Summary
Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.
Abstract
O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.
Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.
Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.
Introduction
Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente1. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta o desenvolvimento das artérias colaterais. Os monócitos são um tipo de célula importante associado com collateralization. Nosso grupo centrou-se em Pesquisar os efeitos de monócitos em áreas de inflamação4,5, em particular, usando o modelo de isquemia do membro posterior para induzir isquemia e inflamação subsequentes6. Os monócitos lar de áreas de inflamação e causam respostas sistêmicas complexas que levam ao desenvolvimento de collateralization7.
Com o uso da microscopia intravital, podemos estudar o comportamento dessas células na vivo e observar a orientação de monócitos injetados para as áreas de inflamação. A maioria dos estudos anteriores descrevem apenas post-mortem de análises, que possuem desvantagens, incluindo uma introdução de artefatos histológicos e um grande número de animais necessários para preparações. Com nossa abordagem, podemos investigar processos imunológicos e formação colateral através de viver de imagem em múltiplos pontos de tempo.
Além do desenvolvimento das artérias colaterais em áreas isquêmicas, monócitos também influenciam o crescimento do tumor. Para investigar estes processos, injetamos uma matriz de membrana basal, como extraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame, um tumor rico em proteínas de matriz extracelular8e analisar usando microscopia intravital. Esta matriz é usada para teste de tela moléculas para formação de rede de células endoteliais ou terapias contra o cancro através da inibição angiogênico; Neste caso, vamos avaliar o potencial angiogênico de tumor de monócitos para celular terapia9,10,11.
O objectivo do presente protocolo é demonstrar uma maneira fácil e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo . Podemos gerar um ambiente de teste mais realista em relação ao exame histológico do post-mortem o tecido muscular.
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Protocol
nosso estudo foi realizado com a permissão do estado de Saxônia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, de acordo com a seção 8 da lei alemã de proteção animal. (§ 8, n. º 1 da lei alemã de proteção animal de 18.05.2016 - BGBI. Eu s. 1206, 1313, § 31 de TierSchVersV de 13.08.2013).
Nota: para os experimentos aqui, 8 a 12 camundongos BALB/c machos de semana foram utilizados, e monócitos humanos de doadores de sangue foram utilizados para a visualização de monócitos através de microscopia intravital.
1. preparação da célula
Nota: para o isolamento de monócitos, por favor, veja nosso vídeo anterior publicado na JoVE para instruções: " isolamento e endovenosa injeção de murino medula óssea derivada Os monócitos " por Wagner et al. 4
Nota: quando trabalhar com as células de todas as etapas deve ser esterilizado para evitar a contaminação.
- Coloracao celular com 3,3 '-perclorato de Dioctadecyloxacarbocyanine
- Ressuspender as células em meio de cultura livre de soro com uma densidade de 1 x 10 6 células/mL.
Nota: Apenas meio livre de soro permite uma coloração eficiente, uma vez que o corante lipofílico já caso contrário iria ser capturado pelos componentes lipofílicos do soro. - Adicionar 5 µ l de 1mm 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato em dimetilformamida a 1 mL de suspensão de célula e ressuspender cuidadosamente.
- Incubar a solução de célula a 37 ° C por 20 min.
- Centrifugar as células a 37 ° C e 500 x g, durante 5 min.
- Desalojar o sobrenadante e ressuspender as células com o meio de soro suplementado quente vitela fetal 37 ° C.
- Repetir as etapas 1.1.4 e 1.1.5 duas vezes.
- Contar as células com a fórmula:
- Ressuspender as células com 150 solução de NaCl 0,9% estéril µ l.
- Injetar as células a veia da cauda.
- Ressuspender as células em meio de cultura livre de soro com uma densidade de 1 x 10 6 células/mL.
2. Anestesia
- Anestesia por inalação
- vaporizar isoflurano com a ajuda de um vaporizador usando uma concentração de 5% em um escaninho fechado sob uma capa de segurança química.
- Cuidado com o mouse e colocá-lo para o lixo.
- Lidar com o animal pela pele do pescoço posterior, depois que parou de se mover.
- Anestesia intraperitoneal
Nota: anestesia de uso isoflurano, descrita no passo 2.1, para realizar uma injeção intraperitoneal. Com a recuperação rápida e de curta duração efeito narcótico da anestesia isoflurano, é mais fácil lidar com o mouse e injetar a anestesia intraperitoneal.- Use uma solução de 2,4 mL cetamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL NaCl (0,9%) para a injeção intraperitoneal.
- Pesar o animal antes de aplicar o anestésico.
Nota: A fórmula para o anestésico é:
- usar uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G para injectar a solução para o baixo-ventre esquerdo.
- Coloque o mouse em sua gaiola e esperar pelo efeito narcótico.
Nota: O efeito narcótico normalmente aparece dentro de 5 min se a injeção foi bem sucedida. A correta profundidade da anestesia pode ser determinada pela ausência de reflexo de tampa ou reação a pitada do dedo do pé, bem como uma taxa de respiração regular, controlada.
3. Implantação da membrana basal, como Matrix
Nota: Este método é usado pelo nosso grupo para estudar a angiogênese do tumor após a injeção de monócitos. Dependendo das experiências, fatores de crescimento pode ser adicionados à matriz da membrana basal-like. Realizamos a ligadura da artéria femoral antes de injetar o tumor no flanco do mouse. A matriz deve ter uma temperatura de 4 ° C para a injeção. A esta temperatura, a matriz é fluido; o gel endurece em um sólido à temperatura corporal (37 ° C). Para melhor visibilidade da matriz subcutânea plug, raspar a pele do rato no local da injeção.
Nota: opcional: Adicione 100 ng fator de crescimento fibroblástico básico, 300 ng vascular fator de crescimento endotelial e 26 UI heparina sob condições estéreis para a matriz de membrana basal-like.
- Carregar 1 mL de matriz em uma seringa de insulina 30g e loja no gelo até o uso.
- Colocar o animal na mesa e mantenha a pele do rato ao lado do local da injeção, no flanco.
- 500 µ l da membrana basal, como matriz de injectar por via subcutânea.
Nota: Por razões práticas, é necessário injetar a membrana basal, como matriz compacta em um único local para evitar dispersão subcutâneo. Será mais fácil desalojar o artificial tumor do tecido após sacrificar o mouse no final do experimento.
4. Injeção da veia da cauda
Nota: praticar a injeção de veia de cauda com solução de NaCl em animais de teste antes de experimentação. Se os monócitos não podem adequadamente ser injetados na veia do rabo, não haverá nenhum efeito sistêmico sobre o collateralization. Neste protocolo, injetamos monócitos 2,5 milhões. Tentar injetar não mais do que 5 µ l/g de peso corporal.
- Use a solução de monócitos preparada sob passo 1.1.8 contendo 2,5 milhões monócitos.
- Usar uma agulha de 30g e uma seringa de insulina 1 mL para a injeção.
- Cuidadosamente lidar com o mouse, conter o animal a retenção e verifique se o mouse não é prejudicado e tem espaço adequado para a respiração.
- Fazer a retenção sobre a almofada de aquecimento para que a cauda pode entrar em contato com a placa.
- Identificar as veias de cauda, que estão localizadas no lado lateral da cauda.
- Fugissem a 90 °, então a veia da cauda aparece na parte superior da cauda.
- Desinfectar o lado de injeção antes de injetar os monócitos.
- Tentar injectar a solução de monócitos em um ângulo plana com o bisel da agulha virado para cima
Nota: Pare a injeção se aparecer uma bolha, como este é um sinal de uma injeção de falha. Tente o procedimento novamente mais proximalmente. - Parar o sangramento no local da injeção, aplicando uma pressão suave na cauda para cerca de 60 anos.
- Observar o animal durante 30 min monitorar para efeitos colaterais sistêmicos e posicione o mouse em sua jaula, depois que o animal se recuperou totalmente.
5. A microscopia intravital
- preparação
- Coloque o mouse anestesiado sobre a almofada de aquecimento (37 ° C) para manter uma temperatura constante e corrigir as patas no lugar com fita adesiva.
- Desinfectar a pele no local da perna ou flanco que é usado para a microscopia.
- Raspar a região de interesse para melhor manuseio e para evitar a interferência com cabelo.
- Excisar a pele com um bisturi estéril e pinça fina em uma área quadrada de 0,5 x 0,5 cm.
Nota: É importante manter a região de interesse húmidas; caso contrário, a qualidade das imagens e tecido ficará comprometida. Solução de NaCl pode ser usada para umedecer a área. - Coloque a perna entre dois selos ajustáveis e coloque um vidro de tampa em cima os selos.
- Garantir que o tecido é molhado e está em contacto com o vidro.
- Inject 50 µ l rodamina dextrano retrobulbar no sistema venoso para melhor visibilidade dos vasos.
- Começar a microscopia e ajuste a posição da perna, se necessário.
- Configurações de microscopia intravital
- ligar o microscópio, computador, interfaces eletrônicas e lasers.
- Ligar a unidade de aquecimento da câmara de incubação e/ou aquecimento fase (placa/almofada) e definir a temperatura a 37 ° C.
- Iniciar o software de aquisição. Se o microscópio é equipado com um scanner de ressonância, selecione esse modo de digitalização rápido.
- Esperar até que a temperatura atinja um nível constante (35-37 ° C)
Nota: Uma temperatura estável é importante para: (a) o mouse, o que sob anestesia não pode controlar sua temperatura corporal e (b) evitar ou pelo menos minimizando deriva focal. Isto pode demorar 1h para várias horas, dependendo das condições do ambiente (por exemplo, sistema de ar condicionado e o número de fontes de calor na sala, incluindo as pessoas). Se os objectivos de imersão são usados, zona de contato entre a lente e tampa de vidro (ou tecido) é uma fonte típica de instabilidade. Aquecimento a lente com um aquecedor objetivo pode ajudar; Alternativamente, um microscópio com um sistema de autofoco é altamente recomendado. - Selecionar uma lente de ampliação com uma alta abertura numeral que preenche os requisitos da resolução do experimento (ver nota no final desta seção).
- Otimizar as configurações de microscópio em relação ao ganho, ajustes da canaleta, velocidade de digitalização, pixels de resolução, profundidade volume, tamanho de etapa e em média antes de colocar o animal experimental no palco.
- Scan bidirecionalmente para reduzir o tempo de aquisição.
- Coloque o mouse anestesiado no palco escaldadas microscópio após o microscópio atingiu condições estáveis e as configurações foram testadas com a ajuda de um boneco.
- Trazer a região de interesse dentro da matriz da membrana basal, como em foco usando iluminação luz brilhante e inspecionar brevemente os capilares por luz ultravioleta com configurações de filtro adequado para o fluorophores aplicada.
- Alternar para digitalização modo; iniciar a digitalização no modo de baixa resolução de 256 x 256 e aumentar o ganho e poder do laser até um sinal é observado no monitor.
- Foco na estrutura de interesse. Zoom até que todos os detalhes são visíveis.
- Define " começar a " e " final " posições na direção axial.
- Parar a varredura.
- Definir piso tamanho (por exemplo, 0,5 µm) e o número de aviões focais (por exemplo, 10-20).
- Interruptor para a resolução de pixel final (512 x 512 ou 1.024 x 1.024) dependendo da velocidade do movimento estruturas subcelulares ou células e selecione o scan velocidade (frequência de varredura) que se encaixa melhor aos movimentos. Bidirecional de digitalização é recomendada para fixar a aquisição de pilhas.
Nota: Selecione a maior taxa de varredura de digitalização que oferece qualidade de imagem suficiente. Verificadores de ponto típico oferecem velocidades entre 400 Hz e 1,4 kHz. Scanners de ressonância fornecem um adicional de 8 kHz ou 12 kHz. Reduzindo o número de linhas na direção y, a taxa de varredura pode ser aumentada (valores típicos são 512 x 512, 512 x 256 ou 512 x 200 pixels de resolução). Dependendo da relação sinal-ruído, um pode tentar melhorar a qualidade de imagem, adicionando a linha média entre 2 e 4. Normalmente, uma configuração de 512 x 200, com uma média de não resulta em um tempo de aquisição/quadro de 18 ms no modo bidirecional com um scanner de ressonância de 8 KHz; com 512 x 200 e 4 x em média, retarda para baixo para 56 ms por quadro.
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Representative Results
A microscopia intravital para o exame do tumor e o crescimento de vasos colaterais desencadeada por monócitos pode ajudar a revelar novos aspectos nos mecanismos moleculares de vasculogênese e arteriogenesis. As células devem ser preparadas e injetado cuidadosamente usando as etapas do protocolo. Diferenças podem levar a variações entre experiências simples. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso (Figura 1) para manter efeitos sistêmicos e evitar a embolia, que pode ocorrer se a injeção é realizada no sistema arterial.
Se a membrana basal, como matriz é usado, injetando-se lentamente para evitar a dispersão ajudará com plug explantação para periciar histológica (Figura 2, Figura 3). Após sacrificar o mouse, a ficha de matriz da membrana basal, como irá ser explantada do flanco do mouse. Dentro a ficha de membrana basal, como matriz, podemos medir vascularização contando capilares dentro de diferentes configurações experimentais (Figura 4, Figura 5).
Outra condição para experiências bem sucedidas é a configuração de microscópio, que depende de software, hardware e preparação de animais (Figura 6). Se estruturas subcelulares (< 2 µm) precisa ser identificado, um microscópio vertical com 2-fóton-excitação e água imersão objectivos (20 X ou 25 X, numeral abertura 1.0) com longa distância de trabalho (> 2 mm) são aconselháveis. Desde que os objectivos de imersão de água com alta abertura numeral são extremamente sensíveis às variações do índice de refração, a resolução da imagem ideal e o brilho devem ser ajustados movendo um colarinho de correção no objetivo. Infelizmente, ajuste manualmente é bastante difícil devido ao espaço limitado. Portanto, caros objectivos com uma correção de colarinho motorizados são oferecidos pelos fabricantes de microscópio.
Se celular resolução (5-10 µm) é suficiente, um 10 x seca lente com uma abertura numeral 0,4 ou superior e uma longa distância de trabalho (> 2 mm) é recomendado. Neste caso, uma verticalidade ou um carrinho de microscópio invertido pode ser selecionado. Viver com um 10 X lente seco (numeral abertura 0,4), imagem latente da pilha em fatores de zoom mais elevados (> 3) é muito mais fácil e mais barato porque clássico laser confocal, microscopia (ou seja, 1 da excitação de fóton) pode ser usado para obter pilhas de imagem com suficiente resolução. Se tempo é necessário para a aquisição de imagens, diminui a quantidade de dextrano rodamina dentro do navio. Para uma melhor visibilidade dos vasos, a injeção do fluoróforo deve ser repetida (Figura 7).
É mais eficaz para ajustes diferentes da amostra e decidir a melhor qualidade de imagem possível. A utilização de sondas positivas para células ou membrana basal como matriz (sem transplante) pode ajudar a obter configurações ideais. Nós poderia detectar rotulados monócitos através de intravital microcopy dentro o sangue fluxo e tecido muscular (Figura 8, Figura 9). Exame histológico de seções do tecido verifica as nossas conclusões (Figura 10).
Figura 1 : Injeção de 2,5 milhões de monócitos na veia cauda. As veias estão localizadas no lado lateral da cauda, com artérias no lado dorsal e ventral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Injeção de membrana basal, como matriz. Tratar a pele do rato e injetar a matriz da membrana basal, como no flanco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Matriz explantados plug do flanco do mouse (ver ponto 3.5). Incorporados navios, cinco dias após o transplante de monócitos através da veia da cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Comparação de vascularização dentro da matriz da membrana basal-like ( 
+ SD, n = 3 em cada grupo). Navios dentro a ficha de membrana basal, como matriz, com nenhum fator de crescimento adicionado (barra vermelha), em comparação com os vasos da membrana basal, como matriz plug com fator de crescimento adicionado. A suplementação da membrana basal, como matriz com fator de crescimento leva a embarcação maior crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Os navios dentro a ficha de membrana basal, como matriz. Visualização de sangue fluir (vermelho) dentro de navios (setas) e monócitos (verde) de orientação dentro a ficha de membrana basal, como matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Mouse preparado para aquisição de imagens. As patas são fixadas com fita adesiva e um vidro de tampa está posicionado na parte superior dois selos ajustáveis. A região de interesse foi extirpada com um bisturi. NaCl é usada para umedecer a área, então a qualidade das imagens e o tecido não pode ser comprometida.
Figura 7 : Diminuiu a visibilidade dos vasos. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato manchado monócitos (setas) dentro da matriz da membrana basal, como ao lado de um navio (seção longitudinal, *). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Monócito liberado no vaso. Visualização in vivo de 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato manchado e transplantado monócito (seta verde) dentro da artéria colateral (*). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Microscopia intravital. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato manchado monócitos (setas) dentro de vasos colaterais com formação típica de saca-rolhas (*) corados com dextran rodamina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Reagidos coloração da musculatura de coxa. Navios (vermelho: actina alfa músculo liso, *), macrófagos (verde: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, setas), núcleo celular (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar com outras instituições para compartilhar os dispositivos.
Existem outras dificuldades relacionadas com este protocolo que pode ser evitado com a prática. No início, pode haver problemas com o posicionamento do mouse sob o microscópio, e qualidade da imagem pode sofrer nestas circunstâncias. Outro ponto crítico é a injeção de veia de cauda. Os monócitos só podem ser vistos nas veias se injetado corretamente. Portanto, é aconselhável praticar a injeção antes de posicionar o mouse.
Isolamento de monócitos também é fundamental. Os monócitos podem ser isolados de espécies diferentes, usando vários protocolos, que muitas vezes levam a diferentes resultados e célula rendimentos12,13,14. É necessário trabalhar em condições estéreis para evitar contaminação. Danos celulares devem ser evitado através de pipetagem cuidadosamente e mantendo a temperatura constante.
Apesar destes inconvenientes, este método é prático e fácil de executar, permitindo que os usuários lançar luz sobre a angiogênese do tumor e os mecanismos básicos por trás da doença arterial periférica.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela ELSE-Kröner-Stiftung e a DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação de pesquisa alemã) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). Agradecimento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidade Otto-von-Guericke Magdeburg, Alemanha, para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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