Summary
フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。
Abstract
多数の技術は、細胞周期の S 期で DNA 複製の進行状況を追跡する開発されています。これらの技術のほとんどは、場所の解明とゲノム重複ではなく、その完了の開始時期に向かって指示されています。しかし、我々 はこれらの地域の染色体の破損や、突然変異レベルが上昇に苦しむので、レプリケーションを完了する最後はゲノムの領域を理解し、彼らは病気と高齢化に関連付けられていることが重要です。ここで我々 は我々 が代わりにレプリケーションを完了する最後のゲノムのこれらの領域を識別するために複製開始反応を監視するために使用されている技術を拡張する方法について説明します。このアプローチは、フローサイトメトリーと高スループット シーケンスの組み合わせに基づいています。このレポートは、この手法の酵母への応用に焦点を当て、アプローチは DNA の内容によると流れの cytometer で並べ替えることができます任意のセルで使用できます。
Introduction
真核生物ゲノムのレプリケーションは、レプリケーションでは、レプリケーションからフォーク (Fragkosら2015年1文献) 両方の方向で進むの起源と呼ばれる複数の個別サイトで開始されます。起源が異なるタイミングと、焼成の効率とレプリケーション元のアクティビティを監視し、この変化の原因を解明するいくつかの手法が開発されました。個々 の原点の活動は、単一座礁させた DNA2、アクティブな起源の周りのフォームのレベルから推論できるまたは特定の複製中間体3を監視する第 2 ゲルの電気泳動を使用して、どちらで検出できます。放射性プローブ。起源は、前者の特定の知られていたシーケンスに制限され、これらの手法の両方はより簡単に出芽酵母よりも哺乳類セルので適用されます。マイクロ アレイの出現により、世界的に焼成の起源を評価することが可能になりました。これは最初重い同位体と DNA の分類、中含まれている軽い同位体に G1 ブロックから細胞を放出、重・軽ハイブリッド DNA ゲノム4の形成を監視によって行われました。高スループット シーケンスの導入許可同様ゲノムは、高価な同位体ラベリングの要件なしで活動を起源の監視します。細胞は、DNA の内容によると流れの cytometer のディープ シーケンスを受ける DNA ソートされます。シーケンスのカバレッジが S 期にわたって 2 倍に 1 x から進むにつれて、ので相対的なレプリケーションのタイミングは G1 あるいは G25,6S 期細胞の読み取りの深さを比較することによって評価できます。特に酵母に適用これらのテクニックは、dna 塩基配列、クロマチン構造と DNA 複製タンパク質起源タイミングと効率の規制方法のより深い理解につながった。
細胞増殖の中に遺伝情報の忠実な伝達には、DNA の複製の起源で行われるの唯一の成功の開始だけでなく、複製フォークが満たすために発生するレプリケーションが正常に完了が必要です。レプリケーションの開始のようなレプリケーションの完了のタイミングは、残りの細胞周期の後半でもレプリケートされていない特定の領域にゲノム間で異なります。このような領域は特にアクティブな複製の起源から遠いかシーケンスやクロマチン構造の DNA ポリメラーゼを阻害する場合があります。後期地域をレプリケートする染色体の破損および高い突然変異率と関連付けられ、がんと老化7,8,9に関与している壊れやすいサイトとして自分自身のマニフェストことができます。しかし、ゲノムの安定性の維持に DNA の複製が正しく完了の重要性にもかかわらずこれが起こる場所と方法の理解が遅れてレプリケーション開始。後半レプリケーションは病気に関連付けられている個々 の遺伝子の中で、たとえば、qPCR10場所の解明と後半のレプリケーションを欠けている原因の基礎となるグローバル研究検討されています。ここで我々 は"G2 seq"高スループット シーケンスのゲノム複製の完了に光を当てるとフローサイトメトリーを組み合わせる我々 として酵母の11を参照手法について述べる。軽微な変更は、このプロトコルは DNA 量順の流れをすることができます任意のセルに合わせることができます。
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Protocol
1 のセルの準備の流れ Cytometry の並べ替え
- 文化一晩成長後 5 x 106 1.5 mL あたり7セルを 10 倍の密度に達するような YEPD 液 8 mL を含む 15 mL の試験管を接種する (注 1 の議論」を参照)。
- 酵母 (1,400 × g、室温、4 ° C で) 5 分 15 mL スクリュー キャップ遠心管でスピンダウン、1.5 mL 70% エタノールで 1.6 の mL および microfuge の管に転送この座っている部屋の温度で 1 時間または氷 (少なくとも 3 h をさせる細胞を再懸濁します4 ° C で不明確に保存されることができます) (議論点 (2) を参照)。
- 1 分の microfuge (14,000 x g、4 ° C) で酵母をスピン、1 分の 1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2、スピン ・ ダウン (14,000 x g, 4 ° C) で再懸濁します、上清を吸引、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 で再懸濁します、0.25 mg/mL 50 ° c または一晩熱ブロックまたは水浴で 37 ° C で 1 h RNAse ソリューションを含みます。
- 50 μ L, プロテイナーゼ K 溶液 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、ボリューム グリセリン 50% の重量で再停止される) を追加し、50 ° C で 1 時間インキュベート
- Cells (14,000 × g, 4 ° C) スピンダウン、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 細胞を再懸濁します、スピン ・ ダウン (14,000 x g、4 ° C)、真空上清を吸引、クエン酸ナトリウム 50 mM で再停止される 1 mL 1 μ M 緑核酸ひずみで再懸濁します、pH 7.2 室温で 1 時間暗闇の中で孵化、2 x 2 の超音波 s 各 (出力 2 ワット)。
2. 細胞選別
- 図 1のように各細胞周期の段階から、少なくとも 160 万単相細胞を収集フェーズ G1、S、"初期 G2 は、"、「後半 G2」は、DNA 内容に従ってセルを並べ替えるセルの並べ替えアイコンを使用して、(議論点 (3) を参照)。
- Microfuge の管にセルを転送およびスピン ・ ダウンで 4 ° C、および microfuge 14,000 x g で 20 分間細胞と真空上清を吸引 (ペレットは、無期限に-20 ° C で凍結保存ことができます; ポイント (4) の議論を参照)。
3. DNA の抽出とシーケンシング ライブラリの準備
注: 次の手順に基づいて酵母ゲノム DNA 抽出キットで「議定書 I」(材料の表を参照してください).
- 酵母細胞壁溶解酵素細胞壁や酵母細胞壁溶解酵素の 5 μ L を消化、ボルテックス、によって再懸濁します、37 ° C、40-60 分インキュベートすることができる独自のバッファー「消化バッファー」の 120 μ L を追加します。
- 「換散バッファー、」洗剤と渦 10-20 s ハードを含む独自のバッファーの 120 μ L を追加します。
- 250 μ L のクロロホルムを追加 - 徹底的にミックス 1 分。
- 2 分間および microfuge の最高速度で回転します。
- DNA 結合列と、および microfuge の最高速度で 1 分間遠心上清をロードします。
- 「DNA 洗浄バッファーの「エタノール、および、および microfuge の最大の速度で 1 分間遠心を含む独自バッファー 300 μ l を追加します。流れを破棄 DNA 洗浄バッファーの 300 μ L を追加し、洗浄プロセスを繰り返します。
- 新鮮なおよび microfuge の管にスピン列を転送、水 (ない TE) の 60 μ L を追加 - 1-3 分待って、10 の遠心分離機、DNA を溶出します。
- された dsDNA 高感度バッファーで希釈 1: 200 と、指定された規格の 10 μ L を用いた校正、蛍光光度計で測定蛍光 dsDNA 高感度試薬の 195 μ L DNA の 5 μ L を追加することによって濃度を測定します。10 と 50 ng の DNA 収量の間期待します。
- 超音波 (ピーク事件電源 450、デューティー比 30%、サイクル/バースト 200、治療時間 60 秒、水レベル 6) 250-350 bp の断片を DNA を破壊します。
- DNA サンプル調製キットを使用してライブラリを準備し、高速モードで DNA シーケンス楽器でシーケンス処理するそれ (少なくとも 1000 万 50 bp シングル エンド ヒット) (議論注 (5) を参照)。
4. データ ・ レプリケーションの世代シーケンスの解析のプロファイルします。
- Gsnap12を用いた出芽酵母sacCer3 ゲノム シーケンスを配置 (ディスカッション注 (6) を参照)。
- 塩基あたりを読む Bedtools の"genomeCoverageBed"ソフトウェア13を使用して深さを決定します。
- 存在する場合、読み取りの深さで artefactual スパイクを削除 (ディスカッション注 (7) を参照)。
- 滑らかな読む深さ r"runMean"関数を使用してウィンドウをスライド 20 kb で中央分離帯を用いた染色体によってパッケージ"caTools"(ディスカッション注 (8) 参照)。
- プロットは完全にレプリケートされた読み取りの深さ (ディスカッション注 (9) を参照) の割合として S 段階、初期 G2 後半 G2 で深さを読みます。
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Representative Results
我々 は出芽酵母における後半の複製サイトを識別するために上記の手順を使用しています。人工染色体の知られている遅い複製領域を使用してこの方法をテストを正確かつ信頼性の高い技術を証明しました。我々 の結果も示しているレプリケーションのタイムリーな完了の生物学的重要性染色体 7、我々 は G2 seq 結果に基づいて後期複製として識別、後期複製領域が失われたことを示すことによって約散布地域11同等より頻繁制御します。
G2 seq と結果の具体的な例を図 2に示します。私たちと仮定したが欠けている Sir2 と呼ばれる蛋白質脱アセチル化酵素を細胞で特に遅くレプリケートされたゲノムの領域でしょう。図 2 aは、(赤) (青) 野生型とsir2データ分析の進行を示しています。(上段) の生のデータには、ほとんどが Ty 要素の存在のための大きなスパイクが含まれています。これらのスパイクは、2.5 倍の各サンプル (中間の行) の深さを読む中央で読み取りの深さをキャッピングで削除されます。Despiked データは、20 kb のスライディング ウィンドウ (下の行) と滑らかになります。最後に、データは正規化され、G1 のレベルとの比としてプロットします。Sir2変異体は、典型的な後期複製の領域は、図 2でハイライトされます。
図 1.流れ cytometry プロファイルを示す細胞周期分画を使用しました。すべてのゲートの外側の限界をマークしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2 。(A B)生データ (最上位の行) からデータ処理の進行データ (中間の行) を despiked し、野生のタイプ (A) とsir2 (B) の (下行) データを平滑化します。(C) の比率 S 相 - 初期 G2-、後半 G2-G1 に深さを読みます。青と赤のsir2の野生型。右上にハイライト表示領域は、 sir2変異を特定後期複製領域を示しています。スケールによると完全な (2 n) レプリケーションの一部完全にレプリケートされていないセルが 0.5、1 で完全にレプリケートされたセルに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
一方、この手法は堅牢で、比較的まっすぐな前方、特に注意は次に捧げられるべき。
(1) 以来、文化は接種後必要な密度だけ 4 h に到達した後収穫される場合細胞周期の分布に相違が顕在ログ段階に達する前に少なくとも 12 時間の文化が成長するを推奨します。我々 の仮定では比較的安定した平衡に達した細胞周期の分布はより飽和させた文化は、最近では新鮮な媒体に転送されているときにまだ流動的で配布よりも「本物の」ログ位相分布を表します。
(2) 固定する前にセルを回転の代わりに細胞は、酵母の培養にエタノールの最終濃度が 70%、100% エタノールを直接追加しても修正できます。細胞は合成またはリッチ (YEPD) 培地で育てることができます。
(3) 細胞周期の段階は、530 nm の発光領域の関数としてプロットのセル番号で並べ替えの可視化します。我々 は S と G2 と G1 と S の間の変曲点が S 段階の輪郭を描くため堅牢なランドマークとなる、我々 は初期と後期の G2 を分離する境界として G2 最大値を使用を発見しました。「初期 G2」とセルは S 段階 DNA の複製が完了するまで、技術的に意味で精度を犠牲にしておそらく明快さと簡潔さのため「後半 G2」の用語を使います。G2 seq の目標は後半 G2 分数で明らかにされる、非常に遅い複製サイトの識別には S 期と細胞周期のすべての段階を通じてレプリケーションに従う初期 G2 細胞を収集します。
(4) が、セルが並べ替えの後速やかにスピンダウンする重要です。セル一晩ダウンそれらを回転する前に座ってはいけない。彼らは 4 ° C で保存されている場合、遠心分離によって細胞を回復する, 並べ替え時にもろくなっていて時間と溶解の問題が多かった。
(5) としていくつか 500 万読み取りで十分ですが、プロット読み取りの番号が小さいほど滑らかになります。さらに少ない読み取りデータ セットは 20 kb より大きい windows を平滑化では対応できる場合がありますが、我々 はこれを試していません。
(6) 広く使用した配置またはすべてのソフトウェア (例えば、ボウタイ14Novalign (http://www.novocraft.com)、BWA15、Gsnap12) していきます。
(7) 高スループット シーケンス データ イーストからは、しばしば Ty 要素を反映して、読み取りの深さで時折スパイクを示します。私たちは 2.5 x 2.5 x 中央より大きい繰り返し伸張 (例えばrDNA) を含む知られている地域の外の読み取りの深さの深さを読む中央のサンプルを置き換えることによって、これらを排除します。RDNA および染色体の端を除外するには、反復的な要素を含む知られているので。この「despiking」に R 言語を使用して例は次のとおりです。
# は、データを含む「読み取り」と呼ばれるデータ フレームを作成します。
chr <-担当者 ('クリスマス'、10)
pos <-seq (1, 10)
rd <-c (3、4、6、5、88、2、9、10、900、1)
読み取り <-計数 ('染色体' = chr、
'位置 pos =
'read_depth' = rd)
#"despike"読み取りの深さ。
読み取り [, 'despiked'] <-ifelse (読み取り [, 3] > (2.5 * median(reads[,3]))、
(2.5 * median(reads[,3]))、
reads[,3])
「キャップ」または"despiking"も可能である 1 つ以上の場所にマップの読み取りを除くが、これは例のちょうど 2 つの場所にマップ読み込みがなくなります。出芽酵母、先祖代々 重複16起因のゲノムを操作するときは、1 つ以上の場所にマップが、貴重な情報を提供する読み取りのインスタンスも珍しくありません。
(8) R パッケージ「動物園」(https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) で"rollmedian"関数と"runmean"関数 R パッケージ「caTools」(https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html) に匹敵する結果を得た。
(9) は同等の結果を与えたすべての読み取りの深さを正常化する多数の方法で実験しました。私たちの有利なアプローチは S 相サンプルではゲノムの少なくともいくつかの領域が完全にレプリケートされているという前提に基づいています。我々 は中央値初期発射精度の高い 12 に対応するサイトで、データ セットの深さを読むの完全なレプリケーションを表す読み取り深度を決定した (「信頼度」> = 7) 公開データ セットの起源。(http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & テーブル = Raghu2001_ori & ext_format = & フォーマット タブを =)。ほとんどのアプリケーションでは、正規化で使用したアプローチが重要ではないとの数の合計を読む最も単正規化多くの合理的なオプションがあります。ただし、反復配列の数のサンプル間に大きな差がある場合は正規化数の合計を読むが誤解することができますは注目に値するです。たとえば、2 系統が rdna 塩基配列が異なるいくつかの倍を比較すると、総カウントを取りに正規化を確認する大きい rDNA 配列を持つ株のゲノムの領域は小さいひずみよりも後で複製する artefactually 表示配列。
要約すると、G2 seq はレプリケーション プロファイル用の既存技術を論理的に拡張を表します。その他のシーケンス ・ マイクロ アレイ ・ ベースのテクニックのような G2 seq ゲルのゲノム広い範囲の分析との複製の起源の場所の知識の要件の欠如は、二次元の利点があります。後者は哺乳類細胞、どことは異なり出芽酵母の複製起点に限定されない特定のシーケンスに特に関連します。ゲルが G2 の seq 拡張 G2 seq DNA の内容によると、セルを並べ替えることができます他の生物にによって完全に達成不可能な DNA 複製の分子の中間の解像度のレベルは比較的まっすぐにする必要がありますを提供する一方、しかし、反復性の高い高等真核生物のゲノム性は、はるかに困難な短いリードの配列の配置になります。大幅に長く提供シーケンス技術を読む長さ役に立つかもしれないこの点、G2 seq は比較的長い読み取り17を関連付けることができます高いエラー率に堅牢なする必要があります、特に以来。我々 の経験で、最も問題が発生する可能性のある技術的な問題は彼らがソートされている後、DNA の分離の前に座っている細胞を知らせることです。これらの細胞は特に壊れやすい、時間とともに、溶解を表示され、DNA はせいぜい 1 時間または 2 つの並べ替えの内で分離する必要があります。この技術の有望な将来の方向性、完成の遅れを早期開始からゲノム複製の動態のより高い解像度を取得する分数の数が増え S と G2 の両方のフェーズに分割があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事は a. b. に NIH GM117446 助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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