Summary
I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.
Abstract
L'obiettivo terapeutico per la malattia arteriosa periferica e malattia cardiaca ischemica è quello di aumentare il flusso di sangue al aree ischemiche causata da stenosi emodinamica. Chirurgia vascolare è un'opzione praticabile in casi selezionati, ma per i pazienti senza indicazioni per la chirurgia come progressione di lavorare o riposare dolore, ischemia critica degli arti o gravi perturbazioni alla vita, ci sono poche possibilità per mitigare la loro malattia. Terapia cellulare tramite aspersione del monocito-aumentato attraverso la stimolazione della formazione collaterale è una delle poche opzioni non invasive.
Il nostro gruppo esamina arteriogenesi dopo trapianto del monocito in topi utilizzando il modello di ischemia del hindlimb. Precedentemente, abbiamo dimostrato miglioramento nell'arto posteriore aspersione mediante trapianto di tetano-stimolata syngeneic del monocito. Oltre agli effetti sulla formazione collaterale, la crescita del tumore potrebbe risentire anche questa terapia. Per studiare questi effetti, utilizziamo un modello di topo scantinato membrana-come matrice iniettando la matrice extracellulare del sarcoma Engelbreth-Holm-sciame nel fianco del mouse, dopo l'occlusione dell'arteria femorale.
Dopo gli studi di tumore artificiale, utilizziamo la microscopia intravital per studiare in vivo angiogenesi del tumore e del monocito homing all'interno delle arterie collaterali. Precedenti studi hanno descritto l'esame istologico dei modelli animali, che presuppone l'analisi successiva agli artefatti post mortem . Il nostro approccio Visualizza homing monocito al aree di collateralization in sequenze di tempo reale, è facile da eseguire e indaga il processo di angiogenesi del tumore e arteriogenesi in vivo.
Introduction
Malattie cardiovascolari, tra cui malattia coronarica o malattia arteriosa periferica, sono le più comuni cause di morte a livello globale1. La terapia cellulare è un promettente approccio per curare le malattie cardiovascolari, in particolare per le persone che non sono in grado di sottoporsi a interventi chirurgici. Ci sono diversi approcci per utilizzare cellule o loro sostanze secrete come strumento terapeutico2,3, con l'obiettivo generale di migliorare la perfusione e mantenere la funzione del tessuto ischemico e underperfused. Un tentativo di raggiungere questo obiettivo è migliorare arteriogenesi, che favorisce lo sviluppo delle arterie collaterali. I monociti sono un tipo di cellula importante connesso con collateralization. Il nostro gruppo si è concentrata sulla ricerca degli effetti dei monociti nelle aree di infiammazione4,5, in particolare utilizzando il modello di ischemia del hindlimb per indurre ischemia e conseguente infiammazione6. Monociti sede di aree di infiammazione e provocare risposte sistemiche complesse che portano allo sviluppo di collateralization7.
Con l'uso di microscopia intravital, possiamo studiare il comportamento di queste cellule in vivo e osservare l'homing dei monociti iniettati ad aree di infiammazione. Maggior parte degli studi ex descrivono solo post-mortem analisi, che tengono gli svantaggi tra cui l'introduzione di artefatti istologici e gran numero di animali necessari per le preparazioni. Con il nostro approccio, possiamo analizzare processi immunologici e formazione collaterale via live imaging più intervalli di tempo.
Oltre allo sviluppo delle arterie collaterali in aree ischemiche, monociti anche influenzano la crescita del tumore. Per studiare questi processi, abbiamo iniettare una matrice del tipo di membrana dello scantinato estratta dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm, un tumore ricco di matrice extracellulare proteine8e analizzare utilizzando la microscopia intravital. Questa matrice è utilizzata per molecole di screen test per formazione di rete delle cellule endoteliali o terapie anti-cancro attraverso inibizione angiogenica; in questo caso, si valuterà il potenziale di angiogenesi del tumore dei monociti per cella terapia9,10,11.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare un modo facile ed efficiente per lo studio dei processi immunologici causati da ischemia in un modello in vivo . Possiamo generare un ambiente di test più realistico rispetto ad un workup istologico post-mortem del tessuto del muscolo.
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Protocol
il nostro studio è stato svolto con il permesso dello stato della Sassonia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, ai sensi dell'articolo 8 della legge tedesca per la protezione degli animali. (§ 8, comma 1 della legge tedesca per la protezione degli animali da 18.05.2016 - BGBl. I s. 1206, 1313, TierSchVersV § 31 da 13.08.2013).
Nota: per gli esperimenti qui, sono stati usati 8 a 12 topi BALB/c maschili a settimana vecchio e monociti umani da donatori di sangue sono stati utilizzati per la visualizzazione dei monociti tramite microscopia intravital.
1. preparazione delle cellule
Nota: per l'isolamento dei monociti, nostro precedente pubblicato un video su Giove per istruzioni, vedere: " isolamento e iniezione endovenosa di murino del midollo osseo derivato Monociti " di Wagner et al. 4
Nota: quando lavorano con le cellule di tutti i passaggi devono essere sterile per evitare la contaminazione.
- Macchiatura delle cellule con 3,3 '-perclorato di Dioctadecyloxacarbocyanine
- risospendere le cellule in terreno di coltura libera del siero con una densità di 1 x 10 6 cellule/mL.
Nota: Solo mezzo libero del siero permette una colorazione efficiente, poiché il colorante lipofilico altrimenti sarebbe già essere catturato dai componenti lipofilici del siero. - Aggiungere 5 µ l di 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato in dimetilformammide a 1 mL di sospensione cellulare e Risospendere accuratamente.
- Incubare la soluzione di cella a 37 ° C per 20 min.
- Centrifugare le cellule a 37 ° C e 500 x g per 5 min.
- Sloggiare il supernatante e risospendere le cellule con il mezzo di 37 ° C caldo fetale di vitello siero completato.
- Ripetere due volte i passaggi 1.1.4 e 1.1.5.
- Contare le celle con la formula:
- risospendere le cellule con soluzione sterile 0,9% NaCl 150 µ l.
- Iniettare le cellule nella vena caudale.
- risospendere le cellule in terreno di coltura libera del siero con una densità di 1 x 10 6 cellule/mL.
2. Anestesia
- Anestesia inalazione
- vaporizzare isoflurane con l'aiuto di un vaporizzatore usando una concentrazione del 5% in un contenitore chiuso sotto una cappa di sicurezza chimica.
- Gestire il mouse con attenzione e metterlo nel Cestino.
- Gestire l'animale dalla pelle del collo posteriore, dopo che ha smesso di muoversi.
- Intraperitoneale anestesia
Nota: anestesia di uso isoflurano, descritto al punto 2.1, per eseguire un'iniezione intraperitoneale. Con il recupero veloce e breve durata d'azione effetto narcotico dell'anestesia isoflurano, è più facile gestire il mouse e iniettare anestesia intraperitoneale.- Utilizzare una soluzione di 2,4 mL ketamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL di NaCl (0,9%) per l'iniezione intraperitoneale.
- Pesare l'animale prima di applicare anestetico.
Nota: La formula per l'anestetico è:
- utilizzare una siringa da insulina 1 mL con ago 30g per iniettare la soluzione nel ventre sinistro.
- Posizionare il mouse nella sua gabbia e attendere per effetto narcotico.
Nota: L'effetto narcotico appare normalmente entro 5 min se l'iniezione è stata completata. La corretta profondità dell'anestesia può essere determinata da assenza di riflesso coperchio o reazione al pizzico di punta, così come un tasso normale, controllato di respirazione.
3. L'impianto della membrana dello scantinato-come matrice
Nota: questo metodo è utilizzato dal nostro gruppo per studiare l'angiogenesi del tumore dopo l'iniezione del monocito. A seconda degli esperimenti, fattori di crescita possono essere aggiunti alla matrice della membrana dello scantinato-come. Abbiamo effettuato la legatura dell'arteria femorale prima di iniettare il tumore nel fianco del mouse. La matrice deve avere una temperatura di 4 ° C per l'iniezione. A questa temperatura, la matrice è fluido; il gel si indurisce in un solido a temperatura corporea (37 ° C). Per una migliore visibilità della matrice sottocutanea spina, radere la pelle del mouse al sito di iniezione.
Nota: opzionale: 26 U.I. eparina in condizioni sterili alla matrice della membrana dello scantinato-come fattore di crescita del fibroblasto base di aggiungere 100 ng e 300 fattore di crescita endoteliale vascolare ng.
- Caricare 1 mL di matrice in una siringa da insulina 30G e conservare il ghiaccio fino all'uso.
- Gettare l'animale sul tavolo e tenere la pelle del mouse accanto al sito di iniezione sul fianco.
- Iniettare per via sottocutanea 500 µ l della matrice della membrana dello scantinato-come.
Nota: Per motivi pratici, è necessario immettere la matrice del tipo di membrana dello scantinato in modo compatto in un'unica sede per evitare la dispersione sottocutaneo. Sarà più facile rimuovere il tumore dal tessuto artificiale dopo sacrificare il mouse alla fine dell'esperimento.
4. Iniezione della vena della coda
Nota: praticare l'iniezione della vena della coda con soluzione di NaCl su animali da esperimento prima sperimentazione. Se i monociti non possono essere adeguatamente iniettati nella vena caudale, non ci sarà nessun effetto sistemico sul collateralization. In questo protocollo, abbiamo iniettato monociti 2,5 milioni. Tenta di iniettare non più di 5 µ l/g di peso corporeo.
- Utilizzare la soluzione di monocito preparata sotto passo 1.1.8 contenente 2,5 milioni monociti.
- Utilizzare un ago 30g e una siringa da insulina 1 mL per l'iniezione.
- Con attenzione maneggiare il mouse, trattenere l'animale nel dispositivo di ritenuta e assicurarsi che il mouse non è danneggiato e ha spazio sufficiente per la respirazione.
- Mettere il dispositivo di ritenuta sul riscaldamento pad in modo che la coda può contattare la piastra.
- Identificare le vene di coda, che si trovano sulla parte laterale della coda.
- Girare la coda 90 °, così vena caudale appare sul lato superiore della coda.
- Disinfettare il lato di iniezione prima di iniettare i monociti.
- Tenta di iniettare la soluzione del monocito in un angolo piatto con la smussatura dell'ago rivolto verso up.
Nota: Interrompere l'iniezione se viene visualizzata la finestra di un blister, come questo è un segno di un'iniezione non riuscita. Tentare la procedura ancora più prossimalmente. - Fermare emorragia al sito di iniezione applicando leggera pressione sulla coda per circa 60 anni.
- Osservare l'animale per 30 min monitorare gli effetti collaterali sistemici e posizionare il mouse nella sua gabbia dopo l'animale ha pienamente recuperato.
5. La microscopia intravital
- preparazione
- posizionare il mouse anestetizzato il termoforo (37 ° C) per mantenere una temperatura costante e fissare le zampe in posizione con nastro adesivo.
- Disinfettare la pelle presso il sito della gamba o del fianco che viene utilizzato per la microscopia.
- La regione di interesse per una migliore maneggevolezza e per evitare interferenze con i capelli la barba.
- Asportare la pelle con un bisturi sterile e una pinzetta in un'area quadrata di 0,5 x 0,5 cm.
Nota: È importante mantenere l'area di interesse umido; in caso contrario, sarà compromessa la qualità delle immagini e dei tessuti. Soluzione di NaCl può essere utilizzata per inumidire l'area. - Collocare la gamba tra due francobolli regolabile e posizionare una copertura vetrata in cima i francobolli.
- Garantire il tessuto è bagnato ed è in contatto con il vetro.
- Inject 50 µ l rodamina destrano retrobulbar nel sistema venoso per una migliore visibilità dei vasi.
- Avviare la microscopia e regolare la posizione della gamba, se necessario.
- Impostazioni di microscopia intravital
- accendere il microscopio, computer, interfacce elettroniche e laser.
- Accendere il riscaldamento della camera di incubazione e/o riscaldamento tappa (piastra/pad) e impostare la temperatura a 37 ° C.
- Avviare il software di acquisizione. Se il microscopio è dotato di uno scanner di risonanza, selezionare questa modalità di scansione veloce.
- Aspettare fino a quando la temperatura raggiunge un livello costante (35-37 ° C)
Nota: Una temperatura stabile è importante per: (a) il mouse, che nell'ambito dell'anestesia non può controllarne la temperatura corporea e (b) evitando o almeno minimizzare drift focale. Questo potrebbe richiedere 1 h a diverse ore, a seconda delle condizioni circostanti (ad es., sistema di aria condizionata e il numero di fonti di calore in camera, incluse le persone). Se si utilizzano obiettivi di immersione, la zona di contatto tra l'obiettivo e copertura in vetro (o tessuto) è una tipica fonte di instabilità. Riscaldamento la lente con un riscaldatore oggettivo può aiutare; in alternativa, un microscopio con un sistema di autofocus è altamente raccomandato. - Selezionare una lente di ingrandimento con un apertura numeral elevata che soddisfa i requisiti di risoluzione dell'esperimento (Vedi nota alla fine di questa sezione).
- Ottimizzare le impostazioni di microscopio rispetto al guadagno, impostazioni del canale, velocità di scansione, pixel di risoluzione, profondità volume, dimensione di passaggio e in media prima di mettere l'animale da laboratorio sul palco.
- Scan in entrambe le direzioni per ridurre i tempi di acquisizione.
- Posizionare il mouse anestetizzato sul palco preriscaldati microscopio dopo il microscopio ha raggiunto condizioni stabili e le impostazioni sono state testate con l'aiuto di un manichino.
- Mettere la regione di interesse all'interno della matrice della membrana dello scantinato-come a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce brillante ed esaminare brevemente i capillari da luce ultravioletta con le impostazioni del filtro adeguato per i fluorophores applicata.
- Passare alla modalità; scansione avviare la scansione in modalità a bassa risoluzione 256x256 e migliorare guadagno e potere del laser fino a quando un segnale è osservato sul monitor.
- Focus sulla struttura di interesse. Ingrandire fino a quando tutti i dettagli sono visibili.
- Definire " avviare " e " fine " posizioni in direzione assiale.
- Interrompere la scansione.
- Definire dimensioni passo-passo (ad esempio, 0,5 µm) e il numero di piani focali (ad es., 10-20). Velocità di
- switch per la risoluzione di pixel finale (512 x 512 o 1.024 x 1.024) a seconda della velocità del movimento strutture subcellulari o celle e selezionare la scansione (scansione frequenza) che si adatta meglio ai movimenti. Bidirezionale di scansione è consigliata per fissare l'acquisizione degli stack.
Nota: Selezionare il più alto tasso di scansione di scansione che dà sufficiente qualità d'immagine. Punto tipico scanner forniscono velocità comprese tra 400 Hz e 1,4 kHz. Risonante scanner forniscono un ulteriore 8 o 12 kHz. Riducendo il numero di linee in direzione y, il tasso di scansione può essere ulteriormente aumentato (i valori tipici sono 512 x 512, 512 x 256 o 512 x 200 pixel di risoluzione). In base al rapporto segnale-rumore, si può tentare di migliorare la qualità dell'immagine aggiungendo la riga che si aggirano tra 2 e 4. In genere, l'impostazione di 512 x 200 con nessun risultato in media in un periodo di acquisizione di 18 ms in modalità bidirezionale con uno scanner di risonanza di 8 KHz; con 512 x 200 e 4 x una media, rallenta fino a 56 ms per ogni frame.
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Representative Results
La microscopia intravital per l'esame del tumore e la crescita dei vasi collaterali innescato dai monociti può aiutare a rivelare nuovi aspetti in meccanismi molecolari di angiogenesi del tumore e arteriogenesi. Le cellule devono essere preparate e iniettato con cura utilizzando la procedura del protocollo. Differenze possono portare a variazioni tra singoli esperimenti. I monociti devono essere iniettati nel sistema venoso (Figura 1) per mantenere gli effetti sistemici ed evitare gli emboli, che possono verificarsi se l'iniezione avviene nel sistema arterioso.
Se viene utilizzata la matrice del tipo di membrana basale, iniettare lentamente per evitare dispersione aiuterà con spina espianto per ulteriore esame istologico (Figura 2, Figura 3). Dopo sacrificare il mouse, la spina di matrice della membrana dello scantinato-come sarà essere espiantata dal fianco del mouse. All'interno la spina della membrana dello scantinato-come matrice, possiamo misurare la vascolarizzazione contando capillari all'interno di differenti impostazioni sperimentali (Figura 4, Figura 5).
Un'altra condizione per esperimenti di successo è l'impostazione di microscopio, che dipende dal software, hardware e preparazione degli animali (Figura 6). Se strutture subcellulari (< 2 µm) necessità di essere identificato, un microscopio dritto con acqua e 2-Photon-eccitazione obiettivi di immersione (X 20 o 25 X, numeral apertura 1.0) con lunga distanza di lavoro (> 2 mm) sono consigliabili. Poiché obiettivi di immersione acqua con apertura numeral elevata sono estremamente sensibili alle variazioni di indice di rifrazione, la risoluzione ottimale dell'immagine e la luminosità deve essere regolate spostando un collare di correzione all'obiettivo. Purtroppo, regolazione a mano è abbastanza difficile a causa di spazio limitato. Di conseguenza, costosi obiettivi con una correzione di collare motorizzato sono offerti da microscopio produttori.
Se cellulare ad alta risoluzione (5-10 µm) è sufficiente, un 10x secca lente con un'apertura numeral 0,4 o superiore e una lunga distanza di lavoro (> mm 2) è raccomandato. In questo caso, può essere selezionato un montante o uno stand di microscopio invertito. Imaging delle cellule con un 10 X lente asciutto (numeral apertura 0,4)-Live at più elevati fattori di zoom (> 3) è molto più facile e più conveniente perché classico laser confocale microscopia (cioè, 1 fotone eccitazione) può essere utilizzato per ottenere gli stack di immagine con sufficiente ad alta risoluzione. Se molto tempo è necessario per l'acquisizione di immagini, diminuisce la quantità di destrano rodamina all'interno del vaso. Per una migliore visibilità dei vasi, l'iniezione del fluoroforo deve essere ripetuto (Figura 7).
È più efficace di assaggiare diverse regolazioni e decidere la migliore qualità di immagine possibile. L'uso di sonde positivi per cellule o matrice del tipo di membrana dello scantinato (senza trapianto) può aiutare a ottenere le impostazioni ottimali. Potremmo rilevare con etichettati monociti via videomicroscopia microcopy all'interno del tessuto di muscolo e flusso sanguigno (Figura 8, Figura 9). L'esame istologico delle sezioni del tessuto consente di verificare i nostri risultati (Figura 10).
Figura 1 : Iniezione di monociti 2,5 milioni nella vena caudale. Le vene si trovano sulla parte laterale della coda, con le arterie sul lato dorsale e ventrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Iniezione di scantinato membrana-come matrix. Gestire la pelle del mouse e iniettare la matrice della membrana dello scantinato-come nel fianco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Matrice explanted spina dal fianco del mouse (Vedi punto 3.5). Cinque giorni dopo il trapianto di monocito via vena caudale dei vasi incorporati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Confronto di vascolarizzazione all'interno della matrice della membrana dello scantinato-like ( 
+ SD, n = 3 in ogni gruppo). Vasi all'interno la spina della membrana dello scantinato-come matrice, con nessun fattore di crescita aggiunto (barra rossa), rispetto ai vasi sanguigni della membrana dello scantinato-come matrice spina con fattore di crescita aggiunto. Il completamento della membrana dello scantinato-come matrice con fattore di crescita porta alla crescita aumentata del vaso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Vasi all'interno la spina della membrana dello scantinato-come matrix. Visualizzazione del sangue flusso (rosso) all'interno di vasi (frecce) e monocito homing (verde) all'interno della spina della membrana dello scantinato-come matrice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Mouse preparato per acquisizione immagine. Le zampe sono fissate con nastro adesivo e un vetro di copertura è posizionato sulla sommità di due francobolli regolabile. La regione di interesse è stata asportata con un bisturi. NaCl è utilizzato per inumidire la zona così non sarà compromessa la qualità delle immagini e dei tessuti.
Figura 7 : In diminuzione di visibilità dei vasi. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato macchiato monociti (frecce) all'interno della membrana dello scantinato-come matrice accanto a un vaso (sezione longitudinale, *). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : Monocito svuotata nel vaso. Visualizzazione in vivo del 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato macchiato e trapiantato monocito (freccia verde,) all'interno dell'arteria collaterale (*). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9 : Microscopia intravital. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato macchiato monociti (frecce) all'interno di vasi collaterali con tipica formazione cavatappi (*) macchiati con destrano rodamina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10 : Della muscolatura della coscia la macchiatura di Immunohistological. Vasi (rosso: actina alfa del muscolo liscio, *), i macrofagi (verde: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato, frecce), nucleo cellulare (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto mette in luce lo sviluppo delle arterie collaterali, il comportamento dei monociti in questi vasi e il processo di arteriogenesi. I passaggi per l'applicazione del presente protocollo sono facili da imparare e può essere utilizzato in altri campi della scienza. Nonostante questi vantaggi, ci sono alcuni svantaggi. Per esempio, apparecchiature microscopica sono necessaria per eseguire le tecniche descritte. Come ottenere attrezzature per un esperimento è insostenibile, quindi è importante collaborare con altre istituzioni per condividere i dispositivi.
Ci sono altre difficoltà connesse con questo protocollo che può essere evitato con la pratica. All'inizio, ci possono essere problemi con il posizionamento del mouse sotto il microscopio, e la qualità dell'immagine possa soffrire in queste circostanze. Un altro punto critico è l'iniezione della vena della coda. Monociti possono essere visto solo nelle vene se iniettato correttamente. Pertanto, si consiglia di praticare l'iniezione prima di posizionare il mouse.
Isolamento del monocito è anche fondamentale. I monociti possono essere isolati da specie diverse, utilizzando più protocolli, che spesso portano a vari risultati e cella rendimenti12,13,14. È necessario lavorare in condizioni sterili per evitare la contaminazione. Danno delle cellule dovrebbe essere prevenuta con il pipettaggio con attenzione e mantenere temperature costanti.
Nonostante questi svantaggi, questo metodo è pratico e facile da eseguire, consentendo agli utenti di mettere in luce l'angiogenesi del tumore e i meccanismi di base dietro la malattia arteriosa periferica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da ELSE-Kröner-Stiftung e la SFB DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, German Research Foundation) 854 (Sonderforschungsbereich, centro di ricerca in collaborazione). Speciale grazie a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburgo, Germania, per il supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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