Summary
Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.
Abstract
Nombreuses techniques ont été développées pour suivre la progression de la réplication de l’ADN par l’intermédiaire de la phase S du cycle cellulaire. La plupart de ces techniques ont été dirigée vers l’élucidation de l’emplacement et le calendrier d’ouverture de la duplication du génome, et non son achèvement. Toutefois, il est essentiel que nous comprenons des régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication, car ces régions souffrent de taux élevés de cassures chromosomiques et de mutation, et ils ont été associés à la maladie et le vieillissement. Ici, nous décrivons comment nous avons étendu une technique qui a été utilisée pour surveiller l’initiation de la réplication pour plutôt identifier ces régions du génome modifié de réplication complet. Cette approche repose sur une combinaison de cytométrie en flux et séquençage à haut débit. Bien que ce rapport se concentre sur l’application de cette technique à la levure, l’approche peut être utilisée avec toutes les cellules qui peuvent être triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN.
Introduction
Réplication du génome des eucaryotes est initiée à de nombreux endroits discrets, appelés origines de réplication, de laquelle la réplication fourchettes procéder dans les deux sens (examinées par Fragkos et al., 20151). Origines varient dans leur calendrier et l’efficacité de la mise à feu, et plusieurs techniques ont été développées pour surveiller l’activité d’origine de réplication et d’élucider les causes de cette variation. L’activité d’origine individuelle peut être déduite des niveaux de simple brin ADN2, qui se forme autour des origines actives, ou en utilisant l’électrophorèse sur gel 2D pour surveiller la réplication spécifiques intermédiaires3, qui peuvent être détectés avec sondes radioactives. Ces deux techniques sont plus facilement appliquées chez S. cerevisiae que dans les cellules de mammifères, parce que les origines sont limitées à des séquences spécifiques connues dans l’ancien. Avec l’avènement des puces à ADN, il est devenu possible d’évaluer l’origine de tir dans le monde. Tout d’abord, cela a été fait par marquage ADN avec des isotopes lourds, libérant des cellules d’un bloc G1 dans isotopes légers contenant moyens et ensuite suivi la formation de lourd-léger hybride ADN dans le génome de4. L’introduction du séquençage à haut débit a permis semblable pangénomique suivi d’activité d’origine sans l’obligation de marquage isotopique coûteux. Les cellules ont été triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN et leur ADN soumis au séquençage en profondeur. Parce que la couverture de la séquence procède de 1 x à 2 x au cours de la phase S, synchronisation de réplication relative peut être évaluée en comparant les profondeurs lire des cellules en phase S à celles de G1 ou G2,5,6. Ces techniques, en particulier appliqués à la levure, a conduit à une meilleure compréhension de comment les séquence d’ADN, structure de la chromatine et protéines de réplication de l’ADN réglementent l’efficacité et le calendrier d’origine.
La transmission fidèle de l’information génétique au cours de la prolifération cellulaire ne nécessite pas seulement réussie initiation de la réplication de l’ADN, qui se déroule aux origines, mais aussi la réussite de la réplication, ce qui se produit où se rencontrent les fourches de réplication. Comme l’initiation de la réplication, le calendrier d’achèvement de la réplication varie au sein du génome avec certaines régions restantes non répliquées, même tard dans le cycle cellulaire. Ces régions peuvent être particulièrement éloignées des origines de réplication active ou peuvent contenir des séquences ou des structures de la chromatine qui entravent les ADN polymérases. Réplication tardif des régions peut se manifester comme des sites fragiles, qui sont associés à des cassures chromosomiques et des taux de mutation plus élevés et ont été impliqués dans le cancer et le vieillissement7,8,9. Toutefois, malgré l’importance du bon achèvement de la réplication de l’ADN dans le maintien de la stabilité du génome, de comprendre où et comment cela se déroule traîne loin derrière celle de l’initiation de la réplication. Et tandis que des gènes individuels dont la réplication tardive a été associée à la maladie ont été étudiées avec, par exemple, qPCR10, études mondiales visant à élucider les emplacements et les causes de retard font défaut, la réplication sous-jacentes. Ici, nous décrivons une technique nous parler pour comme « G2 seq » dans lequel nous combinons la cytométrie en flux avec le séquençage à haut débit pour faire la lumière sur l’achèvement de la réplication du génome dans11de levure. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être adapté à toutes les cellules qui peuvent être à débit-triés selon la teneur en ADN.
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Protocol
1. préparation des cellules pour Flow Cytometry tri
- Inoculer 15 mL tubes à essai contenant 8 mL de bouillon YEPD telles que les cultures atteignent une densité de 5 x 106 à 1. 5 x 107 cellules / mL après une nuit de croissance (Voir discussion note 1).
- Tournez en bas des cellules de levure (1 400 x g, à température ambiante ou à 4 ° C) dans un tube à centrifuger 15 mL bouchon à vis pendant 5 min, de remettre en suspension des cellules dans 1,5 mL d’éthanol à 70 % et le transfert d’un tube à centrifuger 1,6 mL, laisser ce reposer pendant 1 h à température ambiante ou au moins de 3 h sur glace ( peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° C) (voir point de Discussion (2)).
- Tournez en bas des cellules de levure dans les microtubes (14 000 x g, 4 ° C) pendant 1 min, resuspendre dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2, centrifuger (14 000 x g, 4 ° C) pendant 1 min, aspirer le surnageant, resuspendre dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2 , contenant 0,25 mg/mL solution de RNAse pendant 1 h à 50 ° C ou une nuit à 37 ° C en bain de bloc ou de chaleur.
- Ajouter 50 µL de solution de protéinase K (20 mg/mL resuspendues dans 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50 % en poids de glycérol de volume) et incuber pendant 1 heure à 50 ° C.
- Tournez en bas des cellules (14 000 x g, 4 ° C), remettre en suspension des cellules dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2, tournez en bas (14 000 x g, 4 ° C), aspirer le surnageant avec vide, remettre en suspension dans 1 mL 1 µM vert acide nucléique souche resuspendue dans 50 mM du citrate de sodium , pH 7,2 et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante, laisser agir 2 x pour 2 s chaque (puissance de sortie 2 watts).
2. cellule Tri
- À l’aide d’un trieur de cellules, trier les cellules en fonction de la teneur en ADN en phases G1, S, « G2 précoce » et « fin G2 », recueillant au moins 1,6 millions de cellules haploïdes de chaque phase du cycle cellulaire comme dans la Figure 1 (voir point de Discussion (3)).
- Cellules de transfert pour microtubes et faire tourner les cellules pendant 20 min à 14 000 x g à 4 ° C dans des microtubes et aspirer le surnageant avec aspirateur (le culot peut être conservé congelés à-20 ° C indéfiniment ; voir point 4).
3. ADN Extraction et la préparation de séquencer des bibliothèques
Remarque : Les étapes suivantes sont basées sur « Protocole I » dans l’extraction de l’ADN génomique de levure Kit (voir Table des matières).
- Ajouter 120 µL de Digestion « tampon », une mémoire tampon brevetée qui permet l’enzyme lytique de la levure digérer les parois cellulaires et 5 µL d’enzyme lytique de la levure, remettre en suspension au vortex et incuber à 37 ° C pendant 40 à 60 min.
- Ajouter 120 µL de « Tampon de lyse, « un propriétaire tampon qui contient un détergent et vortex dur pour 10-20 s.
- Ajouter 250 chloroforme µL - bien mélanger pendant 1 min.
- Tournant à vitesse maximale pendant 2 minutes.
- Charger le surnageant sur la colonne de liaison ADN et centrifuger à vitesse maximale pendant 1 minute.
- Ajouter 300 µL d’ADN de lavage « tampon », une mémoire tampon de propriété industrielle qui contient de l’éthanol et centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale. Jeter le débit à travers, ajouter 300 µL de tampon de lavage ADN et répétez le processus de lavage.
- Transférer la colonne dans un tube à centrifuger frais, ajouter 60 µL d’eau (pas TE) - attendre 1-3 min et puis centrifuger pendant 10 s pour éluer l’ADN.
- Mesurer la concentration en ajoutant 5 µL d’ADN à 195 µL de réactif de haute sensibilité ADN double brin qui a été dilué 1 : 200 dans un tampon haute sensibilité ADN double brin, puis mesure de fluorescence dans un fluorimètre, à l’aide de 10 µL de normes fournis pour l’étalonnage ; attendre entre 10 et 50 ng de la récolte totale de l’ADN.
- Soniquer (PIC Incident puissance 450, facteur d’utilisation 30 %, de Cycles par la Burst 200, temps de traitement 60 s, 6 niveau d’eau) pour briser l’ADN en fragments bp 250-350.
- Préparer une bibliothèque à l’aide de la trousse de préparation des échantillons ADN et il (lectures de single-end au moins 10 millions de 50 PB) séquence sur l’instrument de séquençage de l’ADN en mode rapide (voir la note de synthèse (5)).
4. analyse du séquençage des données et génération de réplication profils
- Aligner les séquences à Saccharomyces cerevisiae sacCer3 génome à l’aide de Gsnap12 (voir la note de synthèse (6)).
- Déterminer par nucléotide lu profondeurs à l’aide « genomeCoverageBed » logiciel13 des Bedtools.
- Déposez crampons artéfactuelles dans les profondeurs de la lecture, le cas échéant (voir la note de synthèse (7)).
- Lisses lu profondeurs par chromosome utilisant médianes dans un 20KO coulissante en utilisant la fonction « runMean » dans l’affaire R paquet « caTools » (voir la note de synthèse (8)).
- Intrigue lu profondeurs en phase S, G2 précoce et tardive G2 en pourcentage des profondeurs de lire entièrement répliqués (voir la note de synthèse (9)).
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Representative Results
Nous avons utilisé la procédure décrite ci-dessus pour recenser les sites de réplication tardif dans la levure de bière. Cette approche à l’aide d’une région de réplication fin connue sur un chromosome artificiel des tests prouvé la technique précis et fiable. Nos résultats ont également démontré l’importance biologique de l’achèvement dans les délais de réplication en montrant qu’une région de réplication tardive sur le chromosome 7, que nous avons identifié comme fin de réplication sur la base de nos résultats G2-seq, a été perdue environ plus souvent qu’un comparable contrôler a triplé région11.
Un exemple précis de résultats avec G2-seq est illustré à la Figure 2. Nous avions émis l’hypothèse qu’il y auraient des régions du génome qui reproduit en particulier tard dans les cellules manquent une DÉSACÉTYLASE de protéine appelé Sir2. Figure 2 a montre la progression de l’analyse des données de type sauvage (bleu) et sir2 (rouge). Les données brutes (rangées supérieures) contiennent de grandes pointes, dont la plupart est dues à la présence d’éléments de Ty. Ces pointes sont éliminés par le plafonnement des profondeurs lire à 2,5 fois la médiane lire la profondeur pour chaque échantillon (rangées). Les données despiked sont ensuite lissées avec une fenêtre coulissante de 20KO (rangée du bas). Enfin, les données sont normalisées et tracées sous forme de rapport aux teneurs dans G1. Une région typique de réplication tardive qui apparaît chez le mutant sir2 est mis en évidence dans la Figure 2.
Figure 1. Flow cytometry profil indiquant le cycle cellulaire fractions utilisées ; les limites extérieures des portes toutes marquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. (A-B) La progression du traitement des données des données brutes (premières lignes), despiked données (rangées) et lissée de données (lignes de fond) pour le type sauvage (A) et sir2 (B). (C) Ratios de S phase - début G2- et fin G2-G1 lu profondeurs. Type sauvage en bleu et sir2 en rouge. La région en surbrillance en haut à droite montre une région fin de réplication spécifiques à sir2 mutant. L’échelle indique la fraction de réplication complet (2N) ; une cellule complètement non répliquée semblerait à 0,5, une cellule entièrement répliquée au 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que cette technique est robuste et relativement simple, une attention particulière devrait être consacrée à ce qui suit :
(1) nous recommandons que les cultures poussent pendant au moins 12 h avant qu’ils atteignent la phase logarithmique, puisque les différences manifestent dans les distributions de cycle cellulaire si les cultures sont récoltés après avoir atteint la densité souhaitée juste 4 h après l’inoculation. Notre hypothèse est qu’une distribution de cycle cellulaire qui a atteint un équilibre relativement stable représente le mieux une distribution de phase de « vrai » journal qu’une distribution qui est toujours dans le flux quand une culture saturée a été transférée récemment à un milieu frais.
(2) au lieu de filer vers le bas les cellules avant de le fixer, les cellules peuvent être également fixés en ajoutant directement l’éthanol à 100 % à la culture de levure pour que la concentration finale d’éthanol est de 70 %. Les cellules peuvent être cultivés dans un milieu riche ou synthétique (YEPD).
(3) phases de cycle de cellules sont visualisées dans le tri par traçage nombre de cellules en fonction de la zone d’émissions de 530 nm. Nous avons constaté que les points d’inflexion entre G1 et S et entre S et G2 servent de repères solides pour délimiter la phase S, et nous utilisons le maximum de G2 comme limite pour séparer G2 précoces et tardives. Nous utilisons les termes « G2 précoce » et « fin G2 » pour la clarté et de concision, peut-être au détriment de la précision dans la mesure où les cellules sont techniquement en phase S jusqu'à ce qu’ils ont terminé la réplication de l’ADN. Bien que le G2-seq vise à identifier les sites de réplication très tardive, qui devaient être révélées dans la fraction de G2 fin, nous recueillons la phase S et cellules G2 précoces de suivre à travers toutes les phases du cycle cellulaire, la réplication.
(4) il est extrêmement important que les cellules filer vers le bas rapidement après le tri. Ne pas laisser des cellules pendant la nuit avant de faire les tourner vers le bas. Nous avons eu des problèmes de récupération des cellules par centrifugation, s’ils ont été stockés à 4 ° C, ce qui suggère qu’ils deviennent fragiles sur tri et lyse avec le temps.
(5) aussi peu que 5 millions de lectures est suffisantes, mais les parcelles deviennent moins lisse avec la baisse du nombre de lectures. Ensembles de données avec encore moins de lectures peuvent être en mesure d’être logés en lissant avec windows supérieurs à 20 Ko, mais nous n’avons pas essayé cela.
(6) tout logiciel d’alignement couramment utilisée (p. ex., noeud papillon,14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15ou Gsnap12) fonctionnera.
(7) données de séquençage haut débit de la levure montrent des pointes occasionnelles dans les profondeurs de lecture, qui reflètent souvent les éléments Ty. Nous éliminons ces en substituant 2,5 x médian échantillon lu profondeurs pour des profondeurs de lecture en dehors des régions connues pour contenir des étirements répétitifs (p. ex., l’ADNr) qui sont supérieurs à la médiane de x 2,5. L’ADNr et les extrémités des chromosomes sont exclues car ils sont connus pour contenir des éléments répétitifs. Un exemple de cette « despiking » en utilisant le langage R est le suivant :
# créer une trame de données appelée « lectures » contenant des données :
Chr <-rep ('chrI', 10)
POS <-seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
lit <-data.frame (« chromosome » = chr,
« position » = pos,
« read_depth » = rd)
# « despike » les profondeurs lire :
se lit [, « despiked »] <-ifelse (lectures [, 3] > (2.5 * median(reads[,3])),
(2.5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
« Bouchage » ou « despiking » peut aussi être réalisé par excluant les lectures qui mappent vers plusieurs emplacements, mais cela permettra d’éliminer les lectures qui mappent vers, par exemple, seulement deux emplacements. Instances de lectures qui correspondent à plusieurs emplacements, mais encore de fournir des renseignements précieux, ne sont pas rares, lorsque vous travaillez avec S. cerevisiae, dont le génome résulte d’une duplication ancestrale16.
(8) nous avons obtenu des résultats comparables avec la fonction « rollmedian » dans le progiciel R « zoo » (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) et la fonction « runmean » dans le progiciel R « caTools » (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) nous avons expérimenté avec de nombreuses méthodes pour normaliser les profondeurs lire, qui donne des résultats comparables. Notre approche favorisée repose sur l’hypothèse qu’au moins certaines régions du génome sont entièrement reproduites dans notre échantillon de phase S. Nous avons déterminé la profondeur qui représentait une réplication complète comme la médiane lu profondeur dans notre jeu de données sur les sites correspondant aux 12 premiers tirs confiance élevée (score de « confiance » > = 7) origines dans un ensemble de données accessible au public. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & table = Raghu2001_ori & ext_format = & format = tab). Pour la plupart des applications, l’approche adoptée pour la normalisation n’est pas critique et il y a beaucoup d’options raisonnables, normalisant plus simplement pour lire le compteur totaux. Toutefois, il est à noter que s’il existe de grandes différences dans le nombre de séquences répétées entre les échantillons, normalisation de lire compteur totaux peut être trompeuse. Par exemple, lorsqu’on compare deux souches dont tableaux ADNr diffèrent par plusieurs fois, normalisant à lire les chefs d’accusation au total peut faire certaine régions du génome de la souche avec le plus grand tableau ADNr artefactually semblent reproduire plus tard que la souche avec la plus petite tableau.
En résumé, le G2-seq représente un prolongement logique des techniques existantes pour le profilage de la réplication. Comme les autres techniques de base de séquençage et de microarray, G2-seq a avantages sur 2D gel d’analyse du génome de couverture large et l’absence d’exigence de la connaissance de l’emplacement de départ de la duplication. Ce dernier est particulièrement pertinent dans les cellules de mammifères où, contrairement à dans la levure de bière, origines de réplication ne se limitent pas à des séquences spécifiques. En revanche, des gels 2D fournissent un niveau de résolution des intermédiaires moléculaires dans la réplication de l’ADN totalement inaccessible par G2-suiv. Extending G2-seq à d’autres organismes dont les cellules peuvent être triés selon la teneur en ADN devrait être relativement simple, Cependant, la nature hautement répétitive des génomes des eucaryotes supérieurs rend l’alignement de courtes séquences de lecture beaucoup plus difficile. Nouvelles technologies de séquençage qui offrent beaucoup plus lire longueur peut s’avérer utile à cet égard, surtout depuis la G2-seq devrait être relativement robuste à des taux plus élevés d’erreur qui peuvent être associés à plus longues lectures17. Dans notre expérience, le problème technique qui est plus susceptible de causer des problèmes est de laisser les cellules s’asseoir une fois qu’ils ont été triés et avant l’isolement de l’ADN. Ces cellules semblent être particulièrement fragile et lyse avec le temps, et l’ADN doit être isolé au maximum une heure ou deux de tri. Orientations futures prometteuses pour cette technique incluent divisant le nombre de fractions d’obtenir une résolution plus élevée de la dynamique de la réplication du génome, de l’initiation précoce à retard croissant des phases S et G2.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par grant GM117446 NIH à A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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