Summary
Моноциты являются важными посредниками arteriogenesis в контексте болезнь периферических артерий. С помощью базальной мембраны как матрица и прижизненной микроскопии, этот протокол расследует Моноцит самонаведения и связанных с ними опухоли ангиогенеза после инъекции Моноцит в бедренной артерии лигирование мышиных модели.
Abstract
Терапевтические цель для периферической артериальной болезни и ишемической болезни сердца является увеличить приток крови к ишемической районах, вызванные гемодинамики стенозом. Сосудистая хирургия является жизнеспособным вариантом в отдельных случаях, но для пациентов без показания для операции, такие как прогрессии для отдыха боль, ишемии нижних конечностей или крупных срывов для жизни и работы, существует несколько возможностей для смягчения их болезни. Клеточная терапия через Моноцит повышенной перфузии путем стимулирования обеспечения формирования является одним из нескольких неинвазивные вариантов.
Наша группа рассматривает arteriogenesis после трансплантации Моноцит в мышей, с использованием модели ишемии задних конечностей. Ранее мы продемонстрировали улучшение перфузии задних конечностей с использованием столбняка стимулирует сингенных Моноцит трансплантации. Помимо последствий для обеспечения формирования роста опухоли могут быть затронуты этой терапии. Расследовать эти эффекты, мы используем базальной мембраны как матричная модель мыши путем впрыскивать внеклеточного матрикса саркомы Engelbreth-холм-Рой в бочку мыши, после окклюзии бедренной артерии.
После исследования искусственных опухоли мы используем прижизненной микроскопии для изучения в vivo опухоли ангиогенеза и Моноцит самонаведения в залог артерий. Предыдущие исследования описал гистологическом Животные модели, которая предполагает последующий анализ в посмертный артефактов. Наш подход визуализирует Моноцит самонаведения районы обеспечение в режиме реального времени последовательностей, легко выполнить и исследует процесс arteriogenesis и опухоли ангиогенеза в естественных условиях.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемической болезни сердца или болезнь периферических артерий, являются наиболее распространенными причинами смерти во всем мире1. Клеточная терапия-это перспективный подход для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, особенно для людей, которые не могут пройти хирургических вмешательств. Существует несколько подходов для использования ячеек или их выделяется веществ как терапевтическое средство2,3, с учетом общей цели улучшения перфузии и поддерживать функции ишемического и underperfused ткани. Одна попытка достичь этой цели – улучшить arteriogenesis, который стимулирует развитие залога артерий. Моноциты являются важным ячейки тип, связанный с обеспечение. Наша группа была сосредоточена на изучение последствий моноцитов в области воспаления4,5, в частности с помощью модели ишемии задних конечностей вызывают ишемию и последующего воспаление6. Моноциты дома в области воспаления и вызвать сложные системные ответы, которые приводят к развитию обеспечение7.
С использованием прижизненной микроскопии мы можем изучить поведение этих клеток в естественных условиях и наблюдать самонаведения вводят моноцитов в области воспаления. Большинство бывших исследования только описывают посмертное анализов, которые держат недостатки, включая введение гистологические артефакты и большое количество животных, необходимых для подготовки. С нашим подходом мы можем исследовать иммунологических процессов и обеспечения формирования через жить изображений в нескольких точках времени.
Помимо разработки сопутствующего артерий в ишемических зонах моноцитов также влияют на рост опухоли. Для расследования этих процессов, мы придать базальной мембраны как матрица, извлеченные из Engelbreth-холм-Рой мыши саркомы, опухоли богаты белков внеклеточного матрикса8и анализировать с помощью прижизненной микроскопии. Эта матрица используется для экрана теста молекул для формирования сети эндотелиальных клеток или противораковых терапий путем ингибирования ангиогенных; в этом случае мы будем оценивать потенциал ангиогенных опухоли моноцитов клетки терапии9,10,11.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации простой и эффективный способ изучения иммунологических процессов, вызванных ишемии в модели в естественных условиях . Мы можем создавать более реалистичные тестовой среде по сравнению с гистологическим реакционной посмертное мышечной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
наше исследование проводилось с разрешения государства, Landesverwaltungsamt Галле, Саксония-Анхальт согласно разделу 8 немецкого закона о защите животных. (§ 8, пункте 1 немецкого права для защиты животных от 18.05.2016 - BGBI. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV от 13.08.2013).
Примечание: для экспериментов здесь, были использованы 8-12 недельных самцов мышей BALB/c, и человека моноцитов крови доноров были использованы для визуализации моноциты через прижизненной микроскопии.
1. Подготовка клетки
Примечание: для изоляции моноцитов, смотрите наши предыдущие опубликованных видео на JoVE инструкции: " изоляции и внутривенных инъекций мышиных производные костного мозга Моноциты ", Вагнер и др. 4
Примечание: при работе с клетками все шаги должны быть стерильные, чтобы избежать загрязнения.
- Окрашивания клеток с 3,3 '-перхлорат Dioctadecyloxacarbocyanine
- Ресуспензируйте клеток в сыворотке крови бесплатно питательной среды с плотностью 1 х 10 6 клеток/мл.
Примечание: Только сыворотка бесплатно среднего позволяет эффективно окрашивание, поскольку липофильных краситель бы в противном случае уже захвачен липофильных компонентов сыворотки. - Добавить 5 мкл 1 мм 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine перхлората в диметилформамиде до 1 мл суспензии клеток и Ресуспензируйте тщательно.
- Инкубировать решение клеток при 37 ° C 20 мин
- Центрифуга клетки при 37 ° C и 500 g x 5 мин
- Выбить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 37 ° C теплой плода теленка сыворотки дополнены среднего.
- Дважды повторить шаги 1.1.4 и 1.1.5.
- Подсчитать ячейки с формулой:
- Ресуспензируйте клетки с 150 мкл стерильного 0,9% раствор NaCl.
- Вставки ячейки в Вену хвост.
- Ресуспензируйте клеток в сыворотке крови бесплатно питательной среды с плотностью 1 х 10 6 клеток/мл.
2. Анестезия
- Ингаляционной анестезии
- изофлюрановая с помощью испарителем, используя 5% концентрации в закрытых бен под капотом химической безопасности испаряться.
- Осторожно мышь и положил его в мусорное ведро.
- Обрабатывать животного кожу задняя шеи после того, как она перестала двигаться.
- Внутрибрюшинного анестезии
Примечание: использование изофлюрановая анестезии, описанные в разделе Шаг 2.1, для выполнения внутрибрюшинной инъекции. С быстрого восстановления и короткого действия наркотического эффекта изофлюрановая анестезии это проще для обработки мыши и придать внутрибрюшинного анестезии.- Использовать раствор 2.4 кетамин (10%), 0,8 мл Ксилазина (2%) до 6,8 мл NaCl (0.9%) для внутрибрюшинной инъекции.
- Вес животного до применения анестезии.
Примечание: Формула для анестезии является:
- использовать инсулин шприц 1 мл с иглой 30 G для вставки решение в левой подбрюшье.
- Место мыши в его клетке и ждать наркотического эффекта.
Примечание: Наркотического эффекта обычно появляется в течение 5 мин, если инъекции был успешным. Правильной глубины анестезии может определяться отсутствие крышки рефлекс или реакция на мыс пинча, а также регулярные, контролируемых скорость дыхания.
3. Имплантация базальной мембраны как матрицы
Примечание: Этот метод используется нашей группой для изучения после инъекции Моноцит ангиогенез опухоли. В зависимости от экспериментов факторы роста могут добавляться к матрице базальной мембраны как. Мы исполняли бедренной артерии лигирование перед инъекцией опухоль на фланге мыши. Матрицы должны иметь температуре 4 ° C для инъекций. На этой температуре матрица является жидкость; гель затвердевает в тело при температуре тела (37 ° C). Для лучшей видимости подкожной матрицы вилка, брить кожу мыши в месте инъекции.
Примечание: необязательно: добавить 100 нг основные фибробластический фактор роста, 300 нг Сосудистый эндотелиальный фактор роста и 26 И.Ю гепарина в стерильных условиях к базальной мембраны как матрица.
- Загрузить 1 мл матрицы в 30 G инсулина шприц и магазин на льду до использования.
- Положите животное на стол и держать кожу мыши рядом с инъекции на фланге.
- Придать 500 мкл базальной мембраны как матрицы подкожно.
Примечание: По практическим соображениям необходимо придать базальной мембраны как матрица компактно в одном месте, чтобы избежать подкожной дисперсии. Это будет проще выбить искусственного опухоль из ткани после принесения в жертву мыши в конце эксперимента.
4. Хвост вен инъекций
Примечание: практика инъекции Вену хвост с раствором NaCl на подопытных животных до экспериментов. Если моноциты нельзя адекватно вводят в Вену хвост, будет существовать не системный эффект на обеспечение. В этом протоколе мы вводили 2,5 миллионов моноцитов. Попробуйте вводить не более чем 5 мкл/г веса.
- Использовать решение Моноцит, подготовленный под шаг 1.1.8, содержащие 2,5 миллионов моноцитов.
- Использовать иглой 30 G и шприц 1мл инсулин для инъекций.
- Тщательно обрабатывают мыши, удержать животное в фиксатор и убедитесь, что мышь не повредило и имеет достаточное пространство для дыхания.
- Поместить фиксатор на грелку, чтобы хвост можно связаться пластину.
- Идентифицировать хвост вен, которые расположены на боковой стороне хвоста.
- Превратить хвост 90 °, поэтому хвост вен появляется на верхней стороне хвоста.
- Лечить стороне инъекции перед инъекцией моноцитов.
- Пытаются придать Моноцит решение в плоский угол с скос иглы перед макияж
Примечание: Остановите инъекции, если появляется волдырь, поскольку это является признаком неудачных инъекций. Попытка снова процедура более проксимально. - Остановить кровотечение в месте инъекции, применяя мягкое давление на хвост для около 60-х.
- Наблюдать животных для 30 мин для мониторинга системных побочных эффектов и поместите курсор мыши в своей клетке, после того, как животное полностью выздоровел.
5. Прижизненной микроскопии
- Подготовка
- место наркотизированных мыши на грелку (37 ° C) для поддержания постоянной температуры и исправить лапы на месте с помощью скотча.
- Дезинфекции кожи в месте ноги или бочку, которая используется для микроскопии.
- Бритья региона интерес для лучшей управляемости и во избежание помех с волосами.
- Акциз кожу стерильным скальпель и тонкой щипцами в площадь 0,5 х 0,5 см.
Примечание: Важно сохранить региона интерес влажной; в противном случае будут подорваны качество изображений и ткани. Раствор NaCl может использоваться для смочите области. - Поместить ноги между двумя регулируемыми марок и положение покровным стеклом на вершине марки.
- Ткани мокрый и контактирует с стекло.
- InjECT 50 мкл родамин декстрана ретробульбарная в венозной системы для лучшей видимости судов.
- Начать микроскопии и отрегулировать положение ноги при необходимости.
- Прижизненной микроскопии параметры
- включите Микроскоп, компьютеров, электронных интерфейсов и лазеров.
- Включения обогрева инкубационного палаты и/или Отопление этап (плита/pad) и установите температуру до 37 ° C.
- Начать приобретение программного обеспечения. Если микроскоп оснащен резонансный сканер, выберите этот быстрый режим сканирования.
- Ждать до тех пор, пока температура достигает постоянного уровня (35-37 ° C)
Примечание: Стабильная температура имеет важное значение для: (a) мышь, которая под наркозом не может контролировать свою температуру тела и (b) избежать или по крайней мере минимизировать фокуса дрейфа. Это может занять 1 h до нескольких часов, в зависимости от окружающих условий (например, системы кондиционирования воздуха и количество источников тепла в комнате, в том числе людей). Если используются цели погружения, контактной зоны между объективом и Стекло покровное (или ткани) является типичным источником нестабильности. Отопление объектив с объективной нагреватель может помочь; Кроме того, настоятельно рекомендуется микроскопа с системой автофокусировки. - Выберите увеличение объектива с высокой цифрой диафрагмы, которая отвечает требованиям резолюции эксперимента (см. Примечание в конце этого раздела).
- Оптимизировать параметры микроскопа относительно усиления, настройки каналов, скорость сканирования, пикселей, глубина объем, размер шага и усреднения до размещения экспериментальных животных на сцене.
- Сканирования двунаправленно уменьшить время аэросъёмки.
- Место наркотизированных мышь на подогретую микроскопа, после того, как Микроскоп достиг стабильных условий и параметров были протестированы с помощью манекена.
- Принести региона интерес в матрице базальной мембраны как в фокус с помощью яркого света освещения и инспектировать кратко капилляров ультрафиолетового света с надлежащей фильтрации параметров для прикладной флуорофоров.
- Переключиться на режим; сканирования начать сканирование в режиме низкого разрешения 256 x 256 и повысить прибыль и мощность лазера до тех пор, пока сигнал наблюдается на мониторе.
- Внимание на структуре интерес. Увеличение до тех пор, пока все детали видны.
- Определить " начать " и " конец " позиции в осевом направлении.
- Остановить сканирование.
- Определить степпинг размер (например, 0,5 мкм) и количество фокальной плоскости (например, 10-20).
- Переключатель для окончательного пикселей резолюции (512 x 512 или 1024 x 1024) в зависимости от скорости движущихся внутриклеточных структур или клеток и выберите Проверка скорость (частота сканирования), который подходит лучше для движений. Двунаправленного сканирования рекомендуется ускорить приобретение стеков.
Примечание: Выберите самый высокий показатель сканирования сканирования, что дает достаточное качество изображения. Типичные точки сканеры обеспечивают скорости между 400 Гц и 1.4 кГц. Резонансные сканеры обеспечивают дополнительный 8 кГц или 12 кГц. Уменьшая количество линий в y направлении, можно увеличить скорость сканирования (типичные значения — 512 x 512, 512 x 256 или 512 x 200 пикселей резолюции). В зависимости от соотношения сигнал шум можно попытаться улучшить качество изображения путем добавления строки в среднем между 2 и 4. Как правило параметр 512 x 200 без усреднения результатов в приобретение/сроки 18 ms в двунаправленном режиме с 8 кГц резонансный сканер; с 512 x 200 и 4 x усреднения, он замедляет вплоть до 56 ms за кадр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Прижизненной микроскопии для изучения опухоли и залога судов роста, вызванного моноцитов может помочь выявить новые аспекты в молекулярных механизмах по ангиогенез опухоли и arteriogenesis. Клетки должны быть подготовлены и вводили, тщательно с использованием действия протокола. Различия могут привести к вариации между одной экспериментов. Моноциты должны быть введены в венозной системы (рис. 1) для сохранения системных эффектов и избежание эмболии, которые могут возникнуть, если инъекции проводится в артериальную систему.
Если используется базальной мембраны как матрица, инъекционных медленно, чтобы избежать рассеивания поможет с эксплантация вилка для дальнейшего гистологического исследования (рис. 2, рис. 3). После принесения в жертву мыши, будут описаны вилку базальной мембраны как матрица с фланга мыши. В рамках базальной мембраны как матрица вилка мы можем измерить васкуляризации, подсчитывая капилляров в различных экспериментальных настройки (рис. 4, рис. 5).
Еще одним условием успешных экспериментов является параметр Микроскоп, который зависит от программного обеспечения, оборудования и подготовки животных (рис. 6). Если внутриклеточных структур (< 2 мкм) необходимо определить, вертикально микроскоп с 2-Фотон возбуждение и воды погружение целей (20 X или 25 X, числительное диафрагмы 1.0) с рабочим расстоянием (> 2 мм) рекомендуется. Поскольку цели погружения воды с высокой цифрой диафрагмы крайне чувствительны к вариации преломления, оптимальное разрешение и яркость должна корректироваться путем перемещения коррекции ошейник на цель. К сожалению Регулировка вручную довольно трудно из-за ограниченного пространства. Таким образом дорогие целей с моторизованным воротник коррекции предлагаются производителями микроскопа.
Если достаточна сотовой резолюции (5-10 мкм), 10 x сухой объектив с цифрой апертурой 0.4 или выше и длинный рабочее расстояние (> 2 мм) рекомендуется. В этом случае вертикально или инвертированным микроскопом стенд могут быть выбраны. Живой клетки изображений с 10 X сухого объектива (числительное апертурой 0.4) выше факторы масштабирования (> 3) это гораздо проще и дешевле, потому что классической Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (то есть, 1 Фотон возбуждения) может использоваться для получения стеки изображений с достаточной резолюции. Если много времени требуется для приобретения изображений, уменьшается количество родамин декстрана внутри судна. Для лучшей видимости судов, инъекции Флюорофор должен быть повторен (рис. 7).
Это наиболее эффективный способ попробовать различные коррективы и решить лучшее качество изображения возможно. Использование положительных зонды для клеток или базальной мембраны как матрица (без пересадки) может помочь получить оптимальные настройки. Мы могли обнаружить помечены моноциты через прижизненной микрофильм в крови поток и мышечные ткани (рис. 8, рис. 9). Гистологическое исследование тканей секций проверяет наши выводы (Рисунок 10).
Рисунок 1 : Инъекций 2,5 миллионов моноцитов в Вену хвост. Вены расположены на боковой стороне хвоста, с артерии на дорсальной и вентральной стороне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Инъекции базальной мембраны как матрицы. Обрабатывать кожу мыши и вставляют базальной мембраны как матрица на фланге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Вилка описаны матрица с фланга мыши (см. пункт 3.5). Включены судов через пять дней после трансплантации Моноцит через Вену хвост. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Сравнение васкуляризации в матрице базальной мембраны как ( 
+ SD, n = 3 в каждой группе). Судов в вилку базальной мембраны как матрица с добавил без фактор роста (красная полоса), по сравнению с судов базальной мембраны как матрица вилки с фактором роста добавил. Добавок базальной мембраны как матрица с фактором роста приводит к увеличению судна росту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Судов в вилку базальной мембраны как матрица. Визуализация крови потока (красный) внутри сосудов (стрелки) и моноцитов самонаведения (зеленый) в пределах вилку базальной мембраны как матрица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Мышь подготовлен для захвата изображений в. Лапы фиксируются с клейкой лентой и Стекло покровное располагается на вершине две регулируемые марки. Области интереса был вырезан с помощью скальпеля. NaCl используется для смочите области, так что качество изображения и ткани не будут скомпрометированы.
Рисунок 7 : Снижение видимости судов. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат окрашенных моноцитов (стрелки) в пределах матрицы базальной мембраны как рядом с судна (продольный разрез, *). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Моноцит вспыхнул в сосуд. В естественных условиях визуализация 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат витражи и пересаженные Моноцит (зеленая, стрелка) в рамках обеспечения артерии (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 : Прижизненной микроскопии. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат окрашенных моноцитов (стрелки) в пределах сопутствующий суда с типичной штопор формирования (*) окрашивали родамин декстрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10 : Иммуногистохимического окрашивания мускулатура бедра. Судов (красный: альфа-гладких мышц актина, *), макрофагов (зеленый: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Перхлораты, стрелки), клеточное ядро (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь проливает свет на развитие залога артерий, поведение моноцитов в этих судов и процесс arteriogenesis. Шаги для применения этого протокола, легко учиться и может использоваться в других областях науки. Несмотря на эти преимущества есть некоторые недостатки. К примеру микроскопические оборудование требуется для выполнения описанных методов. Получение оборудования для одного эксперимента является неустойчивым, поэтому очень важно сотрудничать с другими учреждениями, чтобы поделиться устройства.
Существуют другие трудности, связанные с настоящим Протоколом, который может избежаться с практикой. В начале, там могут быть проблемы с позиционирования мыши под микроскопом, и в этих обстоятельствах может пострадать качество изображения. Другой критической точки-это инъекции Вену хвост. Моноциты можно увидеть только в венах, если вставлен правильно. Таким образом желательно, на практике инъекций до позиционирования мыши.
Моноцит изоляции также является критической. Моноциты могут быть изолированы от разных видов, с использованием нескольких протоколов, которые часто приводят к различным результаты и ячейки урожаи12,,1314. Это необходимо для работы в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения. Повреждение клеток должно быть предотвращено тщательно закупорить и поддержания постоянной температуры.
Несмотря на эти недостатки этот метод является практическим и легко выполнять, позволяя пользователям пролить свет на ангиогенез опухоли и основные механизмы за болезнь периферических артерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ELSE-Kröner-Stiftung и DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Немецкий исследовательский фонд) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, совместный исследовательский центр). Особая благодарность Ханс-Хольгер Гёртнер, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke университет Магдебург, Магдебург, Германия, для технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
