Summary
Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.
Abstract
Vele technieken zijn ontwikkeld om de voortgang van DNA replicatie via de S-fase van de celcyclus. De meeste van deze technieken hebben gericht geweest op opheldering van de locatie en het tijdstip van de inleiding van het genoom dubbel in plaats van de voltooiing ervan. Het is echter van essentieel belang dat wij regio's van het genoom die laatste volledig repliceren begrijpen, omdat deze gebieden kampen met verhoogde niveaus van chromosomale breuk en mutatie, en ze geassocieerd met zowel ziekte en veroudering zijn. Hier beschrijven we hoe we een techniek die is gebruikt voor het controleren van replicatie inleiding om te identificeren die regio's van het genoom in plaats daarvan laatste volledige replicatie hebben uitgebreid. Deze aanpak is gebaseerd op een combinatie van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing. Hoewel dit verslag concentreert zich op de toepassing van deze techniek op gist, kan de aanpak worden gebruikt met alle cellen die kunnen worden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA-inhoud.
Introduction
Eukaryotische genoom replicatie wordt gestart op meerdere afzonderlijke locaties, oorsprong van replicatie, van welke replicatie vorken gaan in beide richtingen (herzien in Fragkos et al., 20151) genoemd. Oorsprong variëren in zowel hun timing en de efficiëntie van vuren, en verscheidene technieken zijn ontwikkeld om te controleren van de replicatie oorsprong activiteit en het ophelderen van de oorzaken van deze variatie. De activiteit van individuele oorsprong kan worden afgeleid uit de niveaus van single-stranded DNA2, welke vormen rond de oorsprong van het actief, of met behulp van 2D gelelektroforese volgen specifieke replicatie tussenproducten3, die beide kunnen worden opgespoord met radioactieve sondes. Beide technieken zijn gemakkelijker toegepast in S. cerevisiae dan bij zoogdiercellen omdat oorsprong beperkt tot specifieke bekende opeenvolgingen in de voormalige zijn. Met de komst van microarrays werd het mogelijk om te beoordelen van oorsprong afvuren wereldwijd. Eerst gebeurde dit door het labelen van DNA met zware isotopen, cellen van een blok van de G1 vrijgeven in medium met lichte isotopen en vervolgens toezicht op de vorming van zware-licht hybride DNA in het genoom4. De invoering van hoge-doorvoer sequencing toegestaan soortgelijke genoom-brede monitoring van oorsprong activiteit zonder de eis van dure isotopische labeling. Cellen werden gesorteerd in een stroom cytometer volgens DNA inhoud en hun DNA onderworpen aan diepe sequencing. Omdat de sequentie dekking opbrengst van 1 x tot 2 x in de loop van de S-fase, kan replicatie van de relatieve timing worden beoordeeld door vergelijking van Lees diepten van cellen in de S-fase aan die van de G1 of G25,6. Deze technieken, met name toegepast op gist, geleid tot een dieper begrip van hoe opeenvolging van DNA, chromatine structuur en DNA replicatie eiwitten oorsprong timing en efficiëntie reguleren.
Trouwe transmissie van genetische informatie tijdens cellulaire proliferatie vereist niet alleen succesvol inleiding van DNA-replicatie, die plaatsvindt op de oorsprong, maar ook de succesvolle voltooiing van de replicatie, die optreedt waar de replicatie vorken ontmoeten. Als inleiding van replicatie verschilt het tijdstip van voltooiing van de replicatie het genoom met bepaalde regio's resterende niet-gerepliceerde zelfs laat in de celcyclus. Dergelijke regio's mogelijk met name ver van actieve replicatie oorsprong of sequenties of chromatine structuren die de polymerase van DNA belemmeren kunnen bevatten. Laat het repliceren van regio's kan manifesteren zich als kwetsbare sites, die worden geassocieerd met een chromosomale breuk en een hogere mutatie, en zijn betrokken bij kanker en veroudering7,8,9. Ondanks het belang van goede voltooiing van DNA-replicatie voor handhaving van de stabiliteit van het genoom, heeft ons begrip van waar en hoe dit gebeurt echter bleef ver achter dat van replicatie inleiding. En terwijl afzonderlijke genen waarvan laat replicatie geassocieerd met de ziekte is zijn bestudeerd met, bijvoorbeeld, qPCR10, global studies gericht op het ophelderen van de locaties en de onderliggende oorzaken van een te late replicatie hebben ontbroken. Hier beschrijven we een techniek die we verwijzen naar het als "G2 seq" waarin we stroom cytometry combineren met hoge doorvoersnelheid sequencing licht te werpen op de voltooiing van de replicatie van het genoom in gist11. Met kleine wijzigingen, kan dit protocol worden aangepast aan alle cellen die stroom-gesorteerd op basis van DNA-inhoud worden kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van cellen voor stroom Cytometry sorteren
- Inoculeer 15 mL reageerbuisjes met elk 8 mL YEPD Bouillon zodanig dat de culturen een dichtheid van 5 x 10,6 tot en met 1.5 x 107 cellen per mL na overnachting groei bereiken (zie discussie opmerking 1).
- Spin down gistcellen (1.400 x g, op kamertemperatuur of 4 ° C) in een centrifugebuis van 15 mL schroefdop voor 5 min, resuspendeer de cellen in 1,5 mL 70% ethanol, en overdracht aan een 1.6 mL microfuge buis, deze zitten voor 1 uur bij kamertemperatuur of ten minste 3 uur op ijs (verhuur kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ° C) (zie punt van discussie (2)).
- Spin down gistcellen in de microfuge (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C) voor 1 min, gecombineerd supernatant, resuspendeer in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2 , met 0,25 mg/mL RNAse oplossing gedurende 1 uur bij 50 ° C, of 's nachts bij 37 ° C in de warmte blok of water bad.
- Voeg 50 µL proteïnase K oplossing (20 mg/mL geresuspendeerde in 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% gewicht aan volume glycerol) en incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C.
- Spin down cellen (14.000 x g, 4 ° C) resuspendeer de cellen in 1 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 7,2, spin down (14.000 x g, 4 ° C), gecombineerd met vacuüm supernatant, resuspendeer in 1 mL 1 µM groene nucleïnezuur stam geresuspendeerde in 50 mM Natriumcitraat , pH 7,2 en broeden in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, bewerk ultrasone trillingen ten 2 x voor 2 s elke (uitgangsvermogen 2 watt).
2. de cel sorteren
- Met behulp van een cel sorter, sorteren cellen volgens DNA inhoud in fasen G1, S, "vroege G2" en "late G2", het verzamelen van ten minste 1,6 miljoen haploïde cellen van elke fase van de celcyclus zoals in Figuur 1 (zie punt van discussie (3)).
- Cellen overbrengen microfuge buizen en spin down cellen gedurende 20 minuten bij 14.000 x g bij 4 ° C in de microfuge gecombineerd supernatant met vacuüm (de pellet kan worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C voor onbepaalde tijd; Zie discussie punt (4)).
3. DNA-extractie en de voorbereiding van de Sequencing van bibliotheken
Opmerking: De volgende stappen zijn gebaseerd op "protocol I" in de gist Genomic DNA-extractie Kit (Zie Tabel van materialen).
- Voeg 120 µL van "Spijsvertering Buffer," een eigen buffer waarmee de lytische enzym gist te verteren de celwand en 5 µL van gist lytische enzym, resuspendeer door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 40-60 minuten.
- Voeg 120 µL van "Lysis-buffermengsel," een eigen buffer die wasmiddel, en vortex hard voor 10-20 s bevat.
- Voeg toe 250 µL chloroform - Meng voor 1 min.
- Draaien op maximale snelheid in een microfuge gedurende 2 minuten.
- Het laden van het supernatant op de DNA-bindende kolom en centrifuge op maximale snelheid in een microfuge voor 1 min.
- Voeg 300 µL van "DNA wassen Buffer," een eigen buffer dat ethanol en centrifuge voor 1 min op maximale snelheid in een microfuge bevat. Negeren van de stroom door, voeg 300 µL van DNA was Buffer, en herhaal het proces van wassen.
- De spin kolom overbrengen in een verse microfuge buis, voeg 60 µL van water (niet TE) - 1-3 min wachten en vervolgens Centrifugeer gedurende 10 s tot elueer de DNA.
- Meten van de concentratie door 5 µL van DNA toe te voegen aan 195 µL van dsDNA hoge gevoeligheid reagens dat al verdunde 1:200 in dsDNA hoge gevoeligheid buffer en vervolgens maatregel fluorescentie in een Fluorimeter, met 10 µL van meegeleverde normen voor kalibratie; tussen 10 en 50 ng van DNA totale opbrengst verwachten.
- Bewerk ultrasone trillingen ten (piek Incident Power 450, plicht Factor 30%, cycli per barsten 200, behandeling tijd 60 s, waterniveau 6) te breken van DNA in 250-350 bp fragmenten.
- Bereiden van een bibliotheek met behulp van DNA monster voorbereiding kit en het volgnummer van het (minstens 10 miljoen 50 bp single-end leest) op het DNA sequencing instrument in de snelle modus (zienoot discussie (5)).
4. analyse van het rangschikken van gegevens en generatie van replicatie profielen
- Uitlijnen van sequenties aan Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoom met behulp van Gsnap12 (zienoot discussie (6)).
- Vaststellen per-basenpaar Lees diepten met behulp van Bedtools' "genomeCoverageBed" software13.
- Verwijderen van artefactual spikes in Lees diepten, indien aanwezig (zienoot discussie (7)).
- Vloeiend lezen diepten door chromosoom medianen met een 20 kb glijden venster met "runMean"-functie in R pakket "caTools" (zienoot discussie (8)).
- Perceel Lees diepten in de S-fase, vroege G2 en laat G2 als een percentage van volledig gerepliceerde Lees diepten (zienoot discussie (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben de procedure die hierboven beschreven te identificeren laat replicerende sites in ontluikende gist gebruikt. Deze aanpak met behulp van een bekende laat replicerende regio op een kunstmatig chromosoom testen bleek de techniek nauwkeurig en betrouwbaar. Onze resultaten ook gebleken dat het biologische belang van tijdige afronding van replicatie door aan te tonen dat een late replicerende regio op chromosoom 7, die we geïdentificeerd als laat repliceren op basis van de resultaten van onze G2-seq, verloren was ongeveer drievoudige controle vaker dan een vergelijkbare regio11.
Een concreet voorbeeld van resultaten met G2-seq is afgebeeld in Figuur 2. Wij hadden dat er hypothetische zou worden regio's van het genoom die gerepliceerd met name laat in cellen ontbreekt een eiwit deacetylase Sir2 genoemd. Figuur 2A toont de progressie van data-analyse voor wild type (blauw) en sir2 (rood). De onbewerkte gegevens (bovenste rijen) bevatten grote spikes, waarvan de meeste wegens de aanwezigheid van Ty elementen zijn. Deze spikes zijn verwijderd door de aftopping Lees diepten op 2.5 x de mediaan lezen diepte voor elk monster (middelste rijen). De despiked gegevens worden vervolgens vloeiend gemaakt met een schuifraam 20 kb (onderste rij). Ten slotte zijn de gegevens genormaliseerd en uitgezet als ratio's aan de niveaus in G1. Een typische laat-repliceren regio die wordt weergegeven in de sir2 mutant is gemarkeerd in figuur 2C.
Figuur 1. Stroom cytometry profiel met vermelding van de celcyclus breuken gebruikt; buitenste grenzen van alle poorten gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. (A-B) Progressie van de gegevensverwerking van onbewerkte gegevens (bovenste rijen), despiked van gegevens (middelste rijen) en vloeiend gemaakt van gegevens (onderste rijen) voor wild type (A) en sir2 (B). (C) verhoudingen van S fase - vroege G2- en laat-G2-G1 lezen diepten. Wild type in blauw en sir2 in het rood. Het gemarkeerde gebied rechts bovenin ziet u een late replicerende regio specifieke sir2 mutant. Schaal geeft aan de Fractie van de volledige (2N) replicatie; een volledig niet-gerepliceerde cel lijkt op 0,5, een volledig gerepliceerde cel bij 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel deze techniek robuust is en relatief ongecompliceerd, bijzondere aandacht moet worden besteed aan het volgende:
(1) Wij raden dat culturen gedurende ten minste 12 uur groeien voordat ze log fase, bereiken aangezien de verschillen manifesteren in celcyclus distributies als culturen worden geoogst na het bereiken van de gewenste dichtheid slechts 4 h na inoculatie. Onze veronderstelling is dat een celcyclus distributie die een relatief stabiel evenwicht heeft bereikt beter een "echte" log fase verdeling dan een verdeling die is nog steeds in beweging vertegenwoordigt als een verzadigde cultuur is meer onlangs overgedragen aan de verse medium.
(2) in plaats van draaiende beneden de cellen vóór de vaststelling, kunnen cellen ook worden opgelost door rechtstreeks toe te voegen 100% ethanol tot de cultuur van de gist zodat de uiteindelijke concentratie van ethanol 70 is %. Cellen kunnen worden gekweekt in medium voor synthetische of rijke (YEPD).
(3) de celcyclus fasen worden gevisualiseerd voor sorteren op plotting celaantal als een functie van 530 nm emissie gebied. We hebben geconstateerd dat de buigpunten tussen G1 en S en tussen S en G2 als robuuste monumenten dienen voor de S-fase uitgezet, en we de G2 maximaal als de grens gebruiken om te scheiden van vroege en late G2. We gebruiken de termen "vroege G2" en "late G2" voor de duidelijkheid en beknoptheid, misschien ten koste van nauwkeurigheid in de zin dat cellen technisch in de S-fase zijn totdat ze DNA replicatie hebben voltooid. Hoewel het doel van G2-seq is het identificeren van zeer late-repliceren sites, die zouden worden geopenbaard in de late G2 Fractie, verzamelen we S fase en vroege G2 cellen te volgen van replicatie via alle fasen van de celcyclus.
(4) het is uitermate belangrijk dat cellen naar beneden onmiddellijk na het sorteren worden gesponnen. Laat geen cellen zitten 's nachts voor draaien ze naar beneden. Wij hebben problemen cellen herstellen door middel van centrifugeren, als ze zijn opgeslagen bij 4 ° C, suggereren dat ze kwetsbaar op sorteren worden en lyse met tijd gehad.
(5) zo weinig zoals 5 miljoen leest is voldoende, maar percelen worden minder vloeiend met lagere nummers van luidt als volgt. Gegevenssets met nog minder leest kunnen worden opgevangen door het vloeiend maken met windows groter is dan 20 kb, maar we hebben niet geprobeerd dit.
(6) uitlijning gebruikte software (b.v., Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15of Gsnap12) zal werken.
(7) high throughput sequencing gegevens uit gist weergeven incidentele pieken in Lees diepten, die vaak Ty elementen weerspiegelen. Wij elimineren deze te vervangen door 2.5 x mediaan monster diepten voor lees diepten buiten de regio's bekend bevatten repetitieve rek (b.v., het rDNA) die groter dan 2,5 x mediaan zijn lezen. De rDNA en de uiteinden van chromosomen zijn uitgesloten, omdat ze zijn bekend om de herhaalde elementen bevatten. Een voorbeeld van deze "despiking" met behulp van de R-taal is het volgende:
# Maak een gegevensframe genaamd "luidt" die gegevens bevatten:
Chr <-rep ('chrI', 10)
POS <-seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
leest <-data.frame ('chromosome' chr, =
'positie' = pos,
'read_depth' = rd)
# "despike" de Lees diepten:
leest [, 'despiked'] <-ifelse (leest [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
"Aftopping" of "despiking" kan ook worden bereikt door exclusief leest die worden toegewezen aan meer dan één locatie, maar dit zal elimineren leest die naar, bijvoorbeeld, slechts twee locaties verwijzen. Exemplaren van leest die aan meerdere locaties toewijzen, maar nog steeds bieden waardevolle informatie, zijn niet ongewoon bij het werken met S. cerevisiae, waarvan genoom het gevolg is van een voorouderlijke dubbel16.
(8) Wij hebben vergelijkbare resultaten met zowel de functie van de "rollmedian" in de R-pakket "zoo" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) en de "runmean"-functie in de R-pakket "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) Wij hebben geëxperimenteerd met tal van methoden om te normaliseren Lees diepten, die vergelijkbare resultaten gaf. Onze favoriete aanpak is gebaseerd op de veronderstelling dat ten minste sommige regio's van het genoom in onze steekproef S fase volledig zijn gerepliceerd. Wij vastbesloten de Lees diepte die vertegenwoordigd volledige replicatie als de mediaan leest diepte in onze gegevensverzameling op sites die overeenkomt met de vroegste afvuren hoog vertrouwen 12 ("vertrouwen" score > = 7) oorsprong in een openbaar gegevensverzameling. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & tafel = Raghu2001_ori & ext_format = & format = tab). Voor de meeste toepassingen, de aanpak voor normalisatie is niet kritisch en er zijn vele redelijke opties, meest gewoon om te lezen van graaf totalen normaliseren. Het is echter vermeldenswaard dat als er grote verschillen in het aantal herhaalde sequenties tussen monsters, normalisatie te lezen van graaf totalen misleidend kan zijn. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van twee stammen waarvan rDNA matrices met verschillende vouwen verschillen, kunt normaliseren tot totaal lezen graven maken bepaalde gebieden van het genoom van de stam met de grotere rDNA array artefactually weergegeven uiterlijk op de stam met de kleinere repliceren matrix.
Kortom vertegenwoordigt G2-seq een logische uitbreiding van bestaande technieken voor profielanalyse van replicatie. Net als van andere sequencing en microarray gebaseerde technieken heeft G2-seq voordelen ten opzichte van 2D gel analyse van genoom-brede dekking en het ontbreken van de vereiste kennis van de plaats van oorsprong van de replicatie. Dit laatste is bijzonder relevant in zoogdiercellen waar, in tegenstelling tot in de ontluikende gist, replicatie oorsprong niet beperkt tot specifieke opeenvolgingen zijn. Aan de andere kant, bieden 2D gels een niveau van resolutie van moleculaire tussenproducten bij DNA-replicatie volledig onbereikbaar door G2-seq. uitbreiden G2-seq op andere organismen waarvan de cellen kunnen worden gesorteerd volgens de DNA-inhoud moet relatief ongecompliceerd, echter, de zeer repetitieve aard van het genoom van hogere eukaryoten maakt uitlijning van korte Lees sequenties veel uitdagender. Nieuwe sequencing-technologieën waarmee aanzienlijk langer Lees lengte kan nuttig zijn in dit verband vooral omdat G2-seq moet relatief robuust aan de hogere foutenpercentages die geassocieerd met langer leest17 worden kunnen. In onze ervaring, is het technische probleem dat hoogstwaarschijnlijk om problemen te veroorzaken te laten cellen zitten nadat ze zijn gesorteerd en voorafgaand aan de isolatie van DNA. Deze cellen worden weergegeven als bijzonder kwetsbare en lyse met tijd en DNA worden geïsoleerd binnen hooguit een uur of twee voor het sorteren. Veelbelovende toekomstige richtingen voor deze techniek behoren zowel S en G2 fasen te verdelen in toenemende aantallen van breuken te verkrijgen van hogere resolutie van de dynamiek van genoom replicatie, na opening van de vroege tot late voltooiing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidie NIH GM117446 A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
