Summary
Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.
Abstract
Inzicht in de mechanismen die controle van kritieke biologische gebeurtenissen van neurale cel populaties, zoals proliferatie, differentiatie of cel lot besluiten, zal doorslaggevend zijn voor design therapeutische strategieën voor veel ziekten van het zenuwstelsel. Huidige methoden voor het bijhouden van cel populaties vertrouwen op hun uiteindelijke resultaten in stilstaande beelden en ze over het algemeen niet met voldoende temporele resolutie aan het omgaan met gedragsproblemen in afzonderlijke cellen. Bovendien variaties in celdood, gedrags heterogeniteit binnen een celpopulatie, verdunning, verspreiden of het lage rendement van de markers die gebruikt voor het analyseren van de cellen zijn alle belangrijke handicaps die zal leiden tot onvolledige of onjuiste read-outs van deresultaten. Omgekeerd vertegenwoordigt uitvoeren van levende beeldvorming en eencellige bijhouden onder passende omstandigheden een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van elk van deze gebeurtenissen. Hier, wordt een time-lapse video-microscopie protocol, gevolgd door post-processing, beschreven om bij te houden van de populaties van de neurale met eencellige resolutie, met specifieke software. De beschreven methoden kunnen onderzoekers te pakken essentiële vragen met betrekking tot de cel biologie en bloedlijn progressie van verschillende neurale populaties.
Introduction
Om nieuwe en effectievere therapeutische strategieën ontwikkelen om te regenereren neurale populaties, moeten we eerst begrijpen de fundamentele mechanismen die cellen met een regeneratieve neurale potentieel te handhaven. Nastreven van dit doel vereist een uitgebreide kennis van de factoren die het evenwicht tussen de onbeweeglijkheid, proliferatie/differentiatie, de modus en de timing van de divisie, lengte van de celcyclus, trekkende capaciteiten, levensvatbaarheidte regelen. Hoewel het een technische aanpak die heeft gewerkt voor vele jaren1, leven van beeldvorming en rechtstreekse waarneming nog steeds de beste optie om de hierboven genoemde gebeurtenissen te controleren. In tegenstelling tot vele andere benaderingen gecentreerd op eindpunt uitlezingen, live beelden en eencellige bijhouden informeren door de lengte van een experiment2,3,4,5, 6. zo de toevoeging van temporele resolutie kunt celdood, heterogene cel gedrag of cel lot besluiten, evenals zoveel andere kritieke gebeurtenissen kunnen worden geïdentificeerd die misschien anders doorgeven onopgemerkt. Ideaal, deze functies van cellen beste moeten worden gecontroleerd op de eencellige niveau in vivo waar zowel intrinsieke (cel autonome) en extrinsieke (cel niche) signalen in aanmerking worden genomen.
Echter, hoewel de in vitro situatie gebeurtenissen in een omgeving die niet reproduceren van de natuurlijke omgeving plaatsvinden doet, de lage dichtheid kweekomstandigheden meestal gebruikt in deze protocollen zijn geschikter te onthullen van de intrinsieke kenmerken van de cellen. Bovendien kan een meer simplistische controle van het omringende milieu, door eenvoudigweg de aanpassing van het groeimedium, vormen een waardevol instrument om te onderzoeken van de afzonderlijke rol van elke extrinsieke factor waarin de neurale niche, evenals omgevingsfactoren die kunnen in pathologische scenario's7,-8,9,10,11,12,13worden geïnduceerd. Daarom, wanneer correct geconfigureerd, zoals in het protocol hier voorgesteld, levende imaging biedt een oplossing haalbaar in vitro om aan te pakken van de meeste vragen eerder geïnventariseerd.
Dit protocol beschrijft in het kort, de hardware, software, kweekomstandigheden en de belangrijkste stappen die nodig zijn om met succes uitvoeren van een levende imaging experiment gevolgd door eencellige bijhouden. Deze aanpak biedt waardevolle informatie die helpt om te onthullen van de fundamentele aspecten van de biologie en de progressie van de afkomst, van meerdere neurale populaties.
Protocol
In de volgende secties beschrijven de stappen die nodig zijn om uit te voeren levende imaging gevolgd door eencellige volgen van meerdere neurale populaties (Figuur 1). Alle procedures waarbij dieren beschreven in dit protocol moeten worden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS).
Figuur 1. Regeling ter illustratie van de voornaamste experimentele stappen van de procedure, dat wil zeggen: cel cultuur, levende imaging PICC en gegevensverzameling, eencellige bijhouden en het uiteindelijke resultaat. De stappen worden genummerd volgens de werk-flow van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
1. de celcultuur: Isolatie en Plating van de geselecteerde neurale bevolking of cel Lineage
Opmerking: In combinatie met dit protocol, zijn voorbeelden van de toepassing ervan op verschillende cel populaties gegeven aan haar hulpprogramma voor het analyseren van de biologie van neurale cellen valideren. Deze omvatten: adulte neurale stamcellen (aNSCs) is afgeleid van de muis SubEpendymal Zone (SEZ) (voor een gedetailleerde isolatie protocol Zie14); Postnatale corticale astrocyten te bestuderen neuronale herprogrammering (voor een gedetailleerde isolatie protocol Zie15); Postnatale cerebellaire astrocyten (voor een gedetailleerde isolatie methode Zie16); en muis Neuro-2a neuroblastoom cellijn (N2a).
- Beënt de cellen rechtstreeks in poly-D-lysine gecoate 24-Wells-platen. Gebruik 1 mL gestolde voedingsbodem per putje. Incubeer de platen bij 37 ° C en 8% CO2 voor aNSCs, of bij 37 ° C en 5% CO2 voor de astrocyten/cellijn gedurende 2 uur voorafgaand aan levende imaging. Vermijd het gebruik van coverslips om te voorkomen dat ongewenste beweging zoals de gemotoriseerde Microscoop fase wordt verplaatst waardoor eencellige bijhouden onhaalbaar.
Opmerking: Cel dichtheden en cultuurmedia, werkzaam in de experimenten zijn: 30-40.000 cellen per putje voor aNSCs in Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM:F12 nutriënt mengsel medium); 20.000 cellen per putje voor N2a cellen in DMEM hoge Glucose medium, 80.000 cellen per putje voor cerebellaire astrocyten bij DMEM hoge Glucose drager wordt vastgelegd; en 55-65.000 cellen per putje voor postnatale astrocyten bij DMEM:F12 nutriënt mengsel medium. - Het standaardiseren van het cultuur-protocol door het aanpassen van de celdichtheid van de cultuur aan het laagste aantal cellen haalbaar. De celdichtheid moet echter voldoende hoog is om de levensvatbaarheid van de cultuur.
Opmerking: Als de celdichtheid te hoog is, de overtollige puin of slechte dissociatie (bosjes) kan een belemmering vormen bijhouden van afzonderlijke cellen.
2. levende Imaging door Time-lapse Video-microscopie
- Inschakelen van de Microscoop, camera, hardware en incubatie systemen. De temperatuur en luchtdruk op 37 ° C en 8% CO2 voor aNSCs of tot 37 ° C en 5% CO,2 voor de astrocyten/cel-lijn. Toestaan dat de temperatuur en CO2 niveaus te stabiliseren gedurende 1-2 uur.
Opmerking: Speciale apparatuur is vereist voor het uitvoeren van time-lapse video-analyse, waaronder: helder veld/fase contrast/fluorescentie microscopen met gemotoriseerde onderdelen; incubatie apparaten waarmee de temperatuur, het CO2 en de vochtigheid; en ten slotte, betrouwbare en voldoende krachtige hardware en software kunnen verwerven en verwerken van de hoeveelheid foto's verkregen tijdens live imaging experimenten (Please check de Tabel van de materialen). - Zodra de cellen worden stevig gekoppeld aan de plaat (2 uur na de beplating), gebruik een permanente marker pen om een klein merkteken op de bodem van een put die niet zal worden gebruikt voor het bijhouden, dat wil zeggen, een goed dat geen cellen bevat.
Opmerking: Dit merk zal worden gebruikt als een verwijzing naar de xyz-coördinaten nul, en het kan worden gebruikt op elk gewenst moment tijdens of na het experiment, of tussen de veranderingen van medium, terug te keren naar de nulpositie. - Plaats de plaat binnen van de Microscoop incubatie kamer en steek stevig de plaat naar het toneel voor het vermijden van elke ongewenste beweging tijdens de verplaatsing van de Microscoop van gemotoriseerde fase.
- Laat de temperatuur van de cel-kweekmedium aan equilibreer in de zaal gedurende ongeveer 20 minuten. Deze stap wordt voorkomen dat een verlies van focus tijdens de opname als gevolg van de dilatatie van componenten.
- Start van de live-imaging-software en selecteer de time-lapse module aan het opzetten van het experiment.
- De totale duur van het experiment en de afbeelding overname cycli in de "tijdschema tabblad menu" instellen Als gevolg van de inherente fototoxiciteit van de verzonden of fluorescentie licht gebruikt, definieert u een afdoende interval aan het evenwicht tussen de temporele resolutie van de analyse en de mogelijke dood van de cel.
Opmerking: bijvoorbeeld, een totaal van 120 h werd geselecteerd voor aNSC culturen, verwerven helderveld foto's elke 5 min. overwegen dat de verwerving van 120 h van een enkele film in deze configuratie 120-150 gigabytes aan gratis opslagruimte in het apparaat van de computer vergt. - Selecteer de afbeelding posities die zijn gedefinieerd door de x en y-coördinaten en de brandpuntsafstand (de z-coördinaat) in het "xyz punten tab menu". Omvatten het referentiepunt (nul xyz-coördinaat) als de aanvangspositie om op te halen van de coördinaten op elk gewenst moment.
- Selecteer het type van overname in het "golflengte tabblad keuzemenu", helderveld alleen of in combinatie met de excitatie van de epifluorescence wanneer dit nodig is. Selecteer de blootstellingstijd. In gedachten houden dat overmatige blootstelling aan overgedragen, en met name tl-licht, het gevaar van levensvatbaarheid van de cellen kan brengen (zoals hierboven is aangegeven).
- Voor aNSCs, cerebellaire astrocyten en N2a cellen, selecteert u helderveld (10-50 ms belichtingstijd).
- Voor getransduceerde corticale astrocyten helderveld (10-50 ms belichtingstijd) in combinatie met rood/groene fluorescentie selecteert, afhankelijk van de verslaggever voor het experiment gebruikt (rode excitatie golflengte: 550 nm en 400 ms belichtingstijd; groene excitatie golflengte: 460-500 nm en 100 ms belichtingstijd).
- Definieert de naam van het experiment en de map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. De lijst met posities te herladen van het experiment op elk gewenst moment opslaan en zodra alle voorwaarden zijn ingesteld, lopen het experiment door te klikken op de knop "run nu".
- Onderbreken van het experiment en opnieuw aan te passen de voorwaarden van de focus te klikken op de "overschrijven z-knop" eenmaal per dag totdat het experiment is voltooid. Als wijzigingen in het medium vereist tijdens de live beeldvorming zijn, onderbreken van het experiment en de plaat op te halen uit de tijd vervallen zaal.
Opmerking: De veranderingen in de pH van het medium als gevolg van celdood of overmatige proliferatie, evenals variaties bij kamertemperatuur, kunnen van invloed zijn op de juiste aandacht van de Microscoop op de cellen. Voor gevoelige culturen (zoals aNSCs) raden wij het gebruik van medium aangevuld met 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) (eindconcentratie: 1 mM).
3. post imaging immunocytochemie (PICC), gegevensverzameling, en verwerking
- Zodra het experiment is voltooid, onderbreken van de software en ophalen van de plaat voor fixatie en PICC, zoals beschreven in de volgende stappen.
- Uitvoeren van cel fixatie: wassen van de cellen een keer met 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 500 µL van paraformaldehyde (PFA) (4% in PBS), 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) aan het broeden.
Let op: Paraformaldehyde is een sterke fixatief en moet voorzichtig worden omgegaan, Voorkom contact met de huid of ogen. Het moet alleen in een zuurkast worden gemanipuleerd. - Spoel de cellen drie keer met PBS 1 mL en voeg 500 µL van de blokkerende oplossing (PBS met 2% (wt/vol) van bovien serumalbumine (BSA) en 0.2% (vol/vol) van een niet-ionogene oppervlakteactieve stof). Incubeer 1 uur op RT.
- Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 250-400 µL van de primaire antilichamen oplossing. Incubeer 2 h op RT. De primaire antilichamen oplossing bevat primaire antilichamen verdund in PBS met 2% (wt/vol) van BSA en 0.2% (vol/vol) van een niet-ionogene oppervlakteactieve stof. Antilichamen die in de experimenten die hier beschreven worden gebruikt: GFAP (1:500), βIII-tubuline (1:1, 000) en α-tubuline (1:1, 000). Als dit wordt uitgevoerd direct in de put, grotere volumes van de oplossingen vereist zijn (250-400 µL) ter dekking van alle cellen.
- Spoel driemaal met PBS 1 mL en voeg 250-400 µL van de oplossing van de secundaire antilichamen (verdund zoals beschreven in stap 3.4). Secundaire antilichamen gebruikt in de experimenten die hier beschreven:-antimuis fluoresceïne (FITC) (1:800), anti-konijn Cy3 (1:500). Incubeer 1 uur bij RT in het donker.
- Wassen drie keer in 1 mL PBS. Houden van de cellen in 1 mL PBS voor de opeenvolgende stappen van het protocol.
- Plaats de plaat terug op het podium van de Microscoop en steek het stevig naar het toneel voor het voorkomen van ongewenste verkeer tijdens de verplaatsing van de gemotoriseerde Microscoop fase.
- Haal de xyz nulpositie met behulp van het merk in stap 2.2 hebt gemaakt en opnieuw de posities naar dit referentiepunt instellen door op de knop "Offset alle X, Y, Z". Opnieuw instellen de brandpuntsafstand voor elke positie.
- Verwerven van een laatste ronde van de beelden, het configureren van de noodzakelijke voorwaarden voor fluorescentie emissie in de "golflengte selectie tabblad menu" oog op de opsporing van de antigenen die eerder in de PICC gericht.
- Kort, naast helderveld, activeren FITC (excitatie: 495 nm) en Cy3 (excitatie: 550 nm) acquisitie opties in de software. Gebruik 10-50 ms voor helderveld 400 ms blootstelling op te sporen van de fluorophores en druk op de knop "1 loop van de tijd", te verwerven van een laatste ronde van de foto's.
Opmerking: De intensiteit van de fluorescentie kan verschillen afhankelijk van de uitkomst van de PICC. De expositie tijd aanpassen met het oog op de optimale beeldkwaliteit.
- Kort, naast helderveld, activeren FITC (excitatie: 495 nm) en Cy3 (excitatie: 550 nm) acquisitie opties in de software. Gebruik 10-50 ms voor helderveld 400 ms blootstelling op te sporen van de fluorophores en druk op de knop "1 loop van de tijd", te verwerven van een laatste ronde van de foto's.
- Bestand/exporteren de optie van de software en de afbeeldingen in Tagged Image File Format (Tiff) of indeling van de Joint Photographic Experts Group (Jpeg) exporteren naar een vooraf gedefinieerde doelmap.
- Zet de afbeeldingen geëxporteerd naar de gewenste indeling van de opsporingssoftware: The Tracking Tool17 (tTt). Om dit te bereiken, definiëren de input en output map in de "tTt Converter tool" actief venster, evenals de markeringen gebruikt voor de posities (xy) kanalen (c) en de tijd-punten (t), en druk op de knop "convert images".
Opmerking: De afbeeldingen moeten worden gewijzigd overeenkomstig de specifieke instellingen en moeten zij worden opgeslagen in afzonderlijke mappen voor elke positie gebruikt in het experiment. Instructies voor de installatie, eisen, hernoemen van posities/afbeeldingen en het gebruik van de tracking tool zijn beschikbaar om te downloaden op: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.
4. eencellige Tracking
- Voer na het hernoemen van de gegevens, de tTt-software. Selecteer een naam en tTt werk gebruikersmap.
Opmerking: De tracking tool werkmap zal bevatten alle geanalyseerde gegevens en de geëxporteerde resultaten. De werkmap moet de naam tTtexport, met submappen met de naam "AVIexport", "Configs", "TreeExport" en "tTtfiles". - Selecteer het experiment worden geladen in het "select experiment mapvenster", met vermelding van het pad van de map waarin het experiment wordt opgeslagen, en klik vervolgens op de knop 'Laden experiment'.
- Uitvoeren van de log file converter de geladen afbeeldingen transformeren naar een indeling die kan worden gelezen door de opsporingssoftware (voor experimenten voor het eerst geladen, dit zal gevraagd worden automatisch door de software).
- Kies een positie voor bijhouden door te klikken op het symbool (na conversie, een overzicht van de standpunten opgenomen tijdens de experimenten wordt getoond in het "positie layoutvenster"). Elke positie zal vertegenwoordigd worden door een symbool bestaande uit een foto van de positie en het bijbehorende nummer (Zie Figuur 1).
- Zodra het standpunt is geselecteerd en een lijst van de beschikbare beelden wordt weergegeven aan de rechterkant van het "positie layoutvenster", selecteert u deze en klikt u op de knop "Afbeeldingen laden".
- Zodra het laden is voltooid en de "cel Editor venster" verschijnt, selecteer de golflengten en afbeelding interval worden bijgehouden in de "cel Editor Window". Golflengte 0 komt overeen met helderveld, 1 komt overeen met FITC, Cy3, 2 en 3 om DAPI. In de experimenten die hier worden beschreven, interval 1 werd gebruikt, dat wil zeggen, alle afbeeldingen geladen. Om te verduidelijken, betekent interval 2 laden van elke tweede afbeelding.
- Nadat de afbeeldingen zijn geladen, ga terug naar het "positie layoutvenster" en dubbelklik op het pictogram van de eerder geladen positie. De "film" verschijnt waarmee de eencellige tracking moet worden uitgevoerd.
- Na de instructies van het hulpprogramma Tracking, gaan bijhouden. Selecteer het 0 kanaal (overeenkomend met helderveld), en aanpassen van de helderheid en het contrast ("Stel gamma toets"). De tracering starten door op F2 te drukken.
Opmerking: Tijdens het volgen, de bijgehouden cel zal worden gevolgd door de muisaanwijzer erop te plaatsen en op "0" te drukken. De celdeling, de cel apoptosis en de verloren cel knoppen zijn beschikbaar om deze specifieke cel-gebeurtenissen te controleren.
5. eindresultaat
- Zodra één cel bijhouden is afgerond en het nageslacht geïdentificeerd, bewaren het experiment (tabblad cel Editor venster/bestand / opslaan van de huidige structuur) en gaat u verder met het exporteren van de resultaten.
- De bomen van het geslacht en de celgegevens in de "Export menu" gelegen in de "cel Editor Window" exporteren. Ook exporteren de cel afbeeldingen en films via de "Export menu" toegankelijk via het "venster van de film". De beelden, bomen van het geslacht, gegevens en films worden geëxporteerd naar de tTt werkmap.
Representative Results
De methode beschreven in staat stelt kritische vragen over de biologie van de cel van meerdere neurale populaties worden opgelost. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om te controleren van de voortgang van de neurogene en oligodendrogliogenic afkomst van aNSCs7,8,14,18geweest. Door het bijhouden van één aNSCs en hun nakomelingen (figuur 2A, B), was het mogelijk om aan te tonen dat aNSCs geïsoleerde in vitro handhaven hun neurogene aard, genereren meestal neuroblasten, en dat zij een reeks volgen voorgesteld in vivo19 , maar niet eerder aangetoond op het niveau van één cel. Bovendien, deze cultuur systeem toegestaan asymmetrische celdelingen te worden gevisualiseerd voor het eerst in de afstamming van de aNSC van de SEZ (figuur 2B), bieden een uniek model voor het bestuderen van NSC zelf-vernieuwing8,14. Ook, en ongeacht de afkomst geanalyseerd, bleek het mogelijk om waardevolle gegevens met betrekking tot de celgroei, de rondes van de divisie, levensvatbaarheid van de cellen, of de lengte van de celcyclus te verkrijgen.
Figuur 2. Voorbeeld van aNSCs van de SEZ geïsoleerd en geanalyseerd door levende beeldvorming en eencellige bijhouden. Fase contrast beelden verbeelden de progressie van de kloon op verschillende tijdstippen (dag-h: min). De uiteindelijke afbeelding correspondeert met de post imaging immunocytochemie (PICC) voor gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP, rood), βIII-tubuline (groen) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blauw). (A) analyse van symmetrische neurogene bomen door verschillende rondes van het versterken van de divisies Post mitotische neuroblasten genereren. Rode pijlen wijzen naar de cellen in de symmetrische bomen opgenomen. Aan de rechterkant, worden de bomen van het geslacht overeenkomt met het klonen en gegenereerd door de tTt software weergegeven. (B) voorbeeld van een voorvader genereren een asymmetrische neurogene boom, met één tak uitdeinende divisies om te produceren neuroblasten terwijl de andere geeft aanleiding tot rustige GFAP positieve cellen door middel van een mogelijke gebeurtenis van de zelf-vernieuwing ondergaan. Aan de rechterkant, wordt de boom van de bloedlijn gegenereerd door de tTt software weergegeven. In alle bomen van het geslacht: "N" toont na mitotische neuroblasten; "G", rustige GFAP-positieve cellen; "X", de dood van de cel; en "?" een verloren cel. Schaal staaf vertegenwoordigt 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Leven van beeldvorming en eencellige analyse ook bijhouden biedt een nauwkeurige uitlezing van de trekkende capaciteiten van een neuraal bevolking. Dergelijke informatie is verkregen uit postnatale cerebellaire astrocyten voorgelegd aan een kras wond assay20, het genereren van informatie met betrekking tot de gemiddelde afstand reisde door de astrocyten bij het sluiten van de wond (Figuur 3). Bovendien was het mogelijk om te zien dat sommige van de astrocyten verdeeld tijdens het genezingsproces, terwijl anderen ongewijzigd gedurende het gehele experiment blijven. Opvallend, lijken die verdeeld te vertonen meer productieve trekgedrag dan hun niet-delende tegenhangers (reist twee keer zo veel gemiddeld). Dit verschijnsel stelt een zeer interessante heterogeniteit in de capaciteit van de astrocyten vormen een litteken op schade, die zou hebben zijn verdund uit in de uitlezing van een klassieke eindpunt analyse experiment.
Figuur 3. Analyse van het trekgedrag van postnatale cerebellaire astrocyten bij een kras wond assay. Fase contrast beelden verbeelden de wond op verschillende tijdstippen (dag-h: min). Lineage bomen, gegenereerd door tTt software, illustreren het representatieve gedrag, in termen van de celdeling van de astrocyten terwijl het sluiten van de wond. Histogram toont de gemiddelde afstand reisde door de astrocyten geanalyseerd door eencellige bijhouden (gemiddelde ± S.E.M.). Schaal staaf vertegenwoordigt 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Een ander interessant kenmerk van de time-lapse video-microscopie experimenten is de capaciteit om te vergelijken van de proliferatie en differentiatie in een celpopulatie. We testten N2a cellen verguld onder voorwaarden ter bevordering van de proliferatie (in aanwezigheid van 10% foetale runderserum (FBS)) of differentiatie (in het bijzijn van 0.5% FBS + 10 µM arachidonzuur). Het was mogelijk om te volgen van de progressie van de afkomst van deze cellen proliferatieve omstandigheden (figuur 4A), overwegende dat de onderscheidende cellen niet vermenigvuldigen en vormen ze neurites (figuur 4B). Opmerkelijk, eencellige bijhouden toegestaan kolonies met verschillende proliferatie capaciteiten te onderscheiden en neurite rek (en retractie) worden geëvalueerd, verstrekken van nauwkeurige en kwantitatieve gegevens die vervolgens kunnen worden geëxporteerd.
Figuur 4. De bewaking van de biologie van de cel van N2a in proliferatie (A) of differentiatie voorwaarden (B). Fase contrast foto's beeltenis van de progressie van de kloon op verschillende tijdstippen (dag-h: min). De uiteindelijke afbeelding correspondeert met de post imaging immunocytochemie (PICC) voor α-tubuline (groen). (A) één cel bijhouden kan de rondes van de divisie te worden gecontroleerd, evenals de heterogeniteit in de proliferatieve reactie van verschillende cellen. Aan de rechterkant illustreert de boom van de bloedlijn gegenereerd door de tTt software het proliferatieve gedrag van N2a cellen. (B) cellen onder de voorwaarden van de differentiatie sluit de celcyclus en genereren van neurites, een proces dat effectief kan worden gemeten door na imaging analyse. Enkele cel bijhouden, vertegenwoordigd door de bloedlijn boom aan de rechterkant, illustreert hoe N2a cellen celcyclus afsluiten en stoppen van de celdeling differentiatie omstandigheden. Schaal staaf vertegenwoordigt 50 µm.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Ten slotte, woon imaging en eencellige bijhouden is uiterst nuttig om te controleren van morfologische en moleculaire veranderingen wanneer cellen worden ingediend bij de herprogrammering. Live beeldvorming van postnatale astrocyten getransduceerde met Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) biedt waardevolle gegevens met betrekking tot de morfologische veranderingen die bij herprogrammering of de blokkering van de celdeling optreden bij astrocyten geherprogrammeerde (Zie Figuur 5). Bovendien wanneer Ascl1 transductie wordt gecombineerd met de transductie van een constructie-codering voor groene fluorescentie proteïne (GFP) onder de controle van de promoter dubbele Cortin (DCX), is het mogelijk om te bepalen van het exacte tijdstip wanneer neuronale specifieke markers beginnen te worden uitgedrukt in de geherprogrammeerde cellen (Figuur 5). Time-lapse video-microscopie maakt het ook mogelijk het aantal cellen dat herprogrammering worden gekwantificeerd en in vergelijking met de cellen die tijdens dit proces sterven kan worden voltooid. Toezicht op dergelijke gebeurtenissen leidden tot de identificatie van de kritische "checkpoints" in de cellen die met succes geherprogrammeerde9 werden.
Figuur 5. Analyse van postnatale corticale astrocyten onderworpen aan neuronale herprogrammering. Herprogrammering was geïnduceerd door transductie met pro-neurogene Ascl1-rood fluorescentie eiwit (RFP) vectoren. Neuronale conversie werd gecontroleerd door co transductie met een vector GFP onder de controle van een promotor DCX codering. Fase contrast beelden tonen de progressie van herprogrammering op verschillende tijdstippen (dag-h: min). Fluorescentie beelden van RFP en GFP expressie, respectievelijk. Wonen van beeldvorming en eencellige bijhouden toegestaan cruciale gebeurtenissen te volgen, zoals morfologische veranderingen, het ontbreken van celdeling tijdens herprogrammering, de dood van de cel, en de nauwkeurige tijd wanneer geherprogrammeerde cellen beginnen te spreken van neuronale markeringen kan worden gedefinieerd . Schaal staaf vertegenwoordigt 80 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Een van de meest belangrijke waarden voor levende imaging is de mogelijkheid voor het uitvoeren van nauwkeurige lineage opsporing, ophelderen van kritieke aspecten van lineage progressie in een neuraal bevolking. Lineage tracering wordt gedefinieerd als de identificatie en controle van alle van de nakomelingen van een enkel voorlopercellen, van de oprichter van de kloon naar de volgende kloon21gevormd. Opmerkelijk, alternatieve testmethoden voor lineage traceren (bv, virale transductie of multicolor verslaggever constructies21) hebben een essentieel nadeel, waarbij het eindresultaat is gebaseerd op stilstaande beelden en het doet niet noodzakelijkerwijs de hele reeks vormen. Dit betekent dat celdood, heterogeniteit in het gedrag van de bevolking van de cel, verdunning, verspreiden of slecht efficiëntie van de markers, samen met andere belangrijke handicaps, leiden tot onvolledige of onjuiste read-outs van de resultaten2. Levende imaging maakt bovendien de onderzoeker voor het analyseren van de belangrijke kenmerken van de biologie van neurale bevolkingen, zoals de modus en de timing van de celdeling celgroei, migratie, proliferatie versus differentiatie, lengte van de celcyclus, neurite vorming, complexiteit en lengte, cel lot selectie (differentiatie), of conversie (herprogrammering).
Bovendien, levende imaging gemakkelijk kan worden aangevuld met andere analyse die bedoeld zijn om gegevens van afzonderlijke cellen zoals, bijvoorbeeld, RNA sequencing. Echter, om gecombineerde profiteren zowel live beeldvorming en andere technieken vereist dat deze cellen eerder gecontroleerd in de films zijn later opnieuw geïdentificeerd en afzonderlijk verzameld voor de secundaire analyse. Dit kan worden bereikt met behulp van microscopen die positioneel coördinaten, door het toepassen van fluorescerende verslaggevers voor specifieke cellen of analyseren van de verdeling van de groepen van cellen als verwijzingen bevatten. Inderdaad, de combinatie van het transcriptoom profiel en het gedrag van afzonderlijke cellen kunnen vertegenwoordigen een krachtige route ophelderen van nieuwe moleculaire signalen die betrokken zijn bij de biologie van cellen.
Een van de belangrijkste problemen die een levende imaging experiment in gevaar kunnen brengen is een onvoldoende celdichtheid cultuur. Zoals eerder aangegeven, bij hoge dichtheid de overdaad aan puin of slechte dissociatie (klomp vorming) invloed kan zijn op de kwaliteit en de ruimtelijke resolutie van de beelden, het maken van eencellige bijhouden onhaalbaar. Daarom moeten de voorwaarden van de bevolkingen van de afzonderlijke cel onder studie worden aangepast aan het laagste aantal cellen mogelijk zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de cultuur van de cel.
De frequentie van Beeldacquisitie is ook van cruciaal belang en moet worden zorgvuldig aangepast, met name wanneer fluorescentie verlichting wordt gebruikt. Overmatige blootstelling aan verzonden en vooral fluorescentie licht levensvatbaarheid van de cellen in gevaar kan brengen. Als alternatief, een bovenmatige vertraging tussen het vastleggen van de beelden kan interfereren met de temporele resolutie van de analyse.
Een andere belangrijke stap tijdens het levende imaging experiment is de periodieke aanpassing van zich te concentreren. Storing in de juiste instelling/re-setting van de scherpstelafstand kan belemmeren eencellige bijhouden. Bovendien is het noodzakelijk om zorgvuldig controleren dat de kamer van de incubatie bewaart het voldoende temperatuur, vochtigheid en CO2 niveaus, tot wijziging van de ongewenste variaties die leiden celdood tot kunnen.
Ten slotte, zodra de PICC is verricht, is het belangrijk goed de xyz nul-positie voorafgaand aan de laatste ronde van Beeldacquisitie ophalen. Onjuiste opnieuw instellen van de xyz nulpositie zal bemoeilijken overeenkomen met de fase contrast en immunofluorescentie beelden, belemmeren de identificatie van de nakomelingen van de cel.
Hoewel deze benadering vele positieve facetten heeft, blijven enkele beperkingen aan de levende imaging van neurale bevolking. Bijvoorbeeld, maakt de lage celdichtheid vereist voor het uitvoeren van succesvolle eencellige tracking van aNSCs het onmogelijk om biochemische tests, zoals Western blotting14in dienst. Bovendien controle snel verdelen populaties zoals cerebellaire astrocyten of N2a cellen is stoffelijk beperkt aangezien het vaak ook moeilijk om bij te houden van de cellen als de culturen in de buurt van samenloop. Bovendien, vele cultuur-methoden, evenals de inherente biologische beperkingen die verbonden zijn met de isolatie van cellen, vaak levensvatbaarheid cel over lange periodes, beperking van de duur van de levende imaging experimenten. Tot slot, isoleren van cellen uit hun natuurlijke omgeving heeft zowel positieve als negatieve effecten. Cellen geïsoleerd van hun fysiologische niche kunnen mislukken om te ontvangen van belangrijke signalen die moduleren van hun gedrag, terwijl op hetzelfde moment, het vertegenwoordigt een krachtig instrument voor het testen van het effect van deze signalen individueel in de progressie van de bloedlijn van specifieke neurale populaties.
Gezien de beperkingen hierboven beschreven, is het duidelijk dat het perfecte methodologische scenario zijn zou om uit te voeren levende imaging en één cel bijhouden experimenten onder normale fysiologische omstandigheden in vivo. Huidige technieken zijn echter niet kon volgen van afzonderlijke cellen voor langere tijd in diepe delen van de hersenen-2. Dus moet de toekomst voor levende imaging richten op het overwinnen van deze beperking, gericht op de celbiologie van afzonderlijke cellen in vivo met de kleinste mogelijke interferentie van de fysiologische omgeving3volledig te analyseren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij bedanken Beatriz Gascon voor haar hulp en kunst werk in Figuur 1. Wij danken ook Dr. C. Norris voor zijn hulp. Het werk hier gepresenteerd werd gesteund door onderzoekssubsidies, "Red de excelencia Consolider-Ingenio Spaans ionkanaal initiatief" (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) en Fundación Ramon Areces Grant programma (PR2018/16-02). Felipe Ortega erkent de Ramon y Cajal programma van het Spaanse ministerie van economie en concurrentievermogen (MEC: RYC-2013-13290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
