Summary
Мы опишем технику для объединения проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности для определения конца репликации областей генома.
Abstract
Были разработаны многочисленные методы следить за ходом репликации ДНК через S-фазе клеточного цикла. Большинство из этих методов были направлены на выяснение местоположения и времени начала генома дублирования, вместо того, чтобы его завершения. Однако важно, что мы понимаем областей генома, которые последний для завершения репликации, потому что эти регионы страдают повышенные уровни хромосомных обрыва и мутации, и они были связаны с болезнью и старения. Здесь мы описываем, как мы расширили технику, которая была использована для мониторинга инициации репликации вместо определить те регионы генома последний для полной репликации. Этот подход основан на комбинации проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности. Хотя настоящий доклад сосредоточен на применение этого метода для дрожжей, этот подход может использоваться с любой клетки, которые могут быть отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК.
Introduction
Эукариотический геном репликация инициируется в нескольких дискретных сайтов, называется происхождение репликации, от которых репликации вилки действовать в обоих направлениях (обзор в Fragkos et al., 2015-1). Истоки различаются в их сроках и эффективности стрельбы, и были разработаны несколько методы для отслеживания репликации происхождения деятельности и выяснения причин этого изменения. Деятельность отдельных происхождение может быть выведено из уровней одноцепочечной ДНК2, какие формы вокруг активной происхождение, или с помощью электрофореза геля 2D для мониторинга репликации конкретных промежуточных3, оба из которых могут быть обнаружены с радиоактивные датчики. Оба эти методы применяются более легко в S. cerevisiae чем в mammalian клетках, потому что происхождение ограничены конкретным известных последовательностей в бывшем. С появлением microarrays стало возможным оценить происхождения, выпустив глобально. Впервые это было сделано путем маркировки ДНК с тяжелых изотопов, выпуская клетки из блока G1 в средних содержащих легкие изотопы и затем мониторинг формирования тяжелых свет гибридной ДНК через генома4. Введение высокой производительности виртуализации позволило аналогичные генома широкий мониторинг активности происхождения без требования дорогих изотопный маркировки. Клетки были отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК и их подвергается глубокой секвенирования ДНК. Потому что охват последовательности продолжается от 1 x до 2 x в течение фазы S, сроки относительной репликации можно оценить путем сравнения чтения глубины клеток в S фазе для тех, кто в G1 или G25,6. Эти методы, особенно применяется для дрожжей, привело к более глубокому пониманию как последовательность ДНК, Структура хроматина и белки репликации ДНК регулировать происхождения сроках и эффективности.
Верным передачи генетической информации в ходе пролиферации требует не только успешно инициации репликации ДНК, который проходит на происхождение, но и успешного завершения репликации, которое происходит, где встречаются репликации вилки. Как начала репликации сроки завершения репликации варьируется генома с некоторых регионов, остальные нереплицированные даже поздно в клеточный цикл. Такие регионы могут быть особенно отдаленные от истоков активной репликации или могут содержать последовательностей или структур хроматина, которые препятствуют полимераз. Поздно репликации регионы могут проявить себя как хрупкие сайтов, которые связаны с хромосомной поломки и более высокие скорости мутации и были причастны к раку и старению7,8,9. Однако несмотря на важность надлежащего завершения репликации ДНК в поддержание стабильности генома, наше понимание того, где и каким образом это происходит значительно отстает в инициации репликации. И хотя отдельные гены, чьи конце репликации был связан с болезнью были изучены с, например, ПЦР10, глобальные исследования, направленные на изучение места и основные причины позднего репликации хватает. Здесь мы опишем технику, которую мы ссылаемся как «G2 seq», в котором мы комбинируем проточной цитометрии с высокой пропускной способностью последовательности пролить свет на завершении репликации генома в дрожжи11. С незначительными изменениями этот протокол может быть адаптирована к любой клетки, которые могут быть потока сортировано согласно содержание ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток для потока цитометрии сортировки
- Прививать 15 мл пробирки, содержащие 8 мл бульона, YEPD, таким образом, что культуры достичь плотности тарелок 5 x 10-6 до 1,5 x 10-7 клеток / мл после ночи роста (см. Примечание 1 обсуждения).
- Спин вниз дрожжевых клеток (1400 x g, при комнатной температуре или 4 ° C) в колпачок пластиковых пробирок 15мл за 5 мин, Ресуспензируйте клетки в 1,5 мл 70% этанол и передачи 1.6 mL отцентрифугировать трубки, давая это сидеть в течение 1 ч при комнатной температуре или по крайней мере 3 h на льду ( можно бесконечно храниться при температуре 4 ° C) (см. обсуждение пункта (2)).
- Спин вниз дрожжевых клеток в отцентрифугировать (14.000 x g, 4 ° C) 1 мин, Ресуспензируйте в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2, спин вниз (14.000 x g, 4 ° C) в течение 1 мин, аспирационная супернатант Ресуспензируйте в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2 , содержащий 0,25 мг/мл РНКазы решение за 1 час при температуре 50 ° C, или на ночь при 37 ° C в блок или водой ванне тепла.
- Добавьте 50 мкл протеиназы K решение (высокомобильна в 10 мм трис рН 7,5, 2 мм CaCl2, 50% веса для тома глицерина 20 мг/мл) и инкубировать 1 час при температуре 50 ° C.
- Спин вниз клетки (14.000 x g, 4 ° C), Ресуспензируйте клеток в 1 мл 50 мм цитрат натрия, рН 7,2, спина вниз (14.000 x g, 4 ° C), аспирационная супернатант с вакуумом, Ресуспензируйте в 1 мл 1 мкм зеленый нуклеиновой кислоты штамм высокомобильна в цитрат натрия 50 мм , pH 7.2 и инкубировать в темноте за 1 ч при комнатной температуре, sonicate 2 x 2 s каждый (Выходная мощность 2 Вт).
2. ячейку Сортировка
- Используя ячейки сортировщик, Сортировка ячеек в зависимости от содержания ДНК в фазы G1, S, «раннего G2» и «конце G2», собирая по крайней мере 1,6 миллиона haploid клетки от каждой фазы клеточного цикла, как показано на рисунке 1 (см. обсуждение пункта (3)).
- Передавать трубы отцентрифугировать клетки и спина вниз клетки для 20 минут, 14.000 x g при 4 ° C в отцентрифугировать и аспирационная супернатант с вакуумом (гранулы могут храниться бессрочно заморожены при-20 ° C; см. обсуждение пункта (4)).
3. ДНК добыча и подготовка секвенирования библиотек
Примечание: Следующие шаги основаны на «протокол I» в добыче дрожжи геномной ДНК Kit (см. Таблицу материалы).
- Мкл 120 «Пищеварение буфера, «несвободных буфер, который позволяет литических ферментов дрожжей дайджест клеточной стенки и 5 мкл литические фермента дрожжей, Ресуспензируйте vortexing и инкубировать при 37 ° C 40-60 мин.
- 120 мкл «Буфера Lysis, «несвободных буфер, содержащий моющего средства и вихрь трудно для 10-20 s.
- Добавить 250 мкл хлороформ - тщательно перемешать за 1 мин.
- Спина на максимальной скорости в отцентрифугировать на 2 мин.
- Загрузите супернатант на ДНК привязки столбцов и центрифуги на максимальной скорости в отцентрифугировать за 1 мин.
- Добавьте 300 мкл «ДНК мытья буфера, «несвободных буфер, который содержит этанол и центрифуги за 1 мин на максимальной скорости в отцентрифугировать. Отменить через поток, 300 мкл буфера мытья ДНК и повторить процесс стирки.
- Передать трубку свежие отцентрифугировать столбце спин, 60 мкл воды (не TE) - ждать 1-3 мин и затем центрифуги для 10 s элюировать ДНК.
- Измерять концентрацию, добавив 5 мкл ДНК 195 мкл Реагента dsDNA высокая чувствительность, которая была разбавленных 1: 200 dsDNA высокая чувствительность буфера, а затем измерения флуоресценции в флуориметр, используя 10 мкл комплект стандартов для калибровки; ожидаете между 10 и 50 нг ДНК всего урожая.
- Sonicate (пик инцидента мощность 450, коэффициент 30%, циклов за взрыв 200, лечение время 60 s, уровня воды 6) разорвать на 250-350 bp фрагменты ДНК.
- Подготовьте библиотеку с помощью ДНК образца подготовка комплекта и последовательности его (по крайней мере 10 миллионов 50 bp один конец прочтений) на инструменте секвенирования ДНК в быстрый режим (см. Примечание обсуждение (5)).
4. Анализ последовательности данных и генерации репликации профилей
- Выравнивание последовательностей генома sacCer3 Saccharomyces cerevisiae , используя Gsnap12 (см. Примечание обсуждения (6)).
- Определите, что пара-база читать глубины с использованием программного обеспечения «genomeCoverageBed» Bedtools'13.
- Удаление артефакта шипы в глубинах чтения, если присутствует (см. Примечание обсуждения (7)).
- Гладкая прочитаны глубины хромосомы, использование медианы в 20 КБ, скользящее окно, с помощью функции «runMean» в R пакет «caTools» (см. Примечание обсуждения (8)).
- Участок читать глубины в S фазе, ранние G2 и конце G2 в процентном отношении глубин полностью реплицированных чтения (см. Примечание обсуждения (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали процедуру, описанную выше для определения конца репликации сайтов в многообещающий дрожжей. Опробовать этот подход с использованием известных конце репликации региона на искусственных хромосом доказали технику для точной и надежной. Наши результаты также продемонстрировали биологической важности своевременного завершения репликации, показывая, что поздно тиражирование региона на хромосоме 7, которые мы определили как конце репликации на основе результатов наших G2-seq, было потеряно примерно в три раза чаще, чем сопоставимые управления региона11.
Конкретный пример результатов с G2-seq показан на рисунке 2. Мы предположил что там будет областей генома, который особенно поздно реплицироваться в клетках не хватает белка гистонов, называется Sir2. Рисунок 2A показывает прогрессию анализа данных для дикого типа (синий) и sir2 (красный). Необработанные данные (Верхняя строк) содержат большие пики, большинство из которых из-за присутствия элементов Ty. Эти шипы удаляются укупорки чтения глубины 2,5 x средней глубины для каждого образца (в середине строки) читал. Despiked данные затем сглажены с 20 КБ скользящее окно (Нижняя строка). Наконец данные нормализованы и как коэффициенты к уровням в G1. Типичный региона конце репликации, которая появляется в sir2 мутант выделяется в рисунке 2 c.
Рис. 1. Поток цитометрии профиль, указывающее клеточного цикла дроби используется; внешние границы всех ворот отмечен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. (A-B) Прогрессирование обработки данных от необработанных данных (верхних строк), despiked данных (средняя строк) и сглаживаются данных (нижней строки) для дикого типа (A) и sir2 (B). (C) коэффициенты S фазу-, ранние G2-и конце G2-G1 читать глубины. Дикого типа синим и sir2 в красный цвет. Выделенную область в правом верхнем углу показывает конце репликации региона конкретных sir2 мутанта. Масштаб показывает долю репликации полного (2N); полностью нереплицированные ячейки будет появляться в 0,5, полностью репликации клеток в 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот метод является надежной и довольно прямо вперед, особое внимание следует обратить на следующее:
(1) мы рекомендуем, что культур расти по крайней мере 12 часов прежде чем они достигнут этапа журнала, поскольку различия проявляются в клеточный цикл распределения, если культур собирают после достижения желаемой плотности просто 4 h после прививки. Мы исходим из того, что клеточного цикла распределения, которая достигла относительно стабильное равновесие лучше представляет распределение фаза «реальных» журнала чем распределение, которое все еще находится в поток при насыщенных культура была передана недавно свежие среднего.
(2) вместо из спиннинг вниз клетки до фиксации, клетки могут устанавливаться также непосредственно добавив 100% этанола в культуру дрожжей, так что конечная концентрация этанола составляет 70%. Клетки можно выращивать в среде богатых или синтетические (YEPD).
(3) для сортировки по номеру построения клеток как функция 530 Нм выбросов области визуализируются фазы клеточного цикла. Мы нашли, что точки перегиба между G1 и S и S и G2 служить надежные ориентиры для разграничения фазы S, и мы используем G2 максимум как границы для разделения ранних и поздних G2. Мы используем термины «раннего G2» и «конце G2» для ясности и краткости, возможно за счет точности в том смысле, что клетки являются технически в S-фазе завершения репликации ДНК. Хотя цель G2-seq состоит в идентификации очень поздно репликации сайтов, которые должны быть выявлены в конце G2 фракции, мы собираем S-фазе и начале G2 клетки следовать репликации через все фазы клеточного цикла.
(4) критически важно закрученная клетки вниз незамедлительно после сортировки. Не позволяйте клетки сидеть всю ночь перед спиннинг их вниз. У нас были проблемы восстановления клетки центрифугированием, если они были сохранены на 4 ° C, предполагая, что они становятся хрупкими после сортировки и лизируют с течением времени.
(5) как мало как 5 миллионов читает достаточно, но участки становятся менее гладкая с меньшее количество операций чтения. Наборы данных с еще меньше читает может быть в состоянии удовлетворяться путем сглаживания с windows размером более 20 КБ, но мы не пробовали это.
(6) любого программного обеспечения широко используется выравнивание (например, Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com),15АДЖУ или Gsnap12) будет работать.
(7) высокой пропускной способности данных последовательности из дрожжей Показать случайные шипы в чтения глубинах, которые часто отражают элементы Ty. Мы устраняем эти путем замены 2,5 х Средний образец читать глубины для чтения глубины за пределами регионов, содержат повторяющиеся участки (например, рДНК), которые больше, чем 2,5 x медиана. Потому что они известны содержат повторяющиеся элементы исключаются рДНК и концы хромосом. Примером этой «despiking» на языке R является следующее:
# создать фрейм данных под названием «читает», содержащий данные:
ЦПЧ <-респ ('ХПН', 10)
POS <-seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
читает <-data.frame ('хромосома' = КПЧ,
«позиция» = pos,
«read_depth» = rd)
# «despike» читать глубины:
читает [, «despiked»] <-ifelse (читает [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
«Ограничение» или «despiking» также может быть достигнуто в исключая чтений, которые сопоставляются с более чем в одном месте, но это устранит чтений, которые сопоставляют, например, всего в двух местах. Экземпляры чтений, которые сопоставляются с более чем в одном месте, но по-прежнему предоставляют ценную информацию, не являются редкостью, при работе с S. cerevisiae, чей геном результатом предков дублирования16.
(8) мы получили сопоставимые результаты с функцией «rollmedian» в пакете R «зоопарк» (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) и функцию «runmean» в пакете R «caTools» (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) мы экспериментировали с многочисленные методы, чтобы нормализовать чтения глубины, все из которых дал сопоставимые результаты. Наш благоприятствования подход основан на предположении, что по крайней мере некоторые регионы генома полностью реплицируются в нашей выборке фазы S. Мы определили чтения глубины, которая представлена полной репликации как медиана читать глубины в наш набор данных на сайтах соответствующих 12, ранние стрельбы высокая достоверность (оценка «доверие» > = 7) происхождение публично доступных данных в наборе. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & таблицы = Raghu2001_ori & ext_format = & формат = вкладка). Для большинства приложений подход на нормализацию не является критическим, и есть много разумных вариантов, наиболее просто нормализации для чтения составляет всего. Однако стоит отметить, что, если существуют большие различия между образцами в число повторяющихся последовательностей, нормализации читать фото итогов может ввести в заблуждение. Например при сравнении двух штаммов, чьи рДНК массивы отличаются несколько раз, нормализации общей чтения графов можно сделать определенные регионы генома штамма с большего массива рДНК, как представляется, artefactually повторить позже, чем сорт с меньшего массив.
В резюме G2-seq представляет логическое расширение существующих методов профилирования репликации. Как и другие методы, на основе последовательности и microarray дна G2-seq имеет преимущества над 2D гель анализ генома широкое освещение и отсутствие требования знаний о месте происхождения репликации. Последний является особенно актуальным в mammalian клетках, где, в отличие от в многообещающий дрожжей, происхождение репликации не ограничиваются конкретной последовательности. С другой стороны 2D гели обеспечивают уровень разрешения молекулярных интермедиатов в репликации ДНК совершенно недостижимой, G2-след расширение G2-seq для других организмов, клетки которых могут быть отсортированы по ДНК содержание должно быть довольно прямо вперед, Однако высоко повторяющийся характер геномов высших эукариот делает выравнивание коротких последовательностей чтения гораздо более сложной. Новые технологии виртуализации, которые предоставляют значительно больше читать что длина может оказаться полезным в этом отношении, особенно поскольку G2-seq должно быть относительно высокими с более высоким уровнем ошибок, которые могут быть связаны с более читает17. Наш опыт технические проблемы, что является наибольшей вероятностью вызвать проблемы давая сидеть после того, как они были отсортированы и до изоляции ДНК клетки. Эти клетки представляется особенно хрупким и лизируют со временем, и ДНК должны быть изолированы в течение максимум на час или два сортировки. Перспективные направления для этой техники включают, разделив все большее число фракций получить высокое разрешение динамики генома репликации, от раннего начала позднего завершения фазы S и G2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана гранта NIH GM117446 а.б.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
