Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

C. एलिगेंस में व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के तहत आयु मॉडुलन के दौरान जीन अभिव्यक्ति के स्तर द्वारा इनकोडिंग जानकारी का ठहराव

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम जीन अभिव्यक्ति और उम्र के लिए व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध से संबंधित करने के लिए एक रूपरेखा पेश करते हैं । हम व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के लिए और इस प्रतिमान के तहत जीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । हम आगे की गणना विश्लेषण की रूपरेखा के लिए अंतर्निहित खाद्य संवेदन में शामिल आनुवंशिक परिपथों की सूचना प्रसंस्करण सुविधाओं प्रकट करते हैं ।

Abstract

संवेदी प्रणालियों जानवरों का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, प्रक्रिया, और अपने पर्यावरण के लिए जवाब । खाद्य बहुतायत एक पर्यावरणीय क्यू है कि पशु शरीर क्रिया विज्ञान और व्यवहार पर गहरा प्रभाव पड़ता है । हाल ही में, हम भोजन बहुतायत से निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस में लंबी उंर के मॉडुलन से पता चला है और अधिक जटिल से पहले मांयता प्राप्त है । भोजन के स्तर में परिवर्तन करने के लिए उंर की जवाबदेही विशिष्ट जीन है कि तंत्रिका सर्किट के भीतर सूचना प्रसंस्करण को नियंत्रित करने के द्वारा अधिनियम द्वारा निर्धारित किया जाता है । हमारे ढांचे आनुवंशिक विश्लेषण, उच्च प्रवाह मात्रात्मक इमेजिंग और जानकारी सिद्धांत को जोड़ती है । यहां, हम वर्णन कैसे इन तकनीकों के लिए किसी भी जीन है कि व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के लिए एक शारीरिक प्रासंगिकता है विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, इस कार्यप्रवाह कैसे ब्याज की एक जीन व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के तहत उंर को नियंत्रित करता है प्रकट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है; फिर स्थापित करने के लिए कैसे जीन की अभिव्यक्ति खाद्य स्तर के साथ बदलता है; और अंत में, पर्यावरण में खाद्य बहुतायत के बारे में जीन अभिव्यक्ति द्वारा संप्रेषित जानकारी की राशि का एक निष्पक्ष ठहराव प्रदान करने के लिए । जब कई जीन एक साथ तंत्रिका सर्किट के संदर्भ में जांच कर रहे हैं, इस कार्यप्रवाह कोडन सर्किट द्वारा नियोजित रणनीति को उजागर कर सकते हैं ।

Introduction

सभी जीवों को अपने अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए वातावरण में परिवर्तन करने के लिए भावना और प्रतिक्रिया करने के लिए सक्षम होना चाहिए । जानवरों में, तंत्रिका तंत्र प्राथमिक डिटेक्टर और पर्यावरण के बारे में जानकारी के transducer है और किसी भी परिवर्तन है कि जीव के अस्तित्व को प्रभावित हो सकता है के लिए शारीरिक प्रतिक्रिया निर्देशांक1. खाद्य बहुतायत एक पर्यावरण क्यू है कि अच्छी तरह से कई संदर्भों में अध्ययन किया है कि न केवल भोजन से संबंधित व्यवहार को विनियमित है, ऐसे2चारा के रूप में, लेकिन यह भी एक जानवर की लंबी उंर के प्रभावों । भोजन बहुतायत में परिवर्तन के द्वारा उंर के मॉडुलन आहार प्रतिबंध (डॉ) के रूप में जाना जाता है एक घटना है, और व्यापक विकास संरक्षण3है ।

निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस मौलिक जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । तकनीक के ढेर सारे विकसित किया गया है कि कीड़ा जीनोम, जैसे RNAi और vivo में जीन संपादन तकनीक के हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं । कीड़ा और उसके ऑप्टिकल पारदर्शिता के छोटे शारीरिक आकार भी दोनों transcriptional और शोधों फ्लोरोसेंट पत्रकारों और ऐसे microfluidics4के रूप में उच्च प्रवाह प्रौद्योगिकियों के उपयोगिता के vivo इमेजिंग में खुद को उधार दे । साथ में, इन उपकरणों का परीक्षण कैसे तंत्रिका सर्किट प्रत्यक्ष पशु व्यवहार का दोहन किया जा सकता है ।

C. एलिगेंस एक bacterivore है और कई तरीकों कि बैक्टीरियल एकाग्रता5,6,7,8 से छेड़छाड़ करके खाद्य बहुतायत के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति प्रकाशित किया गया है . सी. एलिगेंस अनुसंधान समुदाय के भीतर, डॉ दो अलग संदर्भों में अध्ययन किया गया है । पहली बार ' शास्त्रीय डॉ ' का कार्यकाल हो सकता है, क्योंकि यह अन्य जीवों में घटते हुए भोजन के स्तर के जवाब में देखे गए परिवर्तनों को दर्पण करता है । इस संदर्भ में, विज्ञापन libitum स्तर से खाद्य बहुतायत कम एक बढ़ती हुई उंर में परिणाम तक एक इष्टतम तक पहुंच जाता है, के बाद इस बिंदु दीर्घायु भोजन के आगे कमी के साथ कम हो जाती है6,7, 9. दूसरा प्रसंग जिसके अंतर्गत डॉ सी. एलिगेंस में अध्ययन किया गया है जो आहार अभाव में कीड़े की दीर्घायु किसी भी जीवाणु खाद्य स्रोत10,11का पूरा हटाने के द्वारा वृद्धि हुई है । Entchev एट अल में (२०१५)12, हमें पता चला कि इन दो अलग मानदंड से उत्पंन डॉ में जटिलता एक साथ एक संदर्भ के तहत जांच की जा सकती है हम ' व्यापक रेंज डॉ ' शब्द । प्रोटोकॉल का उपयोग करके नीचे उल्लिखित, हम डॉ में शामिल जीन के एक नए वर्ग की पहचान की है कि एक साथ भोजन बहुतायत के लिए उंर की प्रतिक्रिया मिलाना और तंत्रिका सर्किट में शामिल है कि नब्ज खाद्य12 (चित्रा 1) ।

पर्यावरण में परिवर्तन करने के लिए एक जानवर की प्रतिक्रिया जैविक प्रक्रियाओं के एक दृश्य है कि जटिल नियामक शरीर विज्ञान के लिए पर्यावरणीय जानकारी संदेश संवेदी प्रणाली लिंक को एकीकृत करता है । हालांकि इस तरह के "सूचना प्रवाह" के यंत्रवत विवरण अक्सर अज्ञात हैं, आनुवंशिक उपकरण कैसे इस जटिल अभिकलन विभिंन जैविक घटकों के बीच आयोजित किया जाता है में एक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे हाल के काम में, हमने दिखाया है कि डीएएफ-7 और फड-1 एक खाद्य संवेदन तंत्रिका सर्किट के माध्यम से खाद्य बहुतायत के बारे में पर्यावरण की जानकारी के संचरण में शामिल कर रहे है कि सी. एलिगेंस12 में उंर संग्राहक , 13. सूचना सिद्धांत14के गणितीय ढांचे को लागू करने से, हम बिट्स के संदर्भ में पर्यावरणीय जानकारी की मात्रा को बढ़ाता है, कि जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है में डीएएफ-7 और फड-1 विभिंन खाद्य स्तरों के पार विशिष्ट ंयूरॉंस में । इस से, हम तो एन्कोडिंग इस तंत्रिका सर्किट द्वारा नियोजित रणनीति को उजागर करने में सक्षम थे और यह कैसे आनुवंशिक रूप से नियंत्रित किया जाता है (चित्रा 2).

निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम समझने की क्या विशिष्ट ंयूरॉंस में व्यक्त ब्याज की जीन का प्रभाव है और कैसे वे पर्यावरण से जीवन की जानकारी के प्रवाह में भाग लेने के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा । मोटे तौर पर, हमारे फ्रेमवर्क दो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और एक गणना कार्यप्रवाह में विभाजित है । प्रायोगिक पहलुओं के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि ब्याज की जीन की म्यूटेंट की जांच की जा सकती है जो ब्रॉड-रेंज के तहत डॉ. वफादार transcriptional पत्रकारों को भी विभिंन खाद्य स्तरों पर जीन के अभिव्यक्ति स्तर को यों तो जरूरी है । हमारे विधि में चर्चा किए गए गणनात्मक विश्लेषण को पूरा करने में सक्षम होने के लिए, डेटासेट को अभिव्यक्ति वितरण के सार्थक अनुमान प्रदान करने के लिए पर्याप्त आकार की आवश्यकता होती है । हालांकि हम विश्लेषण के लिए टेंपलेट स्रोत कोड प्रदान करते हैं, उपयोगकर्ता के लिए जानकारी के सिद्धांत की भाषा है कि बड़े पैमाने पर हमारे अभिकलनी ढांचे में प्रयोग किया जाता है के साथ परिचित होने की जरूरत है । स्रोत कोड R और C++ में लिखे गए हैं । इसलिए उन्हें सार्थक तरीके से लागू करने के लिए एक निश्चित स्तर की प्रोग्रामिंग प्रवीणता भी जरूरी है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सामांय कीड़ा संस्कृति के लिए बैक्टीरियल संस्कृतियों और प्लेटों की तैयारी

  1. एक २५० मिलीलीटर कांच की बोतल में lysogeny शोरबा (पौंड) मीडिया के १०० मिलीलीटर तैयार करने और autoclaving.
    2. द्वारा निष्फल
  2. लगाना ई कोलाई तनाव OP50 की एक एकल कॉलोनी के साथ बोतल और ३७ & #176; सी रात भर, और फिर 4 & #176 पर संस्कृति की दुकान; सी जब तक की जरूरत है ।
  3. तैयार 5 L के बाँझ निमेटोड वृद्धि मध्यम (NGM) आगर < सुप वर्ग = "xref" > 15 और aliquot 12 मिलीलीटर की मात्रा बाँझ में 6 सेमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन.
  4. को रात भर सेट करने की अनुमति दें और फिर 4 & #176; C जब तक आवश्यक हो तब स्टोर करें ।
  5. बीज NGM प्लेटें कम से 3 दिन पहले २२५ & #956 के साथ प्रयोग करने के लिए; प्रशीतित OP50 संस्कृति के एल. प्लेट्स को 20 & #176 पर स्टोर करे; C जब तक जरूरत हो.
< p class = "jove_title" > 2. प्रयोग के लिए बैक्टीरियल संस्कृतियों और कमजोर पड़ने की तैयारी

  1. एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी में पौंड मीडिया के ५०० मिलीलीटर के दो बहुत सारे तैयार है और autoclaving द्वारा निष्फल ।
  2. लगाना OP50 की एक एकल कॉलोनी के साथ प्रत्येक कुप्पी और ३७ & #176 पर बढ़ती है; सी लगभग 14 ज.
    3. के लिए २०० rpm पर मिलाते हुए
  3. ५० के अंतिम एकाग्रता के लिए एंटीबायोटिक streptomycin के साथ संस्कृतियों के पूरक & #956; g/एमएल । ३७ & #176 पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए जारी रखें; सी तो 15 मिनट के लिए बर्फ पर कुप्पी जगह
  4. प्रत्येक संस्कृति के ४५० मिलीलीटर अलग बाँझ केंद्रापसारक की बोतलों में स्थानांतरण (आदर्श ५०० मिलीलीटर क्षमता की बोतलें बंटवारे संस्कृतियों से बचने के लिए) । बर्फ पर बचे हुए संस्कृति को बनाए रखने, के रूप में यह बैक्टीरिया की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  5. पर बोतलें नीचे स्पिन ४५०० x g में एक प्रशीतित केंद्रापसारक पर सेट 4 & #176; C के लिए 25 min. supernatant त्यागें और बर्फ पर बोतलों की दुकान.
  6. पतला १०० & #956; बचे संस्कृति के l को ९०० में प्रत्येक कुप्पी से & #956; l बाँझ पौंड का उपयोग करें 1 मिलीलीटर के बाँझ पौंड spectrophotometer शून्य करने के लिए, और फिर प्रत्येक संस्कृति के 10 गुना कमजोर पड़ने के आयुध डिपो ६०० का निर्धारण. उदाहरण के लिए, यदि आयुध डिपो ६०० की 10 गुना कमजोर पड़ने संस्कृति के ०.२८ है तो संस्कृति एक वास्तविक ओडी ६०० की २.८.
  7. १.१२ x 10 10 OP50 कोशिकाओं के बैक्टीरिया का एक काम स्टॉक समाधान का उपयोग करें/एमएल, जो ५६ के एक आयुध डिपो ६०० के बराबर होती है । इसलिए, उदाहरण के आयुध डिपो ६०० ऊपर से २.८ के का उपयोग कर, ४५० एमएल संस्कृति से एक 20 गु मूल मात्रा है, जो इस मामले में २२.५० मिलीलीटर में से गोली reसस्पेंड । एक बाँझ एस बेसल समाधान के साथ बैक्टीरिया reसस्पेंड ५० & #956; g/mL (SB + strep) के लिए streptomycin के साथ पूरक है.
  8. बाँझ SB की उचित मात्रा में गोली reसस्पेंड + strep.
  9. में काम कर रहे शेयर के धारावाहिक कमजोर पड़ने से प्रयोगों में इस्तेमाल किया सभी बाद की सांद्रता बनाने + strep तालिका में सूचीबद्ध कमजोर पड़ने कारकों का उपयोग कर 1.
< p class = "jove_title" > 3. स्थापना आयुष्यात उपाययोजना

< p class = "jove_content" > नोट: उम्र की परख पर प्रदर्शन कर रहे हैं 6 सेमी का इलाज ऊतक संस्कृति streptomycin और कार्बेनिसिलिन (एनएससी) के साथ पूरक NGM आगर के 12 मिलीलीटर के साथ भरा, दोनों ५० & #956 के एक अंतिम एकाग्रता पर; g/mL । इन ऊतक संस्कृति प्लेटें अच्छी तरह से नहीं या बहुत कम बैक्टीरियल सांद्रता में उंर परख के लिए अनुकूल हैं, के रूप में कीड़े काफी कम प्लेट और desiccating की दीवार से चिपके रहने की संभावना है । दो अलग एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग दवा प्रतिरोध, जो थाली पर बैक्टीरियल एकाग्रता को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण है के विकास से OP50 तनाव को रोकता है । इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ बैक्टीरिया को निष्क्रिय करके, हम रोगजनक संक्रमण के कारण कृमि उंर पर प्रभाव को कम करने के लिए < सुप वर्ग = "xref" > १६ . इससे हम इन प्रयोगों में बैक्टीरियल एकाग्रता के केवल भोजन संबंधी घटकों पर विचार कर सकते हैं. अनेक ग. एलिगेंस वृद्धावस्था अध्ययन पूरक NGM प्लेट्स विथ केमिकल fluoro-2 & #8242;-deoxyuridine (FUdR) वयस्कों को बाँझ प्रदान करने के लिए. हालांकि, FUdR के उपयोग के रूप में समस्याग्रस्त किया जा सकता है इसके उपयोग दीर्घायु परख के साथ कई निराधार मुद्दों पैदा कर सकता है < सुप वर्ग = "xref" > १७ , < सुप class = "xref" > 18 , < सुप class = "xref" > 19 , < सुप वर्ग = "xref" > २० , < सुप क्लास = "xref" > 21 . Entchev एट अल. (2015) < सुप वर्ग = "xref" > 12 ने इस मुद्दे को दरकिनार कर L4 लार्वा के एक्सपोजर को RNAi के एग-5 < सुप class = "xref" > 22 , < सुप class = "xref" > 23 , जो रोकता है oocyte-to-भ्रूण संक्रमण के eggshell के गठन को अवरुद्ध करके निषेचित ग. एलिगेंस अंडाणुओं उनकी मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप.

  1. कल्चर को ग. एलिगेंस उपभेदों कि 20 & #176 पर सीडिंग NGM प्लेटों पर परख की जाएगी; C. प्लेटें बाहर भूखे करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी जानवरों को एक समान फैशन में हो रहे है और संभावित किसी भी transgenerational प्रभाव के लिए खाते के लिए अनुमति दें विकासात्मक स्थितियाँ.
  2. हस्तांतरण भूखे एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर और यह एक नई थाली पर नीचे रखने की थाली से (5 मिमी x 5 मिमी) आगर का एक छोटा सा टुकड़ा काटने से नई वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों को L1 लार्वा, एक प्रक्रिया के रूप में संदर्भित & #39; chunky & #39; by C. एलिगेंस रिसर्च कॉम एकता < सुप वर्ग = "xref" > १५ . L4 अवस्था में पहुँचने तक कीड़े उगते हैं. प्रति तनाव पांच L4 लार्वा तो व्यक्तिगत वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों में स्थानांतरित कर रहे है और 20 में रखा & #176; सी । इन जानवरों P0 पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
  3. की L4 संतति का उपयोग P0 पीढ़ी की F1 पीढ़ी की स्थापना के लिए करते हैं. व्यक्तिगत रूप से जंगली प्रकार N2 तनाव के F1 L4 लार्वा पर 30 वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों ।
    नोट: उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए, आवश्यक प्लेटों की संख्या उनकी विकास दर पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, डीएएफ-7 (ok3125) पशुओं को 20 & #176; C पर एक क्षणिक dauer गिरफ्तारी से गुजरना पड़ता है । इस प्रकार, यह तनाव N2 जंगली प्रकार के कीड़े की एक थाली की तुलना में कम L4 लार्वा पैदा करता है ।
  4. इस अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, डीएएफ-7 (ok3125) प्लेटों से एक दिन पहले ऊपर की स्थापना की और अधिक से अधिक संख्या में, एक अच्छा काम कर अनुपात 3:1 है । N2
  5. स्थानांतरण तुल्यकालित L4-चरण F1 माता पिता की संतति NGM प्लेटों के लिए 1 मिमी IPTG और ५० & #181; जी/एमएल कार्बेनिसिलिन (RNAi प्लेट्स) कि २२५ & #181 के साथ वरीयता प्राप्त थे HT115 बैक्टीरिया के dsRNA को लक्षित अंडे-5 जीन के एल और पर रखा 20 & #176; ग के लिए 24 ज. प्रति तनाव से कम ३६० कीड़े, प्लेट प्रति 15 पशुओं के घनत्व पर रखा, प्रयोग प्रति की जरूरत है ।
  6. के बाद एग-5 RNAi ट्रीटमेंट, कीड़े के स्थानांतरण के लिए एनएससी प्लेट्स के साथ वरीयता प्राप्त २२५ & #181; L के streptomycin-स्वास्थ्यकर्मी OP50 की एकाग्रता पर 2 x 10 9 कक्षों/एमएल ( Table 1 ) पर एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए 20 & #176; सी. इस और बाद के सभी स्थानान्तरण के दौरान कीड़े को शारीरिक क्षति से बचने के लिए, धीरे से एक बहुत पतली धीरे घुमावदार कीड़ा लेने का उपयोग कर कीड़ा के नीचे से स्कूप जानवरों. एक 10 & #181 में विसर्जित करके कीड़ा लेने से जानवरों को फ्लोट; SB की एल छोटी बूंद + नई प्लेट की सतह पर रखा strep.
    7. अगले दिन
  7. , भोजन के स्तर में से प्रत्येक का प्रतिनिधित्व एनएससी प्लेटों के लिए कीड़े पुनर्वितरित l1 तालिका में isted साथ ही एनएससी प्लेटों का एक सेट है कि कोई जीवाणु होते हैं । बीज सभी एनएससी प्लेटें २२५ & #181; एल बैक्टीरिया की प्रासंगिक एकाग्रता के साथ, और बीज बैक्टीरिया मुक्त एनएससी प्लेटों के साथ २२५ & #181; l SB + strep. थाली प्रति 15 पशुओं के एक घनत्व पर कीड़े बनाए रखने के प्रति तनाव के प्रति भोजन की स्थिति के अनुसार कम से कम चार प्लेट में जिसके परिणामस्वरूप । प्लेटों को वांछित प्रायोगिक तापमान पर शिफ्ट करें ।
    8. ताजा एनएससी प्लेटों को
  8. हस्तांतरण कीड़े तालिका 2 .
    9. में उल्लिखित अनुसूची के अनुसार उपयुक्त भोजन एकाग्रता के साथ वरीयता प्राप्त
  9. एक तार लेने के साथ धीरे से उकसाने द्वारा आंदोलन के लिए जानवरों स्कोर । जवाब में असफलता मौत के रूप में बनाए है । हर स्थानांतरण बिंदु पर मौत के लिए जानवरों के स्कोर और फिर पिछले स्थानांतरण बिंदु के बाद दैनिक ।
< p class = "jove_title" > 4. इमेजिंग प्रयोगों की स्थापना करना

< p class = "jove_content" > नोट: इस खंड में उल्लिखित चरणों एक दिए गए तापमान पर इमेजिंग एक प्रयोगात्मक भोजन की स्थिति के लिए प्रति तनाव पर्याप्त कीड़े उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं । इस प्रोटोकॉल को शर्तों की संख्या है कि किसी भी दिन पर छवि हो जाएगा फिट किया जा सकता है । हालांकि, देखभाल प्रायोगिक डिजाइन में लिया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि समय सीमा उचित है और कि विभिंन उपभेदों भर में जानवरों इमेजिंग के दिन 12 घंटे से अधिक एक उंर अंतर नहीं है । यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि transcriptional पत्रकारों imaged जा रहा है एकल प्रतिलिपि transgenics हैं, के रूप में यह और अधिक बारीकी जीन के मूल विनियमन के समान होगा । नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल, और तालिका 3 में संक्षेप में, यह भी बड़ी तुल्यकालिक आयु प्राप्त करने के लिए एक सुव्यवस्थित विधि प्रदान करता है उपभेदों की आबादी मिलान, जो अंय प्रायोगिक कार्यप्रवाह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. संस्कृति जानवरों पर इमेजिंग प्रयोगों में 10 सेमी का इलाज टिशू कल्चर प्लेटों कीड़े का अधिक से अधिक घनत्व के लिए अनुमति देने के लिए (& #8764; प्लेट प्रति १०० पशु) उम्र से परख.
  2. के साथ 10 सेमी प्लेटें भरें NGM आगार प्लेटें और बीज के साथ ५ २२५ & #181; एल aliquots के एक पार की तरह प्रशीतित OP50 संस्कृति के गठन ।
< p class = "jove_title" > 5. रिपोर्टर उपभेदों की प्रारंभिक संस्कृति

  1. culture c. एलिगेंस उपभेदों कि 20 & #176 पर वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों पर परख की जाएगी; C. प्लेटें बाहर भूखे करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी जानवरों को एक समान फैशन में बड़े हो रहे है और किसी के लिए संभावित खाते के लिए अनुमति दें विकासात्मक स्थितियों का transgenerational प्रभाव ।
  2. चूंक भूखे L1 लार्वा NGM प्लेटों को वरीयता देते हैं और L4 अवस्था में पहुंचने तक उगते हैं । तीन L4 लार्वा प्रति तनाव दो सीडिंग NGM प्लेटों पर अंतरण 20 & #176; सी. इन जानवरों P0 पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
  3. की L4 संतति का उपयोग P0 पीढ़ी की F1 पीढ़ी की स्थापना के लिए करते हैं. जगह F1 L4 जंगली प्रकार रिपोर्टर के लार्वा 4 बीज NGM प्लेटों पर । उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए, आवश्यक प्लेटों की संख्या उनकी विकास दर पर निर्भर करता है । डीएएफ के पिछले उदाहरण का प्रयोग-7 (ok3125) , इस पृष्ठभूमि में रिपोर्टर उपभेदों तीन बार नंबर प्लेट की आवश्यकता होती है और जरूरत है दो दिन पहले जंगली प्रकार रिपोर्टर उपभेदों के लिए सेट, विकास दर में अंतर के लिए खाते में ।
< p class = "jove_title" > 6. अंडा-संग्रह और रिपोर्टर उपभेदों के तुल्यकालन

< p class = "jove_content" > नोट: ब्याज की कुछ जीन C. एलिगेंस में विकास और अंडा बिछाने दोष जब रूपांतरित, जो इसे और अधिक कठिन बनाता है में अनुसंधान समुदाय परिणाम । विभिंन पादी के पशुओं के बड़े तुल्यकालिक आबादी उत्पंन करते हैं । उदाहरण के लिए, डीएएफ-7 (ok3125) उत्परिवर्तन का कारण बनता है एक गंभीर अंडा-जंगली प्रकार N2 तनाव की तुलना में दोष बिछाने । इसलिए, मात्रात्मक इमेजिंग प्रयोगों के लिए विभिंन उपभेदों के तुल्यकालिक L4 लार्वा की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए मैंयुअल रूप से कीड़े उठा से एक अधिक मजबूत पद्धति की आवश्यकता है । इस कारण से, transcriptional रिपोर्टर उपभेदों एक सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO) के अधीन थे/सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) gravid वयस्कों के समाधान उपचार जानवरों को खोलने और उनके अंडे मुक्त करने के लिए, एक प्रक्रिया सामांयतः के रूप में संदर्भित करने के लिए & #39; ब्लीचिंग & #39; द तक ग. एलिगेंस अनुसंधान समुदाय < सुप class = "xref" > 15 .

  1. उपभेदों के बीच वृद्धि दर में अंतर के लिए खाता है और गणना जब प्रत्येक तनाव की प्लेटें काटा और ब्लीच किया जाना चाहिए । का एक उदाहरण के लिए जब जंगली प्रकार और डीएएफ-7 (ok3125) रिपोर्टर उपभेदों ब्लीच कर रहे है देखें तालिका 3 .
  2. प्रश्नपत्र धो प्लेटों से एक दिया तनाव के कीड़े, उचित दिन पर, SB के 15 मिलीलीटर का उपयोग कर और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा । प्राकृतिक रूप से तलछट के लिए पशुओं की अनुमति दें और फिर तरल की मात्रा को समायोजित करने के लिए 7 मिलीलीटर
  3. gravid वयस्कों युक्त ट्यूब करने के लिए 5% NaClO और 5 एम NaOH के 1 मिलीलीटर की 2 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे से कोई अधिक से अधिक 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण रॉक । NaClO बैक्टीरिया और कीड़े को मार देंगे, जबकि NaOH कीड़े के अलावा किसी भी निषेचित अंडे वे तरल में शामिल जारी तोड़ने के लिए कारण बनता है । भ्रूण के आसपास काइटिन eggshell उपचार के प्रभाव से बचाता है, जब तक जोखिम समय अपेक्षाकृत कम रहता है । 3 मिनट की मशीन के बाद, भंवर ~ 30 एस के लिए ट्यूब कीड़ा लावे के आगे गोलमाल की सुविधा के लिए ।
    4. 3 के बाद
  4. -मिन गर्मी १,००० x जी पर मिश्रण नीचे स्पिन 1 मिनट के लिए अंडे गोली । दूर महाप्राण एक बाँझ गिलास एक वैक्यूम कुप्पी से जुड़ा पिपेट का उपयोग कर supernatant के अधिकांश, एक ट्यूब में ~ ०.५ मिलीलीटर जा रहा है, ताकि अंडे को परेशान करने के लिए नहीं.
  5. sb के ९.५ मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड और फिर केंद्रापसारक कदम दोहराने और एक अतिरिक्त दो बार कदम resuspension ताकि अंडे तीन बार की कुल SB के साथ धोया गया है ।
  6. अंतिम धोने के बाद, केंद्रापसारक के माध्यम से अंडे गोली और फिर सभी को त्यागें, लेकिन supernatant के ०.५ मिलीलीटर । SB की शेष ०.५ मिलीलीटर में अंडे को पुनर्निलंबित और फिर aliquot १०० & #181; L को ३ १० सेमी सीड NGM प्लेट्स पर प्रत्येक प्लेट पर सभी पांच जीवाणु लॉन पर समान रूप से १०० & #181; L को वितरित करें । जंगली प्रकार उपभेदों के लिए, अंडे की थाली प्रति २०० से अधिक घनत्व पर जमा नहीं किया जाना चाहिए ।
    1. ४८ h के लिए 20 & #176; C पर प्लेट रखने और L4 लार्वा की एक अत्यधिक समरूप जनसंख्या प्राप्त करने के लिए । देरी विकास phenotypes के साथ उपभेदों के लिए, यह उपलब्ध के रूप में कई अंडे जमा करने के लिए सलाह दी जाती है और गर्मी समय में वृद्धि । for & #160; उदाहरण के लिए, रख डीएएफ-7 (ok3125) -युक्त रिपोर्टर उपभेदों पर 20 & #176; ग के लिए ~ ६४ h अंडे हैच और L4 मंच तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 7. अंडे के साथ रिपोर्टर उपभेदों के उपचार-5 RNAi

  1. प्रश्नपत्र धो तीन प्लेटें बंद SB के 15 मिलीलीटर का उपयोग कर और एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में तरल इकट्ठा । L4 लार्वा को प्राकृतिक रूप से तलछट की अनुमति दें, और फिर सभी लेकिन महाप्राण ~ ०.५ एमएल तरल की । जंगली typ मेंई रिपोर्टर उपभेदों, यह कदम L4 से छोटा कोई लार्वा निकालता है । उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में, इस कदम डीएएफ के मामले में dauers जैसे किसी भी गिरफ्तार लार्वा को हटाने एड्स-7 (ok3125) .
  2. ने शादाब के 9 एमएल वाले कीड़े को फिर से सस्पेंड कर दि या । फिर, L4 लार्वा की अवसादन दर की निगरानी और फिर सभी लेकिन महाप्राण ~ ०.५ supernatant की मिलीलीटर एक बार L4 लार्वा की सबसे गोली है । इस प्रक्रिया को एक बार फिर दोहराएं । फिर महाप्राण सभी लेकिन ~ ०.५ मिलीलीटर तरल की एक बार बहुमत L4 लार्वा का निपटारा किया है ।
  3. Add 10 & #181; L बाँझ S बेसल के पूरक के साथ ०.१% Pluronic F-१२७ (SB + wdp) L4 लार्वा युक्त तरल करने के लिए. यह एक surfactant के रूप में कार्य करता है और लार्वा प्लास्टिक पिपेट युक्तियों की आंतरिक सतह से चिपके से बचाता है ।
    1. धीरे से एक P200 कम प्रतिधारण पिपेट टिप का उपयोग कर लार्वा reसस्पेंड और फिर aliquot १५० & #181; l पर ३ १० सेमी RNAi प्लेट्स कि 5 x २२५ & #181 के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं; l of egg-5 RNAi बैक्टीरिया. सुनिश्चित करें कि कीड़े समान रूप से सभी पांच जीवाणु लॉन भर में वितरित कर रहे हैं ।
  4. एक बार तरल आगर में अवशोषित कर लिया है, प्लेटों कि धोने प्रक्रिया द्वारा मैन्युअल रूप से उन्हें दूर उठा द्वारा समाप्त नहीं किया गया से किसी भी गैर-L4 लार्वा निकालें । फिर प्लेटों को 20 & #176 पर स्टोर करें; C for 24 h.
< p class = "jove_title" > 8. ब्रॉड रेंज की दीक्षा डॉ

< p class = "jove_content" > नोट: 24 ज एग-5 RNAi ट्रीटमेंट के बाद, L4 लार्वा जो मूल रूप से प्लेटों पर जमा किए गए थे, 1 दिन पुराने व्यस्क बन गए होंगे ।

  1. किसी भी युवा लार्वा है कि पहले मैनुअल हटाने इस स्तर पर बंद कदम बच, प्लेटों पर केवल 1 दिन पुराने वयस्कों छोड़ने से उठाओ ।
    2. प्रत्येक तनाव के लिए
  2. , एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ SB की 15 मिलीलीटर + strep के साथ तीन प्लेटों से 1 दिन पुराने वयस्कों को धो लें । के लिए कीड़े स्वाभाविक रूप से तलछट की अनुमति दें, और फिर महाप्राण सभी लेकिन supernatant के ०.५ मिलीलीटर । SB + strep के ९.५ मिलीलीटर के साथ कीड़े reसस्पेंड और अवसादन और धो चरणों दोहराएँ.
  3. अंतिम धोने के बाद, कीड़े तलछट के लिए अनुमति देते हैं और फिर महाप्राण सभी लेकिन supernatant के ०.५ मिलीलीटर. Add 10 & #181; l SB + wdp और धीरे से एक P200 पिपेट टिप का उपयोग कर लार्वा reसस्पेंड और फिर aliquot १०० & #181; l पर एक एनएससी प्लेट के साथ वरीयता प्राप्त 5 x २२५ & #181; एल बैक्टीरिया पर एक एकाग्रता 2 x 10 9 कोशिकाओं/एमएल.
    1. वितरित १०० & #181; L समान रूप से सभी पांच जीवाणु लॉन में । एक माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट पर मौजूद जानवरों की संख्या का अनुमान: उद्देश्य प्लेट पर १००-१५० कीड़े के बीच है करने के लिए है ।
    2. इस रेंज में एक कीड़ा घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक तरल की मात्रा का निर्धारण और फिर दो अतिरिक्त प्लेटों पर aliquot । पहली थाली पर कीड़े की संख्या को समायोजित भी इस श्रेणी में आते हैं और फिर प्लेटों की दुकान पर 20 & #176; C for 24 h.
  4. अगले दिन, 2 दिन पुराने वयस्कों इकट्ठा और नए एनएससी भोजन के वांछित प्रयोगात्मक एकाग्रता ( तालिका 1 ), चरणों 2 और 3 में उल्लिखित तरीकों का उपयोग कर के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों को वितरित । एक बार तरल आगर में अवशोषित कर लेता है, 24 घंटे के लिए वांछित प्रयोगात्मक तापमान के लिए प्लेटों पाली
    5. अगले दिन
  5. , 3 दिन पुराने वयस्कों को इकट्ठा करने और ताजा एनएससी भोजन की एक ही प्रयोगात्मक एकाग्रता के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों को वितरित, चरणों में उल्लिखित विधियों का पुनः उपयोग ८.३ और ८.४ । एक बार तरल आगर में अवशोषित कर लेता है, ४८ h.
    6. के लिए प्रायोगिक तापमान के लिए प्लेटें वापस
  6. इकट्ठा 5 दिन पुराने वयस्कों और ताजा एनएससी भोजन के एक ही प्रयोगात्मक एकाग्रता के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों को वितरित, ८.३ और ८.४ चरणों में उल्लिखित तरीकों का उपयोग कर । एक बार तरल आगर में अवशोषित कर लेता है, 24 घंटे के लिए प्रायोगिक तापमान के लिए प्लेटें वापस
< p class = "jove_title" > 9. Microfluidic इमेजिंग के रिपोर्टर संवेदनहीन

  1. वयस्कता के दिन 6 पर, छवि जानवरों एक कस्टम Microfluidic मंच का उपयोग < सुप वर्ग = "xref" > २४ , < सुप क्लास = "xref" > २५ . शारीरिक रूप से तीन प्लेटों से पशुओं को उठाओ और एक 5 मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूब में निलंबित SB + strep. की ४.५ मिलीलीटर युक्त
    1. एक बार कीड़े तलछट, महाप्राण सभी लेकिन ~ supernatant के ०.५ मिलीलीटर और SB के 4 मिलीलीटर + strep में पशुओं को फिर से स्थगित । इस धोने के अतिरिक्त बैक्टीरिया है कि अंयथा इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप हो हटा । कीड़े दबाव चालित प्रवाह के माध्यम से एक कस्टम microfluidic डिवाइस में पेश कर रहे हैं < सुप क्लास = "xref" > 24 , < सुप क्लास = "xref" > 25 . डिवाइस के भीतर, व्यक्तिगत कीड़े में निर्देशित कर रहे हैं और एक इमेजिंग चैनल के भीतर फंस दबाव द्वारा gated-चिप वाल्व पर चालित < सुप वर्ग = "xref" > 26 कस्टम सॉफ्टवेयर के नियंत्रण में.
  2. एक बार एक कीड़ा headfirst इमेजिंग चैनल में फंस गया है, एक फ्लोरोसेंट जेड-पोट लीजिए, 2 में ५० वर्गों के साथ & #181; m कदम, एक epifluorescence तेल उद्देश्य (१.३ NA) और एक कैमरा के साथ एक मानक 40X माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । एक साथ एक उत्सर्जन अलगानेवाला का उपयोग कर transcriptional पत्रकारों में से प्रत्येक के लिए लाल और हरी फ्लोरोसेंट छवियों को इकट्ठा करने और विश्लेषण के लिए संग्रहीत । छवि अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्वचालित है ।
  3. छवि स्वचालित रूप से कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग कर प्रक्रिया < सुप वर्ग = "xref" > 27 (https://github.com/meizhan/SVMelegans पर उपलब्ध). Z-पोट MATLAB में लोड कर रहे है और के लिए विश्लेषण के लिए ंयूरॉन-जोड़े और इमेजिंग विमान के भीतर अपने स्थानों की पहचान । अधिकतम अनुमानों की गणना कर रहे हैं, और एक थ्रेसहोल्ड एल्गोरिथ्म व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । कोशिका पहचान तो कीड़ा & #39; s सिर के भीतर रिश्तेदार दूरी और स्थानों के आधार पर गणना की है.
  4. रिपोर्टर प्रतिदीप्ति के लिए, z-स्टैक से प्रत्येक सेल्युलर स्थान के आस-पास तीन-आयामी वॉल्यूम निकालें । उज्ज्वल पिक्सल है, जो पूरी तरह से सभी मामलों में पूरे सेल encapsulation की एक सुसंगत संख्या पर तीव्रता एकीकृत ।
  5. एक जानवर की आंत ऑटो प्रतिदीप्ति में प्रयोगात्मक स्थिति-विशिष्ट या तनाव विशिष्ट परिवर्तन से हस्तक्षेप को खत्म करने के लिए, की विधा के आकलन के माध्यम से आंत (एडीएफ और एएसआई) निकटतम सेल जोड़े के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता की गणना ंयूरॉन के चारों ओर एक मात्रा में तीव्रता वितरण । अंतिम आउटपुट प्राप्त करने के लिए इस पृष्ठभूमि तीव्रता मान एकीकृत प्रतिदीप्ति से घटाएँ ।
< p class = "jove_title" > 10. डेटा असेंबली

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: सभी ंयूरॉंस की प्रतिदीप्ति तीव्रता छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण फ़िल्टर अभिव्यक्ति डेटा फ़ाइल (फेड) जो जीन के वितरण प्रोफाइल अनुमान करने के लिए प्रयोग किया जाता है में संयुक्त कर रहे है अभिव्यक्ति (टेंपलेट आर और C++ लिपियों https://github.com/giovannidiana/templates पर उपलब्ध हैं) ।

  1. मैन्युअल रूप से प्रत्येक संसाधित छवि सभी कक्षों के लिए सही पहचान की पुष्टि करने के लिए जाँच करें । गलत कक्ष पहचान वाली छवियां एक बहिष्करण फ़ाइल में दर्ज की जानी चाहिए । डायना एट अल में । (२०१७) < सुप क्लास = "xref" > १३ बहिष्करण फ़ाइल में एक बाइनरी तालिका होती है जिसमें & #39; 0 & #39; के लिए सही और & #39; 1 & #39 गलत कक्ष पहचान के लिए । तालिका में पंक्तियों की संख्या प्रत्येक कक्ष imaged (यानी एएसआई, एडीएफ और NSM) के लिए एक कॉलम के साथ imaged कीड़े की संख्या के बराबर है ।
  2. फेड फ़ाइल उत्पंन:
    1. को मार चलाने की पटकथा & #34; gen_data + समय & #34; प्रत्येक से प्राप्त व्यंजक मानों के संयोजन वाली कक्ष-विशिष्ट फ़ाइलें जनरेट करने के लिए बहिष्करण फ़ाइल का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया चित्र. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पंन प्रत्येक फ़ोल्डर के लिए, मार स्क्रिप्ट एनोटेशन फ़ाइल पढ़ता & #60; folderprefix & #62; _EXP. txt को निकालने के लिए प्रायोगिक शर्तें और बहिष्करण फ़ाइल & #60; folderprefix & #62; _X. csv केवल सही रूप से चयन करने के लिए न्यूरॉन्स की पहचान की । व्यंजक मान फ़ाइलों से पढ़ा जाता है & #60; folderprefix & #62; _data_ & #60; न्यूरॉन & #62;. csv.
      2. सभी फाइलों को
    2. में श्रेणीबद्ध करें & #34; FED_split. dat & #34; और यह प्रयोग बैच कोड, वर्म लेबल और सेल पहचान के द्वारा छांटें ।
    3. Run & #34; सॉर्ट & #34; (C++ प्रोग्राम, उपयोग:./sort FED_split. dat FED_merged. dat) के साथ प्रविष्टियों का चयन करने के लिए गैर-शूंय प्रतिदीप्ति प्रत्येक कक्ष के लिए और उंहें एकल पंक्तियों में FED_merged. dat.
      4. में संयोजित करें
< p class = "jove_title" > 11. जानकारों का आकलन इनकोडिंग

< p class = "jove_content" > नोट: निम्न कार्यविधि का वर्णन करता है कि कैसे विशिष्ट पर्यावरणीय परिस्थितियों के बारे में जानकारी का अनुमान लगाने के लिए जीन व्यंजकों के सेट द्वारा एंकोडेड. डायना एट अल. में (२०१७) < सुप वर्ग = "xref" > 13 , पर्यावरण में खाद्य बहुतायत के बारे में इनकोडिंग जानकारी की जांच की थी, तथापि, विधि ही पर्यावरण राज्यों के किसी भी असतत संख्या के लिए लागू है । इस तरह की जानकारी entropies या अतिरेक के रूप में जानकारी सैद्धांतिक चर के लिए आवश्यक घटक सेट पर्यावरण उत्तेजनाओं पर विचार के तहत तंत्रिका प्रतिक्रियाओं के संयुक्त संभाव्यता वितरण है । इस तरह के आकलन करने के लिए, यह कीड़े की आबादी के पार प्रतिक्रिया का एक पर्याप्त नमूना है करने के लिए महत्वपूर्ण है । गाऊसी वितरण अपेक्षाकृत छोटे नमूनों से अनुमान लगाया जा सकता है; हालांकि, यह एक विश्वसनीय घनत्व अनुमान के लिए उपयुक्त नमूना आकार यों तो अभिव्यक्ति वितरण के अपेक्षित आकार का एक विचार है करने के लिए महत्वपूर्ण है । विभिंन परीक्षणों में अपरिहार्य परिवर्तनशीलता के कारण, यह जांच करने के लिए आवश्यक है कि एक ही प्रयोग के विभिंन दोहराता से प्राप्त वितरण के केंद्रीय मूल्यों को व्यवस्थित रूप से स्थानांतरित नहीं कर रहे है या कि सांख्यिकीय सुविधाओं के किसी भी अभिव्यक्ति वितरण परीक्षणों में काफी बदल नहीं रहे हैं । मामले में परीक्षण के लिए परीक्षण परिवर्तनशीलता प्रत्येक परीक्षण के भीतर परिवर्तनशीलता के साथ संगत है, यह परीक्षण के भीतर कीड़ों की संख्या बनाम परीक्षणों की संख्या संतुलन के लिए महत्वपूर्ण है बाहर औसत उन पर्यावरण/जैविक कारकों है कि परीक्षण को प्रभावित करने के लिए परीक्षण परिवर्तनशीलता. उन कारकों का नमूना भारी जानकारी पूर्वाग्रह-सैद्धांतिक विश्लेषण सकता है ।

  1. यथा r लिपि & #34; code3D. r & #34; फ़ाइल के आधार पर तीन-आयामी घनत्व पैदा करने के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करता है & #34; FED_merged. dat & #34;, विशिष्ट फेड शीर्ष लेख स्वरूप के अनुसार इस टेम्पलेट को संशोधित करें । सूची & #34; HeaderNames & #34; फेड फ़ाइल में प्रत्येक फ़ील्ड के नाम का प्रतिनिधित्व करता है जबकि & #34; RONames & #34; readouts की सूची है । स्क्रिप्ट का उपयोग करता है R पैकेज & #39; ks & #39; < सुप class = "xref" > 28 , < सुप क्लास = "xref" > 29 न्यूनतम और अधिकतम के बीच की श्रेणी को विभाजित करने वाले प्रत्येक आयाम में जीएस डिब्बे के साथ एक बहुभिंनरूपी ग्रिड के भीतर hypercubic वितरण का अनुमान लगाने के लिए प्रत्येक readout के लिए डेटासेट में मान. जब आं चर & #34; समूह & #34; 0 पर सेट है सभी डेटा घनत्व आकलन के लिए उपयोग किया जाता है । जब & #34; group & #34; लेबल 1 से 5 के बीच है dataset 5 संयुक्त सेट में विभाजित किया गया है, और अभिव्यक्ति घनत्व पांच सेट में से किसी एक के बहिष्करण के परिणामस्वरूप डेटा का ८०% से अनुमान लगाया गया है । यह सुविधा बाद में अनिश्चितताओं का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है ।
    नोट: code3D का उपयोग. r: Rscript code3D. r & #60; GT & #62; & #60; खाद्य & #62; & #60; जीएस & #62; & #60; प. स. फोल्डर & #62; & #60; लेबल & #62; & #60; गट & #62; & #60; frac & #62; जहां जीटी जीनोटाइप का प्रतिनिधित्व करता है, खाद्य पर्यावरण की स्थिति है, पूर्व में मौजूद है फ़ोल्डर जहां बंटनों को संग्रहीत किया जाएगा, लेबल एक फ़ाइल नाम उपसर्ग है और frac उपयोग किए गए डेटासेट के अंश है ।
    2. प्रत्येक पर्यावरण की स्थिति के लिए
  2. अलग ग्रिड आकार जी एस के साथ बहुभिंनरूपी वितरण उत्पंन ( जैसे 20, 30, 40 डिब्बे) । अभिकलनी लोड को कम करने के लिए, जी एस के छोटे मूल्यों को बेहतर कर रहे है जब महीन संकल्प काफी जानकारी अनुमान बदल नहीं है । जीन-अभिव्यक्ति वितरण फोल्डर में लिखा है & #60; फोल्डर & #62; निर्दिष्ट फ़ाइल नाम संरचना के साथ एकल स्तंभ पाठ फ़ाइलों के रूप में code3D. R चलाते समय & #60; लेबल & #62; _ & #60; GT & #62; _ & #60; भोजन & #62; _GS & #60; जीएस & #62; _group & #60; गट & #62;. dat.
    नोट: पिछले चरण सशर्त संभाव्यता बंटनों का अनुमान प्रदान करें < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq1.jpg"/> जहां g सभी पठन-बहिष्कार के सदिश का अर्थ है और f पर्यावरणीय स्थिति है । हालांकि, जीन एक्सप्रेशन और पर्यावरण के बीच आपसी जानकारी की गणना करने के लिए < सुप क्लास = "xref" > 30 , < सुप क्लास = "xref" > 31 .
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq2.jpg"/>
    हम इनपुट के वितरण की आवश्यकता < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq3.jpg"/> जो भी निर्धारित करता है (input-) औसत जीन-अभिव्यक्ति < img alt = "समीकरण 4" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg"/ जब इनपुट वितरण सीधे उपलब्ध नहीं है, तो कोडिंग सुविधाओं को चिह्नित करने के लिए एक सार्थक मात्रा चैनल क्षमता है, जो सभी संभावित इनपुट वितरणों में पारस्परिक जानकारी को अधिकतम करके प्राप्त की जा सकती है ।
    3. जीन-अभिव्यक्ति वितरण का उपयोग करते हुए
  3. , Arimoto-Blahut < सुप वर्ग = "xref" > 32 एल्गोरिथ्म प्रणाली की चैनल क्षमता और जानकारी अधिकतम है कि पर्यावरण इनपुट के वितरण का अनुमान लगाने के लिए लागू होते हैं । एल्गोरिथ्म के कार्यांवयन का एक उदाहरण C++ प्रोग्राम में पाया जा सकता है & #34; Ccap3D. cpp & #34; के लिए त्रि-आयामी जीन-अभिव्यक्ति कोड डायना एट अल में विश्लेषण किया. (2017) < सुप क्लास = "xref" > १३ . उदाहरण: यदि जीनोटाइप GT123 से वितरण डेटा (समूह 3) के ८०% से प्राप्त होते है ग्रिड आकार के बराबर 30 और फ़ोल्डर में संग्रहित & #34;./pdf/& #34; उपसर्ग का उपयोग कर लेबल = & #34;PD च & #34;. GT123 पृष्ठभूमि में एंकोडेड जानकारी की गणना करने के लिए आदेश है ।/Ccap3D GT123 pdf pdf ३० ३
    नोट: सिस्टम द्वारा एंकोडेड जानकारी का आकलन अनिश्चितता के कई स्रोतों द्वारा प्रभावित होता है, जिसमें घनत्व आकलन का विकल्प शामिल होता है एल्गोरिथ्म और नमूना आकार बायस । 11.1 कदम-11.2 अलग घनत्व अनुमान तरीकों का उपयोग करने के लिए प्रत्येक एल्गोरिथ्म द्वारा शुरू की व्यवस्थित पूर्वाग्रह के आकार का मूल्यांकन दोहराया जाना चाहिए ।
  4. नमूना आकार के कारण अनिश्चितता का अनुमान लगाने के लिए, 1 से 5 के बीच समूहों के साथ 11.1-11.2 चरणों से जानकारी की गणना । डेटा के ८०% के इन पांच स्वतंत्र नमूना भर में परिवर्तनशीलता जानकारी अनुमान पर नमूना आकार के प्रभाव को प्रतिबिंबित करेगा ।
  5. डेटा (चरण 5 में) के रूप में नमूना आकार पूर्वाग्रह के लिए सही करने के लिए पर 11.1-11.2 कदम का उपयोग कर जानकारी की गणना (जैक-चाकू विधि) < सुप वर्ग = "xref" > ३३ .
< p class = "jove_title" > 12. अतिरेक, शोर और संकेत सहसंबंध की गणना

  1. पारस्परिक जानकारी की गणना करने के लिए अधिक से अधिक जानकारी के अनुमान से प्राप्त इष्टतम इनपुट वितरण का उपयोग करें < img alt = "समीकरण 5" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq5.jpg"/> प्रत्येक ंयूरॉन N के इनपुट और जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया के बीच । C++ स्रोत फ़ाइल & #34; GetMI1D. C & #34; संयुक्त संभाव्यता बंटनों से सीमांत पारस्परिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक नमूना प्रोग्राम है ।
  2. ऊपर प्राप्त प्रत्येक न्यूरॉन के लिए पारस्परिक जानकारी का योग लेने के द्वारा अतिरेक की गणना और फिर चैनल क्षमता घटाना.
  3. गणना & #34; साधा & #34; सूचना पद < img alt = "समीकरण 6" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq6.jpg"/> < सुप क्लास = "xref" > 13 , < सुप क्लास = "xref" > ३४ . A टेम्पलेट C++ स्रोत फ़ाइल में ढूँढा जा सकता & #34; GetShuffle. C & #34;.
  4. प्रयोग & #34; साधा & #34; अवधि संकेत और शोर सहसंबंध की गणना करने के लिए । सिग्ना के लिएl सहसंबंध हम < img alt = "समीकरण 7" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq7.jpg"/> और शोर सहसंबंध के लिए हम < img alt = "समीकरण 8" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq8.jpg"/>.
    5. अतिरेक पर
  5. अनिश्चितताओं, शोर और संकेत सहसंबंध प्राप्त करने के लिए के रूप में कुल जानकारी (पिछले अनुभाग के चरण ११.३) डेटा के ८०% के कई नमूने से और मानक विचलन लेने.

Representative Results

वंय प्रकार N2 तनाव के साथ ब्याज की जीन के म्यूटेंट पर उंर के प्रयोगों का आयोजन करके, एक स्थापित कर सकते है कि क्या इन जीनों खाद्य प्रतिक्रिया में एक भूमिका है व्यापक रेंज डॉ । जंगली प्रकार की प्रतिक्रिया चित्रा 1एमें चित्रित एक के बराबर होना चाहिए । म्यूटेंट द्वारा इस प्रतिक्रिया के किसी भी मॉडुलन, भोजन की स्थिति में एक गैर वर्दी प्रभाव द्वारा परिलक्षित, इंगित करता है कि इन जीन कृमि की क्षमता को प्रभावित करने के लिए सही ढंग से खाद्य बहुतायत में परिवर्तन का जवाब है, पर जो बिंदु के आगे की जांच व्यापक रेंज के लिए इन जीनों की अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं डॉ वारंट है । यदि, तथापि, म्यूटेंट के दीर्घायु प्रतिक्रिया जंगली प्रकार से काफी अलग नहीं है तो जीन व्यापक रेंज के प्रभाव transducing में कोई भूमिका नहीं है डॉ, मतलब उंर के स्तर पर कम । यदि उत्परिवर्तनों पूरे जीवन की प्रतिक्रिया के एक समान बदलाव का कारण तो जीन भोजन की लंबी उंर पर स्वतंत्र प्रभाव है । इस संभावना है कि ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति भोजन उत्तरदाई है, जो मामले में इन जीनों द्वारा की गई जानकारी उंर के लिए प्रेषित नहीं है नियम नहीं है ।

प्रोटोकॉल का अगला चरण यह निर्धारित करना है कि किस तरह अभिव्यक्ति स्तर को ब्रॉड-रेंज के तहत बदलें, ब्याज की जीन के लिए डॉ. चित्रा 1बीमें, हम डीएएफ-7, जो एएसआइ संवेदी ंयूरॉंस में खाद्य स्तर में परिवर्तन करने के लिए एक प्रतिक्रिया से पता चलता है की एक transcriptional रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के स्तर के माध्यम से इस उदाहरण देकर स्पष्ट करना । एक डीएएफ-7 में (-) उत्परिवर्ती, transcriptional रिपोर्टर की अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया बदल दिया है । यदि ब्याज के जीन सही मायने में भोजन कर रहे है उंर के स्तर पर उत्तरदायी तो एक उंमीद कर सकते है कि उनकी अभिव्यक्ति भी भोजन के साथ बदल जाएगा । तदनुसार, उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में एक transcriptional रिपोर्टर व्यापक रेंज के जवाब में एक बदल अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल होना चाहिए डॉ. तथापि, यह भी संभव है कि एक जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में रुचि के जीन के transcriptional रिपोर्टर अभिव्यक्ति में कोई खाद्य-उत्तरदायी परिवर्तन न दिखाएँ. इस स्थिति में, यह इस प्रोटोकॉल के क्षेत्र के बाहर आता है एक पोस्ट-transcriptional विनियामक प्रभाव का संकेत हो सकता है ।

डायना एट अल में (२०१७)13, हम एडीएफ और NSM में एएसआइ और फड-1 में डीएएफ-7 के लिए अभिव्यक्ति मूल्यों निकाले । चित्रा 2एमें, हम एक दिया खाद्य स्तर के लिए एएसआइ और एडीएफ में अभिव्यक्ति वितरण के आकलन का वर्णन । एकल कीड़ा छवियों से एकाधिक readouts होने से हमें न केवल प्रत्येक ंयूरॉन द्वारा स्वतंत्र रूप से इनकोडिंग जानकारी की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए, लेकिन यह भी पूरे तंत्रिका सर्किट की मिश्रित जानकारी (चित्रा 2बी-2c) । इन दो जानकारी-सैद्धांतिक उपायों के संयोजन से हम एंकोडिंग को ंयूरॉंस द्वारा नियोजित रणनीति के संदर्भ में प्रणाली की विशेषता के लिए भोजन के बारे में जानकारी देते हैं । सर्किट में अतिरेक की मात्रा प्रत्येक न्यूरॉन के लिए पारस्परिक जानकारी का योग लेने और सर्किट के मिश्रित readouts पर विचार करके प्राप्त संयुक्त पारस्परिक जानकारी (चैनल क्षमता) को घटाकर प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के अंतर का एक धनात्मक मान एन्कोडिंग रणनीति के अनावश्यक वर्ण को नोट क्योंकि भागों के बीच संचयी जानकारी पूरे सर्किट द्वारा एंकोडेड वास्तविक जानकारी से बड़ा है । इसके विपरीत एक ऋणात्मक मान एक synergistic कार्यनीति को प्रतिबिंबित करता है क्योंकि वास्तविक जानकारी एंकोडेड उसके घटकों के योग से बड़ी है (चित्र 2B) । जानकारी और अतिरेक विभिंन पादी भर में जीन विनियमन के संभावित उच्च क्रम भूमिकाओं का पता लगाने के लिए की तुलना में हो सकता है, उदाहरण के लिए डायना एट अल । (२०१७) 13 डीएएफ-7 उत्परिवर्तन के प्रभाव बेमानी से एंकोडिंग रणनीति synergistic को स्विच (चित्रा 2सी-2d) ।

Figure 1
चित्र 1 : ब्रॉड-रेंज के तहत उम्र और जीन अभिव्यक्ति की प्रतिक्रिया डॉ. (क) जंगली प्रकार N2 तनाव (काली रेखा) का मतलब उंर व्यापक रेंज के लिए एक जटिल प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है डॉ. इस प्रतिक्रिया की भयावहता डीएएफ-7 जीन (लाल रेखा) के एक नल उत्परिवर्ती में तनु है । त्रुटि पट्टियों का मतलब मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं, Entchev एट अल से डेटा परित. (२०१५) 12. (ख) जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि (ब्लैक लाइन) में डीएएफ-7 जीन के लिए एक transcriptional रिपोर्टर के अर्थ अभिव्यक्ति स्तर भी एक जटिल गैर monotonic प्रतिक्रिया व्यापक रेंज के लिए प्रदर्शन डॉ. डीएएफ-7 में (-) आनुवंशिक पृष्ठभूमि इस transcriptional रिपोर्टर की अभिव्यक्ति अत्यधिक तनु और खाद्य स्तर में परिवर्तन करने के लिए थोड़ा प्रतिक्रिया से पता चलता है । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं, Entchev एट al में एकल परीक्षण से डेटा. (२०१५) 12. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : गणना पद्धति । (क) एडीएफ और डीएएफ में फड-1 अभिव्यक्ति का दो आयामी घनत्व आकलन का चित्रण-एक ग्रिड आयाम 30 x 30 का उपयोग करके ' ks ' R पैकेज से प्राप्त के रूप में एएसआई में 7 अभिव्यक्ति. (ख) एडीएफ, एएसआई और NSM न्यूरॉन्स के लिए फड-1 और डीएएफ-7 (पूरे) और व्यक्तिगत रूप से (भागों की राशि) की संयुक्त अभिव्यक्ति द्वारा इनकोडिंग जानकारी का दृश्य । एंकोडिंग के निरर्थक और synergistic वर्णों को दाईं ओर स्टैक्ड पट्टियों की ऊंचाई और पूर्ण परिपथ द्वारा एनकोड की गई जानकारी के बीच अंतर द्वारा दर्शाया जाता है । (ग) जंगली प्रकार के जानवरों और डीएएफ-7 (-) म्यूटेंट द्वारा इनकोडिंग खाद्य जानकारी के बीच तुलना । (D) म्यूटेंट में स्वीकार्य की गई पारस्परिक जानकारी की कमी synergistic एंकोडिंग की ओर एक स्विच के साथ है । पैनलों बी डी डायना एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । (२०१७) 13. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

बैक्टीरियल एकाग्रता (कोशिकाओं/ ऑप्टिकल घनत्व (600nm) कमजोर पड़ने फैक्टर (पिछले से)
1.12 ई + 10 ५६.००० ०.००
2.00 e + 09 १०.००० ५.६०
6.32 ई + 08 ३.१६० ३.१६
6.32 ई + 07 ०.३१६ १०.००
2.00 e + 07 ०.१०० ३.१६
0 (एस बेसल) ०.००० ना

तालिका 1: व्यापक रेंज में प्रयुक्त खाद्य स्तर और कमजोर पड़ने वाले कारकों डॉ. बैक्टीरियाl सांद्रता (कोशिकाओं/एमएल) व्यापक रेंज DR प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, उनके संबंधित आयुध डिपो६०० माप और कमजोर पड़ने के लिए पिछले एक से प्रत्येक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक कारक के साथ ।

उम्र का प्रायोगिक तापमान
दिन 12.5 ° c 15 डिग्री सेल्सियस 17.5 ° c 20 डिग्री सेल्सियस 22.5 ° c 25 डिग्री सेल्सियस 27.5 ° c
-12 सभी उपभेदों के लिए ताजा NGM प्लेटें और बनाए रखने में 20 डिग्री सेल्सियस
-11
-10 डीएएफ की P0 जनरेशन सेट अप-7 (-) उपभेदों और बनाए रखने में 20 ° c (प्लेट प्रति 1 L4, 5 प्लेट्स)
-9 जंगली प्रकार उपभेदों के P0 पीढ़ी की स्थापना और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने (प्लेट प्रति 1 L4, 5 प्लेट)
-8
-7
-6
-5 डीएएफ-7 की F1 जनरेशन सेट (-) उपभेदों और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने (प्लेट प्रति 1 L4, ९० प्लेट्स)
-4 जंगली प्रकार उपभेदों की F1 पीढ़ी की स्थापना और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने (थाली, 30 प्लेट प्रति 1 L4)
-3
-2
-1
0 F2 L4 लार्वा लेने के लिए & #62; अंडा-5 RNAi प्लेट्स और बनाए रखने पर 20 ° c (प्लेट प्रति 15 L4, 24 प्लेट्स)
1 1-दिन पुराने वयस्कों को एनएससी प्लेट्स में ले जाएं 2.0 e + 9 कोशिकाओं/एमएल खाद्य स्तर के साथ वरीयता प्राप्त और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने
2 2-दिन पुराने वयस्कों को प्रायोगिक भोजन की शर्तों और प्रायोगिक तापमान के अनुसार एनएससी प्लेटों में ले जाना
3 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
4
5 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
6
7 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
8
9 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
10
11 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
12
13
14 स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण स्थानांतरण
15
16
17
18 स्थानांतरण स्थानांतरण
19
20
21
22 स्थानांतरण

2 टेबल: विभिंन तापमान पर आयोजित की उंर के लिए अनुसूची । व्यापक स्तर पर स्थापित करने के लिए आवश्यक कदम की योजनाबद्ध रूपरेखा-अलग तापमान पर डॉ उम्र प्रयोगों डीएएफ-7 का उपयोग कर (-) और उदाहरण के रूप में जंगली प्रकार उपभेदों. प्रत्येक प्रयोगात्मक खाद्य स्तर के ताजा प्लेटों में स्थानान्तरण की संख्या में वृद्धि तापमान के साथ कम हो जाती है । यह तथ्य यह है कि उच्च तापमान पर पशुओं और अधिक तेजी से उंर बढ़ने और इसलिए एक अधिक हस्तांतरण प्रति शारीरिक क्षति के लिए प्रवण है के लिए खाते में है ।

दिनों आईएमए
ging पाइपलाइन -14 डीएएफ में हिस्सा रिपोर्टर उपभेदों (-) पृष्ठभूमि । 20 ° c पर बनाए रखें । -13 हिस्सा रिपोर्टर जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में उपभेदों । 20 ° c पर बनाए रखें । -12 डीएएफ-7 (-) रिपोर्टर उपभेदों की P0 जनरेशन सेट करें । 10cm NGM प्लेट प्रति 3 L4 लार्वा का प्रयोग करें । 2 प्लेट का उपयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । -11 -10 जंगली प्रकार रिपोर्टर उपभेदों के P0 पीढ़ी की स्थापना की । 10cm NGM प्लेट प्रति 3 L4 लार्वा का प्रयोग करें । 2 प्लेट का उपयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । -9 -8 डीएएफ-7 (-) रिपोर्टर उपभेदों की F1 जनरेशन सेट करें । 10cm NGM प्लेट प्रति 3 L4 लार्वा का प्रयोग करें । 12 प्लेट का उपयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । -7 -6 जंगली प्रकार रिपोर्टर उपभेदों की F1 पीढ़ी की स्थापना की । 10cm NGM प्लेट प्रति 3 L4 लार्वा का प्रयोग करें । 4 प्लेट का उपयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । -5 -4 -3 ब्लीच डीएएफ-7 (-) रिपोर्टर उपभेदों दोपहर में (~ 5) और 3 10cm NGM प्लेटों पर जमा अंडे और बनाए रखने पर 20 ° c । -2 ब्लीच जंगली प्रकार रिपोर्टर सुबह में उपभेदों (~ 10) और 3 10cm NGM प्लेटों पर जमा अंडे और बनाए रखने पर 20 ° c । -1 0 10 सेमी एग-5 RNAi प्लेट्स को धो L4 । प्रति तनाव 3 प्लेट का प्रयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । 1 1-दिन के वयस्कों को धोकर एनएससी प्लेट्स को 2.0 e + 9 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त/प्रति तनाव 3 प्लेट का प्रयोग करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें । 2 एनएससी प्लेटों को प्रायोगिक भोजन के स्तर से वरीयता के लिए 2 दिन के वयस्कों को धोएं । प्रति तनाव 3 प्लेट का प्रयोग करें और प्रायोगिक तापमान में बदलाव । 3 ताजा एनएससी प्लेटों के लिए स्थानांतरण । प्रति तनाव 3 प्लेट का प्रयोग करें और प्रयोगात्मक तापमान पर बनाए रखें । 4 5 ताजा एनएससी प्लेटों के लिए स्थानांतरण । प्रति तनाव 3 प्लेट का प्रयोग करें और प्रयोगात्मक तापमान पर बनाए रखें । 6 प्लेटों से पशुओं उठाओ और इमेजिंग के लिए तैयार करते हैं ।

तालिका 3: इमेजिंग पाइपलाइन के लिए शेड्यूल. व्यापक रेंज डॉ इमेजिंग डीएएफ में फ्लोरोसेंट transcriptional रिपोर्टर उपभेदों का उपयोग प्रयोगों की स्थापना की जरूरत कदम की योजनाबद्ध रूपरेखा -7 (-) और उदाहरण के रूप में विभिंन तापमान पर जंगली प्रकार पृष्ठभूमि ।

Discussion

यहां, हम आहार प्रतिबंध है कि पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में खाद्य सांद्रता के एक बहुत व्यापक रेंज encapsulates के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि से लिंक दो पहले अलग घटना C. एलिगेंस डॉ साहित्य, बैक्टीरियल अभाव और शास्त्रीय आहार प्रतिबंध, दोनों आहार प्रभाव एक प्रोटोकॉल के तहत अध्ययन किया जा करने की अनुमति में देखा । नए व्यापक रेंज डॉ प्रतिमान का उपयोग करना है, हम एक विशिष्ट पर्यावरण क्यू के जवाब में एकल सेल जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए एक सामांय ढांचा मौजूद है और निर्धारित कैसे इस सेल encodes जानकारी । हमारे ढांचे के दो प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि वर्णन कैसे उंर और मात्रात्मक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, के तहत क्रमशः, व्यापक रेंज के तहत डॉ. इन प्रायोगिक प्रोटोकॉल से डेटा तो गणना में प्रदान की विश्लेषण के साथ जांच की जा सकती है इस ढांचे को जीन अभिव्यक्ति के स्तर या विभिंन खाद्य परिस्थितियों में उंर में परिवर्तन द्वारा इनकोडिंग जानकारी यों तो ।

उंर के प्रयोग व्यापक रेंज डॉ प्रतिमान छह विशिष्ट खाद्य स्तर (1 तालिका) शामिल है । इस तरह के आहार अभाव10,11 या खाओ-2 आनुवंशिक पृष्ठभूमि३५का उपयोग कर के रूप में कम भोजन के स्तर के तहत दीर्घायु की जांच से अधिक श्रम गहन दृष्टिकोण आवश्यक । हालांकि, एक शर्त के तहत उंर में जांच डॉ में एक जीन की भूमिका की व्याख्याओं की सीमा कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, हम हाल ही में पता चला कि डीएएफ-7 म्यूटेंट जंगली प्रकार जानवरों की तुलना में खाद्य एकाग्रता के लिए प्रतिक्रिया का एक द्वि-दिशा क्षीणन है12 (आंकड़ा 1a). भोजन के अभाव में, डीएएफ-7 म्यूटेंट जंगली प्रकार जानवरों की तुलना में उनकी उम्र का एक छोटा प्रदर्शन करते हैं । अगर हम केवल आहार अभाव माना जाता था, हम व्याख्या की है कि डीएएफ-7 के रूप में केवल उंर विस्तार के लिए आवश्यक जा रहा है जीन, जब वास्तव में डीएएफ-7 भूमिका अधिक जटिल है । इसलिए, प्रोटोकॉल के इस भाग के महत्वपूर्ण परिणाम यह है कि ब्याज की एक जीन भोजन बहुतायत में परिवर्तन करने के लिए जीवन की समग्र प्रतिक्रिया मॉडुलन में शामिल है स्थापित करने के लिए है ।

अंय तरीकों की तुलना में इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह एक उपंयास विधि का उपयोग करता है उंर विश्लेषण के दौर से गुजर पशुओं में संतति उत्पादन को समाप्त । ज्यादातर अध्ययनों से दवा FuDR का उपयोग करने के लिए वयस्कों में germline के प्रसार को बाधित उंहें बाँझ प्रतिपादन । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है FuDR उपचार हालत हो सकता है और जीन विशेष उंर पर प्रभाव17,18,19,20,21, में बुला अपने सामांय प्रयोज्यता प्रश्न । इस प्रोटोकॉल में, संतति उत्पादन का उन्मूलन RNAi के साथ पशुओं के 24 एच उपचार के माध्यम से प्राप्त किया जाता है जो अंडा-5 जीन को लक्षित करते हैं, जो निषेचित ग. एलिगेंस अंडाणुओं के काइटिन eggshell के गठन को रोकता है जिसके परिणामस्वरूप उनके मृत्यू२२,२३. इस विधि का लाभ यह है कि यह बहुत ही देर से अभिनय है और इसलिए germline के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, जो सी. एलिगेंसमें दीर्घायु का एक प्रमुख नियामक है ।

एक व्यापक रेंज डॉ प्रोटोकॉल के संभावित चेतावनी बैक्टीरियल एकाग्रता के तंग नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए जीवाणु प्रसार को नियंत्रित करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग पर अपनी निर्भरता है । कीड़ा के पेट के भीतर बैक्टीरियल प्रसार सी. एलिगेंस16में मौत का एक प्रमुख कारण के लिए जाना जाता है । इस प्रकार, कार्बेनिसिलिन के रूप में बैक्टीरियोस्टेटिक एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग, NGM आगर में बैक्टीरियल प्रसार रोकता है और कीड़े की उम्र बढ़ जाती है गैर एंटीबायोटिक नियंत्रण की तुलना में16. एंटीबायोटिक दवाओं के कुछ प्रकार, इस तरह के रिफैंपिसिन३६ और टेट्रासाइक्लिन परिवार के सदस्यों के रूप में३७,३८, सी. एलिगेंस में जीवन के लिए स्वतंत्र रूप से बैक्टीरियल पर उनके प्रभाव का विस्तार दिखाया गया है प्रसार. हालांकि, साहित्य में ऐसा कोई प्रमाण नहीं है कि या तो कार्बेनिसिलिन या streptomycin जीवाणु प्रसार पर उनके प्रभाव की स्वतंत्र रूप से दीर्घायु को बढ़ा सकते हैं ।

आयु एक जटिल गणना के उत्पादन के रूप में देखा जा सकता है, जहां पर्यावरण की जानकारी, न्यूरॉन नेटवर्क में जीन अभिव्यक्ति द्वारा कराई, शरीर विज्ञान के लिए फैलता है. हमारे प्रोटोकॉल एक कार्यप्रणाली को समझने के लिए कैसे विशिष्ट जीन पर्यावरणीय जानकारी के इस प्रवाह को प्रभावित प्रदान करता है । इस सवाल का पता करने के लिए, हम विश्वसनीय छवि प्रसंस्करण एकल सेल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं के वितरण का निर्धारण करने की जरूरत है । के लिए न केवल जीन अभिव्यक्ति की औसत प्रतिक्रिया खाद्य बहुतायत में परिवर्तन करने के लिए, लेकिन यह भी बड़ी आबादी से पूर्ण सांख्यिकीय वितरण का अनुमान करने में सक्षम हमारे विधि की प्रयोज्यता के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करता है । जीन अभिव्यक्ति का यह सटीक विवरण खाद्य बहुतायत के लिए प्रतिक्रियाओं के आवेदन की अनुमति देता है जानकारी के सिद्धांत के विशिष्ट ंयूरॉंस द्वारा इनकोडिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोडिंग रणनीति तंत्रिका सर्किट द्वारा नियोजित जानकारी ।

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधियों का इमेजिंग और गणनात्मक पहलू जैविक संदर्भों के अधिक से अधिक सेट के लिए लागू होते हैं । हमारे काम में, हम एक छोटे तंत्रिका खाद्य संवेदन में शामिल नेटवर्क पर ध्यान केंद्रित है, तथापि, सूचना के विश्लेषण-प्रसंस्करण सुविधाओं के एक विशिष्ट कोशिका प्रकार या विशिष्ट पर्यावरण cues तक ही सीमित नहीं हैं । भविष्य में, इन तरीकों संभावित इनपुट चर की एक बड़ी विविधता के लिए बढ़ाया जा सकता है, किसी भी शारीरिक उत्पादन को प्रभावित । इन तरीकों को कैसे जीन विनियामक नेटवर्क सांकेतिक शब्दों में बदलना, प्रक्रिया और सूचना संचारित की एक बड़ी समझ में योगदान देगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम रिएजेंट के लिए Bargmann और Horvitz लैब्स का शुक्रिया अदा करते हैं । कुछ उपभेदों CGC द्वारा प्रदान की गई, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है । हम भी पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए एम Lipovsek धंयवाद । इस शोध को वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित (प्रोजेक्ट ग्रांट ०८७१४६ टू Q.C.), BBSRC (bb/H020500/1 और bb/M00757X/1 से Q.C.), यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (न्यूरो २४२६६६ टू Q.C.), यूएस नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (R01AG035317 और R01GM088333 टू H.L.), और यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (०९५४५७८ से H.L., ०९४६८०९ GRFP से M.Z.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

आनुवंशिकी मुद्दा १२६ आहार प्रतिबंध उच्च प्रवाह इमेजिंग सूचना सिद्धांत तंत्रिका विज्ञान Microfluidics तंत्रिका कोडिंग जीन अभिव्यक्ति
<em>C. एलिगेंस</em> में व्यापक रेंज आहार प्रतिबंध के तहत आयु मॉडुलन के दौरान जीन अभिव्यक्ति के स्तर द्वारा इनकोडिंग जानकारी का ठहराव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter