Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Abstract

Zintuiglijke systemen kunnen dieren te detecteren, te verwerken en te reageren op hun omgeving. Overvloed van voedsel is een milieu cue die diepgaande gevolgen voor de dierlijke fysiologie en gedrag heeft. Onlangs, toonden we dat modulatie van de levensduur in de nematode Caenorhabditis elegans door overvloed van voedsel complexer is dan eerder herkend. Het reactievermogen van de levensduur tot veranderingen in voedsel niveau wordt bepaald door de specifieke genen die gedragen beheersen van informatieverwerking binnen een neurale circuit. Ons kader combineert genetische analyse, high-throughput kwantitatieve beeldvorming en informatietheorie. Hier beschrijven we hoe deze technieken kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van elk gen dat fysiologische relevant is voor breed scala dieet beperking. In het bijzonder deze workflow is ontworpen om te onthullen hoe een gen van belang regelt levensduur onder breed-scala dieet beperking; dan vast te stellen hoe de expressie van het gen varieert met voeding niveau; en tot slot, om te zorgen voor een onpartijdige kwantificering van de hoeveelheid informatie overgebracht door genexpressie over voedsel overvloed in de omgeving. Wanneer meerdere genen gelijktijdig in het kader van een neurale circuit onderzocht worden, kan deze werkstroom de codering strategie in dienst van het circuit ontdekken.

Introduction

Alle organismen moeten kunnen te voelen en te reageren op veranderingen in de omgeving om te overleven. Bij dieren, het zenuwstelsel is de primaire detector en transducer van informatie over de omgeving en coördineert de fysiologische reactie op wijzigingen die van invloed kan zijn voor het organisme van survival1. Overvloed van voedsel is een milieu cue momenteel goed onderzocht in verschillende contexten die niet alleen voedselgerelateerde gedrag, zoals foerageren2 regelt, maar ook van invloed op de levensduur van een dier. De modulatie van levensduur door veranderingen in overvloed van voedsel is een fenomeen dat bekend staat als dieet beperking (DR), en heeft brede evolutionaire instandhouding3.

De nematode Caenorhabditis elegans is een krachtig modelsysteem voor het aanpakken van fundamentele biologische vragen. Een overvloed aan technieken zijn ontwikkeld waarmee voor het manipuleren van het genoom van de worm, zoals RNAi en in vivo gene bewerken technieken. De kleine fysieke grootte van de worm en de optische transparantie lenen zich ook voor in vivo imaging van zowel transcriptionele en translationele fluorescerende verslaggevers en het nut van high-throughput technologieën zoals microfluidics4. Deze hulpprogramma's kunnen samen worden aangewend om te onderzoeken hoe neurale circuits directe dierlijk gedrag.

C. elegans is een Bacterivoor en verschillende methoden hebben gepubliceerd waarmee voor de nauwkeurige controle van de overvloed van voedsel door het manipuleren van bacteriële concentratie5,6,7,8 . Binnen de C. elegans onderzoeksgemeenschap, is DR onderzocht in twee verschillende contexten. De eerste kan worden betiteld als 'klassieke DR', zoals het weerspiegelt de veranderingen gezien in reactie op het verkleinen van voedsel niveaus in andere organismen. In dit verband, afnemende voedsel overvloed van ad libitum niveaus resulteert in een toenemende levensduur tot een optimale is bereikt, nadat dit punt levensduur met verdere vermindering van voedsel6,7afneemt, 9. Het tweede kader waaronder DR is onderzocht in C. elegans is dieet ontbering waarin de levensduur van de wormen wordt verhoogd met de volledige verwijdering van eventuele bacteriële voedsel bron10,11. In Entchev et al. (2015)12, we hebben laten zien dat de complexiteit van DR als gevolg van deze twee verschillende paradigma's kan worden onderzocht gelijktijdig in een context die we noemen 'breed-scala DR'. Met behulp van het protocol zoals hieronder beschreven, we geïdentificeerd een nieuwe klasse van genen die betrokken zijn bij DR dat bidirectionally het moduleren van de levensduur reactie op voedsel overvloed en zijn betrokken bij de neurale circuits die zin voedsel12 (Figuur 1).

De reactie van een dier op veranderingen in het milieu integreert een reeks biologische processen die de zintuigstelsel koppelen aan complexe regelgeving interacties overbrengen van milieu-informatie aan fysiologie. Hoewel de mechanistische details van dergelijke "informatiestroom" bekeken, vaak onbekend zijn, kunnen genetische's worden gebruikt voor het verwerven van inzicht in hoe deze complexe berekening wordt georganiseerd onder verschillende biologische componenten. In ons recente werk toonden we dat daf-7 en tph-1 zijn betrokken bij de overdracht van milieu-informatie over voedsel overvloed via een voedsel-sensing neurale circuit dat levensduur in C. elegans12 moduleert , 13. door het toepassen van het wiskundige kader van informatietheorie14, konden we kwantificeren van het bedrag van de milieu-informatie, in termen van bits, dat wordt vertegenwoordigd door het gen expressie veranderingen in daf-7 en tph-1 in specifieke neuronen in verschillende niveaus. Daaruit konden we dan om te ontdekken de codering strategie in dienst van deze neurale en hoe het genetisch wordt gecontroleerd (Figuur 2).

In het volgende protocol schetsen we de stappen die nodig zijn om te begrijpen wat de gevolgen van de genen van belang uitgedrukt in specifieke neuronen zijn en hoe zij deelnemen aan de stroom van voedselinformatie uit omgeving naar levensduur. In het algemeen, onze kader is verdeeld in twee experimentele protocollen en een computationele workflow. Voor de experimentele aspecten, is het van cruciaal belang dat mutanten van de genen van belang dat onder brede-bereik kan worden onderzocht DR. Faithful transcriptionele verslaggevers zijn ook nodig om het kwantificeren van het niveau van de uitdrukking van de genen op verschillende niveaus. Om te kunnen overgaan tot de computationele analyse besproken in onze methode, moet de dataset van voldoende grootte tot zinvolle schattingen van expressie distributies op te leveren. Hoewel wij sjabloon broncodes voor de analyses bieden, moet de gebruiker vertrouwd zijn met de taal van de informatietheorie die uitgebreid door onze computationele kader wordt gebruikt. De broncodes zijn geschreven in R en C++. Daarom is een zekere mate van programmering vaardigheid ook verplicht toe te passen op een zinvolle manier.

Protocol

1. voorbereiding van de bacteriele en platen voor algemene Worm cultuur

  1. lysogenie Bouillon (LB) media in een fles van 250 mL 100 mL voor te bereiden en steriliseren in autoclaaf.
  2. Enten van de fles met een één kolonie van de Escherichia coli stam OP50 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, en sla cultuur bij 4 ° C totdat nodig.
  3. Bereiden 5 L van steriele nematode groei middellange (NGM) agar 15 en aliquot 12 mL volumes in de plastic petrischaaltjes steriele 6 cm.
  4. Toestaan de agar's nachts instellen en vervolgens opslaan bij 4 ° C totdat nodig.
  5. Zaad NGM platen ten minste 3 dagen vóór gebruik met 225 μL van de gekoelde OP50 cultuur. Opslaan van de platen bij 20 ° C totdat nodig.

2. Voorbereiding van bacteriele en verdunningen voor experimenten

  1. bereiden twee veel van 500 mL voor LB media in een erlenmeyer van 2 L en steriliseren in autoclaaf.
  2. Inoculeer elke kolf met een één kolonie van OP50 en groeien bij 37 ° C schudden bij 200 t/min voor ongeveer 14 h.
  3. Vormen een aanvulling van de culturen met de antibiotica streptomycine om een eindconcentratie van 50 μg/mL. Blijven schudden voor 30 minuten bij 37 ° C dan de kolven op ijs voor 15 min. plaatsen
  4. Breng 450 mL van iedere cultuur in aparte steriele centrifuge flessen (idealiter 500 mL capaciteit flessen om te voorkomen dat de culturen splitsen). Behouden van de overgebleven cultuur op het ijs, zoals het zal worden gebruikt voor het bepalen van de concentratie van de bacteriën.
  5. Spin down de flessen bij 4500 x g in een gekoelde centrifuge set bij 4 ° C voor 25 min. Discard supernatant en bewaar de flessen op de ice.
  6. 100 μl van de overgebleven cultuur uit elke kolf in 900 μL van steriele pond gebruik 1 mL steriele LB op nul van de spectrofotometer Verdun en vervolgens bepalen de OD 600 van de 10-fold verdunning van elke cultuur. Als bijvoorbeeld de OD 600 van de 10-fold verdunning van de overnachting cultuur 0.28 dan de cultuur een werkelijke OD 600 voor 2.8 moest.
  7. Gebruiken een werken-stockoplossing van bacteriën van 1.12 x 10 10 OP50 cellen/mL, wat neerkomt op een OD 600 van 56. Dus, met behulp van de voorbeeld OD 600 van 2.8 van bovenaf, resuspendeer de pellet uit de cultuur van 450 mL in een 20 th van het oorspronkelijke volume, die in dit geval is 22.50 mL. Resuspendeer bacteriën met een steriele S basale oplossing aangevuld met streptomycine tot 50 μg/mL (SB + strep).
  8. Resuspendeer de pellet in het juiste volume van steriele SB + strep.
  9. Maken van alle daaropvolgende concentraties gebruikt in experimenten van seriële verdunningen van het bestand werkend in SB + strep met behulp van de verdunningsfactoren vermeld in tabel 1.

3. Instelling van de experimenten van de levensduur

Opmerking: levensduur tests worden uitgevoerd op 6 cm behandeld weefselkweek gevuld met 12 mL NGM agar aangevuld met streptomycine en carbenicillin (NSC), zowel op een eindconcentratie van 50 μg/mL. Deze weefselkweek platen zijn geschikt voor levensduur testen op geen of zeer lage bacteriële concentraties, zoals de wormen aanzienlijk minder gevoelig zijn voor het vasthouden aan de muur van de plaat en desiccating. Het gebruik van twee verschillende antibiotica voorkomt dat de OP50-stam ontwikkeling van resistentie, die is van cruciaal belang bij het beheersen van de bacteriële concentratie op de plaat. Ook door het inactiveren van bacteriën met antibiotica, minimaliseren we van de effecten op worm levensduur als gevolg van pathogene infectie 16. Hierdoor kunnen we dat alleen de voedselgerelateerde onderdelen van bacteriële concentratie in deze experimenten. Veel C. elegans vergrijzing studies vullen NGM platen met de chemische fluoro-2 ′-deoxyuridine (FUdR) te maken van de volwassenen steriel. Het gebruik van FUdR kan echter problematisch als het gebruik ervan leiden diverse storende problemen met lange levensduur testen 17 , 18 , 19 , tot kan 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12 dit probleem omzeild door Gasbedwelming met behulp van L4 larven RNAi ei-5 22 , 23, die remt de oöcyt-naar-embryo overgang door het blokkeren van de vorming van de "eggshell" van bevrucht C. elegans eicellen resulterend in hun dood.

  1. Cultuur de C. elegans stammen die zal worden bepaald op ontpit NGM platen bij 20 ° C. toestaan de platen uit te hongeren uit om ervoor te zorgen dat alle dieren geteeld op een uniforme wijze en potentieel voor eventuele transgenerationele effecten van account worden Developmental voorwaarden.
  2. Overdracht uitgehongerd L1 larven aan nieuwe geplaatste NGM platen door te snijden een klein stukje agar (5 x 5 mm) van de uitgehongerd plaat met behulp van een steriel scalpel en brengen het neer op een nieuwe plaat, een proces genoemd ' chunking ' door de C. elegans onderzoek comm eenheid 15. De wormen groeien tot ze de L4-fase te bereiken. Vijf L4 larven per stam zijn vervolgens overgedragen aan afzonderlijke geplaatste NGM platen en bewaard bij 20 ° C. Deze dieren vertegenwoordigen de generatie P0.
  3. Gebruik L4 nakomelingen van de generatie P0 instellen van de F1-generatie. Individueel plaatsen F1 L4 larven van de wild type N2 stam op 30 geplaatste NGM platen.
    Opmerking: Voor gemuteerde stammen, het aantal platen nodig zijn hangt af van hun groei. Bijvoorbeeld, ondergaan daf-7(ok3125) dieren een voorbijgaande duur arrestatie bij 20 ° C. Dus, deze soort produceert minder L4 larven dan een plaat van N2 wild type wormen.
  4. Om te compenseren voor dit verschil, instellen daf-7(ok3125) platen van een dag eerder dan N2 platen en op een groter aantal, een goede verhouding van de werken is 3:1.
  5. Overdracht gesynchroniseerd L4-fase nakomelingen van de ouders van de F1 te NGM platen aangevuld met 1 mM IPTG en 50 µg Mo/mL carbenicillin (RNAi platen), dat waren bezaaid met 225 µL van HT115 bacteriën uiten dsRNA gericht op het ei-5-gen en op gehouden 20 ° C gedurende 24 uur. Ten minste 360 wormen per stam, gehouden bij een dichtheid van 15 dieren per plaat, komen per experiment.
  6. Na de ei-5 RNAi behandeling, overbrengen in de wormen NSC platen bezaaid met 225 µL van de streptomycine-behandeld OP50 bij een concentratie van 2 x 10 9 cellen/mL (tabel 1) voor een aanvullende 24 uur bij 20 ° C. Voorkom fysieke schade aan de wormen tijdens dit en alle daaropvolgende overdrachten, zachtjes opscheppen dieren uit onder de worm met behulp van een zeer dunne zachtjes gebogen worm kiezen. Float de dieren uit de worm halen door het onder te dompelen in een droplet 10 µL van SB + strep geplaatst op het oppervlak van de nieuwe plaat.
  7. De volgende dag, verspreiden de wormen naar NSC platen vertegenwoordigen elk van de levensmiddelen niveaus lIsted in tabel 1, alsmede een set van NSC platen die geen bacteriën bevatten. Zaad van alle NSC platen met 225 µL van de relevante concentratie van bacteriën, en de platen van de NSC bacteriën vrij met 225 µL SB + strep zaad. Het handhaven van de wormen bij een dichtheid van 15 dieren per plaat, resulterend in ten minste vier platen per voedsel voorwaarde per stam. Verschuiving van de platen op de gewenste temperatuur van experimentele.
  8. Overdracht wormen aan verse NSC platen bezaaid met passende voedsel concentratie volgens het schema beschreven in tabel 2.
  9. Score dieren voor verkeer door zachtjes porren met een draad halen. Verzuim om te reageren is scoorde als dood. Score van dieren voor dood op elke overdracht punt en vervolgens dagelijks na het laatste overstappunt.

4. Setting Up Imaging experimenten

Opmerking: de stappen in deze sectie zijn voldoende voor het genereren van genoeg wormen per stam voor imaging-een experimentele voedsel voorwaarde bij een gegeven temperatuur. Dit protocol kan worden aangepast aan het aantal voorwaarden dat beeld zal worden op een bepaalde dag. Echter, moet worden gezorgd in de proefopzet om ervoor te zorgen dat het tijdschema redelijk is en dat dieren over verschillende spanningen niet een verschil in leeftijd meer dan 12 uur op de dag van imaging hebben. Het is sterk aanbevolen dat de transcriptionele verslaggevers wordt beeld single-kopie transgenics zijn, omdat dit meer op de oorspronkelijke verordening van het gen lijken zal. Het protocol zoals hieronder beschreven en wordt samengevat in tabel 3, biedt ook een gestroomlijnde methode voor het verkrijgen van grote synchrone gematched bevolking van stammen, die kunnen worden gebruikt voor andere experimentele workflows.

  1. Cultuur dieren in experimenten op 10 cm behandeld weefselkweek platen te voorzien in een grotere dichtheid van wormen imaging (∼ 100 dieren per plaat) dan levensduur testen.
  2. Vullen de 10 cm platen met 30 mL NGM agar platen en zaad met vijf 225 µL aliquots van gekoelde OP50 cultuur in een kruis-achtige formatie.

5. Cultuur van de stammen van de verslaggever eerste

  1. cultuur de C. elegans stammen die zal worden bepaald op ontpit NGM platen bij 20 ° C. toestaan de platen uit te hongeren uit om ervoor te zorgen dat alle dieren geteeld op een uniforme wijze en potentieel voor een account worden transgenerationele gevolgen van ontwikkelingsstoornissen voorwaarden.
  2. Brok de uitgehongerd L1 larven aan geplaatste NGM platen en groeien tot ze de L4-fase te bereiken. Drie L4 larven per stam overbrengen in twee geplaatste NGM platen bij 20 ° C. Deze dieren vertegenwoordigen de generatie P0.
  3. Gebruiken de L4 nakomelingen van de generatie P0 instellen van de F1-generatie. Plaats F1 L4 larven van de stam van de verslaggever wilde type op 4 geplaatste NGM platen. Voor gemuteerde stammen afhankelijk het aantal platen nodig in hun groei. Met behulp van het vorige voorbeeld, daf-7(ok3125), verslaggever spanningen in deze achtergrond vereisen driemaal de kentekenplaten en twee dagen voor de wild type verslaggever stammen, ter verantwoording voor verschillen in de groei moet worden opgezet.

6. Ei-collectie en de synchronisatie van de spanningen van de verslaggever

Opmerking: sommige genen van belang in de onderzoekgemeenschap C. elegans veroudering leiden tot groei en ei leggen van gebreken als gemuteerd, waardoor het moeilijker te genereren van synchrone grote populaties dieren van verschillende genotypen. Bijvoorbeeld, veroorzaakt de daf-7(ok3125) mutatie een ernstige ei leggen van defect in vergelijking met het wild type N2 stam. Daarom, om voldoende aantal synchrone L4 larven van verschillende stammen voor kwantitatieve imaging experimenten vereist een robuustere methodologie dan handmatig plukken wormen. Om deze reden, transcriptionele verslaggever stammen werden onderworpen aan een natriumhypochloriet (NaClO) / natriumhydroxide (NaOH) oplossing behandelingvan gravid volwassenen te breken open van de dieren en bevrijden van hun eieren, een proces dat gewoonlijk aangeduid als ' bleken ' door de C. elegans onderzoek Gemeenschap 15.

  1. Account voor verschillen in de groei tussen stammen tarieven en bereken wanneer platen van elke stam moeten worden geoogst en gebleekt. Zie tabel 3 voor een voorbeeld van wanneer wild type en daf-7(ok3125) verslaggever stammen zijn gebleekt.
  2. Wassen van de wormen van een bepaalde stam uit de platen, op de juiste dag, met behulp van 15 mL SB serieel en verzamelen in een steriele 15 mL-buis. Toestaan dat de dieren natuurlijk sediment en past u het volume van de vloeistof tot 7 mL.
  3. Voeg toe 2 mL 5% NaClO en 1 mL van 5 M NaOH aan de buis met de gravid volwassenen. Zachtjes rock het mengsel bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 3 minuten. De NaClO zal doden de bacteriën en wormen, terwijl de NaOH zorgt ervoor dat de wormen te breken uit elkaar loslaten geen bevruchte eieren ze in de vloeistof bevatten. De chitine eierschaal rond de embryo's beschermt hen tegen de effecten van de behandeling, zolang de blootstellingstijd relatief kort blijft. Na de 3-min-incubatie, vortex de buis voor ~ 30 s om verdere uiteenvallen van de worm karkassen.
  4. Na de 3-minuten incubatie spin down het mengsel bij 1.000 x g gedurende 1 minuut aan de pellet de eieren. Weg van de meeste van het supernatans dat met behulp van een steriele glazen pipet verbonden met de kolf van een vacuüm, verlaten ~0.5 mL in elke buis, dus niet te verstoren de eieren gecombineerd.
  5. Resuspendeer de pellet met 9.5 mL SB en herhaalt u vervolgens de centrifugeren stap en resuspensie stappen een extra twee keer zodat de eieren zijn gewassen met SB in totaal driemaal.
  6. Na de finale wassen, pellet de eieren door middel van centrifugeren en vervolgens allemaal maar 0,5 mL van het supernatans dat negeren. Resuspendeer de eieren in de overblijvende 0,5 mL van SB en vervolgens aliquoot 100 µL op drie 10 cm ontpit NGM platen. De 100 µL gelijkmatig moeten verdelen over alle vijf bacteriële gazons op elke plaat. Voor wild type stammen, de eieren niet op dichtheid groter is dan 200 per plaat moeten worden gestort.
    1. Houd platen bij 20 ° C gedurende 48 uur en een zeer homogene populatie van L4 larven te verkrijgen. Voor spanningen met vertraagde groei fenotypen is het raadzaam om te storten zoveel eieren als beschikbaar en verhogen van de incubatietijd. Bijvoorbeeld, het houden van daf-7(ok3125)-met verslaggever stammen bij 20 ° C gedurende ~ 64 h dat de eieren uitkomen en de L4 stadium bereiken.

7. Behandeling van verslaggever stammen met ei-5 RNAi

  1. serieel wassen de wormen uit de drie platen met 15 mL SB en het verzamelen van de vloeistof in een steriele 15 ml-buis. De larven van de L4 naar natuurlijk sediment toestaan en vervolgens gecombineerd allemaal maar ~0.5 mL van de vloeistof. In het wild typee verslaggever stammen, deze stap verwijdert alle larven jonger dan L4. In mutant achtergronden, helpt deze stap de verwijdering van een gearresteerde larven zoals dauers in het geval van daf-7(ok3125).
  2. Resuspendeer de wormen met 9 mL SB. Nogmaals, controleren de snelheid sedimentatie van de L4-larven en vervolgens gecombineerd allemaal maar ~0.5 mL van het supernatans dat zodra het merendeel van de L4 larven hebben Ingehuld. Herhaal dit proces nogmaals. Vervolgens gecombineerd allemaal maar ~0.5 mL van de vloeistof zodra de meerderheid van L4 larven hebben geregeld.
  3. Toevoegen 10 µL van steriele S basale aangevuld met 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) tot de vloeistof met de L4-larven. Dit fungeert als een oppervlakteactieve stof en voorkomt dat de larven vasthouden aan de binnenkant van een plastic pipet tips.
    1. Zachtjes resuspendeer de larven met behulp van een P200 lage retentie pipette uiteinde en vervolgens aliquoot 150 µL op drie 10 cm RNAi platen die worden overgeënt met 5 x 225 µL van ei-5 RNAi bacteriën. Zorgen dat de wormen gelijk verdeeld over alle vijf bacteriële gazons.
  4. Zodra de vloeistof is geabsorbeerd in de agar, elke niet-L4-larven te verwijderen uit de platen die niet werden uitgeschakeld door de procedure wassen door handmatig plukken ze uit. Sla de platen bij 20 ° C gedurende 24 h.

8. Inleiding van breed-scala DR

Opmerking: na de 24u ei-5 RNAi behandeling, de L4-larven die waren oorspronkelijk gedeponeerd op de platen zal geworden zijn 1 - dag oud volwassenen.

  1. Schakelen alle jonge larven die ontsnapt aan de voorafgaande handmatige verwijdering stap uit in dit stadium, waardoor alleen de 1 - dag oud volwassenen op de platen.
  2. Voor elke stam, de 1 dag oud volwassenen aan de drie platen met 15 mL steriele SB + strep te wassen in een tube van 15 mL. Toestaan dat de wormen aan natuurlijk sediment en vervolgens gecombineerd allemaal maar 0,5 mL van het supernatans. Resuspendeer de wormen met 9.5 mL SB + strep en herhaal de sedimentatie en wassen stappen.
  3. Na de finale wassen, zodat de wormen naar sediment en vervolgens gecombineerd allemaal maar 0,5 mL van het supernatans. Voeg 10 µL SB + Plu en zachtjes resuspendeer de larven met een uiteinde van de pipet P200 en vervolgens aliquoot 100 µL op een bord van de NSC bezaaid met 5 x 225 µL bacteriën bij een concentratie van 2 x 10 9 cellen/mL.
    1. Verdelen de 100 µL gelijkmatig over alle vijf bacteriële gazons. Onder een Microscoop schatten het aantal dieren aanwezig zijn op de plaat: het doel is dat tussen 100-150 wormen op het bord.
    2. Bepalen de hoeveelheid vloeistof die nodig is om de dichtheid van een worm binnen dit bereik en vervolgens aliquot op twee extra platen. Aanpassen van het aantal wormen op de eerste plaat ook in dit bereik vallen en vervolgens opslaan van de platen bij 20 ° C gedurende 24 h.
  4. De volgende dag, de 2 dag oud volwassenen verzamelen en distribueren naar nieuwe NSC platen bezaaid met de gewenste experimentele concentratie van voedsel (tabel 1), hergebruik van de methoden beschreven in stappen 2 en 3. Zodra de vloeistof is geabsorbeerd in de agar, verschuiving van de platen op de gewenste experimentele temperatuur voor 24 h.
  5. De volgende dag, de 3 dag oude volwassenen te innen en te verdelen aan verse NSC platen bezaaid met dezelfde experimentele concentratie van voedsel, de methoden die worden beschreven in stap 8.3 en 8.4 hergebruiken. Zodra de vloeistof is geabsorbeerd in de agar, weer de platen in de experimentele omgeving voor 48 h.
  6. De 5 dagen oude volwassenen te innen en te verdelen aan verse NSC platen bezaaid met dezelfde experimentele concentratie van voedsel, de methoden die worden beschreven in stap 8.3 en 8.4 hergebruiken. Zodra de vloeistof is geabsorbeerd in de agar, weer de platen in de experimentele omgeving voor 24 h.

9. Microfluidic Imaging van verslaggever stammen

  1. op dag 6 van volwassenheid, het beeld van dieren met behulp van een aangepaste microfluidic platform 24 , 25. Fysiek Kies af dieren uit de drie platen en schorten in een cryogene tube van 5 mL met 4.5 mL SB + strep.
    1. Één keer de wormen sediment, gecombineerd allemaal maar ~0.5 mL van het supernatans en resuspendeer de dieren in 4 mL SB + strep. Deze wassing verwijdert overtollige bacteriën die anders met beeldvorming interfereren kunnen. De wormen worden ingevoerd in een aangepaste microfluidic apparaat via druk gedreven stroom 24 , 25. Binnen het apparaat, individuele wormen zijn gericht op en gevangen in een imaging kanaal gated door druk-gedreven op de chip kleppen 26 onder de controle van de douanesoftware.
  2. Zodra een worm headfirst in de beeldvorming kanaal gevangen is, verzamelen een fluorescerende z-stack, met 50 secties in 2 µm stappen, met behulp van een standaard epifluorescence Microscoop met een 40 X olie doelstelling (1.3 NA) en een camera. Rood en groen fluorescent beelden verzamelen voor elk van transcriptionele verslaggevers gelijktijdig met behulp van een emissie-splitter en opgeslagen voor analyse. Beeldacquisitie is geautomatiseerd met behulp van douanesoftware.
  3. Proces de afbeelding automatisch met behulp van aangepaste MATLAB scripts 27 (beschikbaar op https://github.com/meizhan/SVMelegans). De Z-stapels zijn geladen in MATLAB en geanalyseerd voor om neuron-pairs en hun locaties binnen het imaging vliegtuig te identificeren. De maximale projecties worden vervolgens berekend, en een drempelmethode-algoritme wordt gebruikt om afzonderlijke fluorescerende cellen te zoeken. Identificatie van de cel wordt dan berekend op basis van de relatieve afstanden en locaties binnen de worm ' s hoofd.
  4. Te kwantificeren verslaggever fluorescentie, pak het driedimensionaal volume rond elke mobiele locatie uit de z-stack. Integreren van de intensiteit over een substantieel aantal de helderste pixels, die volledig de gehele cel in alle gevallen weer inkapselen.
  5. Te elimineren van de interferentie van experimentele conditie-specifieke of stam-specifieke wijzigingen in de darm auto-fluorescentie van elk dier, de intensiteit van de achtergrond van de cel pairs dichtstbijzijnde de darm (ADF en ASI) berekenen via de schatting van de wijze van de de distributie van de intensiteit in een volume rond het neuron. Deze achtergrond intensiteit de waarde van de geïntegreerde fluorescentie te verkrijgen van de uiteindelijke uitvoer aftrekken.

10. Gegevens vergadering

Opmerking: de intensiteit van de fluorescentie van alle neuronen geanalyseerd door het beeld processing software worden samengevoegd tot het gefilterde expressie gegevensbestand (FED), die wordt gebruikt voor het schatten van de profielen van de distributie van gen expressie (sjabloon R en C++ scripts zijn beschikbaar op https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Handmatig controleren elke verwerkte beeld om te bevestigen correcte identificatie voor alle cellen. Afbeeldingen met onjuiste cel identificatie moeten worden opgenomen in een bestand van uitsluiting. In Diana et al. (2017) 13 de uitsluiting-bestand uit een binaire tabel met bestaat ' 0 ' voor corrigeren en ' 1 ' voor onjuiste cel identificatie. Het aantal rijen in de tabel is gelijk aan het aantal wormen beeld met een kolom voor elke cel beeld (dwz ASI, ADF en NSM).
  2. De FED-bestand genereren:
    1. Run de bash script " gen_data + tijd " voor het genereren van cel-specifieke bestanden combineren de expressie waarden, verkregen uit elke worm beeld gefilterd met behulp van het bestand van de uitsluiting. Voor elke map gegenereerd door het beeld processing software, de bash-script leest het aantekening-bestand < folderprefix > _EXP.txt uitpakken van de experimentele omstandigheden en de uitsluiting bestand < folderprefix > _X.csv alleen correct instellen geïdentificeerde neuronen. Expressie waarden worden gelezen uit de bestanden < folderprefix > _data_ < neuron > .csv.
    2. Aaneenschakelen van alle bestanden in " FED_split.dat " en het sorteren van het experiment batchcode, label en cel identiteit worm.
    3. Uitvoeren " soort " (C++-programma, gebruik:. / sorteren FED_split.dat FED_merged.dat) vermeldingen met niet-nulzijnde fluorescentie voor elke cel te selecteren en hen te combineren in één rijen in FED_merged.dat.

11. Schatting van informatie gecodeerd

Opmerking: de volgende procedure wordt beschreven hoe de informatie over bepaalde milieuomstandigheden gecodeerd door de verzameling van gene expressies te kwantificeren. In Diana et al. (2017) 13, de gegevens gecodeerd over voedsel overvloed in de omgeving werd onderzocht, echter de methode zelf is van toepassing op een discrete aantal milieu-Staten. Het hoofdbestanddeel te kwantificeren informatie theoretische variabelen zoals informatie entropieën of redundantie is de joint kansverdeling van de neurale reacties onder de ingestelde milieu stimuli beschouwd. Voor het uitvoeren van deze schatting, is het van cruciaal belang dat er een voldoende bemonstering van de reactie tussen de populaties van wormen. Gauss distributies kunnen worden geraamd van relatief kleine steekproeven; het is echter belangrijk om een idee van de verwachte vorm van de verdeling van de expressie te kwantificeren van de grootte van de passende steekproef voor een betrouwbare dichtheid schatting. Als gevolg van de onvermijdelijke variabiliteit tussen verschillende proeven, is het essentieel om te controleren dat de centrale waarden van de distributies verkregen van verschillende herhalingen van hetzelfde experiment niet systematisch zijn verschoven of dat een van de statistische functies van de expressie distributie niet aanzienlijk gewijzigd over proeven. In het geval dat de variabiliteit van proef-te-proef is compatibel met de variabiliteit binnen elke proef, is het cruciaal dat het evenwicht tussen het aantal experimenten ten opzichte van het aantal wormen binnen proeven gemiddeld uit deze milieu/biologische factoren die invloed hebben op de proces-naar-proces variabiliteit. Undersampling van deze factoren kan zwaar vertekening van de informatie-theoretische analyse.

  1. Als de R-script " code3D.R " biedt een sjabloon voor het genereren van driedimensionale dichtheden gebaseerd op het bestand " FED_merged.dat ", het wijzigen van deze sjabloon op basis van de specifieke opmaak van de koptekst van de FED. De lijst " HeaderNames " de namen van elk veld in het bestand van de FED terwijl " RONames " is de lijst van de uitlezingen. Het script maakt gebruik van de R-pakket ' ks ' 28 , 29 te schatten multivariate verdelingen binnen een hypercubic raster met GS opslaglocaties in elke dimensie controledoeleinden het bereik tussen de minimum en maximum waarden in de dataset voor elke uitlezing. Wanneer de interne variabele " groep " is ingesteld op 0, alle gegevens worden gebruikt voor de schatting van de dichtheid. Wanneer de " groep " label is tussen 1 tot en met 5 de dataset is onderverdeeld in 5 disjuncte verzamelingen en de expressie dichtheden worden geschat uit de 80% van de gegevens die voortvloeien uit de uitsluiting van een van de vijf sets. Deze functie wordt later gebruikt om een schatting van de onzekerheden te.
    Opmerking: Gebruik van code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < eten > < GS > < outfolder > < etiket > < groep > < frac > waar GT vertegenwoordigt het genotype, voedsel staat het milieu, outfolder is de reeds bestaande map waarin de distributies zal worden opgeslagen, label is een filename prefix frac is de Fractie van de dataset gebruikt.
  2. Voor elke milieu voorwaarde genereren de multivariate verdelingen met ander rooster maten GS (b.v. 20,30,40 opslaglocaties). Verklein de computationele belasting en zijn lagere waarden voor GS voorkeur wanneer fijnere resoluties niet aanzienlijk de schatting van de informatie veranderen. Genexpressie distributie zijn geschreven in de map < outfolder > opgegeven bij het uitvoeren van code3D.R als één kolom tekstbestanden met de bestandsnaam structuur < etiket > _ < GT > _ < voedsel > _GS < GS > _Groeperen < groep >. dat.
    Opmerking: de vorige stappen bieden de schatting van de voorwaardelijke kansverdelingen Equation 1 waar g duidt de vector van alle read-outs en f staat het milieu. Echter voor het berekenen van de wederzijdse informatie tussen de expressie van genen en de omgeving 30 , 31.
    Equation 2
    we moeten de verdeling van de input Equation 3 gen-expressie die ook bepaalt de (inbreng-) gemiddeld < img alt = "Vergelijking 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Wanneer de invoer verdeling niet direct beschikbaar is, een zinvolle hoeveelheid te karakteriseren de codering functies is de kanaalcapaciteit, die kan worden verkregen door het maximaliseren van de uitwisseling van informatie over alle mogelijke input distributies.
  3. De Arimoto-Blahut 32-algoritme te schatten van de kanaalcapaciteit van het systeem en de verdeling van de milieu-ingang die informatie maximaliseert met behulp van de genexpressie verdeling, van toepassing. Een voorbeeld van de implementatie van het algoritme kan worden gevonden in de C++-programma " Ccap3D.cpp " voor de driedimensionale gen-expressie code geanalyseerd in Diana et al. (2017) 13. Voorbeeld: als distributies van het genotype GT123 worden verkregen van de 80% van de gegevens (groep 3) met de rastergrootte gelijke 30 en opgeslagen in de map ". /pdf/ " met behulp van een voorvoegsel label = " PDF ". De opdracht voor het berekenen van de informatie die is gecodeerd in de achtergrond GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Opmerking: de schatting van de informatie die is gecodeerd door het systeem wordt beïnvloed door meerdere bronnen van onzekerheid, met inbegrip van de keuze van de schatting van de dichtheid algoritme en steekproef-grootte-bias. Stappen 11.1-11.2 moeten worden herhaald met gebruikmaking van verschillende dichtheid schattingsmethoden voor de evaluatie van de omvang van systematische vertekening geïntroduceerd door elk algoritme.
  4. Om een schatting van de onzekerheid als gevolg van de grootte van de steekproef, te berekenen informatie uit stappen 11.1-11.2 met groepen van 1 tot en met 5. De variabiliteit in deze vijf onafhankelijke proeverijen van de 80% van de gegevens zal de impact van steekproefgrootte nadenken over informatie schatting.
  5. Berekenen van informatie met behulp van stappen 11.1-11.2 over verhoging van de Fractie van de gegevens (zoals in stap 5) om te corrigeren voor de grootte van de steekproef bias (methode Jack-knife) 33.

12. Berekening van redundantie, lawaai en signaal correlatie

  1. Gebruik de optimale invoer distributies verkregen van de schatting van de maximale informatie voor de berekening van de wederzijdse informatie Equation 5 tussen input en gen-expressie respons van elk neuron N. Het bronbestand C++ " GetMI1D.c " is een steekproefprogramma marginale wederzijdse om informatie te verkrijgen van de joint kansverdelingen.
  2. Berekenen van redundantie door middel van de som van de wederzijdse informatie voor elk neuron verkregen boven en trek daar vervolgens het kanaalcapaciteit.
  3. Berekenen de " shuffle " informatie term Equation 6 13 , 34. Een sjabloon C++-bronbestand kan worden gevonden " GetShuffle.c ".
  4. Gebruik de " shuffle " term voor de berekening van de correlatie tussen signaal en ruis. Voor het signal correlatie wij hebben Equation 7 en voor de correlatie van de ruis we hebben Equation 8.
  5. Onzekerheden op redundantie, verkrijgen van lawaai en signaal correlatie wat betreft de totale informatie (stap 11.3 van de vorige sectie) uit meerdere proeverijen van de 80% van de gegevens en het nemen van de standaarddeviatie.

Representative Results

Door het uitvoeren van levensduur experimenten op de mutanten van de genen van belang naast het wild type N2 stam, kan een vast of deze genen een rol in het voedsel antwoord naar breed scala DR hebben. De wild type reactie moet vergelijkbaar zijn met degene die zijn afgebeeld in Figuur 1A. Elke modulatie van deze reactie door de mutanten, doorgevoerd door een niet-uniforme effect op voedsel voorwaarden, aangeeft dat deze genen beïnvloeden het vermogen van de worm correct reageren op veranderingen in overvloed van voedsel, op welk punt nader onderzoek van de reacties van de expressie van deze genen op breed scala DR gerechtvaardigd is. Als de reactie van de levensduur van de mutanten echter niet significant verschillend van het wild-type is dan hebben de genen geen rol in het transducing van de effecten van breed-scala DR, ten minste op het niveau van de gemiddelde levensduur. Als de mutaties een uniforme verschuiving van de hele levensduur reactie veroorzaken dan hebben de genen een voedsel-onafhankelijke effect op levensduur. Dit sluit niet uit dat de uitdrukking van de genen van belang voedsel-responsieve is, in welk geval de informatie die door deze genen niet aan de levensduur doorgegeven wordt.

De volgende fase van het protocol is te bepalen hoe de expressie niveaus wijzigen onder breed-scala DR voor de genen van belang. In Figuur 1Billustreren we dit door de niveaus van de expressie van een transcriptionele verslaggever van daf-7, waaruit een reactie op veranderingen in het niveau van het voedsel in de sensorische neuronen van ASI blijkt. In een daf-7(-) mutant, is de reactie van de expressie van de transcriptionele verslaggever gewijzigd. Indien de genen van belang echt voedsel-reageren op het niveau van de levensduur zijn kan dan men verwachten dat hun expressie ook met voedsel verandert. Dienovereenkomstig moet een transcriptionele verslaggever in de mutant achtergrond een gewijzigde expressie profiel in reactie op breed scala DR. Het is echter ook mogelijk dat de transcriptionele verslaggever van het gen van belang in een wild type achtergrond niet alle voedsel-responsieve wijzigingen in expressie toont. In deze situatie, kan dit duiden op een post-transcriptional regelgevende effect dat buiten het bestek van dit protocol valt.

In Diana et al. (2017)13, we hebben opgehaald expressie waarden voor daf-7 in ASI en tph-1 in de ADF en NSM. In Figuur 2illustreren we de schatting van de verdeling van de expressie in ASI en ADF voor een niveau van bepaald voedsel. Met meerdere uitlezingen uit één worm afbeeldingen stelt ons in staat om te analyseren van niet alleen de hoeveelheid informatie onafhankelijk gecodeerd door elk neuron maar ook de combinatorische informatie van het hele neurale circuit (Figuur 2B-2 C). Het combineren van deze twee informatie-theoretische maatregelen stelt ons in staat om te karakteriseren van het systeem in termen van de codering strategie in dienst van de neuronen te brengen informatie over voedsel. Het bedrag van de redundantie in het circuit kan worden verkregen door de som van de wederzijdse informatie voor elk neuron en de gezamenlijke wederzijdse informatie (kanaalcapaciteit) verkregen door te overwegen de combinatorische uitlezingen van het circuit af te trekken. Een positieve waarde van zo'n verschil geeft een overbodige karakter van de codering strategie omdat de cumulatieve gegevens tussen de delen groter dan de werkelijke gegevens gecodeerd door het hele circuit is. Omgekeerd geeft een negatieve waarde een synergetische strategie omdat de ware informatie gecodeerd groter dan de som van haar onderdelen (Figuur 2B is). Informatie en redundantie kunnen worden vergeleken tussen verschillende genotypen te verkennen mogelijk hogere orde rollen van genregulering, bijvoorbeeld in Diana et al. (2017) 13 het effect van daf-7 mutatie schakelt de codering strategie van redundante aan synergetische (Figuur 2C-2D).

Figure 1
Figuur 1 : Reactie van de levensduur en gen-expressie onder breed scala DR. (A) de gemiddelde levensduur van het wild type N2 stam (zwarte lijn) toont een complexe reactie naar breed scala DR. De omvang van deze reactie is verzwakt in een null mutant van het daf-7 gen (rode lijn). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde, gegroepeerde gegevens uit Entchev et al. (2015) 12. (B) het gemiddelde niveaus van de expressie van een transcriptionele verslaggever voor het daf-7 -gen in wild type achtergrond (zwarte lijn) ook een complexe niet-monotone reactie naar breed scala DR weergeven. In de genetische achtergrond van daf-7(-) de uitdrukking van deze transcriptionele verslaggever zeer is verzwakt en toont weinig reactie op veranderingen in voedsel niveau. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde, gegevens uit een enkel proces in Entchev et al. (2015) 12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Computational methodologie. (A) afbeelding van tweedimensionale dichtheid schatting van tph-1 expressie in ADF en daf-7 expressie in ASI verkregen uit het pakket van de 'ks' R met behulp van een raster dimensie 30 x 30. (B) visualisatie van de informatie die is gecodeerd door de gezamenlijke uitdrukking van tph-1 en daf-7 (geheel) en individueel (som van delen) voor de ADF, ASI en NSM neuronen. Redundante en synergetische tekens van de codering worden vertegenwoordigd door het verschil tussen de hoogte van de gestapelde balken aan de rechterkant en de informatie die is gecodeerd door het volledige circuit. (C) vergelijking tussen voedselinformatie gecodeerd door wild type dieren en daf-7(-) mutanten. (D) de vermindering van de wederzijdse informatie waargenomen in de mutanten wordt begeleid door een schakelaar naar synergetische codering. Panelen B-D zijn aangepast van Diana et al. (2017) 13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Bacteriële concentratie (cellen/ml) Optische dichtheid (600nm) Verdunningsfactor (uit vorige)
1.12E + 10 56.000 0,00
2.00E + 09 10.000 5,60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0.316 10,00
2.00E + 07 0.100 3.16
0 (S basale) 0.000 NB

Tabel 1: voedsel niveaus en verdunningsfactoren gebruikt in breed scala DR. Bacteriënl (cellen/mL) gebruikte concentraties in het breed-scala DR protocol, samen met hun respectieve OD600 metingen en de verdunningsfactor vereist om elke concentratie uit het vorige voorbeeld.

Experimentele temperatuur van levensduur
Dag 12.5° C 15° C 17.5° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27.5° C
-12 Alle stammen aan verse NGM platen stuk en onderhouden bij 20° C
-11
-10 P0 generatie van daf-7(-) stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 5 platen)
-9 P0 generatie van wild type stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 5 platen)
-8
-7
-6
-5 Instellen van de F1-generatie van daf-7(-) stammen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 90 platen)
-4 F1 generatie van wild type stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 30 platen)
-3
-2
-1
0 F2 L4 larven te halen > ei-5 RNAi platen en onderhouden bij 20° C (15 L4 per plaat, 24 platen)
1 1 - dag oud volwassenen naar NSC platen bezaaid met 9 cellen/ml voeding niveau + 2.0e en handhaven bij 20 ° C
2 2 - dagen oude volwassenen NSC platen bezaaid met experimentele voedsel voorwaarden en tot experimentele temperatuur verplaatsen
3 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
4
5 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
6
7 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
8
9 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
10
11 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
12
13
14 Overdracht Overdracht Overdracht Overdracht
15
16
17
18 Overdracht Overdracht
19
20
21
22 Overdracht

Tabel 2: schema voor levensduur uitgevoerd bij verschillende temperaturen. Schematisch overzicht van de stappen die nodig zijn om breed-bereik instellen DR levensduur experimenten bij verschillende temperaturen, daf-7(-) en wild type stammen als voorbeelden gebruikt. Het aantal overdrachten aan verse platen van elk niveau van de experimentele voedsel afneemt met toenemende temperatuur. Dit is op het feit dat dieren bij hogere temperaturen sneller zijn veroudering en zo een meer vatbaar voor fysieke schade per overdracht.

Dagen IMA
ging pijpleiding -14 Brok verslaggever stammen in daf(-) achtergrond. Handhaven bij 20 ° C. -13 Brok verslaggever stammen in wild type achtergrond. Handhaven bij 20 ° C. -12 P0 generatie van daf-7(-) verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 2 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C. -11 -10 P0 generatie van wild type verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 2 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C. -9 -8 F1 generatie van daf-7(-) verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 12 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C. -7 -6 F1 generatie van wild type verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 4 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C. -5 -4 -3 Bleekmiddel daf-7(-) verslaggever stammen in middag (~ 5 pm) en eieren op 3 10cm NGM platen storten en onderhouden bij 20 ° C. -2 Bleekmiddel wild type verslaggever stammen in de ochtend (~ 10 am) en storting eieren op 3 10 cm NGM platen en onderhouden bij 20 ° C. -1 0 Wassen L4 aan 10 cm ei-5 RNAi platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij 20 ° C. 1 Wassen van de 1-daagse volwassenen aan NSC platen bezaaid met 2.0e + 9 cellen / ml. gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij 20 ° C. 2 Wassen 2 dagen volwassenen aan NSC platen bezaaid met experimentele voedsel niveaus. 3 platen per stam en verschuiving kunt experimentele temperatuur. 3 Transfer naar verse NSC platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij experimentele temperatuur. 4 5 Transfer naar verse NSC platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij experimentele temperatuur. 6 Plukken van dieren uit platen en voorbereiden van beeldvorming.

Tabel 3: schema voor imaging-pijpleiding. Schematisch overzicht van de stappen die nodig zijn om breed-scala DR imaging experimenten met behulp van fluorescerende transcriptionele verslaggever stammen in daf-7(-) en wild type achtergronden bij verschillende temperaturen als voorbeelden.

Discussion

Hier presenteren we een nieuwe methode voor dieet beperking die een veel breder scala van voedsel concentraties dan eerder gepubliceerde protocollen kapselt. Deze methode verbindt twee voorheen gescheiden verschijnselen gezien in C. elegans DR literatuur, bacteriële ontbering en klassieke dieet beperking, waardoor zowel dieet effecten worden bestudeerd onder één protocol. Met behulp van de nieuwe brede gasgroep DR paradigma, presenteren we een algemeen kader voor de behandeling van eencellige genexpressie in antwoord op een specifieke milieu cue en bepalen hoe deze cel informatie codeert. Ons kader bestaat uit twee experimentele protocollen die illustreren hoe u levensduur en kwantitatieve beeldvorming, respectievelijk uitvoert, onder brede-bereik DR. Data van deze experimentele protocollen kan vervolgens worden onderzocht met de computationele analyses waarin Dit kader te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door wijzigingen in het gen expressie niveaus of levensduur over verschillende voorwaarden.

Levensduur experimenten met behulp van breed-scala DR paradigma betrekken zes niveaus van de verschillende voedingsmiddelen (tabel 1). Dit vereist een meer arbeidsintensieve aanpak dan levensduur onder minder voedsel niveaus, zoals dieet ontbering10,11 te onderzoeken of het gebruik van de eten-2 genetische achtergrond35. Echter kunt onderzoeken op levensduur onder één voorwaarde beperken de interpretaties van de rol van een gen in DR. Bijvoorbeeld, bleek we onlangs dat daf-7 mutanten een bidirectionele demping van de reactie op voedsel concentratie ten opzichte van wild type dieren12 (figuur 1A). Bij gebrek aan voedsel weergeven daf-7 mutanten een verkorting van hun levensduur in vergelijking met wild type dieren. Als we alleen dieet ontbering overwogen hadden, wij zou hebben uitgelegd dat het gen van de daf-7 als noodzakelijk voor alleen levensduur verlenging, wanneer in feite de rol van de daf-7 complexer is. Daarom is de kritische uitkomst van dit deel van het protocol om te bepalen of een gen van belang is betrokken bij het moduleren van de algehele reactie van levensduur op veranderingen in overvloed van voedsel.

Een groot voordeel van dit protocol in vergelijking met andere methoden is dat het een nieuwe methode gebruikt voor het elimineren van de productie van nakomelingen in de dieren ondergaan levensduur analyse. De meeste studies gebruiken de drug FuDR voor de remming van de proliferatie van de germline bij volwassenen waardoor ze steriel. Recente studies hebben echter aangetoond FuDR behandeling voorwaarde - en gen-specifieke effecten op levensduur17,18,19,20,21, ter discussie kan hebben vraag de algemene toepasbaarheid ervan. In dit protocol, eliminatie van de productie van nakomelingen wordt bereikt door een 24-uurs behandeling van dieren met RNAi gericht op het gen van de ei-5 , dat de vorming van de chitine "eggshell" van remt bevrucht C. elegans eicellen resulterend in hun dood22,23. Het voordeel van deze methode is dat het zeer late-handelt en dus niet interfereert met de kiemcellen, dat een belangrijke regulator van de levensduur in C. elegans is.

Een mogelijke waarschuwing van het breed-scala DR protocol is de afhankelijkheid van het gebruik van de antibiotica om bacteriële proliferatie om te zorgen voor een strakke controle van bacteriële concentratie. Bacteriële proliferatie in de darm van de worm is bekend dat een belangrijke oorzaak van overlijden in C. elegans16. Dus, het gebruik van bacteriostatische antibiotica, zoals carbenicillin, in NGM agar voorkomt bacteriële proliferatie en verhoogt de levensduur van wormen in vergelijking met niet-antibioticum besturingselementen16. Bepaalde soorten antibiotica, zoals rifampicine36 en leden van de tetracycline familie37,38, is aangetoond dat het verlengen van de levensduur in C. elegans onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie. Er is echter geen bewijs in de literatuur dat carbenicillin of streptomycine levensduur onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie kan verhogen.

Levensduur kan worden gezien als de uitvoer van een complexe berekening waar milieu-informatie, gerouteerd door gen-expressie in neuronale netwerken, wordt doorgegeven aan de fysiologie. Ons protocol biedt een methode om te begrijpen hoe specifieke genen beïnvloeden deze stroom van milieu-informatie. Om aan deze vraag, moeten we betrouwbare beeldverwerking om te bepalen van de verdeling van gen expressie reacties op het niveau van één cel. Zijnde kundig voor schatten niet alleen de gemiddelde reactie van genexpressie aan veranderingen in overvloed van voedsel maar ook de volledige statistische verdeling van grote populaties vertegenwoordigt een belangrijke vereiste voor de toepasbaarheid van onze methode. Deze nauwkeurige beschrijving van gen expressie reacties op voedsel overvloed kan de toepassing van informatietheorie te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door de specifieke neuronen, alsmede de codering strategie in dienst van de neurale circuit.

De beeldvorming en Computationele aspecten van de methoden die worden beschreven in dit protocol gelden voor een groter aantal biologische contexten. In ons werk zijn we gericht op een kleine neurale netwerk deelnemen aan voedsel sensing, de analyses van informatieverwerking functies zijn echter niet beperkt tot een specifieke celtype of specifieke milieu signalen. Deze methodologieën kunnen in de toekomst mogelijk worden uitgebreid tot een grotere verscheidenheid van invoervariabelen, waardoor geen fysiologische uitvoer. Deze aanpak zal bijdragen tot een beter begrip van hoe regulerende netwerken van gen codeert, proces en doorgeven van gegevens.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken de Bargmann en Horvitz labs voor reagentia. Sommige stammen werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Wij danken ook M. Lipovsek voor opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de Wellcome Trust (Project Grant 087146 aan Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 en BB/M00757X/1 tot Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 naar Q.C.), ons National Institutes of Health (R01AG035317 en R01GM088333 naar H.L.), en de VS National Science Foundation (0954578 naar H.L., 0946809 GRFP tot M.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

Genetica kwestie 126 dieet beperking High-throughput Imaging informatietheorie Neuroscience Microfluidics Neurale codering genexpressie
Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter