Summary
हम जीनोम के देर से नकल क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह अनुक्रमण संयोजन के लिए एक तकनीक का वर्णन ।
Abstract
कई तकनीकों सेल चक्र के एस चरण के माध्यम से डीएनए प्रतिकृति की प्रगति का पालन करने के लिए विकसित किया गया है । इन तकनीकों के अधिकांश स्थान और इसके पूरा होने के बजाय जीनोम दोहराव की दीक्षा के समय के elucidation की ओर निर्देशित किया गया है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि हम जीनोम के क्षेत्रों को समझने की है कि पूरा करने के लिए पिछले कर रहे है प्रतिकृति, क्योंकि इन क्षेत्रों गुणसूत्र टूटना और उत्परिवर्तन का स्तर ऊंचा उठाया, और वे दोनों रोग और उंर बढ़ने के साथ जुड़े किया गया है । यहां हम वर्णन कैसे हम एक तकनीक है कि प्रतिकृति दीक्षा की निगरानी करने के बजाय पिछले जीनोम के उन क्षेत्रों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया गया है विस्तारित है पूरा प्रतिकृति । इस दृष्टिकोण प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह अनुक्रमण का एक संयोजन पर आधारित है । हालांकि इस रिपोर्ट खमीर करने के लिए इस तकनीक के आवेदन पर केंद्रित है, दृष्टिकोण किसी भी कोशिकाओं है कि एक प्रवाह cytometer में डीएनए सामग्री के अनुसार हल किया जा सकता है के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
Eukaryotic जीनोम प्रतिकृति एकाधिक असतत साइटों पर शुरू की है, प्रतिकृति के मूल कहा जाता है, जिसमें से प्रतिकृति कांटे दोनों दिशाओं में आगे बढ़ना (Fragkos एट अल., 20151में समीक्षित) । मूल दोनों अपने समय और गोलीबारी की क्षमता में भिंनता है, और कई तकनीकों को प्रतिकृति मूल गतिविधि की निगरानी और इस भिंनता के कारणों स्पष्ट विकसित किया गया है । व्यक्तिगत मूल की गतिविधि एकल-असहाय डीएनए के स्तर से आस्थगित किया जा सकता है2, जो सक्रिय मूल के आसपास रूपों, या 2d जेल ट्रो का उपयोग करने के लिए विशिष्ट प्रतिकृति मध्यस्थों की निगरानी के लिए3, जिनमें से दोनों के साथ पता लगाया जा सकता है रेडियोधर्मी जांच । इन तकनीकों के दोनों अधिक आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में एस cerevisiae में लागू कर रहे हैं, क्योंकि मूल पूर्व में विशिष्ट ज्ञात दृश्यों तक ही सीमित हैं । microarrays के आगमन के साथ, यह विश्व स्तर पर गोलीबारी मूल का आकलन करने के लिए संभव हो गया । यह सबसे पहले भारी आइसोटोप के साथ डीएनए लेबल द्वारा किया गया था, एक G1 ब्लॉक से प्रकाश आइसोटोप युक्त में कोशिकाओं को रिहा, और फिर4जीनोम के पार भारी प्रकाश संकर डीएनए के गठन की निगरानी. उच्च प्रवाह अनुक्रमण की शुरूआत महंगी isotopic लेबलिंग की आवश्यकता के बिना मूल गतिविधि के समान जीनोम की व्यापक निगरानी की अनुमति दी । कोशिकाओं को एक प्रवाह cytometer में डीएनए सामग्री और उनके डीएनए गहरी अनुक्रमण के अधीन के अनुसार हल किया गया । क्योंकि अनुक्रम कवरेज एस चरण के पाठ्यक्रम पर 1x से 2x के लिए आय, सापेक्ष प्रतिकृति समय एस चरण में कोशिकाओं के G1 या G25,6में पढ़ने की गहराई की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इन तकनीकों, विशेष रूप से खमीर के लिए लागू किया, कैसे डीएनए अनुक्रम, क्रोमेटिन संरचना, और डीएनए प्रतिकृति प्रोटीन के एक गहरी समझ के लिए नेतृत्व की उत्पत्ति समय और दक्षता को विनियमित ।
के दौरान आनुवंशिक जानकारी के वफादार संचरण सेलुलर प्रसार के सफल दीक्षा की आवश्यकता नहीं है डीएनए प्रतिकृति, जो मूल पर जगह लेता है, लेकिन यह भी पुनरावृत्ति के सफल समापन, जो होता है जहां प्रतिकृति कांटे मिलते हैं । प्रतिकृति की दीक्षा की तरह, प्रतिकृति के पूरा होने के समय भी सेल चक्र में देर से प्रतिकृति शेष कुछ क्षेत्रों के साथ जीनोम भर में बदलता है । ऐसे क्षेत्रों सक्रिय प्रतिकृति मूल से विशेष रूप से दूर हो सकता है या अनुक्रम या क्रोमेटिन संरचनाओं कि डीएनए polymerases बाधा हो सकती है । देर से नकल क्षेत्रों खुद नाजुक साइटों के रूप में प्रकट कर सकते हैं, जो गुणसूत्र टूटना और उच्च उत्परिवर्तन दरों के साथ जुड़े रहे हैं, और कैंसर में फंसा दिया गया है और7एजिंग,8,9। हालांकि, जीनोम स्थिरता के रखरखाव में डीएनए प्रतिकृति के उचित पूरा होने के महत्व के बावजूद, जहां और कैसे इस जगह लेता है की हमारी समझ अभी तक प्रतिकृति दीक्षा के पीछे है । और जब व्यक्तिगत जीन जिनकी देर प्रतिकृति रोग के साथ संबद्ध किया गया है के साथ अध्ययन किया गया है, उदाहरण के लिए, qPCR10, वैश्विक elucidating में निर्देशित अध्ययन स्थानों और देर से पुनरावृत्ति के अंतर्निहित कारणों का अभाव हो गया है । यहाँ हम एक तकनीक का वर्णन हम के रूप में "G2 seq" जिसमें हम उच्च प्रवाह sequencing के साथ फ्लो cytometry गठबंधन करने के लिए खमीर में जीनोम प्रतिकृति के पूरा होने पर प्रकाश डालता है11। छोटे परिवर्तन के साथ, इस प्रोटोकॉल किसी भी कोशिकाओं है कि प्रवाह के लिए डीएनए सामग्री के अनुसार हल किया जा सकता है अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Protocol
1. प्रवाह Cytometry छंटाई के लिए कोशिकाओं की तैयारी
- Inoculate 15 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूबों युक्त 8 मिलीलीटर YEPD शोरबा के प्रत्येक ऐसी है कि संस्कृतियों के एक घनत्व तक पहुँचने 5 x 106 के लिए 1.5 x 107 प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं रात के विकास के बाद (देखें चर्चा नोट 1).
- नीचे स्पिन खमीर कोशिकाओं (1,400 x जी, कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस में) 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी केंद्रापसारक ट्यूब में, 1.5 मिलीलीटर 70% इथेनॉल में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित, और एक 1.6 मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, इस कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए बैठते हैं या बर्फ पर कम से कम 3 ज दे ( 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है) (देखें चर्चा बिंदु (2)) ।
- microfuge में खमीर कोशिकाओं नीचे स्पिन (14,000 x जी, 4 ° c) 1 मिनट के लिए, 1 मिलीलीटर 50 मिमी सोडियम साइट्रेट में पुनर्निलंबित, पीएच 7.2, नीचे स्पिन (14,000 एक्स जी, 4 ° c) 1 मिनट के लिए, महाप्राण supernatant, 1 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित 50 मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच 7.2 , जिसमें 50 डिग्री सेल्सियस या गर्मी ब्लॉक या जल स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में 1 घंटे के लिए 0.25 मिलीग्राम/एमएल RNAse समाधान शामिल है ।
- जोड़ें 50 µ l proteinase K समाधान (20 मिलीग्राम/10 मिमी Tris पीएच 7.5, 2 मिमी CaCl2, 50% वजन मात्रा ग्लिसरॉल में reसस्पैंड) और 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
- सेल नीचे स्पिन (14,000 x जी, 4 डिग्री सेल्सियस), 1 मिलीलीटर 50 मिमी सोडियम साइट्रेट में कोशिकाओं reसस्पेंड, पीएच 7.2, नीचे स्पिन (14,000 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस), निर्वात के साथ महाप्राण supernatant, 1 मिलीलीटर 1 में reसस्पेंड µ एम ग्रीन न्यूक्लिक एसिड तनाव 50 मिमी सोडियम साइट्रेट में reसस्पैंड , 7.2 पीएच और कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए अंधेरे में गर्मी, 2 एस के लिए sonicate 2x प्रत्येक (उत्पादन शक्ति 2 वाट) ।
2. सेल छँटाई
- एक सेल सॉर्टर का उपयोग करना, चित्र के चरणों में डीएनए सामग्री के अनुसार सॉर्ट करें, एस, "अर्ली g2," और "देर से g2", प्रत्येक कोशिका चक्र चरण से कम से १,६००,००० अगुणित कोशिकाओं को इकट्ठा करने के रूप में चित्रा 1 (चर्चा बिंदु (3) देखें) ।
- microfuge ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और microfuge और महाप्राण supernatant में 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 एक्स जी में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं के नीचे स्पिन वैक्यूम के साथ (गोली-20 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल तक जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है; चर्चा बिंदु (4) देखें) ।
3. डीएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी
नोट: निंनलिखित कदम "पर प्रोटोकॉल मैं" खमीर जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट में आधारित है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- के 120 µ एल जोड़ें "पाचन बफर," एक मालिकाना बफर कि खमीर lytic एंजाइम सेल दीवार को पचाने की अनुमति देता है, और 5 खमीर lytic एंजाइम के µ एल, भंवर द्वारा reसस्पेंड, और 40 के लिए 37 ° c-60 मिनट में मशीन ।
- जोड़ें 120 µ एल के "Lysis बफर," एक मालिकाना बफर कि डिटर्जेंट शामिल हैं, और भंवर मुश्किल के लिए 10-20 s ।
- 250 µ एल क्लोरोफॉर्म-1 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रण जोड़ें ।
- 2 मिनट के लिए एक microfuge में अधिकतम गति से स्पिन ।
- डीएनए बाध्यकारी कॉलम पर supernatant लोड और 1 मिनट के लिए एक microfuge में अधिकतम गति से केंद्रापसारक ।
- "डीएनए धोने बफर के 300 µ एल जोड़ें," एक मालिकाना बफर कि इथेनॉल शामिल हैं, और एक microfuge में अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक । के माध्यम से प्रवाह त्यागें, डीएनए वॉश बफर के 300 µ एल जोड़ें, और धोने की प्रक्रिया को दोहराने ।
- एक ताजा microfuge ट्यूब करने के लिए स्पिन कॉलम स्थानांतरण, पानी की 60 µ एल जोड़ें (न ते)-1-3 मिनट रुको और फिर 10 एस के लिए केंद्रापसारक को डीएनए elute ।
- डीएनए के 5 µ एल जोड़ने के द्वारा एकाग्रता उपाय dsDNA उच्च संवेदनशीलता रिएजेंट है कि dsDNA उच्च संवेदनशीलता बफर में 1:200 पतला कर दिया गया है और फिर एक प्रतिदीप्ति में fluorometer उपाय, अंशांकन के लिए आपूर्ति मानकों के 10 µ एल का उपयोग; 10 और 50 डीएनए कुल उपज के एनजी के बीच की उंमीद है ।
- Sonicate (पीक घटना पावर 450, ड्यूटी फैक्टर 30%, 200 फट प्रति चक्र, उपचार समय 60 एस, जल स्तर 6) को 250-350 बीपी के टुकड़ों में तोड़ डीएनए ।
- डीएनए नमूना तैयारी किट का उपयोग कर एक पुस्तकालय तैयार है और तेजी से मोड में डीएनए अनुक्रमण साधन पर (कम से कम १०,०००,०५० बीपी एकल-अंत पढ़ता) अनुक्रम (चर्चा नोट (5) देखें) ।
4. sequencing डेटा का विश्लेषण और प्रतिकृति प्रोफ़ाइल का उत्पादन
- Saccharomyces cerevisiae sacCer3 जीनोम Gsnap12 का उपयोग करने के लिए अनुक्रम संरेखित करें (चर्चा नोट (6) देखें) ।
- प्रति-आधार जोड़ी निर्धारित गहराई Bedtools ' "genomeCoverageBed" सॉफ्टवेयर13का उपयोग करके पढ़ें ।
- यदि वर्तमान (देखें चर्चा नोट (7)) artefactual spikes में पढ़ें गहराई, निकालें ।
- चिकनी एक 20 केबी फिसलने विंडो में माध्य का उपयोग गुणसूत्र द्वारा गहराई से पढ़ें "runMean" समारोह में आर पैकेज "caTools" का उपयोग (चर्चा नोट (8) देखें) ।
- प्लॉट पढ़ें गहराई एस चरण में, जल्दी g2, और देर से g2 पूरी तरह से दोहराया पढ़ने की गहराई के एक प्रतिशत के रूप में (चर्चा नोट (9) देखें).
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Representative Results
हम ऊपर वर्णित प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है नवोदित खमीर में देर से नकल साइटों की पहचान । एक कृत्रिम गुणसूत्र पर एक ज्ञात देर से नकल क्षेत्र का उपयोग कर इस दृष्टिकोण का परीक्षण तकनीक सही और विश्वसनीय होने के लिए साबित कर दिया । हमारे परिणाम भी दिखा रहा है कि गुणसूत्र 7 पर देर से नकल क्षेत्र है, जो हम हमारे G2-seq परिणामों के आधार पर देर से नकल के रूप में पहचान की है, लगभग खो गया था द्वारा प्रतिकृति के समय पर पूरा होने के जैविक महत्व का प्रदर्शन किया है तीन गुना अधिक बार एक तुलनीय नियंत्रण क्षेत्र11।
G2-seq के साथ परिणामों का एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है । हम कल्पना की थी कि वहां जीनोम कि विशेष रूप से एक प्रोटीन deacetylase Sir2 बुलाया कमी कोशिकाओं में देर से दोहराया के क्षेत्र होगा । चित्र 2a जंगली प्रकार (नीला) और sir2 (लाल) के लिए डेटा विश्लेषण की प्रगति को दर्शाता है । कच्चे डेटा (ऊपरी पंक्तियों) बड़े spikes होते हैं, जिनमें से अधिकांश Ty तत्वों की उपस्थिति के कारण कर रहे हैं । इन spikes 2.5 x औसत प्रत्येक नमूने (मध्य पंक्तियों) के लिए पढ़ें गहराई में पढ़ा गहराई कैपिंग द्वारा हटा रहे हैं । एक 20 केबी फिसलने खिड़की (नीचे पंक्ति) के साथ फिर से नुकीला डेटा चिकनी कर रहे हैं । अंत में, डेटा सामान्यीकृत और G1 में स्तरों के अनुपात के रूप में रची जाती है । sir2 उत्परिवर्ती में दिखाई देने वाला एक विशिष्ट देर से नकल करने वाला क्षेत्र चित्र 2cमें हाइलाइट किया गया है ।
चित्र 1. प्रयुक्त सेल चक्र भागों का संकेत cytometry प्रोफ़ाइल प्रवाह; सभी गेट्स की बाहरी सीमाएं चिह्नित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. (A-B) वाइल्ड टाइप (A) और sir2 (B) के लिए raw डेटा (शीर्ष पंक्तियों), विपाइक्ड डेटा (मध्य पंक्तियों) और स्मूथ्ड डेटा (निचली पंक्तियों) से डेटा संसाधन की प्रगति । (ग) एस चरण के अनुपात, जल्दी g2-, और देर से g2-गहराई तक G1 पढ़ें । नीले और लाल रंग में sir2 में जंगली प्रकार । ऊपरी दाएँ में हाइलाइट क्षेत्र sir2 उत्परिवर्ती के लिए विशिष्ट एक देर से नकल क्षेत्र से पता चलता है । स्केल पूर्ण (2N) प्रतिकृति के अंश को इंगित करता है; एक पूरी तरह से unप्रतिकृति कक्ष पर 0.5, एक पूरी तरह से दोहराया सेल 1 पर दिखाई देगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हालांकि इस तकनीक मजबूत और अपेक्षाकृत सीधे आगे है, विशेष रूप से ध्यान निंनलिखित के लिए समर्पित किया जाना चाहिए:
(1) हम अनुशंसा करते है कि संस्कृतियों से कम 12 घंटे के लिए बढ़ने से पहले वे लॉग चरण तक पहुंचने, सेल चक्र वितरण में प्रकट मतभेद के बाद से अगर संस्कृतियों की कटाई कर रहे है वांछित घनत्व तक पहुंचने के बाद सिर्फ 4 टीका के बाद एच । हमारी धारणा है कि एक सेल चक्र वितरण कि एक अपेक्षाकृत स्थिर संतुलन बेहतर पहुंच गया है एक "असली" एक वितरण है कि प्रवाह में अब भी है, जब एक संतृप्त संस्कृति अधिक हाल ही में ताजा माध्यम हस्तांतरित किया गया है से लॉग चरण वितरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
(2) की जगह फिक्सिंग से पहले नीचे कताई कोशिकाओं के, कोशिकाओं को भी सीधे खमीर संस्कृति को 100% इथेनॉल जोड़ने इतना है कि इथेनॉल के अंतिम एकाग्रता 70% है द्वारा तय किया जा सकता है । कोशिकाओं को या तो सिंथेटिक या अमीर (YEPD) मध्यम में उगाया जा सकता है ।
(3) सेल चक्र चरणों 530 एनएम उत्सर्जन क्षेत्र के एक समारोह के रूप में सेल नंबर की साजिश रचने के द्वारा छंटाई के लिए कल्पना कर रहे हैं । हमने पाया है कि G1 और एस के बीच और एस और g2 के बीच मोड़ अंक delineating एस चरण के लिए मजबूत स्थलों के रूप में सेवा करते हैं, और हम g2 को जल्दी और देर से अलग करने के लिए सीमा के रूप में अधिकतम का उपयोग करें । हम शब्दों का उपयोग करें "जल्दी g2" और "देर g2" स्पष्टता और संक्षिप्तता के लिए, शायद सटीकता की कीमत में अर्थ है कि कोशिकाओं एस चरण में तकनीकी रूप से वे डीएनए प्रतिकृति पूरा कर लिया है जब तक. हालांकि g2-seq के लक्ष्य बहुत देर से नकल साइटों, जो देर से G2 भिन्न में पता चला जा करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं की पहचान करने के लिए है, हम सेल चक्र के सभी चरणों के माध्यम से प्रतिकृति का पालन करने के लिए एस चरण और जल्दी G2 कोशिकाओं इकट्ठा.
(4) यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं छंटाई के बाद तुरंत नीचे घूमती है । उंहें कताई से पहले कोशिकाओं को रात भर बैठने न दें । हम अगर वे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है कि वे छंटाई और समय के साथ लाइसे पर नाजुक हो, सुझाव है कि केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को ठीक समस्याओं पड़ा है ।
(5) के रूप में कुछ के रूप में ५,०००,००० पढ़ता पर्याप्त है, लेकिन भूखंडों कम संख्या के साथ चिकनी हो पढ़ता है । भी कम पढ़ता के साथ डेटा सेट 20 kb से बड़े windows के साथ स्मूथिंग द्वारा समायोजित किया जा करने में सक्षम हो सकता है, लेकिन हमने यह प्रयास नहीं किया है ।
(6) किसी भी व्यापक रूप से इस्तेमाल संरेखण सॉफ्टवेयर (उदा, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15, या Gsnap12) काम करेंगे ।
(7) खमीर से उच्च प्रवाह अनुक्रमण डेटा पढ़ने की गहराई है, जो अक्सर Ty तत्वों को प्रतिबिंबित में सामयिक spikes दिखाओ । हम 2.5 x माध्य द्वारा इन को समाप्त करने के लिए, दोहराए जाने वाले हिस्सों (उदा., rDNA) को शामिल करने के लिए जाने वाले क्षेत्रों के बाहर पढ़ने की गहराई को पढ़ें, जो 2.5 x माध्य से अधिक है । rDNA और गुणसूत्रों के सिरों को बाहर रखा गया है क्योंकि वे दोहराए तत्वों को शामिल करने के लिए जाना जाता है । इस "despiking" का एक उदाहरण R भाषा का उपयोग करते हुए निम्न है:
# डेटा युक्त "पढ़ता" नामक एक डेटा फ़्रेम बनाएँ:
chr <-प्रतिनिधि (' चरी ', 10)
स्थिति <-seq (1, 10)
rd <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
<-data. फ़्रेम को पढ़ता है (' गुणसूत्र ' = chr,
' स्थिति ' = पीओएस,
' read_depth ' = rd)
# "कील" पढ़ें गहराई:
पढ़ता है [, ' विपाइक्ड '] <-ifelse (पढ़ता [, 3] > (2.5 * माध्य (पढ़ता [, 3])),
(2.5 * माध्य (पढ़ता है [, 3])),
पढ़ता है [, 3])
"कैपिंग" या "despiking" भी एक से अधिक स्थान के लिए है कि नक्शा पढ़ता को छोड़कर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह है कि नक्शे के लिए उदाहरण के लिए, बस दो स्थानों को समाप्त होगा । के उदाहरण पढ़ता है कि एक से अधिक स्थान पर नक्शा है, लेकिन अभी भी बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं, असामांय नहीं है जब एस cerevisiae, जिसका जीनोम एक पैतृक दोहराव16से परिणाम के साथ काम कर रहे हैं ।
(8) हम दोनों के साथ तुलनीय परिणाम प्राप्त किया है "rollmedian" समारोह में आर पैकेज "चिड़ियाघर" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) और "runmean" समारोह में आर पैकेज "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html) ।
(9) हम कई तरीकों के साथ प्रयोग किया है पढ़ा गहराई, जो सभी के तुलनीय परिणाम दिया सामांय । हमारे इष्ट दृष्टिकोण इस धारणा पर आधारित है कि जीनोम के कुछ क्षेत्रों में पूरी तरह से हमारे एस चरण नमूने में दोहराया जाता है । हम पढ़ें गहराई है कि एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटा सेट में मूल 12 जल्द ही फायरिंग उच्च विश्वास ("विश्वास" स्कोर > = 7) के लिए इसी साइट पर सेट में हमारे डेटा में औसत पढ़ें गहराई के रूप में प्रतिनिधित्व पूर्ण पुनरावृत्ति निर्धारित किया है । (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies&table=Raghu2001_ori&ext_format=&format=tab) । सबसे अनुप्रयोगों के लिए, सामान्यता के लिए लिया दृष्टिकोण महत्वपूर्ण नहीं है और वहाँ कई उचित विकल्प हैं, सबसे बस गिनती योग पढ़ने के लिए सामान्य. हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि यदि नमूने के बीच दोहराए जाने वाले अनुक्रम की संख्याओं में बड़े अंतर होते हैं, तो पढ़ने के लिए सामांय गणना योग भ्रामक हो सकता है । उदाहरण के लिए, जब दो उपभेदों जिनकी rDNA सरणियों की तुलना कई गुना से अलग है, के लिए कुल पढ़ने की गिनती बड़ा rDNA सरणी artefactually के साथ तनाव के जीनोम के कुछ क्षेत्रों को सामांय बनाने के लिए छोटे के साथ तनाव से बाद में दोहराने के लिए प्रकट कर सकते है सरणी.
सारांश में, G2-seq प्रतिकृति profiling के लिए मौजूदा तकनीकों का एक तार्किक एक्सटेंशन का प्रतिनिधित्व करता है । अन्य अनुक्रमण-और microarray आधारित तकनीक की तरह, G2-seq जीनोम व्यापक कवरेज के 2d जेल विश्लेषण पर लाभ और प्रतिकृति मूल के स्थान के ज्ञान की आवश्यकता की कमी है । बाद विशेष रूप से स्तनधारी कोशिकाओं में प्रासंगिक है, जहां, उभरते खमीर के विपरीत, प्रतिकृति मूल विशिष्ट दृश्यों तक ही सीमित नहीं हैं । दूसरी ओर, 2d जैल डीएनए प्रतिकृति में आणविक मध्यवर्ती के संकल्प के एक स्तर को पूरी तरह से G2-seq द्वारा अप्राप्य प्रदान करते हैं । अंय जीवों जिनकी कोशिकाओं डीएनए सामग्री के अनुसार हल किया जा सकता है के लिए g2-seq विस्तार अपेक्षाकृत सीधे आगे होना चाहिए, हालांकि, उच्च eukaryotes के जीनोम के उच्च दोहराव प्रकृति कम पढ़ा दृश्यों का संरेखण बनाता है बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण । विशेष रूप से अब पढ़ने की लंबाई प्रदान उभरते अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों इस संबंध में उपयोगी साबित हो सकता है, खासकर के बाद से G2-seq अपेक्षाकृत उच्च त्रुटि दरों है कि अब के साथ संबद्ध किया जा सकता है मजबूत होना चाहिए17पढ़ता है । हमारे अनुभव में, तकनीकी समस्या यह है कि सबसे अधिक समस्याओं के कारण होने की संभावना है दे कोशिकाओं के बाद वे और हल किया गया है डीएनए के अलगाव से पहले बैठते हैं । इन कोशिकाओं को विशेष रूप से कमजोर होने के लिए और समय के साथ लाइसे दिखाई देते हैं, और डीएनए के भीतर सबसे अधिक एक घंटे या छंटाई के दो से अलग किया जाना चाहिए । होनहार इस तकनीक के लिए भविष्य के निर्देशों भागों की संख्या बढ़ाने में दोनों एस और G2 चरणों विभाजन शामिल जीनोम प्रतिकृति की गतिशीलता के उच्च संकल्प प्राप्त करने के लिए, जल्दी दीक्षा से देर से पूरा करने के लिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम अटल बिहारी को ग्रांट NIH GM117446 ने समर्थन दिया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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