i 1 mL 1 µM grønne nukleinsyre belastning resuspended i 50 mM natriumsitrat , pH 7.2 ruge i mørket 1t ved romtemperatur og sonicate 2 x 2 s hver (utgangseffekt 2 watt).
2. celle sortering
- Bruker celle sortering, sortere cellene etter DNA innhold i faser G1, S, "tidlig G2" og "sent G2", samle minst 1,6 millioner haploid celler fra hver celle syklus fase som figur 1 (se diskusjon punkt (3)).
- Overføre celler til microfuge rør og Nedspinning celler for 20 min 14.000 x g på 4 ° C i microfuge og Sug opp nedbryting med vakuum (pellet kan lagres frosset ved 20 ° C på ubestemt tid, se diskusjon peker (4)).
3. DNA utvinning og utarbeidelse av sekvensering biblioteker
Merk: Følgende er basert på "protokollen jeg" i gjær Genomic DNA utvinning Kit (se Tabell for materiale).
- Legge til 120 µL av "Fordøyelsen Buffer," en proprietær buffer som lar gjær lytisk enzym fordøye cellen vegg og 5 µL av gjær lytisk enzym, resuspend av vortexing og ruge på 37 ° C i 40-60 minutter.
- Legge til 120 µL av "Lyseringsbuffer," en proprietær buffer som inneholder vaskemiddel og vortex vanskelig for 10-20 s.
- Legg til 250 µL kloroform - bland godt for 1 min.
- Spinn for topphastigheten i en microfuge i 2 minutter.
- Last nedbryting på DNA bindende kolonne og sentrifuge med maksimal hastighet i en microfuge for 1 min.
- Legge til 300 µL av "DNA vaske bufferen," en proprietær buffer som inneholder etanol og sentrifuge for 1 min for topphastigheten i en microfuge. Forkaste flyten gjennom, legger 300 µL av DNA vaskebuffer og gjenta prosessen vask.
- Overføre kolonnen spin til en frisk microfuge rør, legge til 60 µL av vann (ikke TE) - vent 1-3 min og deretter virvel for 10 å elute DNA.
- Måle konsentrasjon ved å legge til 5 µL av DNA 195 µL av dsDNA høy følsomhet reagensen som er utvannet 1:200 dsDNA høy følsomhet buffer og deretter måle fluorescens i en fluorometer, bruker 10 µL av følger standarder for kalibrering; Forvent mellom 10 og 50 ng av DNA totale avkastning.
- Sonicate (Peak hendelsen makt 450, plikt faktor 30%, sykluser per briste 200, behandling tid 60 s, vann 6) å bryte opp DNA i 250-350 bp fragmenter.
- Forberede et bibliotek med DNA prøve forberedelse kit og sekvens det (minst 10 millioner 50 bp single-end leser) på DNA sekvensering apparatet i rask modus (se diskusjon merknad (5)).
4. analyse av sekvensering Data og generasjon av replikering profiler
- Justere sekvenser til Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genomet bruker Gsnap12 (se diskusjon merknad (6)).
- Fastslå per-base par lese dypet benytter Bedtools' "genomeCoverageBed" programvare13.
- Fjerne artefactual toppene i Les dybder, hvis det finnes (se diskusjon merknad (7)).
- Glatt lest dypet av kromosom bruk medians i en 20 kb skyve vinduet funksjonen "runMean" i R pakke "caTools" (se diskusjon note (8)).
- Handlingen lese dypet S fase, tidlig G2 og sent G2 som en prosentandel av helt replikerte Les dybder (se diskusjon merknad (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brukt prosedyren beskrevet ovenfor for å identifisere sent etterligner områder i spirende gjær. Tester denne tilnærmingen bruker en kjent sent etterligner region på en kunstig kromosom viste teknikken for å være nøyaktig og pålitelig. Våre resultater har også vist biologiske betydningen av tidsriktig ferdigstillelse replikasjon ved å vise at en sen etterligner region på kromosom 7 som vi identifisert som sent replikere på grunnlag av våre G2-seq resultater, var tapt ca tre-fold oftere enn en sammenlignbar kontroll regionen11.
Et konkret eksempel på resultater med G2-seq er vist i figur 2. Vi hadde hypotesen at det ville være områder i genomet som replikert spesielt sent i celler mangler en protein deacetylase kalt Sir2. Figur 2A viser utviklingen av dataanalyse for wild type (blå) og sir2 (rød). Rådataene (øvre rader) inneholder store toppene, de fleste som forfaller til tilstedeværelsen av Ty elementer. Disse spissene er fjernet av capping Les dybder på 2,5 ganger medianen lese dybde for hvert utvalg (midten rader). Despiked dataene utjevnes så med en 20 kb skyvevinduet (nederste rad). Til slutt er dataene normalisert og plottet som prosenter nivåer i G1. En typisk sent-replikere region som vises i sir2 mutant utheves i figur 2C.
Figur 1. Flow cytometri profil som angir cellen syklus fraksjoner brukes; yttergrensene til alle portene merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. (A-B) Utviklingen av databehandling fra rådata (topp rader), despiked data (midten rader) og glattet data (bunnen rader) for wild type (A) og sir2 (B). (C) prosenter av S fase, tidlig G2 og sent G2-G1 lese dybder. Wild type i blått og sir2 i rødt. Det uthevede området øverst til høyre viser en sen etterligner region bestemte sir2 mutant. Skalaen angir brøkdel av komplett (2N) replikering; en fullstendig unreplicated celle vises 0,5, en helt replikerte celle på 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens denne teknikken er robust og relativt rett frem, spesiell oppmerksomhet bør gis til følgende:
(1) vi anbefaler at kulturer vokser minst 12 h før de når loggen fase, siden forskjeller manifestere i cellen syklus distribusjoner hvis kulturer høstes etter å ha nådd ønsket tetthet bare 4 h etter vaksinering. Vår antakelse er at en celle syklus distribusjon som har nådd en relativt stabil likevekt bedre representerer en "ekte" Logg fase distribusjon enn en distribusjon som er fortsatt i fluks når en mettet kultur er overført mer nylig til frisk medium.
(2) i stedet for spinning ned cellene før Utbedring, kan celler også løses ved direkte å legge 100% etanol til gjær kulturen slik at den endelige konsentrasjonen av etanol er 70%. Cellene kan dyrkes i syntetisk eller rik (YEPD)-medium.
(3) cellen syklus faser er visualisert for sortering av inntegningsrekkefølgen celle nummer som en funksjon av 530 nm utslipp området. Vi har funnet at Bøyning poeng mellom G1 og S og mellom S og G2 fungerer som robust landemerker for skildre S fase, og vi bruker G2 maksimal som grense for å skille tidlig og sent G2. Vi bruker begrepene "tidlig G2" og "sent G2" for klarhet og kortfattethet, kanskje på bekostning av nøyaktigheten i den forstand at cellene er teknisk i S fasen før de har fullført utryddelse. Selv om målet med G2-seq er å identifisere veldig sent replikere nettsteder, som er ventet å bli avslørt i slutten G2 fraksjonen, samle vi S fase og tidlig G2 celler å følge replikering gjennom alle fasene av cellen syklus.
(4) det er kritisk viktig at cellene være spunnet ned umiddelbart etter sortering. Ikke la celler sitte over natten før spinne dem ned. Vi har hatt problemer med gjenopprette celler med sentrifugering hvis de er lagret på 4 ° C, antyder at de blir skjøre ved sortering og lyse med tid.
(5) så lite som 5 millioner leser er tilstrekkelig, men tomter blitt mindre glatt med lavere antall leseoperasjoner. Datasett med enda færre leser kunne innpasses ved utjevning med windows større enn 20 kb, men vi har ikke prøvd dette.
(6) brukte justering programvare (f.eks, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15eller Gsnap12) fungerer.
(7) høy gjennomstrømning sekvensering data fra gjær viser sporadiske pigger i Les dybder, som gjenspeiler ofte Ty elementer. Vi eliminere dette ved å erstatte 2.5 x median prøve lese dybder for Les dybder utenfor områder kjent for å inneholde repeterende strekninger (f.eks, rDNA) som er større enn 2,5 x median. RDNA og endene av kromosomer utelates fordi de er kjent for å inneholde repeterende elementer. Et eksempel på denne "despiking" ved hjelp av R-språk er følgende:
# opprette en data ramme kalt "leser" som inneholder data:
Chr <-rep ('chrI', 10)
POS <-seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
leser <-data.frame ('kromosom' = chr,
"stilling" = pos,
'read_depth' = es)
# "despike" Les dypet:
leser [, 'despiked'] <-ifelse (leser [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
"Capping" eller "despiking" kan også oppnås ved unntatt lyder som tilordnes til mer enn ett sted, men dette vil eliminere lyder som tilordnes til, for eksempel to steder. Forekomster av lyder som tilordnes mer enn ett sted, men fortsatt gi verdifull informasjon, er ikke uvanlig når du arbeider med S. cerevisiae, som genomet skyldes en nedarvet duplisering16.
(8) vi har fått sammenlignbare resultater med både funksjonen "rollmedian" i R pakken "zoo" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) og "runmean"-funksjonen i R-pakke "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) vi har eksperimentert med mange metoder for å normalisere Les dybder, som ga sammenlignbare resultater. Vår favoritt adgang er basert på antagelsen om at minst noen regioner i genomet er fullt replikert i eksempel våre S-fase. Vi bestemt Les dybden som representerte fullstendig replikering som medianen lese dybde i våre datasett på steder tilsvarer 12 første skyte høy visshet ("tillit" score > = 7) opprinnelse i et offentlig tilgjengelig datasett. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & tabell = Raghu2001_ori & ext_format = & format = kategorien). De fleste programmer tilnærming tatt for normalisering er ikke kritisk og det er mange rimelige alternativer, mest bare normalisering for å lese teller totaler. Det er imidlertid verdt å merke seg at hvis det er store forskjeller i antall gjentatte sekvenser mellom prøvene, normalisering lese teller totalsummer kan være villedende. For eksempel når du sammenligner to stammer som rDNA matriser skiller seg gjennom flere ganger, kan normalisere til totalt lese teller gjøre visse regioner i genomet av belastningen med større rDNA array artefactually synes å gjenskape senest belastningen med den minste matrise.
I sammendraget representerer G2-seq en logisk forlengelse av eksisterende teknikker for replikering profilering. Som andre sekvensering og microarray-baserte teknikker har G2-seq fordeler over 2D gel analyse av genomet bred dekning og mangel på krav kunnskap om plasseringen av replication opprinnelse. Sistnevnte er spesielt relevant i pattedyrceller der, i motsetning til i spirende gjær, replikering opprinnelse ikke er begrenset til bestemte sekvenser. På den annen side, gir 2D gels et nivå på oppløsning av molekylære mellomprodukter i DNA replikering helt uoppnåelig av G2-seq. utvide G2-seq til andre organismer som cellene kan sorteres etter DNA innhold skal være relativt rett frem men gjør svært gjentakende natur genomer av høyere eukaryoter justering av korte Les sekvenser mye mer utfordrende. Nye sekvensering teknologier som gir betydelig lenger lese lengde kan være nyttig i denne forbindelse, spesielt siden G2-seq bør være relativt robust til høyere feil priser som kan knyttes til lengre leser17. I vår erfaring lar teknisk problemet som er mest sannsynlig å forårsake problemer celler når de er sortert og før isolering av DNA. Disse cellene vises å være spesielt sårbare og lyse med tid, og DNA skal isoleres i minst en time eller to for sortering. Lovende fremtid retninger for denne teknikken inkluderer dele både S og G2 i økende antall fraksjoner få høyere oppløsning av dynamikken i genomet replikering fra tidlig initiering til sent ferdigstillelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av grant NIH GM117446 til A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
