Summary
Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.
Abstract
Terapötik periferik arter hastalığı ve iskemik kalp hastalığı için iskemik alanları tarafından hemodinamik darlığına neden kan akışını artırmak için hedeftir. Damar cerrahisi seçili durumda, ama ilerleme gibi cerrahi için belli olmayan hastalar ağrı, kritik uzuv iskemi veya hayat büyük kesintileri dinlenme ya da iş için uygun bir seçenek, kendi hastalık Azaltıcı için birkaç olasılık vardır. Hücre tedavisi monosit gelişmiş perfüzyon teminat oluşumu uyarılması yoluyla üzerinden birkaç non-invaziv seçeneklerden biri.
Bizim grup monosit nakli hindlimb iskemi modeli kullanarak fare içine sonra arteriogenesis inceliyor. Daha önce hindlimb perfüzyon syngeneic monosit tetanoz uyarılmış nakli kullanarak artış göstermiştir. Teminat oluşumu üzerine etkisi yanı sıra, tümör büyüme bu terapi tarafından etkilenebilir. Bu etkileri araştırmak için biz Engelbreth-Holm-Swarm sarkomu hücre dışı matriks fareyi, kanat femoral arter tıkanıklığı sonra enjekte edilerek bir membran benzeri matris fare modeli kullanın.
Yapay tümör çalışmaları sonra biz intravital mikroskobu vivo içinde tümör-anjiogenez ve Kollateral damar içinde homing monosit incelemek için kullanın. Önceki çalışmalarda hayvan modelleri, öldükten sonra yapılara daha sonraki analiz gerektirir histolojik incelenmesi anlatmıştık. Yaklaşımımız monosit posta collateralization gerçek zamanlı sekanslarında bölgelerine görüntüler, gerçekleştirmek, kolay ve arteriogenesis ve tümör angiogenez içinde vivosüreci inceler.
Introduction
Kalp-damar hastalıkları koroner kalp hastalığı veya periferik arter hastalığı, dahil olmak üzere, genel olarak ölüm en yaygın nedeni vardır1. Hücre tedavisi ve cerrahi müdahaleler geçmesi mümkün olmayan insanlar için özellikle kalp-damar hastalıkları, tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Hücreleri ya da onların salgılanan maddeler olarak bir tedavi aracı2,3, perfüzyon geliştirmek ve iskemik ve underperfused doku fonksiyonu sağlamak için genel amacı ile kullanmak için birkaç yaklaşım vardır. Bu hedefe ulaşmak için bir girişim arteriogenesis, Kollateral damar gelişimini artırır geliştirmektir. Monosit collateralization ile ilişkili bir önemli hücre türü vardır. Bizim grup alanlarında inflamasyon4,5, monosit etkilerini araştırma özellikle iskemi ve sonraki iltihap6ikna etmek için hindlimb iskemi modeli kullanarak odaklanmıştır. Monosit ve inflamasyon bölgelerine ev collateralization7gelişmesine yol karmaşık sistemik tepkiler.
İntravital mikroskobu kullanımı ile bu hücrelerin içinde vivo davranışını çalışma ve inflamasyon bölgelerine enjekte monosit posta gözlemlemek. En eski çalışmaları sadece post mortem analizleri, histolojik eser ve çok sayıda hayvan ürünleri için gerekli bir giriş de dahil olmak üzere dezavantajları tutun tarif. Yaklaşımımız, immünolojik süreçleri araştırabilirsiniz ve teminat oluşumu ile canlı görüntüleme birden fazla zaman noktalarda.
Kollateral damar iskemik alanlarda geliştirme ek olarak, monosit da tümör büyümesini etkiler. Bu işlemler araştırmak için Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu, bir tümör hücre dışı matriks proteinleri8' de, zengin çıkarılan bir membran benzeri matris enjekte edip intravital mikroskobu kullanarak analiz. Bu matris ekran test moleküllerine endotel hücre ağ oluşumu veya anjiogenik inhibisyonu yoluyla anti-kanser tedavileri için kullanılır; Bu durumda, monosit hücre terapisi9,10,11tümör anjiogenik potansiyelinin değerlendirecek.
Bu iletişim kuralı, immünolojik süreçleri içinde vivo modelinde iskemi neden eğitim için kolay ve verimli bir şekilde göstermek için amaçtır. Post mortem kas dokusu histolojik testleri için karşılaştırıldığında daha gerçekçi bir test ortamı oluşturabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
bizim çalışma Bölüm 8 hayvan koruma için Alman hukuk göre Saxony-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, durumunu izni ile gerçekleştirildi. (§ 8, paragraf 1 Alman hukuk hayvan 18.05.2016 - BGBI korunmak için. 1206, S. 1313, § 31 TierSchVersV 13.08.2013 gelen).
Not: burada deneyler için 8-12 hafta yaşlı erkek BALB/c fareler kullanıldı ve kan bağış insan monosit monosit intravital mikroskobu ile görselleştirme için kullanıldı.
1. hücre hazırlık
Not: monosit yalıtım için lütfen bizim önceki yayımlanan video JoVE yönergeler için bkz: " yalıtım ve intravenöz enjeksiyon, fare kemik iliği elde Monosit " tarafından Wagner vd. 4
Not: otelde tüm adımları içeren hücreleri çalışma kirlenmesini önlemek için steril olmalı.
- Hücre boyama 3,3 ile '-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat
- Resuspend serum serbest kültür orta yoğunluklu olarak 1 x 10 6 hücre/mL hücrelerde.
Not: Yalnızca serum ücretsiz orta lipofilik boya aksi takdirde zaten serum lipofilik bileşenleri tarafından esir edilemeyen bu yana bir verimli, boyama etkinleştirir. - Ekleyin 5 µL 1 mm 3,3 '-dimethylformamide 1 ml hücre süspansiyon Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat ve dikkatle resuspend.
- Incubate 20 dakika süreyle 37 ° C'de hücre çözümü
- Hücreleri 37 ° C ve 500 x g 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
- Süpernatant çıkarmak ve 37 ° C sıcak fetal buzağı serum takıma orta hücrelerle resuspend.
- 1.1.4 ve 1.1.5 adımları iki kez yineleyin.
- Formül içeren hücreleri saymak:
- 150 µL steril % 0,9 NaCl çözüm hücrelerle resuspend.
- Hücreleri kuyruk damar içine enjekte.
- Resuspend serum serbest kültür orta yoğunluklu olarak 1 x 10 6 hücre/mL hücrelerde.
2. Anestezi
- İnhalasyon anestezi
- bir kimyasal güvenlik başlık altında kapalı bir depo gözünde % 5'lik bir konsantrasyon kullanarak bir Buharlaştırıcı yardımıyla isoflurane buharlaştırmak.
- Fare dikkatli bir şekilde ele ve depo gözüne koydu.
- Hareketli durduktan sonra hayvan arka boyun cilt tarafından ele.
- Mayi anestezi
Not: kullanım isoflurane anestezi, mayi iğne gerçekleştirmek için adım 2.1, açıklanan. Hızlı kurtarma ve kısa etkili narkotik isoflurane anestezi etkisi ile fareyi işlemek ve mayi anestezi enjekte kolaydır.- 2,4 mL ketamin (% 10), 0.8 mL Xylazine (% 2) ve 6.8 mL NaCl (% 0,9) bir çözüm için mayi enjeksiyon kullanın.
- Anestezi uygulamadan önce hayvan tartmak.
Not: Anestezi için formül şöyledir:
- 1 mL insülin şırınga 30 G iğne ile çözüm sol bel altı enjekte etmek kullanın.
- Onun kafes içinde fareyi getirin ve narkotik etkisi için bekleyin.
Not: enjeksiyon başarılı narkotik etkisi normalde 5 dk içinde görünür. Anestezi doğru derinliği kapak refleks veya ayak çimdik tepki yokluğu, hem de nefes düzenli, kontrollü oranında tarafından belirlenebilir.
3. Membran benzeri matris implantasyonu
Not: Bu yöntem bizim grup monosit enjeksiyon sonra tümör angiogenez incelemek için kullanılır. Deneyler bağlı olarak büyüme faktörleri membran benzeri matris eklenir. Biz fareyi kanadını tümör enjekte önce femoral arter ligasyonu uygulandı. Matrisin bir sıcaklık enjeksiyon için 4 ° c olması gerekir. Bu sıcaklıkta matrix sıvıdır; bir katı, vücut sıcaklığında (37 ° C) için jel sertleşir. Subkutan matris daha iyi görüş için fiş, enjeksiyon yerinde fare cilt tıraş.
Not: isteğe bağlı: eklemek 100 ng temel fibroblast büyüme faktörü, 300 ng vasküler endotelyal büyüme faktörü ve membran benzeri matris için steril koşullarda 26 IU heparin.
- Kadar kullanmak 30 G insülin şırınga ve mağaza buz Matrix 1 mL yüklemek.
- Hayvan açayım ve enjeksiyon izi kanatta yanındaki fareyi cilt tutun.
- Enjekte membran benzeri matris 500 µL subkutan.
Not: pratik nedenlerden dolayı bu membran benzeri matris subkutan dağılım önlemek için sıkı bir yerde enjekte etmek gereklidir. Deney sonunda fare ödün sonra yapay doku tümöründen çıkarmak daha kolay olacak.
4. Kuyruk damar enjeksiyon
Not: kuyruk ven enjeksiyon NaCl çözümü deneme önce test hayvanlar üzerinde ile pratik. Monosit yeterince kuyruk damarda enjekte olamaz, collateralization sistemik etkisi olacaktır. Bu protokol için 2.5 milyon monosit enjekte. Vücut ağırlığı en fazla 5 µL/g enjekte çalışın.
- Adım 2.5 milyon monosit içeren 1.1.8 altında hazırlanan monosit çözüm kullanın.
- Enjeksiyon için 30 G iğne ve 1 mL insülin şırınga kullanın.
- Dikkatle fare işlemek, restrainer hayvan dizginlemek ve fare değil zarar ve nefes almak için yeterli alan bulunduğundan emin olun.
- Kuyruk plaka ulaşabilirsiniz restrainer Isıtma yastığını koymak.
- Kuyruk yan tarafında bulunan kuyruk damarlar tanımlamak.
- 90 °, kuyruk kuyruk ven kuyruk üst tarafında görüntülenen aç.
- Enjeksiyon yan monosit enjekte önce dezenfekte.
- Düz bir açı monosit çözümde yukarıya bakacak şekilde iğne eğim ile enjekte çalışın
Not: bir blister görünürse, bu başarısız bir enjeksiyon belirtisi olarak enjeksiyon durdurmak. Yordam yeniden denemeden daha proksimale. - Enjeksiyon yerinde yaklaşık 60'lar için kuyruğu üzerinde hafif basınç uygulayarak kanamayı durdurmak.
- Hayvan hayvan tam olarak kurtarıldı sonra onun kafes içinde fareyi getirin ve sistemik yan etkileri için izlemek 30 dk için gözlemlemek.
5. İntravital mikroskopi
- hazırlık
- yapışkan bant ile yer imzalat fare üzerinde sabit bir sıcaklıkta tutmak ve pençeleri yerde düzeltmek için Isıtma yastığını (37 ° C).
- Deri bacak ya da mikroskopi için kullanılan yan yerinde dezenfekte.
- Bölgenin ilgi daha iyi kullanım ve saç girişimi engellemek için tıraş.
- Tüketim steril neşter ve 0.5 x 0.5 cm kare bir alanda iyi Forseps ile cildi.
Not: İlgi bölgenin nemli tutmak önemlidir; Aksi takdirde, resim ve doku kalitesi tehlikeye girer. NaCl eriyik-ebilmek var olmak kullanılmış-alan nemlendirmek için. - Bacak arasında iki ayarlanabilir pul yerleştirin ve bir cam pulları üzerine konumlandırın.
- Doku ıslak ve cam ile temas halinde olun.
- INJECT 50 µL rodamine dextran retrobulbar damarlarının daha iyi görüş için Venöz sisteme.
- Başlamak mikroskobu ve gerekirse bacak konumunu ayarlamak.
- İntravital mikroskobu ayarları
- mikroskop, bilgisayar, elektronik arabirimleri ve lazerler açın.
- Kuluçka odası ısıtıcının üzerinde açmak ve/veya Isıtma sahne (plaka/tuş takımı) ve sıcaklığı ayarlamak için 37 ° c
- Edinme yazılımını başlatın. Mikroskop ile rezonans tarayıcı donanımlı, bu hızlı tarama modunu seçin.
- Sıcaklığı sabit düzey (35-37 ° C) ulaşıncaya kadar bekleyin
Not: İstikrarlı bir sıcaklık için önemlidir: anestezi altında vücut ısısı ve (b) kaçınmak veya en azından minimizing odak kayması kontrol edemez (a) fare,. Bu 1 h olarak (örneğin, Klima sistemi ve ısı kaynaklarının insanlar dahil Oda sayısı) çevre koşullarına bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Daldırma hedefleri kullandıysanız, objektif ve cam (veya doku) arasındaki temas bölgesi istikrarsızlık tipik bir kaynağıdır. Objektif ile objektif bir Kalorifer Isıtma yardımcı olabilir; Alternatif olarak, bir otomatik odaklama sistemi mikroskopla önerilir. - Deneme çözümleme gereksinimleri karşılayan yüksek bir rakam diyafram açıklığı ile büyütme lens seçin (bu bölümün sonundaki nota bakın).
- İle ilgili kazanç, kanal ayarları, inceden inceye gözden geçirmek hız, pixel kararlılık, derinlik birim, adım boyu ve Sahne Alanı'nda deneysel hayvan yerleştirmeden önce ortalama mikroskop ayarlarını optimize.
- Tarama edinme süresini azaltmak için uzmanlığından.
- Yer imzalat fare prewarmed mikroskop Sahne Alanı'nda sonra mikroskop kararlı koşullar ulaştı ve ayarları bir kukla yardımı ile test ettik.
- Faiz bölgesi membran benzeri matris içinde parlak ışık aydınlatma kullanarak odak haline getirmek ve kısaca tarafından uygulanan fluorophores için yeterli süzgeç ayarları ultraviyole ışıkla kılcal incelemek.
- Geçiş için tarama modu; düşük çözünürlük 256 x 256 modu taramaya başlayın ve kazanç geliştirmek ve lazer güç kadar bir sinyal monitörde görülmektedir.
- Odak faiz yapısı üzerinde. Tüm ayrıntıları görünür hale gelene kadar yakınlaştırın.
- Tanımla " başlangıç " ve " son " eksenel yönde pozisyon.
- Taramayı durdur.
- Bozkır boyutu (örneğin, 0,5 µm) ve odak uçaklar (örneğin, 10-20) sayısını tanımlamak.
- Anahtar için belgili tanımlık hareket eden hücre altı yapıları veya hücreleri ve seçme tarama hızına bağlı olarak son piksel çözünürlük (512 x 512 ya da 1024 x 1024) hızı (tarama frekans) hareketleri için en uygun. Çift yönlü tarama yığınları edinimi tutturmak için önerilir.
Not: yeterli resim kalitesi verir tarama en yüksek tarama hızı seçin. Tipik noktası tarayıcılar hızları 400 Hz ve 1.4 kHz arasında sağlar. Rezonans tarayıcılar bir ek 8 kHz veya 12 kHz sağlar. Y-yönde satır sayısını azaltarak, tarama hızı daha da arttırılabilir (tipik değerlerdir 512 x 512, 512 x 256 veya 512 x 200 piksel çözünürlük). Sinyal-gürültü oranı bağlı olarak bir saat 2 ile 4 arası ortalama satır ekleyerek görüntü kalitesini artırmak deneyebilirsiniz. Genellikle, bir ortamda 512 x 200 ortalama sonuç bir satın alma/süre 8 KHz rezonans tarayıcı ile çift yönlü modda 18 ms; 512 x 200 ve ortalama x 4 ile kare başına 56 ms aşağı yavaşlatır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör ve monosit tarafından tetiklenen Kollateral damar büyüme incelenmesi için intravital mikroskobu tümör anjiogenez ve arteriogenesis moleküler mekanizmaları yeni yönlerini ortaya çıkarmak yardımcı olabilir. Hücreleri hazır olmalı ve dikkatlice adımları protokolü kullanarak enjekte. Farklılıklar arasında tek deneyler varyasyonları için yol açabilir. Monosit Venöz sistem (sistemik etkileri korumak ve emboli, eğer enjeksiyon Arteryel sistemde yapılır hangi oluşabilir önlemek için,şekil 1) içine enjekte olmalı.
Membran benzeri matris kullandıysanız, yavaş yavaş dağılım önlemek için enjekte tak explantation daha fazla histolojik inceleme için yardımcı olacaktır (Şekil 2, şekil 3). Fare ödün sonra membran benzeri matris fişi fare kanadını explanted. Membran benzeri matris fiş içinde vaskülarizasyon kılcal (şekil 4, şekil 5) farklı deneysel ayarlarındaki sayarak ölçebilirsiniz.
Başarılı deneyler için başka bir koşul bağlı yazılım, donanım ve hayvan hazırlık (şekil 6) mikroskop ayardır. Eğer hücre altı yapıları (< 2 µm) lüzum-e doğru var olmak identified, 2-Foton-uyarma ve su daldırma hedefler (20 X veya 25 X, sayısal diyafram 1.0) kadar çalışma mesafesi ile dik bir mikroskopla (> 2 mm) tavsiye vardır. Su daldırma hedefleri yüksek rakam diyafram ile Kırılma indisi varyasyonları için son derece duyarlı olduğundan, en uygun görüntü çözünürlüğü ve parlaklık düzeltme tasma amaç hareket tarafından ayarlanması gerekir. Ne yazık ki, elle ayarlama sınırlı yer nedeniyle oldukça zordur. Bu nedenle, pahalı objektif bir motorlu yaka düzeltme ile mikroskop üreticileri tarafından sunulmaktadır.
Hücresel çözünürlük (5-10 µm) yeterli ise, 10 x kuru 0.4 veya daha yüksek bir rakam diyafram açıklığı ile lens ve uzun bir çalışma mesafesi (> 2 mm) önerilir. Bu durumda, bir dik veya bir ters mikroskop stand seçilebilir. Yüksek zum faktörler hücre görüntüleme ile 10 X kuru mercek (sayısal diyafram 0,4) canlı (> 3) klasik confocal lazer mikroskobu (Yani, 1 foton uyarma) tarama görüntü yığınları ile yeterli elde etmek için kullanılan çok daha kolay ve daha ucuz çünkü Çözünürlük. Fazla zaman görüntü alımı için gerekli ise, rodamine dextran gemi içinde miktarını azaltır. Gemiler bir daha iyi görüş için fluorophore enjeksiyon olması gerekir (Şekil 7) tekrarladı.
Farklı ayarlamalar örnek ve en iyi görüntü kalitesini mümkün olmadığına karar vermek en etkilidir. Pozitif probları kullanım hücreler veya membran benzeri matris (olmadan nakli) için en iyi ayarları elde etmek yardımcı olabilir. İntravital microcopy (şekil 8, Şekil 9) kan akışı ve kas dokusu içinde yolu ile Etiketlenmiş monosit tespit olabilir. Histolojik dokusu bölümleri incelenmesi bizim bulgular (şekil 10) doğrular.
Resim 1 : 2.5 milyon monosit enjeksiyon kuyruk ven içine. Damarlar dorsal ve ventral tarafta arterler ile kuyruk, yan tarafında yer alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Enjeksiyon membran benzeri matrisinin. Fare cilt işlemek ve kanadını membran benzeri matrisinde enjekte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Fare kanadını explanted matris fiş (bkz: 3.5 üzerine gelin). Beş gün sonra monosit nakli kuyruk ven yoluyla eklenen gemiler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Membran benzeri matris içinde vaskülarizasyon karşılaştırılması ( 
+ SD, n = 3 her grupta). Damarları membran benzeri matris tak gemiler için büyüme faktörü ile eklendi göre membran benzeri matris fişi ile hiçbir büyüme eklendi faktörü (kırmızı bar), içinde. Membran benzeri büyüme faktörü matrisiyle takviyesi artan gemi büyümesine yol açar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Gemiler içinde membran benzeri matris tak. Görselleştirme kan akışı (kırmızı) gemiler (oklar) ve içinde membran benzeri matris tak (yeşil) homing monosit içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Fare resim alma için hazır. Belgili tanımlık paws yapışkan bant ile sabittir ve bir cam iki ayarlanabilir pul üst kısmında konumlandırılmış. Bölgenin ilgi neşterle eksize. NaCl görüntüleri ve doku kalitesi değil tehlikeye girer böylece alan nemlendirmek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Gemileri görünürlüğünü azaldı. Monosit (oklar) membran benzeri matris yanında bir kap içinde lekeli 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (boyuna bölümü, *). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Monosit gemi temizlendi. Vivo görselleştirme 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat lekeli ve monosit (Yeşil ok) içinde teminat arter (*) nakledilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : İntravital mikroskobu. Rodamine dextran ile lekeli 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine lekeli perklorat monosit (oklar) tipik tirbuşon oluşumu (*) ile Kollateral damarlar içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10 : Immunohistological uyluk kas boyama. Gemiler (kırmızı: Alfa düz kas aktin, *), makrofajlar (yeşil: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat, oklar), hücre çekirdeği (mavi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemi Kollateral damar, monosit bu damarları davranışını ve arteriogenesis sürecinin geliştirilmesi ışık tutuyor. Bu iletişim kuralı uygulamak için belgili tanımlık merdiven are basit-e doğru öğrenmek ve diğer bilim alanlarında kullanılabilir. Bu avantajlara rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, mikroskobik ekipman açıklanan teknikleri yürütmek için gereklidir. Aygıtların paylaşmak için diğer kuruluşlarla işbirliği yapmak önemlidir bu yüzden bir deneme için ekipman edinme sürdürülemez,.
Uygulama ile önlenebilir bu iletişim kuralı ile bağlı diğer zorluklar vardır. Başlangıçta, orada-ebilmek var olmak mikroskop altında fare konumlandırma ile ilgili sorunlar ve görüntü kalitesi bu şartlar altında acı olabilir. Kuyruk ven enjeksiyon başka bir kritik noktasıdır. Monosit sadece eğer düzgün enjekte damarlarında görülebilir. Bu nedenle, fare yerleştirmeden önce enjeksiyon uygulama için tavsiye edilir.
Monosit yalıtım da önemlidir. Monosit farklı türlerden çeşitli sonuçları ve hücre sayıları12,13,14kez neden birden çok iletişim kuralını kullanarak ayrılmış olabilir. Kirlenmesini önlemek için steril koşullarda çalışmak gereklidir. Hücre hasarı dikkatle pipetting ve sabit sıcaklık sürdürmek engelledi.
Bu dezavantajları rağmen bu yöntem kullanıcıların tümör anjiogenez ve periferik arter hastalığı arkasındaki temel mekanizmaları ışık olanak sağlayan pratik ve gerçekleştirmek kolay olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser ELSE-Kröner-Stiftung tarafından desteklenen ve DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, ortak araştırma merkezi). Teknik destek için özel Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya, teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
