Summary
Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.
Abstract
Sinir hücre popülasyonlarının, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma veya hücre kader kararlar, gibi önemli biyolojik olaylar kontrol mekanizmaları anlama sinir sistemini etkileyen birçok hastalık için tedavi edici tasarım stratejileri için çok önemli olacak. Hareketsiz görüntüler onların son sonuçlar hücre popülasyonlarının izlemek için geçerli yöntemleri itimat ve genellikle tek kişilik hücrelerde davranış özellikleri tanımlamak için yeterli zamansal çözünürlük sağlamak başarısız. Ayrıca, hücre ölümü değişimler, bir hücre nüfus, seyreltme, yayma veya hücreleri çözümlemek için kullanılan veri işaretleyicilerini düşük verimlilik içinde davranış heterojenite sonuçları eksik veya yanlış okuma için götürecek tüm önemli handikapları bulunmaktadır. Bunun tersi olarak, bu olayların her biri izlemek için güçlü bir araç performans canlı görüntüleme ve uygun koşullar altında izleme tek hücre temsil eder. Burada, post-processing tarafından takip time-lapse video mikroskobu iletişim kuralı, belirli yazılım istihdam sinirsel nüfus tek hücre çözünürlükte izlemek için kullanılmıştır. Açıklanan yöntemlerden farklı sinirsel nüfus hücre biyolojisi ve soyu ilerleme ile ilgili temel soru çözmek araştırmacılar etkinleştirin.
Introduction
Sinirsel nüfus yeniden oluşturmak için yeni ve daha etkili tedavi stratejileri geliştirmek için öncelikle rejeneratif sinirsel potansiyele sahip hücreleri korumak temel mekanizmaları anlamak gerekir. Bu hedefin peşinde sendika, nükleer silahların yayılmasına karşı/farklılaşma, modu ve bölünme, hücre döngüsünün uzunluğu, göçmen kapasiteleri, canlılığızamanlaması dengesini düzenleyen faktörler kapsamlı bir bilgi gerektirir. Birçok yıl1için istihdam bir teknik yaklaşım olmasına rağmen canlı görüntüleme ve doğrudan gözlem hala yukarıda listelenen olayları izlemek için en iyi seçenek kalır. Son nokta çıktıları üzerinde merkezli birçok diğer yaklaşımların aksine görüntüleme yaşamak ve tek hücre izleme bilgilerini bir deney2,3,4,5, uzunluğu boyunca sağlar 6. böylece, zamansal çözünürlük eklenmesini sağlar hücre ölümü, türdeş olmayan hücre davranış veya hücre kader kararlar, aksi takdirde geçmek olabilir tespit edilmesi gibi pek çok diğer kritik olayları fark edilmeden. İdeal olarak, bu özellikler hücrelerinin en iyi tek hücre düzeyi içinde vivo takip edilmelidir nerede her iki iç (hücre özerk) ve dışsal (hücre niş) ipuçlarını dikkate alınır.
Vitro durum olaylar doğal çevre çoğaltmak değil bir ortamda gerçekleşen, ancak, genellikle bu protokollerin kullanılacağını düşük yoğunluklu kültür koşulları içsel özelliklerini ortaya çıkarmak daha uygun olmakla birlikte, hücreleri. Ayrıca, sadece büyüme orta değiştirerek çevreleyen ortamın, daha basit bir kontrol olabilir çevresel faktörler yanı sıra her sinir niş tanımlar extrinsic faktör bireysel rolünü araştırmak için değerli bir araç teşkil edebilir patolojik senaryoları7,8,9,10,11,12,13' te bağlı olmak. Bu nedenle, ne zaman doğru yapılandırılmış, burada, önerilen Protokolü olduğu gibi canlı görüntüleme daha önce numaralandırılan sorulara yönelik olarak uygun vitro çözümü sağlar.
Kısacası, bu protokol donanım, yazılım, kültür koşulları ve izleme tek hücreli tarafından izleyen bir canlı görüntüleme deneyi başarıyla gerçekleştirmek için gereken temel adımları açıklar. Bu yaklaşımın temel yönleri Biyoloji ve soy progresyon birden çok sinir örneğin alınma olasılığını ortaya çıkarmak için yardımcı olur değerli bilgiler sunar.
Protocol
Aşağıdaki bölümlerde canlı görüntüleme birden çok sinir nüfus (şekil 1) tek hücre izleme tarafından takip gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Tüm yordamlar içeren hayvanlar bu protokol için açıklanan olmalıdır laboratuvar hayvan bilimi (ICLAS) için uluslararası Konseyi kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır.
Şekil 1. Yordam, Yaniasıl deneysel adımları gösteren düzeni: hücre kültürü, canlı görüntüleme, PICC ve veri toplama, tek hücre izleme ve nihai sonucu. Belgili tanımlık merdiven Protokolü'nün iş akışı göre numaralandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
1. hücre kültürü: İzolasyon ve seçili sinirsel nüfus veya hücre Lineage kaplama
Not: Bu protokol ile birlikte, sinir hücreleri Biyoloji analiz etmek için yararını doğrulamak için farklı hücre popülasyonlarının için kendi uygulama örnekleri verilmiştir. Bu içerir: Yetişkin sinir kök hücreleri (aNSCs) elde edilen SubEpendymal bölgesi (SEZ) mouse (için bir detaylı yalıtım Protokolü Bkz:14); Nöronal (bir detaylı yalıtım Protokolü Bkz:15için); yeniden şekillendirmek için çalışmaya postnatal kortikal astrocytes Doğum sonrası serebellar astrocytes (bir detaylı yalıtım yöntemi görmek için16); ve fare nöro-2a Nöroblastom hücre kültürünü (N2a).
- Tohum hücreleri doğrudan Poli-D-lizin üzerinde 24-şey plakaları kaplı. Kültür orta 1 mL iyi kullanın. 37 ° C ve % 8 CO2 için aNSCs veya astrocytes/hücre satırı için canlı görüntüleme önce 2 h 37 ° C ve % 5 CO2 tabak kuluçkaya. Tek hücre izleme olanaksız kılan motorlu mikroskop sahne yerlerinden gibi istenmeyen hareket önlemek için coverslips kullanmaktan kaçının.
Not: Hücre yoğunluğu ve kültür deneylerde istihdam medya vardır: 30-40,000 hücreler/iyi Dulbecco içinde aNSCs için kartal orta (DMEM:F12 besin karışımı orta); değiştiren'ın DMEM yüksek glikoz orta serebellar astrocytes için 20.000 hücre/iyi DMEM yüksek glikoz orta N2a hücreler için 80.000 hücreler/iyi; ve 55-65.000 hücreler/iyi DMEM:F12 besin karışımı orta doğum sonrası astrocytes için. - Kültür Protokolü kültür hücreleri mümkün düşük sayıda hücre yoğunluğu ayarlayarak standartlaştırmak. Yine de, hücre yoğunluğu kültür canlılığı korumak için yeterince yüksek olması gerekir.
Not: hücre yoğunluğu çok yüksek ise, aşırı enkaz veya zavallı ayrılma (kümeleri) izleme tek hücre engelleyebilir.
2. live tarafından hızlandırılmış Video mikroskobu görüntüleme
- Mikroskop, kamera, donanım ve kuluçka sistemlerinde açmak. Sıcaklığı ayarlamak ve hava basıncı 37 ° C ve % 8 CO2 için aNSCs veya astrocytes/hücre satırı için 37 ° C ve % 5 CO2 . Sıcaklık ve CO2 düzeyleri için 1-2 h stabilize etmek için izin verir.
Not: Belirli donanım hızlandırılmış video analiz gerçekleştirmek için gereken de dahil olmak üzere: parlak alan/faz kontrast/floresan mikroskoplar motorlu bileşenlerle; sıcaklık, CO2 ve nem kontrolü kuluçka cihazlar; ve son olarak, güvenilir ve yeterince güçlü donanım ve yazılım edinme ve resimler hacmi işleme yeteneğine (Lütfen kontrol edin Malzemeler tablo) canlı görüntüleme deneyler sırasında elde edilen. - Hücreleri sıkıca plaka (2 h sonra kaplama) İliştirildikten sonra Daimi marker kalem izlemek için Yani, hücreleri içermeyen bir şey kullanılmaz bir şey dibindeki küçük bir işareti yapmak için kullanın.
Not: Bu işareti bir referans olarak xyz koordinatları sıfır olarak kullanılan ve sırasında veya deneme sonra veya orta sıfır konumuna döndürmek için değişiklikler arasında herhangi bir zamanda kullanılabilir. - Plaka mikroskop'ın kuluçka odası yerleştirin ve sıkıca plaka mikroskop'ın motorlu sahne yer değiştirme sırasında herhangi bir istenmeyen hareketi önlemek için sahne alanı ekleyin.
- Yaklaşık 20 dk için odasında equilibrate için hücre kültür orta sıcaklık izin. Bu adım bileşenleri genişleme nedeniyle kayıt sırasında odak bir kaybı önlemek olacaktır.
- Canlı görüntüleme yazılımı başlatmak ve deneme oluşturmak için zaman hata modülü seçin.
- Deneme ve görüntü edinme döngüleri toplam süresi "zaman çizelgesi sekmesi menüsünde" ayarlayın. Doğal fototoksisite, iletilen veya kullanılan Floresan ışık nedeniyle, zamansal çözünürlük analizi ve potansiyel hücre ölümü arasında dengelemek için yeterli aralığı tanımlayın.
Not: Örneğin, toplam 120 h aNSC kültürler, aydınlık alan resimler her 5 dk. düşünün bu yapılandırmadaki tek bir filmin 120 h edinimi 120-150 gigabytes-in özgür depolama yer içinde belgili tanımlık bilgisayar aygıt gerektirecektir edinme için seçildi. - X ve y koordinatları ve "xyz Puan tab menü" içinde odak mesafesini (z koordinatı) tarafından tanımlanan görüntü konumlara seçin. Referans noktası (xyz sıfır koordinatı) koordinatları herhangi bir zamanda almak için olarak başlangıç konumunu içerir.
- Sadece veya gerektiğinde epifluorescence uyarma ile birlikte satın alma "dalga boyu seçimi sekmesi menüsünde", aydınlık alan türünü seçin. Çekim hızı seçin. Akılda tutulması bu aşırı maruz kalma aktarılan ve özellikle Floresan ışık, (yukarıda belirtildiği şekilde) hücre canlılığı uzlaşma.
- ANSCs, serebellar astrocytes ve N2a hücreleri için aydınlık alan (10-50 ms çekim hızı) seçin.
- Transduced kortikal astrocytes aydınlık alan (10-50 ms çekim hızı) birlikte kırmızı/yeşil floresan ile seçmek için bir deneme için kullanılan muhabir bağlı olarak (kırmızı uyarma dalga boyu: 550 nm ve 400 ms çekim hızı; yeşil uyarma dalga boyu: 460-500 nm ve 100 ms çekim hızı).
- Deneme ve görüntülerin depolanacağı klasör adını tanımlayın. Kurtarmak belgili tanımlık liste pozisyonları denemeyi istediğiniz zaman yeniden yüklemek için ve tüm koşulları oluşturduktan sonra "Şimdi Çalıştır" butonuna basarak denemeyi çalıştırmak.
- Deneme duraklatmak ve "üzerine z düğme" tıklayarak odak koşulları yeniden deneme tamamlanıncaya kadar bir kez günlük ayarlayın. Canlı görüntüleme sırasında değişiklikleri orta gerekiyorsa, deneme duraklatmak ve plaka zaman atlamalı odasından alabilirsiniz.
Not: Hücre ölümü veya aşırı üretimi nedeniyle orta pH değişiklikleri yanı sıra, Oda sıcaklığı, değişimler hücreleri mikroskobunun doğru odaklama etkileyebilir. (Örneğin aNSCs) hassas kültürler için biz 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ile desteklenmiş orta kullanmanızı tavsiye ederiz (son konsantrasyonu: 1 mM).
3. Immunocytochemistry (PICC), veri toplama, sonrası görüntüleme ve işleme
- Deneme tamamlandığında, yazılım duraklatmak ve sonraki adımda açıklandığı gibi fiksasyon ve PICC, plaka almak.
- Hücre fiksasyon gerçekleştirmek: 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) bir kez hücrelerle yıkama ve paraformaldehyde (PFA) PBS (%4), 500 µL ekleyin (RT) oda sıcaklığında 10 dk kuluçka.
Dikkat: Paraformaldehyde güçlü bir sabitleştirici ve cilt veya gözlerle temas önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Sadece bir duman başlık içinde manipüle edilebilir. - Üç kez PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve 500 µL engelleme çözüm (%2 (wt/vol) sığır serum albumin (BSA) ve iyonik olmayan yüzey aktif %0,2 (vol/vol) içeren PBS) ekleyin. 1 h RT. kuluçkaya
- Engelleme çözüm kaldırın ve 250-400 µL birincil antikorlar çözüm ekleyin. 2 h RT. kuluçkaya Birincil antikorlar çözüm birincil antikorlar % 2'si (wt/vol) BSA ve iyonik olmayan yüzey aktif %0,2 (vol/vol) içeren PBS seyreltilmiş içerir. Burada açıklanan deneylerde kullanılan antikorlar: GFAP'nin (1:500), βIII-tübülin (1:1, 000) ve α-tübülin (1:1, 000). Bu doğrudan kuyuya gerçekleştirildiği gibi daha büyük birimleri çözümler gereklidir (250-400 µL hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde).
- Üç kez PBS 1 mL ile yıkayın ve 250-400 µL (3,4 adımda anlatıldığı gibi seyreltilmiş) ikincil antikorlar çözüm ekleyin. Burada açıklanan deneylerde kullanılan ikincil antikorlar: Anti-fare floresein (FITC) (1:800), Anti-tavşan Cy3 (1:500). RT, 1 h karanlıkta kuluçkaya.
- Üç kez 1 mL PBS yıkayın. Hücreleri PBS 1 mL Protokolü'nün sonraki adımlar için unutmayın.
- Plaka geri mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin ve sıkıca motorlu mikroskop sahne yer değiştirme sırasında istenmeyen hareketi önlemek için sahne alanı ekleyin.
- Xyz adım 2.2 işareti kullanarak sıfır konumunu almak ve bu referans noktası konumlara "Ofset tüm X, Y, Z" düğmesine basarak yeniden ayarlayın. Her bir pozisyon için odak mesafesini yeniden ayarla.
- Floresans emisyon "dalga boyu seçimi sekmesi menüsünde" için gerekli koşullar yapılandırma görüntülerin son tur kazanmak daha önce PICC hedef antijenleri algılamak için.
- Kısaca, FITC aydınlık alan ek olarak, etkinleştirmek (uyarma: 495 nm) ve Cy3 (uyarma: 550 nm) yazılım satın alma seçenekleri. 10-50 ms aydınlık alan 400 ms maruz fluorophores algılamak ve Resimler son bir tur elde etmek için "1 zaman döngüsü" düğmesine basın için kullanın.
Not: Floresan yoğunluğu PICC sonucuna bağlı olarak farklı olabilir. Fuar zaman en iyi görüntü kalitesini elde etmek için ayarlayın.
- Kısaca, FITC aydınlık alan ek olarak, etkinleştirmek (uyarma: 495 nm) ve Cy3 (uyarma: 550 nm) yazılım satın alma seçenekleri. 10-50 ms aydınlık alan 400 ms maruz fluorophores algılamak ve Resimler son bir tur elde etmek için "1 zaman döngüsü" düğmesine basın için kullanın.
- Yazılımın dosya/verme seçeneği seçin ve resim etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) veya Joint Photographic Experts Group (Jpeg) biçiminde bir önceden tanımlanmış hedef klasöre verme.
- İzleme yazılımı tarafından gerekli biçime dışa aktarılan görüntüleri dönüştürmek: izleme aracı17 (tTt). Bunu başarmak için giriş tanımlamak ve "tTt Dönüştürücüsü Aracı pencere yanı sıra pozisyonları (xy), kanal (c) ve zaman-puan (t) için kullanılan işaretleri çalışma" klasöründe çıkış ve "görüntüleri dönüştürmek" düğmesine basın.
Not: Görüntüleri belirli ayarlara uygun olarak adlandırılması gerekir ve onlar deneyde kullanılan her pozisyon için tek tek klasörlerin depolanması gerekir. Gereksinimleri, kurulum için talimatları pozisyonlar/görüntü ve kullanım izleme aracı'nın yeniden adlandırma elde edilebilir için download vasıl: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.
4. tek hücre izleme
- Verileri yeniden adlandırdıktan sonra tTt yazılımını çalıştırın. Bir kullanıcı adı ve tTt çalışma klasörü seçin.
Not: İzleme aracı çalışma klasörü tüm analiz verileri ve dışa aktarılan sonuçları tutar mısın. Çalışma klasörü tTtexport, "AVIexport", "Yapılandırmaları", "TreeExport" ve "tTtfiles" adlı alt klasörler içeren adlandırılması gerekir. - Deneme deneme depolandığı, klasör yolu gösteren "select deney klasör penceresinde", yüklenebilmesi için seçin ve sonra "deney Yükle" düğmesini tıklatın.
- Günlük dosyasını değiştirmek dolu görüntüleri izleme yazılımı tarafından okunabilir bir biçime dönüştürmek için çalıştırın (ilk kez yüklü deneyler için bu otomatik yazılım tarafından istenecektir).
- Bir pozisyon izleme için onun sembolü (dönüşüm, deneyler sırasında kaydedilen pozisyonları genel bir bakış "pozisyon düzen penceresinde" görüntülenir sonra) tıklatarak seçin. Her bir pozisyon pozisyon ve ilgili numarasını resmini oluşan simgesiyle temsil edilir (bkz. şekil 1).
- Bir kez konumu seçili ve mevcut görüntülerin "pozisyon Mizanpaj penceresinde" sağ tarafta listelenir, bunları seçin ve "resimleri Y├╝kle" düğmesini tıklatın.
- Bir kez yükleme tamamlandıktan ve "Hücre Düzenleyicisi penceresi" görüntülenir, dalga boyu ve "Hücre düzenleyici penceresinde" izlenmesi gereken görüntü aralığı seçin. Dalga boyunda 0 karşılık gelen aydınlık alan için 1 karşılık gelen için FITC, Cy3, 2 ve 3'e DAPI. Burada açıklanan deneylerde aralığı 1 kullanıldı, Yani, tüm resimler yüklü. Netleştirmek için her ikinci görüntü yükleme aralığı 2 anlamına gelir.
- Görüntüleri yüklenen sonra "pozisyon düzen penceresine" geri dönün ve daha önce yüklenmiş konumu temsil eden simgeyi çift tıklatın. "Film pencere"-ecek gözükmek gerçekleştirilecek tek hücre izleme sağlar.
- İzleme aracı talimatları izleme için devam edin. (Aydınlık için alan karşılık gelen) 0 kanalı seçin ve parlaklık ve kontrast ("gama düğmesini ayarlama"). İzleme F2 tuşuna basarak başlatın.
Not: izleme sırasında izlenen hücre fare işaretçisini yerleştirerek ve "0" tuşuna basarak tarafından takip edilecektir. Hücre bölünmesi, hücre Apoptozis ve kayıp cep düğmeleri bu belirli hücre olayları izlemek kullanılabilir.
5. son sonuç
- Bir kez tek hücre izleme tamamlandı ve tespit, döl deneme kaydetmek (hücre Düzenleyici penceresi/Dosya sekmesini / geçerli ağaç olarak Kaydet) ve sonuçlar vermek için devam edin.
- Soy ağaçları ve hücre veri "" hücre düzenleyici penceresinde"bulunan ihracat menüsünde" verin. Aynı şekilde, cep resim ve film "ihracat menüsü" ihracat "Film pencere" üzerinden erişilebilir. Görüntüler, soy ağaçları, veri ve filmler tTt çalışma klasörüne dışa aktarılır.
Representative Results
Açıklanan yöntemi hücre biyolojisi ile ilgili kritik soru çözülmesi için birden çok sinir örneğin alınma olasılığını sağlar. Örneğin, aNSCs7,8,14,18Nörojenik ve oligodendrogliogenic soyundan ilerlemesini izlemek mümkün oldu. Tek aNSCs ve bu aNSCs göstermek olası onların döl (şekil 2A, B), izleme tarafından izole vitro Nörojenik doğaları, çoğunlukla neuroblasts, üreten sürdürmek ve onlar bir sıra takip Önerilen vivo19 ama daha önce tek hücre düzeyinde gösterdi. Ayrıca, bu kültür sistemi asimetrik hücre bölünmeler NSC kendini yenileme8,14eğitim için benzersiz bir model sağlar (şekil 2B), SEZ aNSC soyundan ilk kez görüntülenmeyecektir izin. Aynı şekilde ve analiz, lineage bakılmaksızın hücre büyümesi, mermi bölümü, hücre canlılığı veya hücre döngüsünün uzunluğu ile ilgili değerli veri almak mümkün.
Şekil 2. ANSCs örneği SEZ izole ve canlı görüntüleme ve tek hücre izleme tarafından analiz etti. Faz kontrast görüntüler farklı zaman noktalarda (gün-h: min) klon ilerlemesini tasvir. Son görüntü sonrası görüntüleme immunocytochemistry (PICC) gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin, kırmızı), βIII-tübülin (yeşil) ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, mavi) karşılık gelir. Sonrası Mitotik neuroblasts oluşturmak için(a)analizi simetrik Nörojenik ağaçların arasında bölünmeler yükseltecek farklı tur. Kırmızı oklar simetrik ağaçlarda bulunan hücreleri üzerine gelin. Sağ tarafta, klonlar için karşılık gelen ve tTt yazılımı tarafından oluşturulan soy ağaçları görüntülenir. (B) neuroblasts sakin GFAP'nin pozitif hücreler arasında potansiyel bir öz-yenileme olayı diğer verir yükselmeye süre üretmek için kuvvetli bölümler geçiren bir şube ile asimetrik bir Nörojenik ağaç üreten bir Dede örneği. Sağ tarafta, tTt yazılımı tarafından oluşturulan soy ağacı görüntülenir. Soy ağaçlarında: "N" gösteriyor sonrası Mitotik neuroblasts; "G", sakin GFAP'nin pozitif hücreler; "X", hücre ölümü; ve "?" kayıp bir hücre. Ölçek çubuğu temsil eden 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Canlı görüntüleme ve tek hücre izleme çözümlemesi de sinirsel bir nüfus göç kapasiteleri doğru bir okuma sağlar. Bu tür bilgiler astrocytes tarafından yara (şekil 3) kapatırken ortalama mesafe ile ilgili bilgi üreten bir karalama yara tahlil20, gönderilmiş doğum sonrası serebellar astrocytes üzerinden elde edildi. Ayrıca, bu diğerleri deney boyunca değişmeden kalır bazı astrocytes iyileşme süreci sırasında bölünmüş görmek mümkün oldu. Çarpıcı, bu bölünmüş (iki katı kadar ortalama olarak seyahat) bölme olmayan meslektaşlarına daha üretken göçmen davranışlar gibi görünüyor. Bu olay bir yara dışarı bir klasik son nokta analiz deneme eşleştirmeyi içinde seyreltilmiş yaralanması üzerine kurmaya astrocytes görevinde çok ilginç bir heterojenite öneriyor.
Şekil 3. Bir çizik içinde doğum sonrası serebellar astrocytes, göçmen davranışını analiz tahlil yara. Faz kontrast görüntüler (gün-h: min) farklı zaman noktalarda yara tasvir. Soy ağaçları, tTt yazılımı tarafından oluşturulan hücre bölünmesi sırasında yara kapatma astrocytes açısından temsilcisi davranışını anlamak. Çubuk grafik tek hücre izleme tarafından analiz astrocytes tarafından ortalama mesafe (ortalama ± S.E.M.) gösterir. Ölçek çubuğu temsil eden 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Hızlandırılmış video mikroskobu deneylerin bir başka ilginç özelliği yayılması ve farklılaşma hücre nüfus karşılaştırmak için kapasitesidir. N2a hücre çoğalması (varlığında % 10 fetal sığır serum (FBS)) veya (huzurunda %0.5 FBS + 10 µM Araşidonik asit) farklılaşma tanıtmak koşullar altında kaplama test ettik. Oysa ayırt hücreleri değil çoğalırlar ve onlar neurites (4B rakam) formu bu hücreler (4A rakam), proliferatif koşullarda lineage ilerlemesini takip etmek mümkün. Dikkat çekici, tek hücre izleme kolonileri farklı nükleer silahların yayılmasına karşı ayırt edici olmak kapasiteleri ve neurite uzama (ve retraksiyon) ile değerlendirilecek, daha sonra ihraç edilebilir kesin ve nicel veri sağlayan izin.
Şekil 4. N2a hücre biyolojisi yayılması(a)veya farklılaşma koşulları (B) izlenmesi. Faz kontrast görüntüleri farklı zaman noktalarda (gün-h: min) klon ilerlemesini gösteren. Son görüntü α-tübülin (yeşil) sonrası görüntüleme immunocytochemistry (PICC) karşılık gelir. (A)tek hücre izleme sağlar izlenecek bölümü yanı sıra heterojenite tur farklı hücrelere proliferatif yanıt olarak. Sağ tarafta, tTt yazılımı tarafından oluşturulan soy ağacı N2a hücreleri proliferatif davranışını gösterir. (B) hücre farklılaşması koşullar altında hücre döngüsünün çıkın ve neurites, etkili bir şekilde sonrası görüntüleme analizi ile ölçülebilir bir işlem oluşturur. Tek hücre izleme, soy ağacı sağ tarafından temsil edilen, nasıl N2a hücreleri çıkmak hücre döngüsü ve hücre bölünmesi farklılaşma koşullar altında durmak gösterilmektedir. Ölçek çubuğu 50 µm temsil eder.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Son olarak, canlı görüntüleme ve izleme tek hücre hücreleri yeniden programlama için gönderildiğinde morfolojik ve moleküler değişiklikleri izlemek son derece yararlıdır. Doğum sonrası astrocytes Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) ile transduced canlı görüntüleme astrocytes programlanmış (bkz: olan zaman yeniden programlama veya hücre bölünmesi tıkanması sırasında oluşan morfolojik değişiklikleri ile ilgili değerli veri sağlar Şekil 5). Ascl1 iletim yeşil Floresans protein (GFP) Çift Kişilik Cortin (DCX) düzenleyicinin kontrolü altında bir yapı kodlama iletim ile birleştirildiğinde, Ayrıca, zaman nöronal kesin zaman noktası tanımlamak mümkün belirli işaretleri programlanmış hücre (şekil 5) ifade etmeye başlar. Hızlandırılmış video-mikroskobu sayılabilir ve bu işlem sırasında ölmek hücrelere göre yeniden programlama işleminin başarıyla tamamlanabilmesi hücre sayısı da sağlar. Bu tür olayları izleme kritik "" denetim noktaları'nı başarılı bir şekilde programlanmış9vardı hücreleri tanımlaması yol açtı.
Şekil 5. Nöronal yeniden programlama için tabi postnatal kortikal astrocytes analizi. Yeniden programlama iletim pro Nörojenik Ascl1-kırmızı Floresans protein (RFP) vektörel çizimler ile indüklenen. Nöronal dönüşüm tarafından ortak iletim GFP DCX organizatörü kontrolü altında kodlama bir vektör ile izlenir. Faz kontrast görüntüler farklı zaman noktalarda (gün-h: min) yeniden programlama ilerleme göstermektedir. Floresans görüntüleri RFP ve GFP ifade, anılan sıraya göre. Canlı görüntüleme ve morfolojik değişiklikler, hücre bölünmesi, hücre ölümü, yeniden programlama sırasında yokluğu gibi izlenmesi gereken çok önemli olaylar tek hücre izleme izin ve programlanmış hücre nöronal işaretleri ifade etmek için ne zamandan beri kesin zaman tanımlanabilir . Ölçek çubuğu temsil eden 80 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Canlı görüntüleme en önemli değerlerden biri doğru soy izleme, sinirsel bir nüfus lineage ilerlemesinde önemli yönlerini elucidating gerçekleştirmek için olasılık var. Soy izleme tanımlayıcısı olarak tanımlanır ve tek bir Dede, tüm döl izleme için sonraki clone klon kurucusu21oluşmuştur. Dikkat çekici, alternatif yöntemler (örneğin, viral iletim veya çok renkli muhabir yapıları21) izleme lineage için istihdam sayede nihai sonucu resimler üzerinde temel alır ve ille öyle kritik bir dezavantajı var tüm sıra oluşturmaktadır. Bu o hücre ölümü, heterojenlik hücre nüfus, seyreltme, yayılan veya zavallı verimliliği ile birlikte diğer önemli handikapları işaretlerinin davranış anlamına gelir, sonuçlar2eksik veya yanlış okuma için neden. Ayrıca, canlı görüntüleme modu ve hücre bölünmesi, hücre büyümesi, göç, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma, hücre döngüsü süresi, neurite karşı zamanlaması gibi sinirsel nüfusun biyolojinin önemli özellikleri analiz etmek araştırmacı sağlar kader seçimi (başkalaşım) veya dönüşüm (yeniden programlama) hücre oluşumu, karmaşıklık ve uzunluğu.
Ayrıca, canlı görüntüleme kolayca tek hücreleri gibi örneğin, veri almak için amaçlanan diğer analizi ile tamamlanmaktadır RNA sıralama. Ancak, canlı görüntüleme ve diğer teknikleri kombine fayda elde etmek için daha önce filmlerde izlenen bu hücreleri daha sonra yeniden tanımlanır ve ayrı ayrı ikincil analizi için toplanan gerektirir. Bu konum koordinatları, belirli hücreleri floresan muhabirleri uygulayarak veya grup hücreleriyle dağıtım başvuruları olarak analiz dahil mikroskoplar kullanarak elde edilebilir. Gerçekten de, transcriptome profil kombinasyonu ve tek tek hücreler davranışını yeni moleküler cues hücreleri Biyolojide yer aydınlatmak için güçlü bir yol gösterebilir.
Bir yetersiz hücre kültür yoğunluğu bir canlı görüntüleme deneyi olumsuz etkileyebilir ana sorunlardan biri. Daha önce belirtildiği gibi yüksek yoğunluklu kalite ve Uzaysal çözünürlük görüntülerin izleme tek hücre yapamayız enkaz veya zavallı ayrılma (yığın oluşumu) fazlalığı etkileyebilir. Bu nedenle, farklı hücre popülasyonlarının altında eğitim şartları hücre olası en düşük sayısı hücre kültürü canlılığı ödün vermeden ayarlanmalıdır.
Resim alma sıklığı da çok önemlidir ve özellikle floresan aydınlatma kullanıldığında dikkatle, ayarlanmalıdır. Aşırı maruz kalma aktarılan ve özellikle Floresan ışık hücre canlılığı tehlikeye atabilir. Alternatif olarak, görüntüleri yakalanması arasında aşırı bir gecikme analizi zamansal çözünürlük ile girişime neden olabilir.
Canlı görüntüleme deney sırasında diğer kritik adım odaklanarak periyodik düzeltmesinden olduğunu. Başarısızlık doğru ayarı/yeniden-setting odak mesafe tek hücre izleme engelleyebilir. Ayrıca, kuluçka odası yeterli sıcaklık, nem ve CO2 düzeyleri, hücre ölümüne neden olabilir istenmeyen varyasyonları değişiklik yapılmasına dair korur dikkatle kontrol etmek gereklidir.
Son olarak, PICC gerçekleştirildikten sonra düzgün resim alma son turun xyz sıfır pozisyonundan almak önemlidir. Yanlış xyz sıfır konumunu yeniden ayarlamak zor hücre döl tanımlaması engelleyen faz kontrast ve ayirt görüntüleri maç yapacak.
Bu yaklaşım birçok olumlu yönü olmasına rağmen canlı görüntüleme için bazı sınırlamalar sinirsel örneğin alınma olasılığını, devam. Örneğin, aNSCs başarılı tek hücre izleme gerçekleştirmek için gereken en düşük hücre yoğunluğu Western Blot14gibi biyokimyasal deneyleri istihdam olanaksız kılıyor. Ayrıca, hızlı nüfus bölen izleme gibi serebellar astrocytes ya da N2a hücreleri sınırlıdır geçici olarak sık sık hücre kültürleri izdiham yakınındaki olarak izlemek çok zor. Ayrıca, birçok kültür yöntemleri, hem de doğal biyolojik kısıtlamalar hücreleri, yalıtım ile ilişkili kez hücre canlılığı uzun sürelerle, canlı görüntüleme deneyler süresini sınırlamak ödün. Son olarak, doğal ortamda hücreleri izole hem olumlu hem de olumsuz etkileri vardır. Fizyolojik onların niş izole hücreler davranış biçimleri, modüle önemli sinyaller almak başarısız olabilir aynı zamanda, bu sinyalleri etkisini ayrı ayrı özel sinirsel lineage ilerlemesini test etmek için güçlü bir araç temsil eder nüfus.
Yukarıda açıklanan kısıtlamalar göz önüne alındığında, bu mükemmel metodolojik senaryo canlı görüntüleme, tek hücre izleme deneyleri normal fizyolojik koşullar içinde vivoaltında gerçekleştirmek olacaktır açıktır. Ancak, güncel teknikler tek hücreleri uzun bir süre için beyin2derin bölgelerinde takip edemiyoruz. Bu nedenle, canlı görüntüleme geleceği tam olarak tek hücreleri içinde vivo hücre biyolojisi fizyolojik çevre3girişim mümkün olan en küçük ile analiz amaçlayan bu sınırlama üstesinden üzerinde odaklanmalıdır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Beatriz Gaskon şekil 1' deki yardım ve sanat eserleri için teşekkür ediyoruz. Ayrıca Dr. C. Norris onun yardım için teşekkür ediyoruz. Burada sunulan iş araştırma hibe, "kırmızı de excelencia Consolider-INGENIO İspanyolca iyon kanal girişimi" tarafından desteklenmiştir (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/buz-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) ve Fundación Ramon Areces hibe programı (PR2018/16-02). Felipe Ortega eder Ramon y Cajal Program İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet (MEC: RYC-2013-13290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
