Summary
Et robust protokol til at overvåge neurale populationer af time-lapse video-mikroskopi efterfulgt af software-baserede efterbehandling er beskrevet. Denne metode repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at identificere biologiske hændelser i en valgte befolkning under live imaging eksperimenter.
Abstract
Forstå de mekanismer, der styrer vigtige biologiske hændelser af neurale cellepopulationer, såsom spredning og differentiering eller celle skæbne beslutninger, vil være afgørende for design terapeutiske strategier for mange sygdomme, der påvirker nervesystemet. Nuværende metoder til at spore cellepopulationer stole på deres endelige resultater i stillbilleder og de generelt undlader at levere tilstrækkeligt tidsmæssige opløsning til at identificere adfærdsmæssige funktioner i enkelte celler. Derudover variationer i celledød, adfærdsmæssige heterogenitet i en celle population, fortynding, spredning eller den lave effektivitet af de markører, der anvendes til at analysere celler er alle vigtige handicap, der vil føre til ufuldstændig eller ukorrekt udlæsning af resultaterne. Derimod repræsenterer udfører live imaging og enkelt celle sporing under passende betingelser et kraftfuldt værktøj til at overvåge hver enkelt af disse begivenheder. Her, er en time-lapse video-mikroskopi protokol, efterfulgt af efterbehandling, beskrevet til at spore neurale populationer med enkelt celle opløsning, beskæftiger specifik software. De beskrevne metoder sætte forskerne til at løse afgørende spørgsmål vedrørende celle biologi og afstamning progression af særskilte neurale populationer.
Introduction
For at udvikle nye og mere effektive terapeutiske strategier for at regenerere neurale befolkninger, må vi først forstå de grundlæggende mekanismer, der opretholder celler med en regenerativ neurale potentiale. At forfølge dette mål kræver en omfattende viden om de faktorer, der regulerer ligevægten mellem ubevægelighed, spredning/differentiering, mode og timing af division, celle cyklus længde, vandrende kapacitet, levedygtighed, osv. Selv om det er en teknisk tilgang, der har været ansat i mange år1, live imaging og direkte observation er stadig den bedste mulighed for at overvåge de begivenheder, der er anført ovenfor. I modsætning til mange andre tilgange centreret om end-point udlæsninger, live imaging og enkelt celle sporing giver oplysninger i hele længden af et eksperiment2,3,4,5, 6. dermed, tilsætning af tidsmæssige opløsning tillader celledød, heterogene celle adfærd eller celle skæbne beslutninger, samt mange andre kritiske begivenheder kan identificeres, der måske ellers passere ubemærket. Ideelt set bør disse funktioner i celler bedst overvåges på en enkelt celle niveau in vivo hvor begge iboende (celle autonome) og ydre (celle niche) stikord tages i betragtning.
Men selv i i vitro situation hændelser indtræffer i et miljø, der ikke reproducere det naturlige miljø, low-density dyrkningsbetingelserne typisk anvendes i disse protokoller er mere egnet til at afsløre iboende egenskaber af den celler. Desuden kan en mere forenklet kontrol af det omgivende miljø, ved at blot ændre vækstmediet, udgøre et værdifuldt redskab til at undersøge de enkelte rolle hver ydre faktor, der definerer de neurale niche, såvel som miljømæssige faktorer, der kan induceres i patologisk scenarier7,8,9,10,11,12,13. Derfor, når korrekt konfigureret, som i den protokol, der er foreslået her, live imaging giver en realistisk in vitro- løsning for at løse de fleste af de spørgsmål, som tidligere nævnt.
Kort sagt, beskriver denne protokol hardwaren, software, dyrkningsbetingelserne og de vigtigste trin, der kræves for at fuldføre en live imaging eksperiment efterfulgt af enkelt celle tracking. Denne tilgang giver værdifulde oplysninger, som hjælper til at afsløre grundlæggende aspekter af biologi, og lineage progression af flere neurale populationer.
Protocol
I følgende afsnit beskrives de trin, der kræves for at udføre live imaging efterfulgt af enkelt celle sporing af flere neurale populationer (figur 1). Alle de procedurer, der involverer dyr i denne protokol beskrevne skal udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra det internationale råd for Laboratory Animal Science (ICLAS).
Figur 1. Ordningen illustrerer de vigtigste eksperimentelle trin af proceduren, dvs.: celle kultur-live imaging, PICC og dataindsamling, enkelt celle tracking og det endelige resultat. Trinene er nummereret efter arbejde-flow i protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
1. celle kultur: Isolation og overfladebelægning af den valgte neurale befolkning eller celle afstamning
Bemærk: I forbindelse med denne protokol, eksempler på dens anvendelse til forskellige cellepopulationer får til at validere sin nytte hen til analysere biologi af neurale celler. Disse omfatter: voksne neurale stamceller (aNSCs) afledt af mus SubEpendymal Zone (SEZ) (for en detaljeret isolation protokol Se14); Postnatal kortikale astrocytter at studere neuronal omprogrammering (for en detaljeret isolation protokol Se15); Postnatal cerebellare astrocytter (for en detaljeret isolation metode Se16); og musen Neuro-2a Neuroblastoma cellelinje (N2a).
- Frø celler direkte belagt på poly-D-lysin 24-godt plader. Brug 1 mL af næringssubstratet pr. brønd. Inkuber plader ved 37 ° C og 8% CO2 for aNSCs, eller ved 37 ° C og 5% CO2 for linjen astrocytter/celle for 2 h før live imaging. Undgå brug af coverslips til at forhindre uønsket bevægelse, som den motoriserede mikroskop fase er fordrevet, hvilket gør enkelt celle tracking uigennemførlige.
Bemærk: Celle tætheder og kultur medier ansat i eksperimenter er: 30-40.000 celler/brønd til aNSCs i Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM:F12 næringsstof blanding medium); 20.000 celler/brønd for N2a celler i DMEM høje glukose medium, 80.000 celler/brønd for cerebellare astrocytter i DMEM høje glukose medium; og 55-65.000 celler/brønd for postnatal astrocytter i DMEM:F12 næringsstof blanding medium. - Standardisere kultur-protokollen ved at justere celle tætheden af kultur til det laveste antal celler gennemførlige. Ikke desto mindre skal celle tæthed være tilstrækkeligt høje til at bevare levedygtigheden af kulturen.
Bemærk: Hvis den celle tæthed er for høj, overskydende snavs eller dårlig dissociation (klumper) kan hindre inddeling af enkelt celler.
2. live Imaging af Time-lapse Video-mikroskopi
- Tænde mikroskopet, kamera, hardware og inkubering systemer. Indstil temperaturen og luft pres til 37 ° C og 8% CO2 til aNSCs eller til 37 ° C og 5% CO2 for linjen astrocytter/celle. Lad temperatur og CO2 niveauer til at stabilisere for 1-2 h.
Bemærk: Specifikke udstyr er kræves for at udføre time-lapse video analyse, herunder: lyse felt/fase kontrast/fluorescens mikroskoper med motoriseret komponenter; inkubation-enheder, der styrer den temperatur, CO2 og fugtighed; og endelig, pålidelig og tilstrækkeligt kraftfulde hardware og software i stand til at erhverve og håndtering af det antal billeder fremstillet under live imaging eksperimenter (venligst Kontroller Tabel af materialer). - Når cellerne er solidt fastgjort til pladen (2 h efter plating) bruge en permanent markør pen til at gøre et lille mærke på bunden af en brønd, der ikke vil blive brugt til at spore, dvs, en brønd, der ikke indeholder celler.
Bemærk: Dette mærke vil blive brugt som reference til nul xyz koordinater, og det kan bruges til enhver tid under eller efter forsøget eller mellem ændringerne af medium, at vende tilbage til nulstillingen. - Pladen anbringes inde i mikroskopet inkubation kammer og fast metalpladen på scenen til at undgå enhver uønsket bevægelse under forskydning af den mikroskop motoriserede Stadium.
- Tillad temperaturen i cellekulturmedium til Reagensglasset her i Parlamentet i ca 20 min. Dette trin vil undgå tab af fokus under optagelse på grund af dilatation af komponenter.
- Start live-imaging software og vælg modulet time-lapse til opsætning af eksperimentet.
- Angive den samlede varighed af eksperimentet og image erhvervelse cyklusser i menuen"tidsplan fane". På grund af den iboende fototoksicitet af den overførte eller fluorescens lys anvendes, definere et passende interval til at balancere mellem det tidsmæssige opløsning af analysen og den potentielle celledød.
Bemærk: For eksempel, ialt 120 h blev valgt for aNSC kulturer, erhverve brightfield billeder hver 5 min. Overvej at erhvervelse af 120 h af en enkelt film i denne konfiguration vil kræve 120-150 GB gratis lagerplads i computer enhed. - Vælg billede positioner defineret ved x og y koordinater og brændvidde (z-koordinaten) i "xyz punkter tab menu". Omfatte referencepunkt (xyz nul koordinat) som den oprindelige holdning for at hente koordinaterne til enhver tid.
- Vælg typen erhvervelse i "bølgelængde fanen menuen", brightfield, alene eller i kombination med epifluorescensmikroskop excitation når det kræves. Vælg eksponeringstiden. Huske på, at overdreven udsættelse for overføres, og især fluorescerende lys, kan det kompromittere cellernes levedygtighed (som angivet ovenfor).
- For aNSCs, cerebellare astrocytter og N2a celler, skal du vælge brightfield (10-50 ms eksponeringstid).
- For transduced kortikale astrocytter Vælg brightfield (10-50 ms eksponeringstid) i kombination med rød/grøn fluorescens, afhængigt af reporter bruges til eksperimentet (rød excitation bølgelængde: 550 nm og 400 ms eksponeringstid; grøn magnetisering bølgelængde: 460-500 nm og 100 ms eksponeringstid).
- Definere navnet på eksperimentet og den mappe, hvor billederne skal gemmes. Opspare listen over positioner for at genindlæse eksperiment på ethvert tidspunkt, og når alle betingelser er indstillet, kører forsøget ved at klikke på "Kør nu"-knappen.
- Pause eksperimentet og re-justere fokus betingelser at klikke på "Overskriv z knappen" en gang om dagen indtil eksperimentet er afsluttet. Hvis ændringer i mediet er påkrævet under den live imaging, pause eksperimentet og hente pladen fra tid bortfalder kammer.
Bemærk: Ændringer i pH af medium på grund af celledød eller overdreven spredning, samt variationer i stuetemperatur, kan påvirke den korrekte fokusering af mikroskopet på cellerne. For følsomme kulturer (f.eks aNSCs) vi anbefaler brugen af medium suppleret med 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) (endelig koncentration: 1 mM).
3. post imaging immuncytokemi (PICC), dataindsamling, og behandling
- Når eksperimentet er afsluttet, pause softwaren og hente plade til fiksering og PICC, som beskrevet i næste trin.
- Udføre celle fiksation: vaske cellerne en gang med 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 500 µL af PARAFORMALDEHYD (PFA) (4% i PBS), inkubere 10 min. ved stuetemperatur (RT).
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er en stærk fiksativ og skal håndteres omhyggeligt for at undgå kontakt med hud eller øjne. Det skal bearbejdes kun inde i et stinkskab. - Cellerne vaskes tre gange med 1 mL PBS og tilsættes 500 µL af den blokerende løsning (PBS indeholdende 2% (wt/vol) af bovint serumalbumin (BSA) og 0,2% (vol/vol) af en nonionisk overfladeaktivt stof). Inkubér 1 h på RT.
- Fjern blokering løsningen og tilsæt 250-400 µL af opløsningen primære antistoffer. Inkuber 2 h på RT. Den primære antistoffer løsning indeholder primære antistoffer fortyndes i PBS, som indeholder 2% (wt/vol) af BSA og 0,2% (vol/vol) af en nonionisk overfladeaktivt stof. Antistoffer forsøgsdyr beskrevet her: GFAP (1: 500), βIII-tubulin (1:1, 000) og α-tubulin (1:1, 000). Eftersom dette foregår direkte i brønden, større mængder af løsningerne, der kræves (250-400 µL) til at dække alle celler.
- Vaskes tre gange med 1 mL PBS og tilføje 250-400 µL af opløsningen sekundære antistoffer (fortyndet som beskrevet i trin 3.4). Sekundære antistoffer forsøgsdyr beskrevet her: anti-mus Fluorescein (FITC) (1:800), anti-kanin Cy3 (1: 500). Inkubér 1 h i RT i mørke.
- Vaskes tre gange i 1 mL PBS. Holde cellerne i 1 mL PBS for de efterfølgende trin i protokollen.
- Pladen anbringes igen på mikroskop-scenen og fast vedhæfte det til scenen for at undgå uønskede bevægelser under forskydning af motoriseret mikroskop fase.
- Hente xyz nulstillingen ved hjælp af mærket lavet i trin 2.2 og re-indstille holdninger til denne referencepunkt ved at trykke på knappen "Kompensere for alle X, Y, Z". Re-indstille brændvidde for hver position.
- Erhverve en sidste runde af billeder, konfiguration af de nødvendige betingelser for fluorescens emission i "bølgelængde udvalg tab menu" for at afsløre antigener tidligere målrettet i PICC.
- Kort, ud over brightfield, aktivere FITC (Excitation: 495 nm) og Cy3 (Excitation: 550 nm) erhvervelse indstillinger i softwaren. Brug 10-50 ms for brightfield 400 ms eksponering til at opdage fluorophores og tryk på knappen "1 gang loop" at erhverve en sidste runde af billeder.
Bemærk: Intensiteten af fluorescens kan variere afhængigt af PICC resultatet. Juster tid, redegørelsen for at opnå den optimale billedkvalitet.
- Kort, ud over brightfield, aktivere FITC (Excitation: 495 nm) og Cy3 (Excitation: 550 nm) erhvervelse indstillinger i softwaren. Brug 10-50 ms for brightfield 400 ms eksponering til at opdage fluorophores og tryk på knappen "1 gang loop" at erhverve en sidste runde af billeder.
- Vælg den software fil/eksport valgmulighed og eksportere billeder i Tagged Image File Format (Tiff) eller Joint Photographic Experts Group format (Jpeg) til en foruddefineret destinationsmappe.
- Konvertere billederne eksporteres til det format, der kræves af tracking software: The Tracking værktøj17 (tTt). For at opnå dette, skal du definere input og output mappe i "tTt Converter værktøj" opererer vindue, såvel som de markører, der anvendes til positioner (xy), kanaler (c) og tidspunkter (t) og tryk på knappen "convert billeder".
Bemærk: Billederne skal omdøbes i overensstemmelse med de specifikke indstillinger og de skal være gemt i individuelle mapper for hver anvendt i forsøget. Installationsvejledning, krav, omdøbning af positioner/billeder og brug af værktøjet sporing er tilgængelig for download på: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.
4. enkelt celle Tracking
- Efter omdøbning data, køre tTt software. Vælg et navn og tTt arbejde i hjemmemappen.
Bemærk: Tracking værktøj arbejdsmappe vil holde alle de analyserede data og de eksporterede resultater. Arbejdsmappen skal hedde tTtexport, som indeholder undermapper opkaldt "AVIexport", "Configs", "TreeExport" og "tTtfiles". - Vælg eksperiment der skal lastes i "Vælg eksperiment mappevinduet", der angiver stien til den mappe hvor eksperimentet er gemt, og klik derefter på knappen "Belastning eksperiment".
- Køre log file converter til at omdanne de indlæste billeder i et format, der kan læses af tracking software (for eksperimenter indlæses første gang, dette vil blive anmodet om automatisk af softwaren).
- Vælg en placering til sporing ved at klikke på dens symbol (efter konvertering, en oversigt over de holdninger, der er registreret under forsøgene vil blive vist i "position layoutvinduet"). Hver position repræsenteres af et symbol, der består i et billede af placeringen og dens tilsvarende nummer (Se figur 1).
- Når placeringen er valgt og en liste over de tilgængelige billeder vises til højre for "holdning layoutvinduet", skal du markere dem og klikke på knappen "Indlæs billeder".
- Når indlæsningen er fuldført og "Celle Editor vinduet" vises, Vælg bølgelængder og billede interval kan spores i "Celle Editor vindue". Bølgelængde 0 svarer til brightfield, 1 svarer til FITC, 2 til Cy3, og 3 at DAPI. I eksperimenter beskrevet her, interval 1 blev brugt, dvs, alle billeder er indlæst. For at præcisere, betyder interval 2 lastningen af hvert andet billede.
- Når billederne er blevet indlæst, gå tilbage til "position layoutvinduet" og dobbeltklik på det ikon, der repræsenterer den tidligere indlæste holdning. Vinduet"film" vises der giver mulighed for enkelt celle sporing udføres.
- Efter instruktionerne Tracking værktøj videre til sporing. Vælg 0 kanalen (svarende til brightfield), og justere lysstyrken og kontrasten ("Juster gamma knap"). Start sporing af trykker F2 nøglen.
Bemærk: Under tracking, cellen sporet følges ved at placere musemarkøren på det og trykke på "0"-tasten. Celledeling, celle apoptose og tabt celle knapper er tilgængelige til at overvåge disse specifikke celle hændelser.
5. endelige resultat
- Når enkelt celle tracking er afsluttet og afkommet identificeret, gemme eksperimentet (under fanen celle Editor vindue/filer / Gem aktuelle træ som) og fortsætte med at eksportere resultaterne.
- Eksportere lineage træer og celledata i "eksport-menu" i vinduet"celle Editor". Ligeledes, eksportere celle billeder og film via menuen"eksport" tilgængelige via vinduet"film". Billeder, lineage træer, data og film vil blive eksporteret til mappen tTt arbejde.
Representative Results
Den beskrevne metode giver mulighed for kritiske spørgsmål vedrørende cellebiologi af flere neurale befolkninger skal løses. For eksempel, har det været muligt at overvåge udviklingen af neurogen og oligodendrogliogenic slægt aNSCs7,8,14,18. Ved at spore enkelt aNSCs og deres afkom (figur 2A, B), det var muligt at påvise, at aNSCs isoleret i vitro opretholde deres neurogen karakter, for det meste skaber neuroblasts, og at de følger en sekvens foreslået i vivo19 men ikke tidligere har været vist på enkelt celle-niveau. Desuden, denne kultur system tilladt asymmetriske celledelinger til visualiseres for første gang i aNSC afstamning fra SEZ (figur 2B), giver en enestående model for at studere NSC selvfornyelse8,14. Ligeledes, og uanset slægt analyseret, var det muligt at opnå værdifulde data vedrørende cellevækst, runder af division, cellernes levedygtighed eller celle cyklus længde.
Figur 2. Eksempel på aNSCs isoleret fra SEZ og analyseret af live imaging og enkelt celle sporing. Fase kontrast billeder skildrer progression af klon på forskellige tidspunkter (dag-h: min). Det endelige billede svarer til post imaging immuncytokemi (PICC) til Glial fibrillære sure protein (GFAP, red), βIII-tubulin (grøn) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå). (A) analyse af symmetrisk neurogen træer gennem forskellige runder af forstærke divisioner til at generere post mitotiske neuroblasts. Røde pile peger på de celler, der er inkluderet i de symmetriske træer. Til højre vises lineage træer svarende til kloner og genereret af tTt software. (B) eksempel på en stamfader, generere en asymmetrisk neurogen træ, med en filial gennemgår forstærkende divisioner for at producere neuroblasts mens de andre giver anledning til inaktiv GFAP positive celler gennem en potentiel selvfornyelse begivenhed. Til højre vises den slægt træ genereret af tTt software. I alle lineage træer: "N" skildrer post mitotiske neuroblasts; "G", inaktiv GFAP-positive celler; "X", celledød; og "?" et tabt celle. Skalalinjen repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Live imaging og enkelt celle tracking analyse også giver en nøjagtig udlæsning af vandrende kapacitet af en neurale befolkning. Sådanne oplysninger er indhentet fra postnatal cerebellare astrocytter forelægges en ridse sår assay20, genererer oplysninger om den gennemsnitlige afstand, som astrocytter når lukke såret (figur 3). Det var desuden muligt at se, at nogle af astrocytter splittet under helingsprocessen, mens andre forbliver uændret i hele eksperimentet. Påfaldende, synes dem, der delte at udstille mere produktiv vandrende adfærd end deres ikke-dividere modparter (rejser dobbelt så langt i gennemsnit). Dette fænomen antyder en meget interessant heterogenitet i astrocytter evne til at danne et ar efter skade, som ville have været fortyndet ud i udlæsning af en klassisk end-point analyse eksperiment.
Figur 3. Analyse af den migrerende opførsel af postnatal cerebellare astrocytter i en skramme sår assay. Fase kontrast billeder skildrer sår på forskellige tidspunkter (dag-h: min). Lineage træer, genereret af tTt software, illustrerer den repræsentative adfærd, hvad angår celledeling i astrocytter mens lukke såret. Histogrammet viser den gennemsnitlige afstand af astrocytter analyseret af enkelt celle tracking (gennemsnit ± S.E.M.). Skalalinjen repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Et andet interessant træk ved de time-lapse video-mikroskopi eksperimenter er i stand til at sammenligne spredning og differentiering i en celle population. Vi har testet N2a celler belagt på betingelser, der fremmer spredning (i nærværelse af 10% føtal bovint serum (FBS)) eller differentiering (i nærværelse af 0,5% FBS + 10 µM arachidonsyre). Det var muligt at følge lineage progression af disse celler proliferativ betingelser (figur 4A), hvorimod differentiering celler ikke formere sig og de danner neurites (figur 4B). Bemærkelsesværdigt, enkelt celle tracking tilladt kolonier med forskellige spredning kapacitet kan skelnes og neurite brudforlængelse (og retraktion) vurderes, at levere præcise og kvantitative data, der efterfølgende kan eksporteres.
Fig. 4. Overvågning af N2a cellebiologi i spredning (A) eller differentiering betingelser (B). Fase kontrast billeder skildrer progression af klon på forskellige tidspunkter (dag-h: min). Det endelige billede svarer til post imaging immuncytokemi (PICC) til α-tubulin (grøn). (A) enkelt celle tracking gør det runder af division skal overvåges, samt heterogeniteten i den proliferative svar af forskellige celler. Til højre illustrerer den slægt træ genereret af tTt software proliferativ opførsel af N2a celler. (B) celler differentiering betingelser frakørsel cellecyklus og generere neurites, en proces, der effektivt kan måles ved post imaging analyse. Enkelt celle tracking, repræsenteret ved slægt træ på højre, illustrerer hvordan N2a celler frakørsel cellecyklus og stoppe celledeling differentiering betingelser. Skalalinjen repræsenterer 50 µm.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Endelig live imaging og enkelt celle sporing er meget nyttigt at overvåge morfologiske og molekylære ændringer, når cellerne er indsendt til omprogrammering. Live imaging af postnatal astrocytter transduced med Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) giver værdifulde data vedrørende de morfologiske ændringer, der opstår under omprogrammering eller blokering af celledeling når astrocytter er ved at blive omprogrammeret (Se Figur 5). Desuden, når Ascl1 transduktion er kombineret med transduktion af en konstruktion kodning for grønne fluorescens protein (NGL) under kontrol af dobbelt Cortin (DCX) promotor, det er muligt at definere det præcise tidspunkt når neuronal specifikke markører Begynd at komme til udtryk i de omprogrammerede celler (figur 5). Time-lapse video-mikroskopi tillader også antallet af celler, der med held fuldføre omprogrammering skal kvantificeres og i forhold til de celler, der dør under denne proces. Overvågning af sådanne begivenheder førte til identifikation af de kritiske "checkpoints" i de celler, der var med succes omprogrammerede9.
Figur 5. Analyse af postnatal kortikale astrocytter underkastes neuronal omprogrammering. Omprogrammeringen er fremkaldt ved transduktion med pro-neurogen Ascl1-rød fluorescens protein (RFP) vektorer. Neuronal konvertering blev overvåget af co transduktion med en vektor kodning normal god landbrugspraksis under kontrol af en DCX promotor. Fase kontrast billeder viser progressionen af omprogrammering på forskellige tidspunkter (dag-h: min). Fluorescens billeder af RFP og normal god landbrugspraksis udtryk, henholdsvis. Live imaging og enkelt celle tracking tilladt afgørende begivenheder skal følges, herunder morfologiske ændringer, i mangel af celledeling under omprogrammering, celledød, og det præcise tidspunkt når omprogrammerede celler begynder at udtrykke neuronal markører kan defineres . Skalalinjen repræsenterer 80 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
En af de vigtigste værdier af live imaging er mulighed for at udføre præcise afstamning sporingen, belyse kritiske aspekter af lineage progression i en neurale befolkning. Afstamning sporingen defineres som identifikation og overvågning af alle afkom af en enkelt stamfader, fra grundlæggeren af klon til det efterfølgende klon dannet21. Bemærkelsesværdigt, alternative metoder for lineage sporing (fx, viral transduktion eller flerfarvet reporter konstruktioner21) har en afgørende ulempe, hvorved det endelige resultat er baseret på still-billeder og det gør ikke nødvendigvis udgør hele sekvensen. Dette betyder at celledød, heterogenitet i opførsel af cellen befolkningen, fortynding, spredes eller dårlig effektivitet af markørerne, sammen med andre vigtige ulemper, føre til ufuldstændig eller ukorrekt udlæsning af resultater2. Desuden live imaging gør det muligt for forskeren at analysere vigtige funktioner over biologi af neurale befolkningsgrupper, såsom mode og timing af celledeling, cellevækst, migration, spredning versus differentiering, celle cyklus længde, neurite dannelse, kompleksitet og længde, celle skæbne udvalg (differentiering) eller omstilling (omprogrammering).
Desuden live imaging nemt kan suppleres med andre analyse til formål at indhente data fra enkelte celler, for eksempel, RNA sekvensering. Men for at opnå samlede udbytte fra både live imaging og andre teknikker kræver at disse celler tidligere overvåges i film er senere igen identificeret og individuelt indsamlet til sekundær analyse. Dette kan opnås ved hjælp af mikroskoper, der omfatter positionelle koordinater, ved at anvende fluorescerende journalister for bestemte celler eller analysere fordeling af grupper af celler som referencer. Ja, kombinationen af transkriptom profil og opførsel af individuelle celler kan repræsentere en kraftfuld rute at belyse ny Molekylær stikord involveret i biologi af celler.
Et af de vigtigste problemer, der kan kompromittere en live imaging eksperiment er en utilstrækkelig celle kultur tæthed. Som anført tidligere, med høj tæthed kan overskydende snavs eller dårlig dissociation (klump dannelse) påvirke kvaliteten og rumlige opløsning af billeder, gør enkelt celle tracking uigennemførlige. Betingelserne i de forskellige cellepopulationer under undersøgelse bør derfor, justeres til det laveste antal celler muligt uden at kompromittere cellekultur levedygtighed.
Hyppigheden af image erhvervelse er også af afgørende betydning og bør tilpasses omhyggeligt, især når fluorescens belysning bruges. Over-eksponering for overføres og især fluorescens lys kan kompromittere cellernes levedygtighed. Alternativt, en overdreven forsinkelse mellem erobringen af billederne kan interferere med den tidsmæssige opløsning af analysen.
En anden kritisk trin under live imaging eksperimentet er periodisk justering af fokus. Svigt i den korrekte indstilling/re-setting af brændvidden kan hindre enkelt celle tracking. Derudover er det nødvendigt nøje at kontrollere at inkubation kammer bevarer den tilstrækkelige temperatur, luftfugtighed og CO2 niveauer, ændring af uønskede variationer, der kan fremkalde celledød.
Endelig når PICC har udført, er det vigtigt at ordentligt hente xyz nul holdning forud for den sidste runde af image erhvervelse. Forkert igen indstilling af xyz nul holdning vil gøre det vanskeligt at matche de fase-kontrast og immunfluorescens billeder, hindrer identifikation af den celle afkom.
Selv om denne tilgang har mange positive aspekter, eksisterer nogle begrænsninger for den live imaging af neurale befolkninger stadig. For eksempel, gør lav celle tæthed kræves for at udføre vellykkede enkelt celle sporing af aNSCs det umuligt at anvende biokemiske assays, såsom Western blotting14. Derudover overvågning hurtigt dividere befolkninger som cerebellare astrocytter eller N2a celler er tidsmæssigt begrænset, da det ofte er for svært at spore celler som kulturer nær sammenløb. Desuden, mange kultur metoder samt de iboende biologiske begrænsninger forbundet med isolering af cellerne, ofte kompromis cellernes levedygtighed over lange perioder, begrænse varigheden af de live imaging eksperimenter. Endelig, isolere celler fra deres naturlige miljø har både positive og negative effekter. Celler isoleret fra deres fysiologiske niche kan undlade at modtage vigtige signaler, modulere deres adfærd, mens på samme tid, det repræsenterer et stærkt middel til at teste effekten af disse signaler individuelt i lineage progression af specifikke neurale populationer.
I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, er det klart, at den perfekte metodologiske scenario ville være at udføre live imaging og enkelt celle tracking eksperimenter under normale fysiologiske forhold in vivo. Aktuelle teknikker er dog ude af stand til at følge enkelt celler i lange perioder i dyb regioner af hjernen2. Derfor, live imaging fremtid bør fokusere på at overvinde denne begrænsning, satsning hen til fuldt analysere cellebiologi af enkelt celler i vivo med de mest mindre interferens mulige fysiologiske miljø3.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Beatriz Gascon for hendes hjælp og kunst arbejde i figur 1. Vi takker også Dr. C. Norris for hans bistand. Arbejde præsenteres her blev støttet af forskningsbevillinger, "røde de excelencia Consolider-Ingenio spansk Ion kanal initiativ" (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/is-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) og Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega anerkender Ramon y Cajal Program spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne (MEC: RYC-2013-13290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
| 24 wells plate | Falcon | 352047 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
| DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
| Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
| Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
| Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
| Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
| Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
| Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
| Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
| CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
| CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
| pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
| 310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
| Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
| High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
| Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
| OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
| Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
| HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |
References
- Conklin, E. G. The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology. Science. 21 (536), 525-529 (1905).
- Ortega, F., Costa, M. R. Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents. Front Neurosci. 10, 78 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Schroeder, T. Tracking hematopoiesis at the single cell level. Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
- Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. Quantitative single-cell approaches to stem cell research. Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).
- Ortega, F., et al. Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling. Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
- Gascon, S., et al. Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).
- Kleiderman, S., et al. Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma. Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).
- Bunk, E. C., et al. Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone. Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).
- Aravantinou-Fatorou, K., et al. CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons. Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).
- Jimenez, A. I., et al. Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes. Glia. 26 (2), 119-128 (1999).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
