Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

إينترافيتال المجهري لصاروخ موجه الوحيدات والأوعية المتصلة بورم في نموذج مورين لأمراض الشرايين الطرفية

Published: August 26, 2017 doi: 10.3791/56290

Summary

هي وحيدات الوسطاء هامة من أرتيريوجينيسيس في سياق أمراض الشرايين المحيطية. باستخدام مصفوفة مثل الغشاء والفحص المجهري إينترافيتال، يحقق هذا البروتوكول الوحيدات صاروخ موجه والمتصلة بورم الأوعية بعد حقن الوحيدات في نموذج موريني ربط شريان فخذي.

Abstract

والهدف العلاجي لأمراض الشرايين المحيطية، ومرض القلب الاقفاري زيادة تدفق الدم إلى المناطق الدماغية الناجمة عن تضيق الفسيولوجية. جراحة الأوعية الدموية خياراً قابلاً للتطبيق في حالات مختارة، ولكن للمرضى دون مؤشرات لعملية جراحية مثل التقدم بقية الألم، الاسكيمية الحرجة أطرافهم، أو اختلالات كبيرة في الحياة أو العمل، وهناك احتمالات قليلة للتخفيف من حدة المرض. خلية العلاج عن طريق نضح الوحيدات محسنة من خلال تحفيز تشكيل الجانبية واحدة من عدد قليل من الخيارات غير الغازية.

ويبحث مجموعتنا أرتيريوجينيسيس بعد زرع الوحيدات في الفئران باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات. سابقا، قد أثبتنا تحسن التروية اللكتات استخدام زرع الوحيدات سينجينيك حفز الكزاز. بالإضافة إلى آثار على تشكيل الجانبية، نمو الورم يمكن أن تتأثر بهذا العلاج، وكذلك. للتحقق من هذه التأثيرات، نستخدم نموذج مصفوفة الغشاء مثل ماوس عن طريق حقن المصفوفة خارج الخلية من ساركومه انجيلبريث-هولم-سرب في الجناح الماوس، بعد انسداد الشريان فخذي.

بعد الدراسات الورم الاصطناعي، نستخدم الفحص المجهري إينترافيتال للدراسة في فيفو ورم الأوعية والوحيدات صاروخ موجه داخل الشرايين الجانبية. وقد وصف الدراسات السابقة النسيجي النظر في نماذج حيوانية، الذي يفترض التحليل اللاحق للتحف بعد الوفاة . نهجنا يتصور الوحيدات صاروخ موجه إلى مجالات الضمانات الاحتياطية في تسلسل الوقت الحقيقي، من السهل القيام به، ويحقق عملية تولد الأوعية أرتيريوجينيسيس وورم في الجسم الحي.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين أو أمراض الشرايين الطرفية، هي الأسباب الأكثر شيوعاً للوفاة على الصعيد العالمي1. خلية العلاج هو اتباع نهج واعدة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية، خاصة بالنسبة للأشخاص غير القادرين على الخضوع لعمليات جراحية. وهناك عدة نهج لاستخدام خلايا أو على مواد يفرزها كأداة علاجية2،3، مع الهدف العام لتحسين التروية والحفاظ على وظيفة الأنسجة الدماغية وأونديربيرفوسيد. محاولة واحدة لتحقيق هذا الهدف هو تحسين أرتيريوجينيسيس، مما يعزز تنمية الشرايين الجانبية. وحيدات نوع خلية هامة المرتبطة بالضمانات الاحتياطية. مجموعتنا ركزت على البحث في آثار وحيدات في مناطق من الالتهاب4،5، لا سيما باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات لحمل الاسكيمية، والتهاب اللاحقة6. الصفحة الرئيسية لمجالات التهاب وحيدات وتتسبب في الاستجابات النظامية المعقدة التي تؤدي إلى تطوير الضمانات الاحتياطية7.

مع استخدام الفحص المجهري إينترافيتال، يمكننا دراسة سلوك هذه الخلايا في الجسم الحي والاحتفال باستضافة أكثر من حقن وحيدات لمناطق التهاب. وتصف معظم الدراسات السابقة إلا بعد الوفاة من التحليلات، التي تنطوي على أضرار بما في ذلك مقدمة من التحف غذائها وإعداد كبيرة من الحيوانات اللازمة للأعمال التحضيرية. مع النهج الذي نتبعه، نحن يمكن التحقيق في العمليات المناعية ويعيش تشكيل الجانبية عن طريق التصوير في نقاط زمنية متعددة.

بالإضافة إلى وضع الشرايين الجانبية في المناطق الدماغية، وحيدات تؤثر أيضا على نمو الورم. للتحقيق في هذه العمليات، ونحن إدخال مصفوفة مثل الغشاء يستخرج من انجيلبريث-هولم-سرب ساركومه الماوس، ورم غنية في المصفوفة خارج الخلية البروتينات8، وتحليل استخدام الفحص المجهري إينترافيتال. يستخدم هذه المصفوفة لجزيئات اختبار الشاشة لتشكيل شبكة خلية بطانية أو العلاجات المضادة للسرطان عن طريق تثبيط الأوعية؛ وفي هذه الحالة، سوف نقيم إمكانيات الأوعية الورم وحيدات الخلية العلاج9،،من1011.

والهدف من هذا البروتوكول إظهار طريقة سهلة وفعالة دراسة العمليات المناعية الناجمة عن الاسكيمية في نموذج في فيفو . ونحن يمكن أن تولد بيئة اختبار أكثر واقعية مقارنة ب workup النسيجي للأنسجة العضلية بعد الوفاة .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجرى دراستنا بإذن الدولة لسكسونيا، لانديسفيروالتونجسامت هالي، وفقا للمادة 8 من القانون الألماني لحماية الحيوانات. (المادة 8، الفقرة 1 من القانون الألماني لحماية الحيوانات من 18.05.2016-بجبي. أنا س 1206، 1313، تيرشفيرسف § 31 من 13.08.2013).

ملاحظة: استخدمت للتجارب هنا، 8 إلى 12 أسبوع القديمة بالب/ج الفئران الذكور، واستخدمت وحيدات البشرية من المتبرعين بالدم لتصور وحيدات عبر الفحص المجهري إينترافيتال-

1. "إعداد خلية"

ملاحظة: لعزل وحيدات، الرجاء راجع لدينا الفيديو المنشورة السابقة في جوف للحصول على إرشادات: " العزلة والحقن حقن من مورين نخاع العظام المستمدة وحيدات " قبل Wagner et al. 4

ملاحظة: عند العمل مع الخلايا جميع الخطوات يجب أن تكون معقمة لتجنب التلوث.

  1. "خلية تلطيخ" مع 3,3 '-بيركلورات ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني
    1. ريسوسبيند الخلايا في المصل المتوسطة الثقافة الحرة مع كثافة 1 × 10 6 خلايا/مل.
      ملاحظة: يمكن فقط المصل المتوسطة الحرة تلطيخ كفاءة، حيث صبغ محبتين خلاف ذلك سوف تكون التقاطها بالفعل بمكونات محبتين للمصل.
    2. إضافة 5 ميليلتر من 1 مم 3,3 '-بيركلورات ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني في ديميثيلفورماميدي إلى 1 مل تعليق خلية وريسوسبيند بعناية-
    3. إينكوباتي حل الخلية عند 37 درجة مئوية عن 20 دقيقة
    4. الطرد المركزي الخلايا في 37 درجة مئوية و 500 غرام x للحد الأدنى 5
    5. إزاحة المادة طافية وريسوسبيند في الخلايا التي تحتوي على 37 درجة مئوية الحارة العجل الجنين المصل تكمل المتوسطة-
    6. كرر الخطوات 1.1.4 و 1.1.5 مرتين.
    7. عد الخلايا مع الصيغة:
      Equation 1
    8. ريسوسبيند الخلايا مع محلول كلوريد الصوديوم 0.9% ميليلتر العقيمة 150-
    9. حقن الخلايا في هذا السياق الذيل.

2. التخدير

  1. التخدير استنشاق
    1. تبخير isoflurane مع المساعدة من المبخر باستخدام تركيز 5% في حاوية مغلقة تحت غطاء سلامة كيميائية-
    2. التعامل مع الماوس بعناية ووضعه في سلة المهملات.
    3. التعامل مع الحيوان بالجلد من مؤخرة العنق بعد أن توقف تتحرك.
  2. التخدير داخل
    ملاحظة: استخدام التخدير إيسوفلوراني، المذكورة في الخطوة 2-1، القيام بحقنه داخل. مع انتعاش سريع ومفعول التخدير isoflurane المخدرة المفعول القصير الأمد، من الأسهل للتعامل مع الماوس وحقن التخدير داخل.
    1. استخدام حل 2.4 مل الكيتامين (10 في المائة) و 0.8 مل Xylazine (2%) 6.8 مل كلوريد الصوديوم (0.9%) للحقن داخل-
    2. وزن الحيوان قبل تطبيق مخدر.
      ملاحظة: صيغة المخدر:
      Equation 2
    3. استخدام حقنه الأنسولين 1 مل مع 30 غ إبرة حقن الحل في أسفل البطن الأيسر.
    4. ضع الماوس في قفصة والانتظار لتأثير المخدرات-
      ملاحظة: يظهر تأثير المخدرات عادة ضمن 5 دقائق إذا تم الحقن بنجاح. يمكن تحديد العمق الصحيح للتخدير وغياب منعكس غطاء أو كرد فعل لقرصة أخمص القدمين، فضلا عن معدل التنفس العادية، الخاضعة للرقابة-

3. غرس مصفوفة مثل الغشاء

ملاحظة: يتم استخدام هذا الأسلوب من مجموعتنا لدراسة الأوعية الورم بعد حقن الوحيدات. اعتماداً على هذه التجارب، يمكن إضافة عوامل النمو إلى المصفوفة مثل الغشاء. ونحن إجراء ربط شريان فخذي قبل الحقن الورم في الجناح الماوس. المصفوفة يجب أن تكون درجة حرارة 4 درجة مئوية للحقن. في درجة الحرارة، وهذه المصفوفة هو السائل؛ الهلام يصلب إلى مادة صلبة في درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية). لرؤية أفضل لمصفوفة تحت الجلد المكونات، يحلق جلد الماوس في موقع الحقن.

ملاحظة: اختياري: إضافة 100 نانوغرام عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية و 300 نانوغرام الأوعية الدموية غشائي عامل النمو 26 وحدة دولية الهيبارين تحت ظروف معقمة للمصفوفة مثل الغشاء.

  1. تحميل 1 مل مصفوفة إلى حقنه الأنسولين 30 جرام ومخزن على الجليد حتى استخدام.
  2. وضع الحيوان على الطاولة وعقد جلد الماوس بجانب موقع الحقن في الجناح.
  3. حقن
  4. 500 ميليلتر من المصفوفة مثل الغشاء تحت الجلد.
    ملاحظة: لأسباب عملية، من الضروري إدخال مصفوفة مثل الغشاء متقاربة في مكان واحد لتجنب تشتت تحت الجلد. سوف يكون من الأسهل لإزاحة الورم الاصطناعي من الأنسجة بعد التضحية بالماوس في نهاية التجربة-

4. ذيل "حقن الوريد"

ملاحظة: ممارسة حقن الوريد الذيل مع محلول كلوريد الصوديوم في اختبار الحيوانات قبل التجريب. إذا لا يمكن حقن وحيدات على نحو كاف في السياق الذيل، لن يكون هناك لا تأثير المنهجية على الضمانات الاحتياطية. وفي هذا البروتوكول، ونحن حقن وحيدات 2.5 مليون. في محاولة لحقن لا يزيد عن 5 ميليلتر/غرام من وزن الجسم.

  1. استخدام الحل الوحيدات أعدت في إطار خطوة 1.1.8 تحتوي على 2.5 مليون وحيدات.
  2. استخدام إبرة 30 جرام وحقنه الأنسولين 1 مل للحقن-
  3. بعناية التعامل مع الماوس، وكبح جماح هذا الحيوان في ريسترينير، وتأكد من الماوس هو لم يصب بأذى، ويحتوي على مساحة كافية للتنفس.
  4. وضع في ريسترينير على لوحة تدفئة حتى الذيل ويمكن الاتصال باللوحة-
  5. تحديد الأوردة الذيل، التي تقع على الجانب الوحشي من الذيل.
  6. تشغيل ذيل 90 °، حيث يظهر السياق ذيل على الجانب العلوي من الذيل.
  7. تطهير الجانب حقن قبل الحقن وحيدات.
  8. محاولة لحقن الحل الوحيدات في زاوية مسطحة بشطبه الإبرة التي تواجه المكياج.
    ملاحظة: إيقاف الحقن إذا ظهر نفطة، هذا هو علامة حقن الفاشلة. محاولة هذا الإجراء مرة أخرى أكثر بروكسيمالي.
  9. وقف النزيف في موقع الحقن بتطبيق ضغط لطيف على الذيل لحوالي 60s.
  10. مراقبة الحيوانات لمدة 30 دقيقة لرصد الآثار الجانبية الجهازية ووضع الماوس في قفصة بعد الحيوان وتعافي تماما.

5. مجهر إينترافيتال

  1. إعداد
    1. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على لوحة تدفئة (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وإصلاح الكفوف في المكان مع شريط لاصق.
    2. تطهير الجلد في موقع المحطة أو الجناح الذي يتم استخدامه للفحص المجهري.
    3. حلق منطقة الاهتمام لمعالجة أفضل وتجنب التدخل في الشعر.
    4. المكوس الجلد بدون مشرط معقم والملقط الجميلة في منطقة مربعة من 0.5 × 0.5 سم.
      ملاحظة: من المهم أن تبقى منطقة الاهتمام رطبة؛ وبخلاف ذلك، سوف يتعرض للخطر نوعية الصور والأنسجة. يمكن استخدام محلول كلوريد الصوديوم لترطيب المنطقة.
    5. وضع ساقه بين طابعين قابل للتعديل ووضع تغطية زجاج على رأس هذه الطوابع.
    6. ضمان النسيج الرطب وهو على اتصال بالزجاج-
    7. اينج
    8. إلخ 50 ميليلتر والرودامين ديكستران خلف المقلة في نظام وريدي لرؤية أفضل للسفن-
    9. بدء تشغيل الفحص المجهري وضبط موضع الساق إذا لزم الأمر-
  2. إعدادات الفحص المجهري إينترافيتال
    1. بدوره على المجهر، والكمبيوتر، والواجهات الإلكترونية، وأشعة الليزر-
    2. تشغيل وحدة تدفئة غرفة الحضانة و/أو التدفئة المرحلة (لوحة/لوحة)، وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    3. ابدأ شراء البرمجيات. إذا المجهر مجهز بماسح ضوئي رنانة، حدد هذا وضع المسح السريع-
    4. انتظر حتى تصل درجة الحرارة إلى مستوى ثابت (35-37 درجة مئوية)
      ملاحظة: درجة حرارة مستقرة مهم عن: (أ) الماوس، والتي لا يمكن التحكم في درجة حرارة الجسم، والانجراف المحورية (ب) تجنب أو التقليل إلى أدنى حد على الأقل تحت التخدير. يمكن أن يستغرق هذا ح 1 لعدة ساعات، تبعاً للظروف المحيطة بها (مثلاً، نظام تكييف الهواء والعدد من مصادر الحرارة في الغرفة، بما في ذلك الشعب). إذا استخدمت الأهداف الغمر، منطقة الاتصال بين العدسة وتغطية الزجاج (أو الأنسجة) مصدر عدم استقرار نموذجية. قد يساعد في تدفئة العدسة مع سخان موضوعية؛ وبدلاً من ذلك، ينصح مجهر مع نظام ضبط تلقائي.
    5. حدد عدسة تكبير مع فتحه الأرقام عالية التي يفي بمتطلبات القرار التجربة (انظر الملاحظة في نهاية هذا القسم)-
    6. تحسين إعدادات المجهر فيما يتعلق بكسب إعدادات قناة، سرعة المسح الضوئي، بكسل، حجم العمق، خطوة والحجم المتوسط قبل أن يضع الحيوان التجريبي في المرحلة-
    7. مسح bidirectionally لتقليل وقت الامتلاك.
    8. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على المسرح مجهر بريوارميد بعد المجهر وصلت إلى أوضاع مستقرة وقد تم اختبار الإعدادات بمساعدة دمية.
    9. تجلب منطقة الاهتمام داخل المصفوفة مثل الغشاء في التركيز باستخدام إضاءة الضوء الساطع وتفتيشها بإيجاز الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية مع إعدادات عامل التصفية المناسبة ل fluorophores التطبيقية.
    10. قم بالتبديل إلى وضع؛ المسح بدء المسح الضوئي في وضع منخفض الدقة 256 × 256 وتعزيز المكاسب والليزر السلطة حتى يتم ملاحظة إشارة على الشاشة-
    11. التركيز على الهيكل للفائدة. تكبير حتى جميع تفاصيل مرئية.
    12. تعريف " ابدأ " و " نهاية " المواقف في اتجاه محوري.
    13. إيقاف المسح الضوئي-
    14. تحديد حجم التنقل (مثلاً، 0.5 ميكرومتر) وعدد الطائرات المحورية (مثلاً، 10-20)-
    15. التبديل إلى القرار النهائي بكسل (512 × 512 أو 1,024 x 1,024) تبعاً لسرعة نقل الهياكل سوبسيلولار أو الخلايا وحدد المسح السرعة (تردد المسح) الذي يناسب بشكل أفضل للحركات. مسح ثنائي الاتجاه المستحسن أن يثبت الحصول على مكدسات.
      ملاحظة: حدد أعلى معدل المسح الضوئي المسح الضوئي الذي يعطي جودة الصورة كافية. الماسحات الضوئية نقطة نموذجية توفر سرعات بين 400 هرتز و 1.4 كيلو هرتز. الماسحات الضوئية الرنانة توفير إضافية 8 كيلو هرتز أو 12 كيلو هرتز. يمكن بتقليل عدد الأسطر في الاتجاه-ص، زيادة معدل المسح كذلك (القيم النموذجية 512 × 512 أو 256 512 × 512 × 200 بكسل). اعتماداً على نسبة الإشارة إلى الضجيج، واحد يمكن محاولة تحسين جودة الصورة عن طريق إضافة خط متوسط بين 2 و 4. بشكل عام، إعداد 512 × 200 مع أية نتائج المتوسط في اكتساب وقت/إطار من 18 مرض التصلب العصبي المتعدد في وضع ثنائية الاتجاه مع الماسح ضوئي مدوية 8 كيلوهرتز؛ 512 × 200 و 4 × المتوسط، فإنه يبطئ وصولاً إلى 56 مرض التصلب العصبي المتعدد لكل إطار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن أن يساعد الفحص المجهري إينترافيتال لفحص الأورام والنمو السفينة الجانبية الناجمة عن وحيدات تكشف عن جوانب جديدة في الآليات الجزيئية لورم الأوعية وأرتيريوجينيسيس. يجب أن يكون مستعدا الخلايا وحقنها بعناية باستخدام خطوات البروتوكول. الاختلافات يمكن أن تؤدي إلى اختلافات بين التجارب واحدة. يجب حقنها وحيدات في النظام الوريدي (الشكل 1) للحفاظ على الآثار النظمية وتجنب انصمام، الذي يمكن أن يحدث إذا كان يجري الحقن في النظام الشرياني.

إذا تم استخدام مصفوفة مثل الغشاء، الحقن ببطء لتجنب تشتت سيساعد مع التوصيل اكسبلانتيشن لمزيد من الفحص النسيجي (الشكل 2، الشكل 3). بعد التضحية بالماوس، وسوف اكسبلانتيد التوصيل مصفوفة شبيهة بغشاء الطابق السفلي من الجناح الماوس. ضمن المكونات الغشاء مثل مصفوفة، يمكننا قياس الأوعية الدموية عن طريق العد الشعيرات الدموية داخل إعدادات تجريبية مختلفة (الشكل 4، رقم 5).

وثمة شرط آخر للتجارب الناجحة هو الإعداد المجهر، الذي يعتمد على الأجهزة والبرمجيات، وإعداد الحيوانات (الشكل 6). إذا كانت الهياكل سوبسيلولار (< 2 ميكرومتر) الحاجة إلى تحديد، مجهر تستقيم مع 2-فوتون-الإثارة والماء الغمر الأهداف (20 X أو 25 X، الفتحة الرقمية 1.0) مع المسافة العمل منذ فترة طويلة (> 2 مم) ينصح. منذ أهداف غمر المياه مع ارتفاع الفتحة الرقمية حساسة للغاية للاختلافات الانكسار، يجب تعديل القرار الصورة المثلى، والسطوع بتحريك ياقة تصويب على الهدف. ولسوء الحظ، التكيف باليد من الصعب جداً بسبب المساحة المحدودة. ولذلك، أهداف غالية مع تصويب طوق يجهز تقدمها مصنعين المجهر.

إذا كان القرار الخلوية (5-10 ميكرون) كافية، علامة x 10 الجاف للعدسة مع فتحه الأرقام 0.4 أو أعلى وطويلة المسافة العمل (> 2 مم) ينصح. وفي هذه الحالة، يمكن تحديد تستقيم أو موقفا مجهر مقلوب. يعيش تصوير الخلية مع 10 X عدسة الجافة (الفتحة الرقمية 0.4) في أعلى تكبير العوامل (> 3) هو أسهل بكثير وأرخص لأنه يمكن استخدام الليزر [كنفوكل] كلاسيكية الفحص المجهري (أي، 1 فوتون الإثارة) للحصول على رصات الصور كافية، مع القرار. إذا كان الكثير من الوقت المطلوب للحصول على الصور، إنقاص مقدار ديكستران والرودامين داخل السفينة. لرؤية أفضل للسفن، يجب أن يكون حقن فلوروفوري تكرار (الشكل 7).

الأكثر فعالية أخذ عينة من تعديلات مختلفة وتقرر أفضل جودة صورة ممكنة. يمكن أن يساعد استخدام المسابير إيجابية للخلايا أو الغشاء مثل مصفوفة (بدون زرع) الحصول على الإعدادات المثلى. يمكن أن نقوم باكتشاف المسماة وحيدات عبر ميكروكوبي إينترافيتال داخل أنسجة العضلات وتدفق الدم (الرقم 8و الرقم 9). دراسة نسيجية لأقسام الأنسجة بالتحقق من النتائج التي توصلنا إليها (الشكل 10).

Figure 1
الشكل 1 : الحقن بالوريد ذيل وحيدات 2.5 مليون- الأوردة موجودة على الجانب الوحشي من الذيل، مع الشرايين على الجانب الظهري والبطني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : حقن مصفوفة مثل الغشاء. التعامل مع جلد الماوس وحقن المصفوفة مثل الغشاء في الجناح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : سد اكسبلانتيد مصفوفة من الجناح الماوس (انظر النقطة 3.5). السفن أدرجت خمسة أيام بعد زرع الوحيدات عن طريق الوريد الذيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : مقارنة بين الأوعية الدموية داخل المصفوفة الغشاء مثل ( Equation 3 + SD، n = 3 في كل مجموعة). السفن داخل المكونات الغشاء مثل مصفوفة، مع لا عامل النمو وأضاف (شريط أحمر)، مقارنة بالسفن من مصفوفة الغشاء مثل التوصيل مع إضافة عامل النمو. المكملات لمصفوفة مثل الغشاء مع عامل النمو يؤدي إلى السفينة زيادة النمو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : السفن داخل المكونات مصفوفة مثل الغشاء. تدفق التصور للدم (أحمر) داخل الأوعية (الأسهم) والوحيدات (الأخضر) صاروخ موجه داخل المكونات مثل الغشاء مصفوفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : إعداد الماوس للحصول على الصور- آثار أقدام ثابتة مع شريط لاصق ويتم وضع زجاج الغطاء العلوي طابعين قابل للتعديل. وقد اقتطعت منطقة الاهتمام مشرط. ويستخدم كلوريد الصوديوم لترطيب المنطقة حتى عدم الإخلال بجودة الصور والأنسجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 : انخفضت الرؤية سفن- 3، 3 '-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني بيركلورات الملون وحيدات (الأسهم) ضمن مصفوفة شبيهة بغشاء الطابق السفلي بجانب سفينة (المقطع الطولي، *). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : مسح الوحيدات في السفينة- في فيفو التصور من 3، 3 '-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني بيركلورات الملون وزرع الوحيدات (السهم الأخضر) داخل الشريان الجانبية (*). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9 : المجهري إينترافيتال- 3، 3 '-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني فوق كلورات الملون وحيدات (الأسهم) داخل الأوعية الجانبية مع تشكيل المفتاح نموذجية (*) الملون مع ديكستران والرودامين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
الرقم 10 : إيمونوهيستولوجيكال تلطيخ لعضلات فخذه. السفن (حمراء: أكتين العضلات الملساء ألفا، *)، الضامة (الأخضر: 3, 3 '-ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني فوق كلورات، أسهم)، نواة الخلية (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسلوب الموصوفة هنا يلقي الضوء على وضع الشرايين الجانبية، سلوك وحيدات في هذه السفن، وعملية أرتيريوجينيسيس. الخطوات اللازمة لتطبيق هذا البروتوكول سهلة التعلم ويمكن استخدامها في مجالات أخرى من العلوم. وعلى الرغم من هذه المزايا، هناك بعض العيوب. على سبيل المثال، مطلوب معدات مجهرية لتنفيذ الأساليب الموصوفة. الحصول على المعدات اللازمة لتجربة واحدة لا يمكن تحمله، ولذلك من المهم أن تتعاون مع مؤسسات أخرى لمشاركة الأجهزة.

وهناك صعوبات أخرى متصلة بهذا البروتوكول التي يمكن تجنبها مع الممارسة. في البداية، يمكن أن يكون هناك مشاكل في تحديد المواقع الماوس تحت المجهر، ويمكن أن تعاني جودة الصورة في ظل هذه الظروف. نقطة حرجة أخرى يتم حقن الوريد الذيل. فقط يتبين وحيدات في الأوردة إذا حقن بشكل صحيح. ولذلك، فمن المستحسن لممارسة الحقن قبل الماوس لتحديد المواقع.

عزل الوحيدات أمر بالغ الأهمية أيضا. يمكن أن تكون وحيدات معزولة من مختلف الأنواع باستخدام بروتوكولات متعددة، مما يؤدي غالباً إلى مختلف النتائج وخلية غلة12،،من1314. من الضروري أن يعمل في ظروف معقمة لتجنب التلوث. وينبغي منع تلف الخلايا بيبيتينج بعناية والحفاظ على درجة حرارة ثابتة.

وعلى الرغم من هذه العيوب، هذا الأسلوب عملية وسهلة لتنفيذ، مما يتيح للمستخدمين تسليط الضوء على ورم الأوعية والآليات الأساسية وراء أمراض الشرايين المحيطية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها ELSE-كرنر-ستيفتونغ و DFG (دويتشه الأوقيانوغرافية، مؤسسة البحوث الألمانية) SFB 854 (سونديرفورشونجسبيريتش، مركز البحوث التعاونية). خاص بفضل هانس-هولغر Gärtner، ميدينزينتروم أوديوفيسويليس، وجامعة أوتو-فون-غيريكا ماجدبورج، ماجدبورج، ألمانيا، لتقديم الدعم التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% fetal calf serum (FCS) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe  Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 29G, 30G
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium Manufactured by our group with single components Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
DiO Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA Katalognummer: D-1819
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Humane leucocyte filters Blood preservation
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%) Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)  Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope  Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077 GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel  Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199  PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Microscope slide Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit  Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer Manufactured by our group with single components PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer Various
Multi-photon microscope  Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%) Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber  Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll Manufactured by our group with single components 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany  Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 % Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %) Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
  2. Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
  3. Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
  4. Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
  5. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
  6. Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
  7. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
  8. Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
  9. Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
  10. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
  11. Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
  12. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
  13. Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
  14. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).

Tags

الطب، 126 مسألة، وحيدات، الفحص المجهري، زرع، أرتيريوجينيسيس، الوريد، الطب، الماوس، والأوعية، والورم، إينترافيتال، فوتون، والخلايا
إينترافيتال المجهري لصاروخ موجه الوحيدات والأوعية المتصلة بورم في نموذج مورين لأمراض الشرايين الطرفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, M., Baer, C., Zuschratter,More

Wagner, M., Baer, C., Zuschratter, W., Riek-Burchardt, M., Deffge, C., Weinert, S., Lee, J. C., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease. J. Vis. Exp. (126), e56290, doi:10.3791/56290 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter