Summary
Cytometry 및 높은 처리량 연속 게놈 늦게 복제 영역을 식별 하는 기술을 설명 합니다.
Abstract
DNA 복제는 세포 주기의 S 단계의 진행에 따라 수많은 기술 개발 되었습니다. 이러한 기술의 대부분의 위치 및 게놈 중복 보다는 그것의 완료의 개시의 타이밍으로 지시 되어 있다. 그러나, 그것은 우리가이 지역 돌연변이, 염색체 파손의 높은 수준의 고통 때문에 마지막 복제를 완료 하는 게놈의 지구를 이해 하 고 그들은 질병과 노화와 연관 된 중요 한. 여기 우리는 어떻게 우리가 대신 마지막 완전 한 복제에 게놈의 그 영역을 식별에 복제 개시를 모니터링 하는 데 사용 된 기술 확장을 설명 합니다. 이 방법은 cytometry 및 높은 처리량 시퀀싱의 조합을 기반으로 합니다. 이 보고서에서는 효 모에이 기술 적용, 접근 교류 cytometer DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 세포와 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
진 핵 게놈 복제 복제, 복제에서 포크 (Fragkos 그 외 여러분, 20151에서 검토) 두 방향에서 진행의 기원 이라고 하는 여러 개별 사이트에서 시작 됩니다. 기원 그들의 타이밍 및 발사의 효율성에서 변화 하 고 몇 가지 기술을 복제 원점 활동을 모니터링 하 고이 변화의 원인 명료 하도록 개발 되었습니다. 개별 근원의 활동의 단일 가닥 DNA2, 활성 기원, 주위는 양식 수준에서 추정 될 수 있다 또는 특정 복제 중간체3모니터를 2 차원 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 둘 다로 검출 될 수 있다 방사성 조사 합니다. 이러한 기술을 모두 기원 전에 특정 알려진된 시퀀스에 제한 때문에 더 쉽게 S. cerevisiae 보다 포유류 세포에 적용 됩니다. Microarrays의 도래와 함께 세계적으로 발사 하는 근원 평가 수 되었다. 이 하 여 무거운 동위 원소와 DNA 라벨, 셀 g 1 블록에서 중간 포함 가벼운 동위 원소에 다음 무거운-가벼운 하이브리드 DNA 게놈4에 걸쳐 형성 모니터링 처음 이루어졌다. 높은 처리량 시퀀싱의 소개 허용 비슷한 게놈 넓은 비싼 동위 원소 라벨의 요구 없이 원산지 활동의 모니터링. 세포는 DNA 내용에 따라 교류 cytometer 및 깊은 시퀀싱을 복종 하는 그들의 DNA에 정렬 했다. 시퀀스 범위 S 단계에 걸쳐 2 x 1 x에서 진행, 때문에 상대 복제 타이밍 G1 또는 g 25,6에 S 단계에 있는 세포의 읽기 깊이 비교 하 여 평가 될 수 있습니다. 특히 효 모에 적용 되는 이러한 기술을 어떻게 DNA 순서, chromatin 구조, 그리고 DNA 복제 단백질 근원 타이밍 및 효율성 규제에 대 한 깊은 이해로 이끌어 냈다.
세포질 확산 중 유전 정보의 충실 한 전송 기원에 이루어지는 DNA 복제의 성공 뿐만 아니라 개시 뿐만 아니라 발생 하는 복제 포크 만나는 복제 성공적으로 완료 해야 합니다. 복제의 개시, 같은 복제의 완료의 타이밍 남은 세포 주기에서 늦게도 복제 되지 않은 특정 지역으로 게놈에 걸쳐 다릅니다. 이러한 지역 특히 활성 복제 기원에서 멀리 떨어져 있을 수 있습니다 또는 시퀀스 또는 DNA polymerases를 방해 하는 염색 질 구조를 포함할 수 있습니다. 늦게 영역 복제 염색체 파손 및 높은 돌연변이 속도와 연결 하 고 암과 노화7,,89에 연루 되어 연약한 사이트로 자신을 나타날 수 있습니다. 그러나, 게놈 안정성의 유지 보수에 DNA 복제의 적절 한 완료의 중요성에도 불구 하 고이 일어난 어디서 및 어떻게의 우리의 이해는 복제 개시의 뒤에 멀리 느껴 지. 그리고 개별 유전자의 늦은 복제 질병과 연관 되었습니다 동안 연구 함께, 예를 들어 정량10, 글로벌 연구 elucidating 위치 및 기본 복제는 부족의 원인에서 감독. 여기는 우리가 "G2 seq"는 우리가 결합 cytometry에 게놈 복제의 완료에 빛을 발산 하는 높은 처리량 시퀀싱으로 효 모11을 참조 하는 기술에 설명 합니다. 사소한 변경,이 프로토콜 흐름 DNA 내용에 따라 정렬 될 수 있는 모든 셀에 적응 될 수 있다.
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Protocol
1. 셀에 대 한 준비 흐름 Cytometry 정렬
- 15 mL 문화 하룻밤 성장 후 1.5 mL 당 107 셀 x 5 x 106 의 밀도 도달 되도록 각 YEPD 국물의 8 mL를 포함 하는 시험관에 접종 (참조 토론 참고 1).
- 효 모 세포 (1400 x g, 실 온 또는 4 ° C에서) 5 분에 대 한 15 mL 스크류 캡 원심 관에 다운 스핀, 1.5 mL 70% 에탄올, 실 온에서 1 h 또는 얼음 (에 적어도 3 h이이 앉아 시키는 1.6 mL microfuge 관에 전송 셀 resuspend 4 ° C에서 무기한 저장할 수) (토론 포인트 (2) 참조).
- 1 분 동안 microfuge (14000 x g, 4 ° C)에서 효 모 세포를 스핀, 1 분 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2, 스핀 (14000 x g, 4 ° C) 아래에 resuspend, 상쾌한 발음, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2에서 resuspend 0.25 mg/mL 1 시간 또는 밤새 껏 열 블록 또는 물 목욕에서 37 ° C에서 50 ° C에서 RNAse 솔루션 포함.
- 50 µ L 성분을 K 솔루션 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2mm CaCl2, 볼륨 글리세롤을 50% 무게에에서 resuspended)를 추가 하 고 50 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- 셀 (14000 x g, 4 ° C) 다운 스핀, 1 mL 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 7.2 셀 resuspend, 스핀 다운 (14000 x g, 4 ° C), 진공 상쾌한 발음, 1 mL 1 µ M 녹색 핵 산 피로 50 m m 나트륨 구 연산 염에 resuspended resuspend pH 7.2 및 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서 품 어, 2 x 2를 sonicate s 각 (출력 2 와트).
2. 셀 정렬
- 그림 1 과 같이 각 세포 주기 단계에서 적어도 1.6 백만 단일 세포를 수집 단계로 G1, S, "초기 g 2는,"와 "늦은 g 2", DNA 내용에 따라 셀 정렬 셀 정렬을 사용 하 여 (토론 포인트 (3) 참조).
- Microfuge 관으로 셀을 전송 하 고 14000 x g는 microfuge에서 4 ° C에 20 분에 대 한 셀 아래로 회전 진공 상쾌한 발음 (-20 ° C에서 무기한 동결 펠 릿을 저장할 수 있습니다; 토론 포인트 (4) 참조).
3. DNA 추출 및 라이브러리 시퀀싱의 준비
참고: 다음 단계는에 따라 "의정서 I" 효 모 게놈 DNA 추출 키트에에서 ( 재료의 표참조).
- "소화 버퍼," 독점 수 있는 버퍼를 효 모 세포 벽, 그리고 효 모 용균성 효소의 5 µ L를 소화, vortexing에 의해 resuspend 및 40-60 분 동안 37 ° C에서 품 어 용균성 효소의 120 µ L를 추가 합니다.
- "세포의 용 해 버퍼," 세제, 그리고 10-20 s 하드 소용돌이 포함 하는 독점 버퍼의 120 µ L를 추가 합니다.
- 250 µ L 클로 프롬을 추가-믹스 철저 하 게 1 분.
- 2 분 동안 microfuge에서 최대 속도로 회전 합니다.
- DNA 바인딩 열과 1 분 대는 microfuge 최대 속도에서 분리기에 상쾌한 로드.
- "DNA 세척 버퍼," 에탄올, 그리고는 microfuge 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기를 포함 하는 독점 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제, DNA 워시 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 세척 과정을 반복.
- 신선한 microfuge 관 스핀 열 전송, 물 (안 테)의 60 µ L-1-3 분을 기다릴 더하고 다음 10 원심 elute DNA를 s.
- DNA의 5 µ L dsDNA 높은 감도 버퍼에 희석된 1: 200 그리고 교정;에 대 한 제공 된 표준의 10 µ L를 사용 하는 fluorometer에서 측정 형광 되었습니다 dsDNA 높은 감도 시 약의 195 µ L을 추가 하 여 농도 측정 DNA의 총 10, 50 ng 사이 기대 합니다.
- Sonicate (피크 사건 전력 450, 듀티 계수 30%, 버스트 200, 치료 시간 60 s, 물 레벨 6 초당 사이클) 250-350 bp 파편으로 DNA 헤어.
- DNA 샘플 준비 키트를 사용 하 여 라이브러리를 준비 하 고 빠른 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 그것은 (적어도 10 백만 50 bp 일자형 읽기)을 시퀀싱 (토론 참고 (5) 참조).
4. 분석 데이터와 복제의 세대 시퀀싱의 프로필
- Saccharomyces cerevisiae sacCer3 게놈 Gsnap12 를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 (토론 참고 (6) 참조).
- 자료 당 쌍 읽기 Bedtools' "genomeCoverageBed" 소프트웨어13를 사용 하 여 깊이 결정 합니다.
- 있는 경우 읽기 깊이에서 artefactual 스파이크를 제거 (토론 참고 (7) 참조).
- 부드럽게 읽을 깊이 염색체 R에서 "runMean" 기능을 사용 하 여 창 슬라이딩 20 kb에서 중앙값을 사용 하 여 패키지 "caTools" (토론 참고 (8) 참조).
- 플롯 (토론 참고 (9) 참조) 완전히 복제 된 읽기 깊이의 S 단계, 초기 g 2는, 늦은 g 2에 있는 깊이 읽기.
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Representative Results
싹 트는 효 모에 늦게 복제 사이트 식별 위에서 설명한 절차를 사용 했습니다. 테스트는 인공 염색체에 알려진된 늦은 복제 영역을 사용 하 여이 이렇게 정확 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 입증 했다. 우리의 결과 또한 시연 복제의 적시 완료의 생물학 중요성 우리가 우리의 G2-seq 결과 근거 하 여 늦은 복제로 식별, 염색체 7에 늦게 복제 영역 손실 되었음을 표시 하 여 약 three-fold는 유사한 보다는 더 빈번 하 게 지역11제어 합니다.
G2-seq와 결과의 특정 한 예는 그림 2에 표시 됩니다. 우리 했다 가설을 거기 것 이다 특히 늦은 세포 복제 게놈의 지역 부족 단백질 deacetylase Sir2 라는. 그림 2A 야생 타입 (청색) 및 sir2 데이터 분석의 진행 (빨간색)를 보여 줍니다. 원시 데이터 (위쪽 행)는 대부분의 타이 성분의 존재에 큰 스파이크를 포함 합니다. 이 스파이크는 각 샘플 (중간 행)에 대 한 깊이 읽기 중앙값 x 2.5에서 읽기 깊이 상한에 의해 제거 됩니다. Despiked 데이터는 다음 20 kb 슬라이딩 윈도우 (아래쪽 행)으로 부드럽게 됩니다. 마지막으로, 데이터 정규화 되며 g 1에서 수준에 비율으로 꾸몄다. 일반적인 복제 늦은 지역 sir2 돌연변이에 나타나는 그림 2C에서 강조 표시 됩니다.
그림 1. Flow cytometry 프로필 나타내는 세포 주기 분수 사용; 모든 게이트의 외부 한계 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. (A-B) 원시 데이터 (상위 행), 데이터 처리의 진행 데이터 (중간 행)를 despiked 하 고 야생 유형 (A) 및 sir2 (B)에 대 한 데이터 (아래쪽 행)을 부드럽게. (C) 비율의 S 단계, 초기 g 2-, 및 늦은 g 2-g 1을 읽고 깊이. 파란색과 빨간색에서 sir2 에서 야생 유형. 오른쪽 상단에 강조 표시 된 지역 늦은 복제 지역 특정 sir2 돌연변이를 보여줍니다. 규모가 나타냅니다의 완전 한 (2N) 복제; 완전히 복제 되지 않은 셀은 0.5, 1에 완전히 복제 된 셀에 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 기술은 강력 하 고 비교적 똑 바른 동안 앞으로, 특정 주의 다음에 전념 한다.
(1) 문화 차이 매니페스트 세포 주기 배포판에 문화는 접종 후 원하는 밀도 그냥 4 h를 도달 하는 데 후 수확 하는 경우 이후 로그 단계를 도달 하기 전에 적어도 12 h에 대 한 성장 좋습니다. 우리의 가정은 세포 주기 분포는 비교적 안정 된 평형에 도달 했습니다 더 나타내는 "진짜" 로그 단계 배포는 아직 유출 때 포화 문화 양도 되었습니다 최근 신선한 매체 배포 보다.
(2) 고정 하기 전에 셀 아래로 회전의 대신 세포 또한 직접 에탄올의 최종 농도 70% 효 모 문화를 100% 에탄올을 추가 하 여 해결할 수 있습니다. 세포 합성 또는 풍부한 (YEPD) 매체에 성장 될 수 있다.
(3) 세포 주기 단계 530 nm 방출 영역의 기능으로 플로팅 휴대 번호로 정렬에 대 한 시각화 됩니다. 우리는 굴절 포인트 및 S와 g 2는 g 1과 S 사이의 S 단계, 묘사에 대 한 강력한 랜드마크 역할을 하 고 우리을 사용 하 여 g 2 최대 경계로 초기 및 런타임에 g 2를 발견 했다. 우리는 "초기 g 2"와 "늦은 G2" 선명도와 짧음, 세포 DNA 복제를 완료 될 때까지 S 단계에서 기술적으로 의미에서 정확도 희생 해 서 아마도 용어를 사용 합니다. G2-seq의 목표는 늦은 g 2 분수에 공개 될 것으로 예상 된다, 매우 늦은 복제 사이트를 식별 하는 S 단계 및 초기 g 2 셀 셀 사이클의 모든 단계를 통해 복제에 따라 수집 합니다.
(4) 그것은 매우 중요 하다는 셀 수 스핀 다운 신속 하 게 정렬 후입니다. 셀을 아래로 회전 하기 전에 밤새 앉아 하지 마십시오. 우리는 문제 4 ° C에 저장 된 경우 원심 분리에 의해 세포의 복구, 그들은 정렬에 취약 되 고 시간 lyse 제안 했다.
(5) 거의 5 백만 읽기 충분 하지만 플롯 될 덜 읽기의 낮은 숫자와 부드러운. 도 적은 읽기 데이터 집합 20 kb 보다 큰 창문이 부드럽게 하 여 수용 될 수 있습니다 하지만 우리는 이것을 시도 하지 않은.
(6) 널리 사용 된 정렬 소프트웨어 (예를 들어, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15또는 Gsnap12) 작동 합니다.
(7) 높은 처리량 시퀀싱 데이터에서 효 모 타이 요소를 반영 하는 종종 읽기 깊이에서 가끔 스파이크를 보여줍니다. 우리는 깊이 읽기 깊이 2.5 x 중앙값 보다 큰 반복적인 뻗어 (예를 들어,는 rDNA)을 포함 알려져 지역 외부에 대 한 읽기 평균 샘플 x 2.5를 대체 하 여 제거 합니다. rDNA 및 염색체의 끝은 그들은 알려진 반복 요소를 포함 하기 때문에 제외 됩니다. R 언어를 사용 하 여이 "despiking"의 예는 다음과 같습니다.
# 라는 "읽기"는 데이터를 포함 하는 데이터 프레임을 만듭니다.
chr <-담당자 ('기독교', 10)
포스 <-seq (1, 10)
rd <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
읽고 <-data.frame ('염색체' = chr,
'위치' = pos,
'read_depth' = rd)
# "despike" 읽기 깊이:
읽기 [, 'despiked'] <-ifelse (읽기 [3], > (2.5 * median(reads[,3])),
(2.5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
"상한" 또는 "despiking" 또한 얻을 수 있는 하나 이상의 위치에 매핑되는 읽기 제외 하지만이 읽기 매핑하는, 예를 들어, 두 위치를 제거 합니다. S. cerevisiae, 누구의 게놈 조상의 중복16에서 결과 작업할 때 둘 이상의 위치에 지도 여전히 유용한 정보를 제공 하는 읽기의 경우 흔히 되지 않습니다.
(8) 우리 R 패키지 "동물원" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html)에서 "rollmedian" 함수와 R 패키지 "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html)에서 "runmean" 기능 비교 결과 얻은.
(9) 우리 모두는 유사한 결과 준 읽기 깊이 정규화 하 수많은 방법으로 실험을 했습니다. 우리의 선호 접근 게놈의 적어도 일부 지역 S 단계 샘플 완전히 복제 가정 기반으로 합니다. 우리는 중간 초기 높은 자신감을 발사 하는 12에 해당 하는 사이트에서 우리의 데이터 세트에 깊이 읽기 전체 복제를 나타내는 읽기 깊이 결정 ("신뢰" 점수 > = 7) 공개적으로 사용 가능한 데이터 집합에서 기원. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & 테이블 Raghu2001_ori & ext_format = = & 형식 탭 =). 대부분의 응용 프로그램에 대 한 정규화에 대 한 접근 방식이 중요 하지 않습니다 하 고 많은 옵션이 합리적인, 그냥 가장 간단 하 게 읽을 수 합계를 정규화 합니다. 그러나, 그것은 샘플 사이 반복 시퀀스의 숫자에 큰 차이가 있다, 읽을 수 합계 정규화 오해의 소지가 있을 수 있습니다 지적 가치가 있다. 예를 들어 누구의 rDNA 배열 다른 여러 배 두 긴장을 비교할 때 읽을 수 총에 정상화 할 수 특정 큰 rDNA 배열 가진 긴장의 게놈의 지역 artefactually와 긴장 보다 나중에 복제 되도록 배열입니다.
요약 하자면, G2-seq 복제 프로 파일링을 위한 기존 기술의 논리적 확장을 나타냅니다. 다른 시퀀싱 및 microarray 기반 기법 처럼 G2-seq 장점이 이상의 2D 젤의 게놈 넓은 범위 분석 및 복제 유래 위치의 지식의 요구의 부족. 후자는 특히 관련, 달리 신진 효 모에 복제 기원에 국한 되지 않습니다 특정 시퀀스 포유류 세포 에서입니다. 다른 한편으로, 2D 젤 g 2이 확장 G2-seq의 세포는 DNA 내용에 따라 정렬할 수 있습니다 다른 유기 체에 의해 완전히 얻기 어려운 DNA 복제에 분자 중간체의 해상도 수준을 상대적으로 곧장 앞으로, 있어야 제공 그러나 높은 진핵생물의 게놈의 높게 반복적인 자연은 더욱 어려운 짧은 읽기 시퀀스의 정렬. 현저 하 게 더 이상 제공 하는 시퀀싱 기술을 신흥 읽을 G2-seq는 상대적으로 더 이상 읽기17와 연결 될 수 있는 높은 오류율을 강력 이어야 한다 때문에 특히 길이 이와 관련, 유용한 증명할 수 있습니다. 우리의 경험에서 문제가 발생할 가능성이 가장 높은 기술 문제 후 정렬 되었습니다 및 DNA의 분리 전에 앉아 셀 풀어 이다. 이러한 세포 특히 취약 하 고 시간, lyse 나타나고 DNA 최대 한 시간이 나 두 분류 내에서 격리 되어야 합니다. 이 기술에 대 한 유망한 미래 방향 S와 G2 단계 늦은 완료 초기 개시에서 게놈 복제의 역학의 높은 해상도 얻기 위해 분수의 숫자를 증가 하는 것을 나누어 포함 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 A.B. 부여 NIH GM117446에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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